BR102019022248A2 - construto de dna recombinante, cassete de expressão e uso - Google Patents

Abstract

A presente invenção se insere no campo de aplicação da biotecnologia molecular em plantas, uma vez que se refere ao construto de DNA recombinante que atua como terminador da transcrição gênica em uma célula vegetal, mais particularmente um construto de DNA recombinante compreendendo pelo menos uma das sequências terminadoras SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5 identificadas em cana-de-açúcar.
Mais especificamente, ditas sequências terminadoras da presente invenção são capazes de modular a transcrição gênica em plantas em resposta ao déficit hídrico.

Description

CONSTRUTO DE DNA RECOMBINANTE, CASSETE DE EXPRESSÃO E USO Campo da invenção:

[1] A presente invenção se insere no campo de aplicação da biotecnologia molecular em plantas, uma vez que se refere ao construto de DNA recombinante que atua como terminador da transcrição gênica em uma célula vegetal, mais particularmente a um construto de DNA recombinante compreendendo pelo menos uma das sequências terminadoras SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5 identificadas em cana-de-açúcar.

[2] Mais especificamente, ditas sequências terminadoras da presente invenção são capazes de modular a transcrição gênica em plantas em resposta ao déficit hídrico.

Fundamentos da invenção:

[3] Nos últimos anos, a geração de plantas geneticamente modificadas se intensificou muito, haja visto as diversas finalidades, seja para a síntese de biomoléculas com fins terapêuticos, seja para produção de alimentos, energia e outros (CHEN; DAVIS, 2016). Brasil, maior produtor mundial de cana-de-açúcar, vem apostando no uso do melhoramento genético de cultivares mais resistentes a estresses abióticos e melhor adaptadas às condições edafoclimáticas do país, o que permitirá expandir o cultivo para outras regiões (MORAIS et al., 2015). Segundo a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), a safra de 2018/2019, estimada em 615 milhões de toneladas (t), gerou um novo recorde na produção de etanol, alcançando 32,3 bilhões de litros, cerca de 18,6% maior do que a safra de 2017/2018.

[4] O uso de plantas como sistemas biológicos de expressão de proteínas recombinantes é outra aposta que está sendo explorada por indústrias e laboratórios no mundo todo. Comparado a outros sistemas biológicos, como cultura de microrganismos ou células de insetos e mamíferos, o uso de plantas oferece diversas vantagens, como menor custo de implementação e processamento, maior flexibilidade e velocidade de produção, baixo risco de contaminação por patógenos de animais e uma produção mais flexível e diversificada de biomoléculas (CHEN; DAVIS, 2016). Pesquisadores vêm desenvolvendo novas abordagens usando técnicas de biotecnologia molecular para aumentar a eficiência da expressão gênica recombinante em plantas, tal como o uso de promotores, por exemplo. No entanto, apesar de sua importância para expressão gênica, terminadores transcricionais têm recebido pouca atenção.

[5] Terminadores transcricionais são sequências de DNA não codificantes que ficam a jusante da região codificante (ORF - Open Reading Frame), indispensáveis para a expressão gênica. No entanto, o número de terminadores transcricionais disponíveis atualmente para aplicação industrial em biotecnologia molecular de plantas é muito reduzido, sendo usados na maioria dos casos os terminadores 35S e NOS (MITSUHARA et al., 1996). Além disso, o uso de um mesmo terminador em múltiplos cassetes de expressão de um mesmo vetor pode ocasionar o silenciamento gênico (NUCCIO, M.; CHEN, X.; CONVILLE, J.; ZHOU, 2015; XING et al., 2010).

[6] Com um genoma poliploide composto por mais de 100 cromossomas, contendo várias sequências não funcionais, torna-se muito laboriosa a identificação de sequências regulatórias em cana-de-açúcar (CARSON; NOTHA, 2000). Apesar de sua proeminente importância econômica, não foi identificada nenhuma sequência terminadora em cana-de-açúcar.

