PT87809B

PT87809B - Processo para a preparacao de promotores para a expressao de dna estranho em bacterias metilotroficas e seu isolamento e utilizacao

Info

Publication number: PT87809B
Application number: PT87809A
Authority: PT
Inventors: Rudiger Marquardt; Ernst-Ludwig Winnacker; Thomas Metzler; Paul Prave
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-06-24
Filing date: 1988-06-23
Publication date: 1992-10-30
Also published as: CN1030939A; NZ225121A; NO882792L; DE3720834A1; FI883005A0; DK345688A; DK345688D0; AU1828388A; EP0296484A2; ZA884486B; NO882792D0; JPS6430588A; PT87809A; EP0296484A3; KR890000667A; IL86849A0; FI883005A

Description

Sabe-se que se pode efectuar uma expressão de DNA estranho em bactérias metilotrúficas, utilizando vúrios sistemas vectores e vúrios sinais de transcrição. Os sinais de transcrição utilizados nesse caso para tal fim sao derivados de genes resistentes ou correspondem aos promotores nor- ! malmente utilizados para a sobreexpressao de genes em E. coli, ! por exemplo tac, lac, trp ou ainda fagopromotores. Windass et al., Nature 287, 396 (1980) descrevem a clonagem e expressão j de desidrogenase de glutamato de E. coli em Methylophilus me- ! thylotrophusj Hennam et al., Nature 297, 80 (1982) bem como De Mayer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 7 9, 4256 (1982) inves

N.

:>

•s

tigaram a expressão de ovalbumina e de inter í erao-CX^ em micro organismos metilotróficos, para citar apenas alguns exemplos.

No registo de patente europeia 98967 descreve

-se o desenvolvimento de sistemas vectores para Methylomonas clara· Utilizam-se plasmldeos nativos do microorganismo metilotrófico para a preparaçao de plasmldeos híbridos que se replicam de forma estSvel quer em Methylomonas clara quer ainda em E. coli. No registo de patente alema 30355θ3 propoe-se a preparaçao de plasmldeos híbridos por meio de fragmentos do plasmídeo de Methylomonas nativo.

Os plasmlneos nativos de Methylomonas clara sao crípticos, isto ê, nao se lhes pode atribuir qualquer fun çao biológica. Foi por isso surpreendente que se pudessem localizar nestes plasmldeos regiões com uma forte actividade de transcrição.

A invenção refere-se por isso al

1. Uma região promotora de um plasmídeo nativo de Methylomonas clara, para a expressão de genes em E. coli e em micro organismos metilotróficos.

2. Um vector híbrido que contêm a região promotora definida em 1.

3· A utilização do vector híbrido definido em 2 para a preparaçao de polipeptídeos em E. coli e em microorganismos metilotróficos.

No texto que se segue descreve-se detalhada— mente a invenção, em particular nas suas formas de execução preferenciais. Além disso, define-se a invenção nas respectivas reivindicações.

Por meio dos métodos de Southern Blot” e de Northern Blot” pode testar—se a transcrição de determinadas

zonas dos plasmídeos de M. clara· Para tal hibridizou—se oRNA total de Methylomonas clara com plasmídeos nativos do microor ganismo e procedeu-se à sua análise.

Para a obtenção da região promotora de acordo com a invenção, parte-se de preferencia do plasmídeo pBE3 de Methylomonas clara DSM 2397, descrito no registo de patente europeia 9δ9θ7· 0 pBE3 corta-se com enzimas de restrição, de preferencia EcoRI, Aval e HincII. Transferem-se em seguida os fragmentos individuais e hibridizam-se com RNA total marcado radioactivamente, verificando-se que o fragmento EcoRI 3, ° fragmento AvaI2 e o fragmento HincIIl apresentam uma forte ac tividade de transcrição. Outros fragmentos do DNA do pBE3 mos traram também uma acçao recíproca com uma amostra de RNA do DSM 2397, contudo muito mais fraca do que a dos fragmentos re ferido s.

Pelo mesmo método pode identificar-se também ' uma forte hibridaÇao destes fragmentos com o RNA total de uma j estirpe de E. coli, que contém o plasmídeo pBE3 clonado no pBR322.

Com plasmídeos sonda de promotor, que codifi— j cam para uma propriedade facilmente identificável, em especial i os construidos para E. coli, podem identificar-se regiões pro j motoras em pBE3 ou nos fragmentos de pBE3 referidos, apés di— i gestão adequada, de preferência por exemplo com Bali ou com j Mbol. Emprega-se de preferência pKK 232-8 como plasmídeo soni da, com o gene estrutural sem promotor para o enzima Cloranfe nicol-acetiltransferase (CAT), para a inactivaçao do cloranfe i nicol. Apos ligaçao com pBE3 ou com os respectivos fragmentos I em pKK.232— 8 e transformaçao de uma estirpe adequada de E. coli, de preferência E. coli HB 101, podem identificar-se os cio nos desejados sobre um substrato nutriente contendo cloranfe- i >

nicol. 0 DNA plasmídeo dos clonos resistentes ao cloranfeni- I col pode caracterizar-se por meio de digestão com vários enzi mas de restrição, por exemplo com Mbol, no caso de uma clona— gem de fragmentos Mbol, ou com uma combinaÇao de EcoRI eBamHl, ~ 3 -

no caso de uma clonagem de fragmentos Bali. Por meio de EcoRI e de BamHI podem identificar-se 4 fragmentos a partir de pias mídeos híbridos contendo pBE3 e 3 fragmentos com Mbol, que conduzem a uma expressão do gene CAT previamente inactivado.

Quando se corta o fragmento EcoRI 3 com Bali ou Mbol, pode identificar-se, por meio do plasmídeo CAT pKK. 232-8, um fragmento com cerca de 430 bp (pares de bases), que é idênt ico a um dos fragmentos obtidos por clonagem ⁿShot-gun do DNA total do pBE3· Sequenciou—se este fragmento, como ainda um fragmento de DNA com cerca de 3^θ hp, que se obteve após clonagem ”shot-gun do fragmento Mbol. Podem limitar—se as re gioes promotoras por meio de programas de computador disponíveis no mercado. Trata—se em ambos os casos de promotores sobrepostos, isto ê, um promotor orientado para a direita (P„)

Γ\ se sobrepoe numa sequencia a um promotor orientado para a esquerda (P^)· As sequências encontram-se representadas na Tabe la 1.

As chamadas sequências convencionais dos pro** ** A motores nao sao essencialmente diferentes das sequências consensuais conhecidas dos promotores de E. coli, e sao por exem pio designadas!

a )	para	a região -35^:	TTGGTT	ou
			TTGCGT	ou
			TTGGCT	ou
			TTGTTC
b)	para	a região —10:	TATGTT	ou
			TAAAAT	ou
			TAT6AT.

Entre a regiao-35 e a região-10 situa-se um número determinado de pares de bases, de preferência 15 a 19,

A* que consistem essencialmente nas bases G e T. Entre a regiao-10 e o inicio da transcrição encontram-se também um certo nú mero de pares de bases, de preferência 7· Em cada caso encontra-se presente uma sequência de Shine Dalgarno.

Estas sequências de promotores conduzem, tanto em E. coli como ainda em microorganismos metiiotrôficos,de preferencia em Methylomonas clara, em particular em DSM 2397» à transcrição de genes posteriormente ligados e podem clonar-se em vectores pendentes de E. coli/ M. clara para a expressão de genes estranhos. Para este fim₅ utilizam—se muito preferencia lmente as sequências de promotor do fragmento Bali ou do fragmento Mbol, representadas na Tabela 1·

Nos exemplos seguintes continua—se a ilustra— »* ** ** >

Çao da invenção. Salvo indicaÇao em contrario, os dados percentuais que se seguem sao ponderais. A construção de vectores de expressão encontra-se representada na figura 1.

Exemplo 1

Isolamento do RNA total

Para o isolamento do RNA total procedeu—se de modo análogo ao da técnica de Zuber e Losick f~Cell 35 » 275 (19Ô3)_7‘

Como no isolamento de DNA cromossomal centrifuga—se em primei ro lugar 1 1 de suspensão de cultura com uma DO (densidade áptica)^QQ de 0,6—0,8 ou 0,8-1,0, a 4°C, e lava—se o precipitado bacteriano com 100 ml de tampao (0,15M NaCl; 0 , IM EDTA, pH 8,0), uma vez que, caso contrário, devido ao sal de Mohr (NH^)gFe(SO^)2 contido no meio de cultura, se pode formar o complexo Fe(SCN)^ vermelho escuro, que poderá eventualmente prejudicar a continuação da reacçao. Todos os passos de isola m»nto se devem efectuar a 4°C, para evitar a degradaÇao do mRNA muito lábil por meio das ribonucleases próprias ou estra nhas. Por esta razao faz-se em seguida a re—suspensão dos peletizados bacterianos em 40 ml de uma solução de tiocianato de guanidinio e de /3—mercaptoetano 1, que ê um forte inibidor de ribonucleases e que se prepara da seguinte maneira (Maniatis, et al. Molecular Cloning, A Labotafcory Manual, CSM, 19θ2): misturam—se 100 g de tiocianato de guanidinio com 100 ml de

- 5 “

Η₂0, 10,6 ml de Tris-Cl 1M (pH 7*6) e 10,6 ml de EDTA 0,2M (pH 8,0) e procede-se a solução por aquecimento a 70°C com agitaçao constante. Após arrefecimento atê à temperatura am— ** biente e adiçao de 21,2 ml de solução de sarcosilo e de 2,lml de /í-mercaptoetano1 ajusta-se o volume total a 212 ml comágua A solução assim prepara a pode guardar-se a 4°C num frasco de vidro castanho. Uma vez que o lisosima já nao ê activo numa solução tao fortemente desnaturente e redutora, as bactérias re-suspendidas têm de ser abertas numa French-Press, De modo a conseguir a estratificaÇao tanto quanto possível de todas as células, colocam-se duas a três camadas sucessivas na French—Press e aplica—se uma pressão de 1400 Psi (arrefecem -se previamente a 4°C o pistão e o recipiente de aço). Procede-se imediatamente à fenolizaçao do lisado completamente homogéneo, mistura-se a fase aquosa com igual volume de uma solução de LiCl 4M e deixa—se em repouso a 4°C durante 1 hora·

RNA precipitado selectivamente deste modo e identificável como um precipitado branco centrifuga-se a 3000 rpm (centrífu ga de mesa) durante 40 minutos e toma-se em EDTA 10 mM (pH7»Q)· Apés repetidas fenolizaçoes precipita-se o RNA do modo habitual com etanol (-20°C) e conserva-se a —20°C numa suspensão de etanol a 70%.