[7] Assim, a presente invenção refere-se a cinco sequências terminadoras (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5) as quais podem ser utilizadas na construção de genes sintéticos contendo apenas as sequências da cana-de-açúcar, o que permite a produção de plantas de cana cisgênicas, ou seja, a produção de plantas com cassete de expressão gênica compostas exclusivamente por sequência promotora, sequencia codificante e terminadoras da própria espécie.

[8] Além disso, um dos principais problemas na agricultura é a seca, que de longe é o estresse ambiental mais importante. Dentre dos estresses, os de tipo abiótico têm sido um interesse particular para aplicação na agricultura devido ao efeito negativo sobre o desenvolvimento a produtividade em geral, bem como pelo temor às mudanças climáticas. Nesse sentido, como as sequências terminadoras são provenientes de genes induzidos por déficit hídrico, elas são especialmente indicadas para uso em genes sintéticos visando o desenvolvimento de plantas de cana cisgênicas melhor adaptadas a condições de estresse abióticos no Brasil e no mundo, tal como a seca. Ainda, a funcionalidade das sequências não está limitada apenas a esse tipo de uso, uma vez que servem na modulação da expressão gênica em outras condições do ciclo de vida da planta.

[9] Além da aplicação para geração de plantas de cana cisgênicas, as sequências terminadoras da presente invenção podem ser também utilizadas na obtenção de plantas de cana transgênicas, uma vez que estas são capazes de regular a expressão de gene heterólogos.

Estado da técnica:

[10] O documento BR 10 2017 021330 7 refere-se a um método para modular a expressão gênica em plantas através do uso de regiões de nucleotídeos do genoma da cana conhecidas como regiões promotoras ou promotores. Já a presente invenção protege as regiões terminadores dos genes em questão.

[11] O documento BR 10 2012 006552-5 refere-se a um método de produção de plantas que apresentam maior tolerância a estresses abióticos o qual compreende a região codificante da cana-de-açúcar contida em um vetor recombinante, dirigido por um promotor e um terminador comercial.

[12] Já o documento BR 10 2016 031053-9 diz respeito a um método para aumento da tolerância de plantas a seca a qual é conferida por meio da superexpressão de gene da cana-de-açúcar em outras espécies de planta, em particular a Arabidopsis thaliana, pela inserção de um vetor contendo a sequência do polinucleotídeo ScbHLH47 da cana-de-açúcar.

[13] Ainda o documento PI 1005743-9 trata da produção de plantas transgênicas tolerantes a estresses ambientais a qual introduz um gene que codifica uma proteína da cana-de-açúcar, o qual é expresso por um promotor e um terminador que funcionam em planta.

[14] Portanto, nenhum documento do estado da técnica descreve um construto de DNA recombinante que atua como terminador da transcrição gênica compreendendo as sequências SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5 com as características inovadoras aqui apresentadas assim como o uso destas na modulação da transcrição gênica em células vegetal, preferivelmente em cana-de-açúcar.

Breve descrição da invenção:

[15] A presente invenção refere-se ao construto de DNA recombinante compreendendo pelo menos uma das sequências terminadoras SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5 identificadas em células vegetal, mais preferivelmente em cana-de-açúcar.

[16] Dito construto de DNA recombinante compreende pelo menos uma das sequências terminadoras da presente invenção as quais são capazes de modular a transcrição gênica em plantas, mais preferivelmente, cana-de-açúcar, em resposta ao déficit hídrico.

Breve descrição das figuras:

[17] Para obter a completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.

[18] Figura 1. Mapa do vetor pTZ57R/T sistema TA cloning usado nas clonagens.

[19] Figura 2. Vetor binário pORE T1, em que a-pORE T1 em sua configuração original, com suas regiões promotoras pHPL e pENTCUP2 e b- pORE T1 modificado, usado como controle positivo, com as regiões promotoras originais substituídas pelo promotor da ubiquitina de milho, usando os sítios enzimáticos em destaque. RB (borda direita) e LB (borda esquerda).