Todas as soluçoes aquosas utilizadas se incubaram durante 48 horas com uma solução de pirocarbonato dietí lico a 0,1% e submeteram—se em seguida a autoclave durante pe lo menos 60 minutos. Tanto quanto possível utilizou-se apenas material plástico esterilizado (tubos Falcon, pipetas plásticas etc·), uma vez que o material de vidro tratado em autocla ve pode ainda conter ribonucleases activas.

Exemplo 2

Separaçao de RNA

Para a electroforese de RNA sao apropriados geles quer de formaldeído como glioxálicos com uma concentra—

çao de agarose de 0,8% a 1,2%. Utilizando um gel glioxálico, que nao ê desnaturado ao contrário do que acontece com os geles de formaldeido, procede-se à desnaturaçao do RNA por meio de tratamento prévio com glioxal. Equilibra-se a queda de pH resultante da electroforese por bombeamento de tampao.

- Geles de formaldeido

Para a preparaçao de geles de agarose-forma 1deído toma—se a quantidade adequada de agarose em água e procede—se à sua dissolução por aquecimento num forno de microon das. Apôs arrefecimento a 60°C, adiciona—se 1/10 do volume fi nal a lOx tampao de gel (100 mM MOPS, pH 7,0', 5θ mM NaAcJ 10 mM EDTA, pH 8,0) e à quantidade de solução de formaldeido a 37% necessária para·se obter uma concentração final de 2,2 M (Lehrach et al. , Biochemistry 16, 4273 (1977)} Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sei. 77·> 6794 (19^0) /. 0 gel líquido ê fortemente irritante para as mucosas e deve por isso ser manuseado nu ma hotte· As amostras de RNA dissolvidas em água ou liofili zadas adicionam-se a 20 jil de tampao heating (lx tampao de gel, 50% de formamidá» formaldeido 2,2 M) e aquecem—se duran25 minutos a 60°C em banho—maria. Apôs mistura com tampao de trabalho (glicerina a 5θ%) 1 mM EDTA, pH 8,0} azul de bromofe nol a 0,4%), podem aplicar-se as amostras sobre um gel horizontal e separar—se por electroforese a 80 Volts sob bombeamento do tampao eluente.

— Geles glioxálicos

Utilizando geles glioxálicos desnaturam-se as amostras de RNA por aquecimento a 50°C durante 60 minutos, na mistura seguinte /RcMa ster e Carmichael, Proc. Natl. Acad. Sei. 24, 4835 (1977)_7:

Glioxal 6M	2,7	P¹
DMSO	8,0
NaH₂P0^0,1M(pH 7,0)	1,6
RNA (atê 20 ug)	3,7	H¹

Dissolve—se a quantidade necessária de agarose, por aquecimento numa solução de NaH^PO^ 10 miM (pH 7,θ), utilizando—se também como tampao eluente uma solução de NaH^PO^ 10 mM. A electroforese efectua-se a 80 V sob bombearaento constante do tampao eluente·

No caso de ser necessário corar os geles de RNA, tal sé se efectua apés terminada a electroforese. Para isso agitam-se os geles ou numa solução de EtBr (3 ^ig/ml) ou numa solução de laranja de acridina (3θ /ig/ml), durante cerca de 15 minutos.

Exemplo 3

Cisão de DNA plasmídeo com endonucleases de restrição

Efectuaram-se digestões individuais com os en zimas adequados, num volume total de 10 a 3θ )*1> a 37°C· Otem ** Λ ~ po de incubaÇao e em geral de 1 a 3 horas a uma concentração de 1 a 3 U/jig de DNA, para o DNA plasmídeo purificado. Como tampões utilizam—se os tampões de alta, tnádia e baixa concentração de Sal aconselhados por Maniatis (1982). Para a digestão com Sal X utiliza-se o tampao indicado pelo fabricante.

Na digestão dupla adicionam—se simultaneamente os enzimas apro priados ao DNA. Controla-se se a digestão ê completa por elecroforese de gel de uma amostra alíquota da mistura reaccional sobre um minigel de agarose.

No caso de se pretender cindir rapidamente o DNA plasmídeo após a abertura das células, aumenta—se o volume reaccional até 4θ—50 pll de modo a diluir os factores perturbantes. 0 tempo de incubaÇao ê neste caso, no máximo, de 1,5 horas.

Exemplo 4 ~ 32

Marcaçao de DNA in vitro com P

Por meio de um processo designado com transia

³²P de DNA de caI, de DNA—polime dos outros nucle

J. Mol. Biol. 113, çao Nick pode conseguir-se a mercaçao com deia dupla, por adiçao de desoxiribonuclease rase e de P-dCTP, na presença simultânea ótidos nao radioactivos /P. W. Rigby et al.,

237 (1977) 7:

Para a marcaÇao de DNA plasmídeo utilizaram-se normalmente 30— 32

-50 Ci de (X- P-dCTP, na forma de uma mistura etanol/água ou na forma 10 vezes concentrada como solução aquosa.

Enquanto que a X- P-dCTP etanólica se tiofiliza completamente à temperatura ambiente, pode utilizar—se directamente a for ma aquosa· λ forma tiofilizada ou a 5 pi da forma aquosa de 32 <7 P— dCTP,- num volume de 5θ /*1 (ou de 45 }il), adiciona—se go ta a gota, em gelo, a mistura seguinte:

p.1 de lOx mistura para translaÇao Nick” (700 mM Tris—Cl} 100 mM MgCl^i 10 mM DTT} 200 jiM dTTP}

200 pM de dGTP, 200 jjM dATP, pH 7,4)

200 pg de DNAase I em solução aquosa} cerca de 10 U de DNA polimerase I de E. coli.

Apôs rápida mistura incubou-se a l6°C durante 60 minutos. Em seguida para-se a reacçao em gelo por adiçao de 5 Jil de EDTA 200 mM (pH 8,0). Imediatamente a seguir, separam -se numa coluna fina de Sephadex G-50, os nucleótidos nao cons truidos do DNA plasmídeo em grande parte marcado. Para tal, ta pa-se a extremidade inferior de uma pipeta de Pasteur esterilizada com um pouco de tecido tratado em autoclave e enche-se a pipeta com Sephadex de grao G-50, que se equilibra com tampao TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0). Lava-se então a coluna com 5 ^ml de TE e aplica-se a mistura reaccional radioacti— va· Por eluição com TE recolhem—se de 100 p.1 cada em recipien tes de Eppendorf esterilizados. Por meio de um monitor manual podem identificar-se as fracções que contem o DNA marcado. Foi esse o caso das fracções 7 a 9, com o mesmo volume de coluna e igual tamanho de plasmídeos, reprodutíveis. Após mistura des tas fracções, mistura-se 2 ^il delas retirado com 15 ml de líquido de cintilação (Quickzint, da firma Zinser), e determi- 9 -

nou-se num contador de cintilações o valor da incorporação ra “

i dioactiva, que ê em geral de 2—5x10 cpm/^ig de DNA. Para o con trole da separaÇao dos DNA plasmídeos marcados dos Λ- P—dCTP nao incorporados, pode efectuar-se uma precipitação de TCA an tes da medição de cintilação» em que ocorre a precipitação ape [ nas do DNA plasmídeo mas nao dos nucleótidos. A partir da diferença de contagem em cpm entre as alíquotas precipitadas e as nao precipitadas, pode avaliai—se a qualidade da separaÇao.

Exemplo 5 i

Transferência passiva (Northern Transfer) de RNA ;

A transferência de RNA sobre filtros de nitro celulose efectua-se como descrito no exemplo 10 para o DNA. [ Mergulham—se directamente geles de formaldeído bem como geles i glioxálicos, sem tratamento prévio, em 20 x tampao SCC ( 3M NaCl, 300 mM citrato de sádio). 0 tempo de transferência ê de 36 a 48 horas· Uma vez que a eficiência da transferência do RNA ê consideravelmente menor quando o gel se tratou com EtBr ου com laranja de acridina, utilizam—se para o Northern-Blot apenas geles de agarose nao coloridos. No caso de se co—hibri dizarem marcadores de DNA, removem—se as bandas corresponden— i

tes que contem os marcadores» apôs electroforese, e desnaturam-se, como descrito no caso do Southern Transfer, neutra— ΐ í

liza—se e em seguida coloca—se de novo no gel e submete-se ao blot.

Exemplo 6 ** ! HibridaÇao de DNA e de RNA

Pouco antes da utilização adiciona—se à solução de hibridaçao atê uma concentração final de 400 pg/ml, tRNA de levedura ou DNA de timo de vitela» que se desnaturou j prèviamente por meio de aquecimento em banho—maria ê ebulição [ seguido de arrefecimento em água gelada. Mergulha—se um máxi— I

mo de cinco filtros de nitrocelulose aquecidos a 80°C e humedecidos com 6x SSC (l x SSC = 0,15 M NaClj 0,15 M citrato de sódio), numa folha de polietileno transparente, na solução de hibridaÇao (cerca de 0,1-0,2 ml por cm de superfície de filtro), evitando a entrada de bolhas de ar. Para saturar todas as posiçoes de ligaÇao do filtro nao específicas, isto ê, nao cobertas por sondas de DNA, procede—se à incubaçao durante pe lo menos 12 horas em banho—maria com agitaçao, a 42°C (prê-hi bridaÇao). Em seguida remove—se completamente o líquido total e preenche—se a solução de hibridaÇao (cerca de 3θ-5θ pl por cuj2 de superfície de filtro) com as sondas radioactivas. Desnatura—se previamente esta solução por aquecimento na mistura j de hibridaÇao e arrefecimento em água gelada· Incubam—se de novo os filtros humedecidos isentos de bolhas de ar, durante pelo menos 12 horas, mas nao mais de 24 horas, a 42°C como des ΐ crito anteriormente. A lavagem subsequente com 2x SSC/0,1%, ΐ durante 15 minutos, libertar os filtros da radioactividade nao ; específica. A mistura de hibridação que contêm a solução radioactiva pode guardar-se a 4°C e utilizar-se várias vezes.

Após secagem à temperatura ambiente sobre papel Whatman 3MM pode efectuar—se a autoradiografia dos filtros.