[20] Figura 3. Construções no vetor binário ZmUbi pORE T1. Cada terminador transcricional, destacados aqui em vermelho, foi clonado a jusante do gene repórter gusA, que codifica a enzima beta-glucuronidase (JEFFERSON; BURGESS; HIRSH, 1986) . Para o controle positivo, usamos a construção ZmUbi pORE T1 que já possuía o terminador NOS. Para o controle negativo, geramos uma construção sem terminador (ZmUbi-t0 pORE T1). RB e LB indicam as bordas direita e esquerda, respectivamente.

[21] Figura 4. Localização histoquímica da atividade de GUS caracterizada por pontos azuis em calos transformados por biobalística. Todos os terminadores testados foram capazes de regular a expressão gênica, comparável ao controle positivo. A construção sem terminador usada como controle negativo (ZmUbi-t0 pORE T1) não apresentou expressão.

[22] Figura 5. Ensaio de quantificação de GUS. Análise fluorimétrica da atividade de GUS a partir de calos transformados com as construções dos terminadores de cana-de-açúcar (tScDHN, tScLNC, tScPRP, tScTIP, tScUBI) e terminador NOS (usada para fins de comparação dos níveis de expressão de GUS). A relação GUS/LUC representa a atividade relativa de GUS sobre o controle interno LUC (luciferase). Os dados são apresentados como média + desvio padrão a partir de triplicatas biológicas de cada construção. Asteriscos representam o teste de t Student entre os pares (P<0,05).

[23] Figura 6. Ensaio da quantificação de GUS, em que é a) Análise fluorimétrica da atividade de GUS a partir de calos transformados com as construções dos terminadores de cana-de-açúcar (tScDHN, tScLNC, tScPRP, tScTIP, tScUBI) e terminador NOS e uma construção sem terminador (usadas para fins de comparação dos níveis de expressão de GUS) e b) Calos transformados com a mesma construção pZmUbi-GUS-tScTIP2-3 + pPZP 221-LUC, mas incubados em meios de cultivos com diferentes concentrações de sais. A relação GUS/LUC representa a atividade relativa de GUS sobre o controle interno LUC (luciferase). Os dados são apresentados como a média + desvio padrão a partir de triplicatas biológicas de cada construção. Asteriscos representam o teste de t Student entre os pares (P<0,05). mo (meio osmótico).

Descrição detalhada da invenção:

[24] A presente invenção refere-se ao construto de DNA recombinante que atua como terminador da transcrição gênica em uma célula vegetal, mais particularmente um construto de DNA recombinante compreendendo pelo menos uma das sequências terminadoras SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5 identificadas em cana-de-açúcar.

[25] Mais especificamente, ditas sequências terminadoras da presente invenção são capazes de modular a transcrição gênica em plantas em resposta ao déficit hídrico.

[26] As referidas sequências terminadoras são provenientes do genoma da cana-de-açúcar, sendo quatro genes com expressão induzida por déficit hídrico (ScDHN, ScLNC, ScPRP, ScTIP2-3) e um constitutivo (ScUbi). Os fragmentos genômicos isolados, nominados como tScDHN, tScLNC, ScPRP, tScTIP2-3 e tScUbi, apresentam 483, 447, 500, 510 e 440 pares de bases (pb), respectivamente. Plasmídeos contendo os terminadores clonados à 3' da região codificante do gene gusA, sob controle do promotor da ubiquitina de milho (ZmUbi) foram utilizados para transformação de calos de cana-de-açúcar. A presença de atividade enzimática da proteína GUS nos calos transformados validou os fragmentos terminadores como sequências ativas e funcionais, confirmando seu uso na expressão de genes de interesse em plantas geneticamente modificadas. Ditas sequências terminadoras estão operacionalmente ligadas a um promotor e a uma sequência polinucleotídica codificante de um RNA. Na presente invenção o promotor selecionado foi o promotor do gene Ubil da ubiquitina de milho (CHRISTENSEN; SHARROCK; QUAIL, 1992), embora outros promotores ativos em células vegetais possam ser utilizados.

[27] Como usado aqui, o termo "operacionalmente ligado" significa que as sequências tendo atividade terminadora da presente invenção estão uma relação funcional com outro componente nucleotídeo da molécula de ácido nucleico. Por exemplo, uma sequência terminadora está operacionalmente ligada a uma sequência codificante se ela afeta a transcrição da sequência codificante.