Exemplo 7

Autora diogra fia

Fixam—se os filtros hibridizados sobre papel Whatman 3MM com pequenas fitas autocolantes e cobrem—se com um filme transparente. Utilizando filmes fotográficos apropria dos (Kodak X-Omat AR» Fuji RX) expoem-se a -80°C» numa cassete com filme de amplificaçao. Para se obterem bandas nítidas pode fazer-se também a exposição à temperatura ambiente, no caso de amostras suficientemente marcadas radioactivas e fortemente hibridizantes.

Exemplo 8

Vvx.,.,

Separaçao do DNA

Empregam—se geles de agarose horizontais de espessura 4-12 mm para a identificação de DNA e para a separa çao de fragmentos de restrição de DNA. Conforme o tamanho do DNA a estudar escolhem—se concentrações de agarose entre 0,4% e 1,2%. ApSs a incorporação da quantidade de agarose adequada em tampao de acetato aquece—se brevemente num forno de microondas e, após arrefecimento a 60°C, adiciona-se uma solução de EtBr (10 mg/ml em água) até uma concentração final de cerda de 0,5 /ig/ml). As condiçoes habituais de electroforese sao de 20—50 V com uma intensidade de corrente de 15—30 mA. Quando os próprios geles nao contêm EtBr, efectua-se a coloraçao, após terminada a electroforese, numa solução de brometo de etí ! dio com a concentração de 3 pg/ml. As bandas de DNA podem visualizar-se por irradiaÇao com luz ultravioleto de comprimento de onda 254 nm e fotografar—se com filne Polaroid (tipo 107)· ‘

I í

Exemplo 9

Southern Transfer¹¹ de DNA | ι

A transferência de DNA de geles de agarose efe ctua-se de acordo com Southern f~J. Mol. Biol. 98 , 5θ3 (1975)7 j do seguinte modo: 1

Agita-se em primeiro lugar o gel de agarose durante 1 hora em tampao de desnaturaçao (1,5 M NaCl; 0,5 M NaOH), depois em tam i pao de neutralizaçao (0,5 M Tris—Cl, pH 5»5> 0,9 M NaCl) durante 2 horas. 0 valor de pH da solução de neutralizaçao ou j do gel nao deve ser superior a 7»5· j

Colocam-se várias tiras de papel Whatman 3MM sobre uma grelha i de plástico de modo a absorverem o líquido mergulhando—as num recipiente de colheita com 20x SSC. Sobre esta grelha coloca-se um papel Whatman 3MM do tamanho do gel de agarose, humede ' eido com 20x SSC, e sobre ele o próprio gel mas na posição contrária, de modo a que a face inferior original fique volta da para cima. Sobre o gel coloca-se então um filtro de nitro—

celulose do mesmo tamanho, mergulhado em 6x SSC, e sobre ele duas camadas de papel Whatman 3MM também do mesmo tamanho. As bolhas de ar existentes entre as várias camadas devem remover -se cuidadosamente por pressão. Sobre isso coloca-se uma pilha de lenços de papel, de modo a sugar para cima o tampao 20x SSC através do gel de agarose, efectuando-se assim a trans ferência do DNA para o filtro de nitrocelulose. Podem cobrir— —se as bordas do filtro com fitas plásticas de cerca de 3 ^cmde largura para impedir um curto circuito entre o reservatório do SSC e os lençps de papel. Enquanto uma grande parte da humidade se difunde para cima a partir do gel, efectua-se a construção apenas com uma placa de vidro. Após cerca de uma hora pode então carregar-se com um peso de cerca de 1 kg. Conforme o tamanho e a quantidade do DNA a transferir, a trans ferência está acabada após 15 a 24 horas. 0 gel já enrugado roda—se juntamente com os filtros, de modo a poderem marcar— —se as posiçoes desejadas do DNA, através das câmaras de apli caçao, com um feltro macio. Em seguida agita-se o filtro durante 5 minutos em 6x SSC e seca-se sobre um papel Whatman à temperatura ambiente e aquece-se durante 2 a 4 horas a 80°C para fixar o DNA.

Exemplo 10

Reacçao da fosfatase

Leva-se o vector linearizado, dissolvido em TE (10 mM Tris—Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0) a um volume final de 250 pl com 12,5 pl de 20x tampao RAP (800 mM Tris—Cl, 100 mM MgCl , 2 mM Cl , pH 8,0) e água, e adiciona-se-lhe 50 U de

Μ M

CIP (calf Intestinal Phosphatase). Após incubaçao a 37 C durante 3 horas, aqueceu-se durante 15 minutos a 68°C após adiçao de 5 Jil de SDS a 10%. Após três tratamentos com fenol, se gue-se a precipitação com etanol e toma-se novamente em TE.

Exemplo 11

MarcaÇao de RNA na posição 5Λ com fosfato radioactivo i

I

I Para a marcaÇao radioactiva de RNA liofiliznram-se cerca de 5 pg do RNA total isolado de acordo com o exem pio 1, e re—suspenderam—se em 10 pl de tampao (5θ mM Tris-CI, mM glicina, 100 mM spermidina x3 HC1, 10 mM EDTA» pH 9,5)·

Por meio de aquecimento durante 10 minutos a 90°C cindiu-se o RNA em fragmentos com extremos 5' livres e colocaram-se em se guida em gelo. Adicionaram-se então as soluçoes seguintes:

I pl 5* tampao de kinase (125 mM Tris-Cl, 50 mM MgCl

A mM MDTT, pH 9,5) j 17 pi h₂0 | pl Kinase de polinucleétido T4 (Boehringer Mannheim ou Bio— j labs) pl ³²P ATP (10 pCi/pl, Amersham).

Apés incubaçao durante 1 hora a 37 C, separou í -se o RNA marcado radioactivamente do ATP por meio de cromaitografia em Sephadex G50. Obteve—se em média um RNA com 10' í ~ !

[cpm/pg. Utilizou—se completamente para a hibridaÇao. ' !

; I

Exemplo 12

Clonagem de fragmentos promotores de M. Clara !

i

Para a clonagem de fragmentos promotores de M.

I clara, digeriu-se completamente o plasmídeo promotor pKK 232-8 (Brosius, Gene, 27 (1984), I5I-I6O) com os enzimas de restrição Smal ou BamHI, como descrito no exemplo 3· No caso da digestão do pKK 232-8 com BamHI seguiu-se ainda um tratamento com fosfatase alcalina· Nos vectores apropriados pré—tratados ligaram-se fragmentos de restrição que se obtiveram por diges tao do plasmídeo pBE—3 de M. clara· A digestão de restrição destes plasmídeos efectuou-se completamente com cada um dos ' enzimas Bali e Mbol. Apés ligaÇao de cada uma das misturas,co mo descrito no exemplo 13, tomaram—se alíquotas de 10 pl das misturas reaccionais de ligase e transformaram-se com estas

alíq uotas células adequadas da estirpe E. coli HB101» de acor do com o método de Cohen et al· » /Proc. Natl. Acad. Sei. 69» 2110 (1972)7. Efectuou—se uma selecção? sobre placas de L-Broth contendo 100 jig/ml de cloranfenicol (no vector pKK 232—8 encontra—se contido um gene resistente ao cloranfenicol intacto» que no entanto nao pode ser lido devido à falta de um promotor). Recolheram-se as colónias resistentes e testou-se o seu teor em DNA plasmídeo por meio de minilisagem. Recolheram-se as colónias com plasmídeos que apresentavam um grande crescimento e testaram-se os plasmídeos em relaÇao à

A» ~ presença de novos fragmentos de restrição» após digestão com os enzimas de restrição EcoRI/BamHI (no caso da clonagem na posição de corte Smal de pKK232-8) ou apenas com Mbol (no caso da clonagem na posição de corte BamHI de pKK232—8)» por meio de electroforese num gel de PAA a 8%.

Exemplo 13

Reacçao de liga se

A ligaçao dos fragmentos de DNA isolados e do vector plasmídeo efectuou—se segundo as condiçoes aconselhadas por Maniatis (1982).

A reacçao efectua—se num tampao de ligase adequado» com uma concentração de DNA de 200-400 ^ig/ml» num volume de 10—20 pl.

A esta mistura adicionam—se 200-400 U de ligase T4 (a que cor responde 1 U da quantidade de enzima necessária para ligar 5θ% de um DNA digerido com HinlII» em 3θ minutos a 16°C» num volu me de 20 pl).

A incubaçao efectua-se a l4-l6°C durante pelo menos 24 horas. Para o controle da ligaçao retira-se em seguida 1/10 de volume da mistura reaccional de ligase e compara—se» sobre um gel de agarose a 0»4%» com uma amostra que se retirou da mistura reaccional antes da adiçao de ligase T4 e se conservou a 4°C.

Exemplo 14

Clonagem de fragmentos promotores em vectores pendentes de M.

clara/E. coli

Os fragmentos clonados no plasmídeo promotor pKK232-8 com actividade promotora podem cortar—se por meio de digestão dupla com os enzimas PstI e Pvul, num fragmento de DNA, que para alêm da sequência promotora que interessa contêm ainda uma parte do vector pKK232—8. A partir do vector hi brido pSE—1 de M. clara/E. coli (de acordo com o registo de patente alema P 36 35 5θ3) obtêm-se por digestão dupla com PstI/PvuI um pequeno fragmento que pode ser substituido pelo segmento de DNA contendo o promotor resultante do pKK232-8.

Os vários derivados do pKK232—8 que contêm diferentes segmentos de DNA de M. clara com actividade promotora, sujeitam—se a uma digestão dupla com os enzimas Pvul e PstI. Digere-se adi cionalmente ainda com o enzima PvuII de modo a evitar na reacçao de ligase subsequente uma rectro-ligaÇao do plasmídeo de partida. Para tal adicionam-se simultaneamente os três enzimas ao DNA num tampao (50 niM Tris-Cl, 10 mM NaCl, 10 mM MgCl^ 10 mM DTT, pH 7,6) e incuba—se durante 1 hora a 37°C. Paralelamente digere—se o vector pSE-Ι com os enzimas Pvul e PstI, completamente, como descrito anteriormente. Testam—se amostras aliquotas de cada uma das misturas reaccionais apôs terminada a reacçao, por meio de electroforese em gel de agarose confirmando-se se a reacçao foi completa. Misturam-se então as aliquotas das misturas reaccionais e ligam—se entre si como descrito no exemplo 13· Apôs efectuada a reacçao de ligase transformam-se células adequadas da estirpe E. coli MB102 com a mistura reaccional de ligase e seleccionam—se os clonos resistentes à tetraciclina. Por meio de minilisagem e digestão dos DNA plasmideos com os enzimas PstI/PvuI seleccionam-se os clonos que contêm o fragmento desejado do pKK.232—8 cio nado no vector pSE—1.