[28] Ainda, a presente invenção provê um cassete de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos compreendendo pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma sequência com pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas na SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5, em que a sequência de nucleotídeos atua como terminador da transcrição gênica em uma planta e que está operacionalmente ligada a um promotor e a uma sequência polinucleotídica codificante.

[29] Para melhor detalhamento da presente invenção, são apresentadas suas etapas experimentais.

- Seleção de genes induzidos por déficit hídrico em cana-de-açúcar:

[30] Foi realizado um experimento em casa de vegetação o qual foi identificado um conjunto de genes diferencialmente expressos na condição de estresse hídrico em raízes de cana-de-açúcar. Cultivares contrastantes para tolerância à seca, RB92579 (mais tolerante) e RB72454 (menos tolerante), foram crescidos em potes contendo solo e substrato durante três meses (fase de perfilhamento) nessa casa de vegetação. Nesse momento, as plantas foram submetidas ao tratamento controle (irrigação contínua) e estresse hídrico (suspensão de rega). As raízes de quatro réplicas biológicas foram coletadas após dois e quatro dias em ambos tratamentos.

[31] Após extração do RNA total e síntese de cDNA, as amostras foram enviadas para sequenciamento em aparelho Illumina Hiseq2000. As sequências produzidas foram utilizadas para montagem de novo do transcriptoma.

[32] Considerando o grupo de genes diferencialmente expressos na condição de déficit hídrico em cana-de-açúcar, foram selecionados quatros genes com expressão induzida pelo déficit hídrico: o gene homólogo à Dehidrina 1 (ScDHN), Precursor Rico em Prolina (ScPRP), RNA longo não codificante (ScLNC), e Proteína Intrínseca ao Tonoplasto 2-3 (ScTIP2-3). A Tabela 1 apresenta os identificadores dos genes selecionados para clonagem das sequências terminadoras expressas da cana-de-açúcar identificadas no projeto SUCEST (Sugarcane Expressed Sequence Tags) (VETTORE et al., 2003).
Tabela 1. Genes induzidos por déficit hídrico selecionados para a clonagem das sequências terminadoras.

SUCEST ID: Identificador das sequências no projeto SUCEST; "No hit": gene sem similaridade com nenhuma sequência expressa do banco de dados SUCEST.

[33] Desta forma, as sequências terminadoras dos quatro genes selecionados foram submetidas à clonagem molecular para ensaios funcionais.

- Seleção do gene ubíquo e constitutivo em cana-de-açúcar ScUBI:

[34] Para avaliar se a região terminadora do gene da ubiquitina de cana poderia ser utilizada para fins biotecnológicos, foi realizada uma busca no banco de dados SUCEST, utilizando a região codificante do gene Ubi1 de milho como isca. A sequência SCRFLR2034G05.g apresentou alta identidade ao nível de DNA e foi selecionada para a clonagem da região terminadora.

- Isolamento e clonagem das sequências terminadoras:

[35] Folhas do cultivar SP80-3280 foram utilizadas para extração de DNA genômico (gDNA), conforme metodologia (SAGHAI-MAROOF, M. A.; SOLIMAN, K. M.; JORGENSEN, R. A.; ALLARD, 1984). As regiões terminadoras dos cinco genes selecionados da presente invenção foram identificadas no banco de dados genômicos disponível pelo Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Etanol (http//bce.bioetanol.cnpem.br/ctceblast/), através da ferramenta BlastN, empregando como iscas as sequências dos contigs geradas pelo RNAseq e/ou ESTs (Expressed Sequence Tags). A região codificante foi predita nos contigs genômicos de cana-de-açúcar tendo como referência o gene homólogo de maior similaridade em sorgo (Sorghum bicolor) e primers específicos desenhados flanqueando a região a jusante ao códon de término da tradução (Tabela 2) . Sequências terminadoras acima de 400 pb foram priorizadas.
Tabela 2. Primers usados para amplificação dos terminadores a partir de gDNA de cana-de-açúcar na orientação 5'- 3