Exemplo 15

Clonagem do gene de primase em vectoreB pendentes com promotores de M. clara

Os derivados do plasmídeo pSE—1 com promotores de M. clara contêm uma posição de corte PstI singular em cuja direcção se oriente a transcrição do promotor. Por ciona gem de um gene estrutural na única posição de corte PstI destes derivados de pSE-Ι, pode efectuar-se assim uma transcrição deste gene estrutural a partir do promotor clonado. Como fonte de um gene estrutural sem promotor utiliza-se o plasmí— deo pWPlOln, de Furste et al· /Gene, 48, 119 (1986)/, a partir do qual, por meio de digestão com PstI, se pode obter um fragmento de DNA, no qual se encontra presente o gene estrutu ral para o enzima primase, sem promotor. 0 fragmento PstI con tido em pWPlOln, que contêm o gene de primase, ê originário do plasmídeo R751 conjugativo e pode seleccionar—se facilmente devido a uma resistência à canamicina simultaneamente presente. Este fragmento PstI de pWPlOln pode clonar em primeiro lugar na única posição de corte PstI do vector de E. coli pBR— 322, procedendo-se como descrito nos exemplos 3 ® 13· ApSs efectuada a ligaÇao transformam—se células adequadas de E. co li HB101, seleccionam-se os clonos resistentes à tetraciclina, identificam—se os clonos construídos por meio de teste à resistência à ampicilina e confirma—se a existência do fragmento PstI resultante do pWPlOln por meio de minilisagem e diges tao com enzimas de restrição. Os clonos obtidos com o fragmen to PstI do pWPlOln em ambas as orientações possíveis utilizam -se como fonte para o fragmento PstI contendo a primase.

A partir destes plasmídeos pode transferir—se o fragmento PstI com o gene estrutural sem promotor da primase para derivados de pSE-Ι com vários promotores de M. clara. Para tal, digerem -se completamente estes derivados de pSE—1, de modo análogo ao do exemplo 3, com o enzima de restrição PstI, o que conduz a uma linearizaçao destes plasmídeos. Paralelamente desliga— -se o gene estrutural sem promotor da primase do vector pBR322 de E. coli por meio de digestão completa com PstI. λ mesma mistura reaccional adiciona-se ainda o enzima Sall de modo a impedir, na reacçao de ligase subsequente, uma recirculaÇao do vector pBR322. Adicionam—se simultaneamente amostras alíquotas das duas misturas reaccionais e ligam—se entre si como

descrito no exemplo 13· Como se mostra na fig· 1, pode proce— der-se também cortando os derivados de pSE-1 e o pSP102n com PstI e ligando-os directamente entre si. Após efectuada a incubaçeo utiliza-se a mistura reaccional de ligase para transformar células adequadas de E. coli MBI01. Seleccionam-se os 1 clonos resistentes a tetraciclina e testam-se os DNA plasmídeos contidos, após minilisagem, em relaÇao à presença dos com j ponentes de DNA desejados. As colónias que contêm o fragmento PstI com o gene sem promotor da primase clonado em pSE—1 podem identificar—se por meio de digestão com PstI de cada um dos DNA plasmídeos· A orientaÇao do fragmento PstI com a pri— mase em relaÇao ao vector obtêm—se por meio de uma digestão com EcoRI. Deste modo podem encontrar—se clonos que contêm o gene de primase numa orientaÇao tal que se podem transcrever ! por meio das sequências de promotor de M. clara previamente j ligadas.

Exemplo 16

Subclonagem em pUC12 í

Digere-se completamente o vector sequenciador de E. coli pUC12 com os enzimas de restrição Accl, Smal, BamHI ou EcoRI como descrito no exemplo 3 ® trata—se com fosfatase alcalina como descrito no exemplo 10. Cinde-se o fragmento de DNA a sequenciar com os enzimas de restrição MspI, Taql,Sau3A, 1 Rsal, HaelII, Bali ou NotI. Os pequenos fragmentos de DNA assim formados separam—se por meio de electroforese em agarose a 1% em tampao TAE (40 mM Tri-acetato, 5 mM acetato de sódio, mM EDTA, pH 8,0) e isolam—se por meio de ligaçao a um fil1 tro de membrana (Schleicher e Schull, Sequences, Application Update 3^4). No caso dos fragmentos NotI encheram-se todos os extremos aguçados por meio de incubaÇao com DNA-polimerase j (Klenow) na presença de todos os quatro nucleótidos como des- í

I crito por Maniatis et al. (Ι9θ2).

Os fragmentos isolados, que se obtiveram após

digestão com os vários endonucleases de restrição, combinam— -se em misturas reaccionais de ligase com o vector UC12 cindi do, de modo que os extremos coesivos ou rombos formados seada ptem entre si. Siga-se cada uma das misturas reaccionais por incubação com o enzima T4-DNA-liga se como descrito no exemplo 13 e transformam—se em células adequadas da estirpe E. coli JM83. Isolaram-se as colónias resistentes à ampicilina e nao coradas de azul, sobre um agar-LB que continha 5θ /ig/Ap e 5θ yjg/ml de X-Gal. Comprovou-se a construção dos fragmentos dese jados por meio de minilisagem seguida de electroforese de gel em agarose.