O isolamento das sequências terminadoras foi realizado por meio de PCR (Polymerase Chain Reaction) em termociclador Life Eco TC-96 (BIOER), tendo como molde o gDNA do cultivar de cana-de-açúcar SP80-3280. Usamos a enzima Kapa Taq DNA Polymerase (Kapa Taq PCR Kit - kapa Biosystems), que deixa resíduos de deoxiadenosina nas extremidades 3' do produto de PCR, ideal para clonagens do tipo TA cloning. Cada reação foi composta pelas seguintes concentrações finais: 1x KAPA Taq Buffer A, 15 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,4 μΜ Primer Forward, 0,4 μΜ Primer Reverse, 1U KAPA Taq DNA Polymerase e 10 ng de gDNA de cana. A ciclagem da PCR usada foi baseada nas recomendações do fabricante (KAPA BIOSYSTEMS, EUA), (Tabela 3).
Tabela 3. Descrição da ciclagem da PCR usada em cada amplificação

Aqui é apresentada apenas uma média da Tm. ή exata Tm. de cada par de prime está descrita r.a Tabela 2.

[36] Todas as reações de PCR foram analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose quanto a especificidade na amplificação e purificadas usando o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, EUA). Cada sequência terminadora foi clonada usando T4 DNA Ligase (New England Biolabs, EUA) (Figura 1) em vetores pTZ57R/T (Thermo Scientific™ InsTAclone™, EUA) que conta com um sistema TA cloning.

[37] Cepas de E. coli DH5a termo-competentes foram usadas nas transformações por choque térmico, a 37°C. As células foram plaqueadas em meio LB sólido contendo o antibiótico de seleção ampicilina e colocadas em estufa à 37°C durante a noite. As colônias obtidas foram cultivadas em meio LB líquido contendo ampicilina à 37°C durante a noite e em seguida foi realizada a extração DNA plasmidial para confirmar a presença do inserto por digestão com enzimas de restrição. Posteriormente foi realizado o sequenciamento para confirmar a identidade das sequências terminadoras inseridas no pTZ57R/T. As sequências utilizadas na presente invenção estão descritas na "Listagem de sequências".

[38] Sublinhado e negrito estão os possíveis sinais de poliadenilação presentes nas sequências terminadoras apontados pelo algoritmo POLYAH, que usa elementos cis identificados em precursores de mRNA de humanos para predizer sítios de poliadenilação (NEUEDER et al., 2018; SOLOVYEV, 1997), disponível em (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=polyah&group=p rograms&subgroup=promoter) . Em fundo escuro estão os sítios de clivagem e poliadenilação, baseado no EST dos terminadores tScDHN, tScLNC, tScTIP2-3 e tScUBI disponíveis no banco de dados da SUCEST. Para o terminador SctPRP usamos o EST encontrado a partir do sequenciamento da amostra de cDNA do gene.

- Construção de vetores para transformação transiente em cana-de-açúcar: Subclonagem no vetor ZmUbi pORE T1:

[39] Para avaliar a funcionalidade das regiões terminadoras foi construído o vetor ZmUbi pORE T1, que é um derivado do vetor pORE T1 (COUTU et al., 2007). O vetor pORE T1 possui dois cassetes de expressão: um cassete repórter, contendo o gene gusA (β-glucuronidase) ativado pelo promotor pHPL (Hydroperoxide Lyase promoter) e outro de seleção, contendo nptII (Neomycin phosphotransferase II) ativado pelo promotor pENTCUP2 (Tobacco Cryptic constituve promoter), ambos regulados pelo terminador NOS de Agrobacterium tumefaciens, conforme apresentado a seguir (Figura 2a). De modo a atender as necessidades da presente invenção, pORE T1 sofreu algumas modificações. Foram realizadas alterações nos cassetes de expressão, substituindo o promotor pHPL do cassete repórter e o promotor do pENTCUP2 do cassete de seleção, pelo promotor pUBI da ubiquitina de milho (ZmUbi) (CHRISTENSEN; SHARROCK; QUAIL, 1992), sendo esta construção usada como controle positivo dos experimentos (Figura 2b).

[40] Para a transferência das regiões terminadoras de SEQ ID NO. 1 a 5, clonadas no vetor pTZ57R/T, os respectivos vetores foram individualmente digeridos com as enzimas de restrição indicadas na
Tabela 4. As digestões foram aplicadas e corridas Tabela 4. Enzimas usadas para excisar os terminadores do vetor pTZ57R/T e subclonar no vetor ZmUbi pORE TI.

em gel de eletroforese 1% para separar cada inserto do vetor pTZ57R/T linearizado. As bandas referentes aos terminadores foram purificadas usando o QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN, EUA).

[41] Para a sub-clonagem dos terminadores no vetor ZmUbi pORE T1 foram feitas digestões deste vetor de forma a excisar o terminador NOS, conforme enzimas descritas na Tabela 4. As digestões foram aplicadas e corridas em gel de eletroforese 1% para separar o vetor ZmUbi pORE T1 do terminador NOS. A banda referente ao ZmUbi pORE T1 sem o terminador NOS foi purificada usando o QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN, EUA). Uma reação de ligação foi montada para cada terminador, contendo aproximadamente 20 ng do terminador e 100 ng do vetor ZmUbi pORE T1 linearizado sem o terminador NOS, 3 unidades de T4 DNA Ligase (New England Biolabs, EUA) e 1x T4 DNA ligase Buffer. A reação foi incubada a 16°C por uma noite. Cepas de E. coli DH5a termo-competentes foram usadas nas transformações por choque térmico, à 37°C. As células foram plaqueadas em meio LB sólido contendo o antibiótico de seleção canamicina e colocadas em estufa, à 37°C, durante a noite. As colônias obtidas foram cultivadas em meio LB líquido contendo canamicina, à 37°C durante a noite e depois feita a extração DNA plasmidial para confirmar a inserção de cada terminador. Posteriormente foi realizado o sequenciamento para confirmar a identidade das sequências.

[42] Uma construção sem terminador foi gerada para ser usada como controle negativo (Figura 3). Para isso, excisamos o terminador NOS do ZmUbi pORE T1 usando as enzimas EcoRV e AsisI, aplicamos no gel de eletroforese 1% e purificamos a banda referente ao vetor usando o QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN, EUA). Em seguida fizemos uma reação com T4 DNA Polimerase (New England Biolabs, EUA) para produzir extremidades abruptas no vetor ZmUbi pORE T1 e então ligamos suas extremidades usando T4 DNA Ligase (New England Biolabs, EUA). Transformamos, cultivamos e extraímos DNA plasmidial usando as mesmas metodologias e materiais acima descritos.

- Validação das sequências de DNA como regiões terminadoras: Biobalística:

[43] Para validação das regiões terminadoras, foram realizadas transformações transientes em calos de cana-de-açúcar usando a técnica de biobalística. Para isso, colônias E. coli DH5a permanentes positivas de cada uma das construções foram cultivadas em 100 mL de meio LB durante a noite para as extrações plasmidiais usando o GenElute™ HP Plasmid Midiprep Kit (SIGMA, EUA). A concentração de cada amostra plasmidial verificada por eletroforese em gel de agarose e quantificada em Nanodrop (Thermofisher, EUA). Em um microtubo de 1,5 mL, 60 mg de micropartículas de tungstênio foram esterilizadas em etanol absoluto e ressuspendidas em glicerol 50%. Alíquotas de 38 pL dessa ressuspensão foram transferidas para microtubos de 2 mL contendo 5 pL de DNA plasmidial (1 pg/pL), 125 pL de CaCl2 2,5 M e 25 pL de espermidina 0,1 M, com o volume final de 300 pL completado com água destilada. A mistura foi agitada em vórtex e o DNA plasmidial adsorvido ao microparticulado de tungstênio foi precipitado em gelo por 15 minutos. Em seguida o sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 500 pL etanol absoluto duas vezes. O precipitado foi então ressuspendido em 50 pL de etanol absoluto. Alíquotas de 10 pL foram distribuídas em discos macrocarrier e posicionadas no aparelho, seguindo as recomendações do fabricante (Biomics, Brasil). Calos de cana-de-açúcar ficaram expostos ao meio osmótico, composto por sais MS (Murashige e Skoog, 1962), sacarose 2%, sorbitol 72,88 g/L, manitol 72,88 g/L, ágar 6 g/L, pH 5,8 por pelo menos 4 horas antes de serem bombardeados. Em placas de Petri, os calos foram posicionados a 9 cm de distância do canhão, e os disparos realizados a 1.200 PSI de pressão sobre 620 mmHg de vácuo em um acelerador de partículas a Hélio (Biomics, Brasil).