Exemplo 17

Sequenciaçao

A sequenciaçao dos fragmentos clonados em pUC12 efectuou-se de acordo com as instruções de trabalho fornecidas pela firma Boehringer Mannheim (Guidelines for quick and simple plasmid sequencing, 1986).

Exemplo l8

Mapping¹¹ de Sl

A identificação do início de transcrição efe— j ctua—se como descrito por Maniatis et al. , pág. 207—209 ou ! por Favaloro et al·, Methods Enzymology 65 (1980)^ pág. 71θ θ seguintes, com a excepção de o híbrido de DNA—RNA formado após digestão por Si se analisar sobre um gel de sequenciaçao. ·

Tabela 1 ^Ρ1

I

Mbo I.

P,

P.

Bali.

P ' GATCCTCTAC GGTCGACCTC AAGCCCAGCC A|TTGGCT|GCA -10

AGCCGAAGCA TCA}TATGAT|C CGGCAGGTGG GAACAACCTT

GCCACCCCCG TGCAACCTCA ACTCTTTGTG 3' : -35 ' CACAAAGAGT TGAGGTTGCA CGGGGGTGGC AAGG|rTGTTC|

CCACCTGCCG GATCAfTATGA TÍSCTTCGGCT TGCAGCCAAT

GGCTGGGCTT GAGGTCGACC GTAGAGGATC 3'

GATCGCTTCG CTTGCCATGT CAGACTCCTT CCGGfTTGGTT| -10

GTGTTGTTTG TTGTTGfTATG TT|GTATTTTA CAGTAAACAA

CAACAAACGC AACAGGCGAA GGCCGGCCGG ATG • GGCGCGGCCG CCGCCGACAT CCGGCCGGCG CTTCGCCTg|F -35 -10

TGCGTfTTGTT GTTGTTTACT GfrAAAAT|ACA ACATACAACA

ACAAACAACA CAACCAACCG GAAGGAGTCT GACATGGCAA

GCGAAGCGAT 3'

Claims

REIVINDICAÇÕES

- ia Processo para a preparaçao de uma região promotora para a expressão de genes em E. coli e em microorganis mos metilotrôficos, caracterizado por se isolar, a partir de plasmídeos nativos de Methylomonas clara, uma região promotora com uma ou mais das seguintes características:

a) a região -35 no promotor, ter a sequência de nucleótidos:

TTGGTT ou TTGCGT ou TTGGCT ou TTGTTC,

b) a região —10 ter a sequência de nucleótidos:

TATGTT ou TAAAAT ou TATGAT, • ** *c) entre a região -35 e a região -10 existir um agrupamento spacer com 15 a 19 pares de bases.

- 2ô Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se isolar a região promotora a partir do pias mídeo pBE-3 de Methylomonas clara DSM 2397·

- 3^a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se isolar a região promotora contendo as sequências indicadas na Tabela 1.

Mbo I.

Bali.

^?R^:

5' GATCCTCTAC GGTCGACCTC AAGCCCAGCC A|rTGGCT)GCA

AGCCGAAGCA TCA|TATGAt|c CGGCAGGTGG GAACAACCTT

GCCACCCCCG TGCAACCTCA ACTCTTTGTG 3' ^?L^:

5' ÇACAAAGAGT TGAGGTTGCA CGGGGGTGGC AAGg(tTGTTC| -10

CCACCTGCCG GACTAfTÃTGA T|aCTTCGGCT TGCAGCCAAT

GGCTGGGCTT GAGGTCGACC GTAGAGGATC 3’

GATCGCTTCG CTTGCCATGT CAGACTCCTT CCGG^TGGTTj -10 gtgttgtttg ttgttg|tatg ttIgtatttta CAGTAAACAA

CAACAAACGC AACAGGCGAA GGCCGGCCGG ATG

5’ GGCGCGGCCG CCGCCGACAT CCGGCCGGCG CTTCGCCTG^F -35 -10

TGCGlfrTGTT GTTGTTTACT g|tAAAAT}ACA ACATACAACA

ACAAACAACA CAACCAACCG GAAGGAGTCT GACATGGCAA

GCGAAGCGAT 3’

Processo para a expressão de genes heterólogos em E. coli e em microorganismos metilotróficos, caracterizado por se introduzir, na ordem de leitura antes do gene heterólogo, uma região promotora com a sequência de Shine-Dar Igarno, na qual:

a região no promotor tem a

TTGGTT ou TTGCGT ou TTGGCT ou TTGTTC, a região -10 no promotor tem a TATGTT ou TAAAAT ou TATGAT, e

M entre as regiões -35 e —10 se cer com 15 a 19 pares de base sequencia ae nucxeotiaos.

sequência de nucleótidos contrar um agrupamento spa- 5^a Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por, no lugar da sequência de Shine-Darlgarno da região promotora, se utilizar uma posição de ligaçao ribossomal pertencente ao gene heterólogo.

A requerente declara que o primeito pedido