Ensaio histoquímico de GUS:

[44] Para este ensaio, os calos transformados ainda em meio osmótico foram transferidos para meio de cultivo EM3, composto por sais MS (Murashige e Skoog, 1962), 2% sacarose, 3 mg/L 2,4-D, 0,5 g caseína e 0,22% gelrite, pH 6,0 e incubados a 2 8°C por 24 h na ausência de luz (JEFFERSON; KAVANAGH; BEVAN, 1987). Em seguida os calos foram transferidos para meio X-GLUC (NaH2PO4 a 0,1 M, pH 8; EDTA 10 mM; TRITON X-100 a 0,1%; K3Fe(CN)6 a 5mM; K4Fe(CN)6.3H2O a 5 mM; X-Gluc 1 mM) e incubados à 37°C por 48h na ausência de luz. Após isso, os pontos azuis que os calos apresentam, característico da expressão de GUS (JEFFERSON; KAVANAGH; BEVAN, 1987)) foram analisados nos calos transformados em um microscópio estéreo modular MZ10F (Leica. Alemanha) e registrados com uma câmera DFC300 FX (Leica, Alemanha) (Figura 4). Todos os terminadores foram capazes de ativar a expressão da ^-glucuronidase e os calos transformados com a construção sem terminador não apresentaram expressão.

Ensaio Fluorescente de MUG:

[45] O ensaio fluorescente de MUG é um método de avaliação quantitativa o qual permite quantificar a atividade da enzima GUS através da medição da fluorescência emitida pela molécula 4-metilumbeliferona (4-MU), produto resultante da hidrólise do substrato 4-metilumbeliferil^-D-glicuronídeo (4-MUG) pela enzima GUS (LANA; NEGRI; SOUSA, 2017) . A molécula 4-MU é um fluoróforo que emite luz em um comprimento de onda de 455nm quando excitada por uma fonte de luz de 365nm. Sua fluorescência é dependente de pH alto, tendo um pico máximo de fluorescência em pH 10 (LANA; NEGRI; SOUSA, 2017) .

[46] Para o ensaio, calos embriogênicos de cana-de-açúcar foram co-transformados com a construção pPZP 221-LUC, DNA plasmidial carregando o gene da luciferase de Renilla reniformis, o qual foi usado como controle interno do ensaio fluorescente de MUG. Para isso, foi acrescentado em todas as amostras, inclusive no controle positivo e negativo, 5 μg de DNA plasmidial pPZP 221-LUC. A co-transformação transiente de cada construção foi feita em triplicata biológica. Para verificar se os terminadores conferem maiores níveis de expressão gênica em condições de estresse abiótico, uma vez que todos os cinco terminadores foram isolados de genes induzidos por déficit hídrico, uma triplicata biológica de calos co-transformados (ZmUbi-GUS-tScTIP2-3 + pPZP 221-LUC) foi incubada a 28°C no escuro por 24h em meio osmótico e outra triplicata da mesma construção, sob as mesmas condições, incubada em meio EM3. Depois de 24 h de incubação, os calos foram macerados em nitrogênio líquido com auxílio de almofariz e pistilo. Foram usados 500 mg de calos macerados para cada replicata biológica. Para a extração de proteínas foram usados 2 mL de tampão de extração (fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0; EDTA 10 mM, pH8; Triton X-100 a 0,1%; β-mercaptoetanol 10 mM), seguido por agitação em vórtex e centrifugação a 14.000 rpm por 10 minutos, e o sobrenadante transferido para um microtubo limpo.

[47] A quantificação de proteínas totais foi realizada usando PierceTM BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Para quantificação da atividade de GUS foram usadas 4-metilumbeliferil-β-D-glicuronídeo (4-MUG) e 4-metilumbeliferona (4-MU) da Sigma-Aldrich (SIGMA, EUA), com metodologia adaptada a partir de Lana et al. (2017). Para bloquear a atividade de enzimas endógenas nos calos de cana que possuem capacidade de clivar 4-MUG em 4-MU, foi usado metanol a uma concentração final de 20% durante a quantificação de GUS. As quantificações foram preparadas em microplaca Corning® 96-well Solid Black (CORNING, EUA). As leituras foram realizadas a 365 nm de excitação e 455 nm de emissão em um espectrofotômetro SpectraMax M3 Multi-Mode Microplate Reader (MOLECULAR DEVICES, EUA).

[48] Todos os calos transformados com as construções de terminadores de cana-de-açúcar (SEQ ID NO: 1-5) apresentaram níveis mais altos de atividade de GUS do que o controle positivo contendo a construção com tNOS, (Figura 5), sugerindo que os terminadores de cana-de-açúcar possuem um potencial maior do que tNOS em regular a expressão gênica. As construções dos terminadores tScDHN, tScLNC, tScPRP, tScTIP2-3 e tScUBI apresentaram, respectivamente, 2,2; 3; 5; 4,7 e 2,5 vezes mais atividade de GUS comparado ao tNOS.

[49] O efeito do estresse por déficit hídrico foi avaliado para a construção contendo o terminador tScTIP2-3, comparando a atividade GUS em calos mantidos em meio osmótico e calos mantidos em meio EM3. Nesse ensaio, os calos mantidos em meio osmótico por 4 horas, bombardeados e então metade dos calos selecionados aleatoriamente foram transferidos para meio EM3 (sem estresse hídrico) e metade para nova placa contendo meio osmótico (com estresse).

[50] Os ensaios fluorimétricos a partir de calos expostos a estresse hídrico (ZmUbi-GUS-tScTIP2-3(mo) na Figura 6A) registraram níveis de atividade de GUS superiores a todas as outras construções mantidas em meio EM3(Figura 6a) . Comparativamente com a mesma construção, mantida em meio EM3, a atividade GUS e meio osmótico foi cerca de 2,3 vezes maior (Figura 6b). Provavelmente os outros terminadores, tScDHN, tScLNC e ScPRP, também tenham uma resposta semelhante a esse tipo estresse, uma vez que todos os quatro terminadores foram isolados de genes induzidos por déficit hídrico.

[51] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

Claims (11)

1. Construto de DNA recombinante, caracterizado por compreender:

   • (a) uma sequência de nucleotídeos compreendendo pelo menos uma das sequências SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5; ou
   • (b) uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma sequência com pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas na SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5,

   
   em que a sequência de nucleotídeos atua como terminador da transcrição gênica em uma planta.
2. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por estar operacionalmente ligado a um promotor e a uma sequência polinucleotídica codificante de um RNA.
3. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo promotor ser o promotor Ubi de milho.
4. Construto de DNA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela sequência polinucleotídica codificante de um RNA ser a do gene gusA.
5. Cassete de expressão, caracterizado por compreender o construto de DNA conforme definido nas reivindicações 1 a 4.
6. Uso do construto de DNA, conforme definido nas reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser na modulação da expressão gênica em plantas.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela modulação genética ser realizada em células, tecidos ou órgãos.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela planta ser cana-de-açúcar.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela cana-de-açúcar ser cisgência ou transgênica.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela cana-de-açúcar cisgênica ser tolerante a estresse abiótico, preferivelmente, seca.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela cana-de-açúcar transgênica regular a expressão de genes heterólogos.

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