PT87419B - Processo para a preparacao de novos peptideos alquilados de libertacao da hormona de crescimento e metodo para tratamento de mamiferos usando-os - Google Patents
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Description
Durante a última década os factores de libertação da hormona de crescimento (GRF) com origem nos tumores de ilhéus pancreáticos humanos (hpGRF) foram isolados, caracterizados e demonstrado possuirem actividade de libertação da hormona de crescimento (GH) na pituitária ante- 1 rior de rato in vitro por (1) R. Guillemin, P. Grazeau, P. Bohlen, F. Esch, N. Ling, e W.B. Wehrenberg /~Science, 218, 585 (1982 ) 7 e (2) J. Spiess, J. Rivier, M. Thorner e
W. Vale /Biochemistry, 21, 6037 (1982)_7· Um hp-GRF(1-29)-NH2 sintético, um gragmento amidado do hpGRF natural, também foi preparado e relatado possuir actividade biológica total intrínseca por Spiess et al. da referência (2).
Em adição, encontrou-se que um aumento na libertação da hormona de crescimento (GH) em mamíferos pode ser conseguido substituindo L-aminoácidos por D-aminoáci- ) dos do hpGRF natural, especialmente nas posições 2 e 3, (Lantz et al., Biochemical and Biophysical Researchs Communications, Vol. 119, N2 1, 1984, pág. 265-272; Vale, Jr. et al., Patente U.S. N° 4.528.190). Igualmente, Vale, Jr et al., divulgaram na patente atrás referida que um aumento na libertação de GH obtem-se inserido um aminoácido N -metilo ou C0^ -metilo-substituido nas posições 1 e 2 de hpGRF. Estes investigadores, no entanto, nem estenderam o comprimento do grupo alguilo além de metilo no extremo N dos peptídeos hpGRF, nem sugeriram que tal extensão pudesse aumentar a actividade dos peptídeos hpGRF.
Sumário do Invento
Este invento relaciona-se com novos peptídeos de libertação da hormona de crescimento e sua utilização para estimular a libertação e aumentar os níveis de hormona de crescimento em mamíferos.
Inesperadamente, descobrimos agora que prolongando o substituinte alquilo no extremo N e concomitante alquilação dos aminoácidos básicos dentro da cadeia peptídica, tais como lisina nas posições 12 e 21, resulta num aumento substâncial em potência na indução da libertação de GM relativamente ao estimulado pelo hpGRF (1-29natural, hpGRF (1-44)NH2 ou /Μ *-Me-Tir1 7hpGRF(1-29)-NH2.
presente invento proporciona assim novos peptídeos mono e per-alquilados, que são originados por alquilações redutoras dos peptídeos de libertação de GH através do uso de cianoboro-hidreto de sódio e aldeídos ou cetonas. Estes peptídeos do presente invento são extremamente potentes na estimulação de libertação da GH em animais de sangue quente, incluindo humanos. Os novos peptídeos estão definidos nas fórmulas I e II, como se segue:
Fórmula I
10 R^-A-B-Ala-Ile-Fen-Tre-R2-Ser-E-Arg-R-R^-Leu-Rg-Gln20 25 29
Leu-Rg-Ala-Arg-R-Leu-Leu-Rg-Ry-Ile-I-Rg-Arg-J
Formula II
10 R^-A-B-Ala-Ile-Fen-Tre-R2-Ser-E-Arg-R-R^-Leu-R2-Gln2030
Leu-Rj. -Ala-R-R-Leu-Leu-Rc -R-,-Ile-I-Ro-R-Gln-Gln-Gli-
6 78
4044
Glu-R9-Asn-Gln-Glu-R^0-R11~R12-R12-R^^-R^3-R^g-Rj^;
onde
Rx é N
N
-Rlg-Tir, N^R-j^g-His, N^-R-^-Fen, N^-R18-Tir,
-Rlg-D-his ou N -R^g-D-Fen;
Ala, D-Ala ou N-Me-D-Ala;
B é Asp, D-Asp;
R2 é Asn, D-Asn ou Ser;
E é Tir, D-Tir;
R é Lis ou N -R^g-Lis;
Ile ou Vai;
Gli,
Asn, Leu
Ser R4 R3 ou
His
Gin ou ou
-aminoisobutírico, -aminobutírico, Ala, Gin, , Ile ou Vai;
Tir;
Gin;
Asp;
Leu, Nle, Ile, Vai, nor Vai, Ser, Tre, Asn ou Gin; ou COOH;
R5 R6 R7
I é Met,
J é NH2
Rg é Ser ou Asn;
Rg é Ser ou Arg;
| R10 | é | Arg | ou | Gin; |
| R11 | z e | Arg | ou | Gli; |
| R12 | z e | Ala | ou | Ser; |
| «13 | z e | Arg | ou | N ε- |
| R14 | z e | Fen, | Vai ou | |
| *15 | z e | Asn | ou | Arg; |
| *16 | z e | OH, | nh2 | , OR |
OH,
R-Lis;
Ala;
z e z
e R17 R18
Leu;
nenhum substituinte;
ou ramificado). Cicloalquilo naftilo, metilnaftilo ou benzilo monoé com halogénio, mede quando o peptídeo pode ser apenas OH, o aminoácido do exé um OH ácido; e os
Gli ou 0R18 ' NH2 alquilo C^-Cg benzilo, em que a substituição ciano; com a condição rato, R^g é Asn e R^g Gli; e quando Gli fôr tremo carboxilo, o grupo funcional sais farmacêuticamente aceitáveis.
Os peptídeos GRF preferidos do invento incluem:
C3-C6' -substituído toxinitro fôr o GRF nh2, or18
Gli ou (linear ou de ou
/ N ^-Etil-Tir1, Nle27_7GRF(l-29)ΝΗ2 que é
10 (N°< -Etil )Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir-Arg20
Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu-Gln
Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2, /-N -Isopropil-Tir\ Nle27 7GRF(l-29)NH2 que é * 10 (N -Isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20
Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu
Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2;
/~N-Isopropil-Tir^_7GRF(1-29)NH2 que é
10 (N ^-Isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20
Arg-Lis-Val-Leu-Gil-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu29
Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;
/_N K-Isopropil-Tir\ D-Ala2 7GRF(1-29)NH2 que é (N X-Isopropil)Tir-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser10 20
Tir-Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu20
Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;
-Ί/-Ν -Ciclo-hexil-Tir1 7GRF(1-29)ΝΗ2 que é (Ν -Ciclo-hexil )-Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser10 20
Tir-Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu29
Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;
/ N-Benzil-Tir^_7GRF(1-29)NH2 que é
10 (-Benzil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20
Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu29
Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;
/~N-Nonil-Tir^_7GRF(1-29)NH2 que é
10 (N -Nonil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Asn-Ser-Tir-Arg20
Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu-Gln29
Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;
/ N-Isopropil-Tir1, N -isopropil-Lis12'21_7GRF(1-29) NH2 que é d
(Na -isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser10f
Tri-Arg-(N v -isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala20 ,29
Arg-(N -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-ArgNH2;
/ N ^-Isopropil-Tir* 1, Ν fe-isopropÍl-Lis12'21_7GRF(1-29)0H que é
10 (N ^-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20 Arg-(N ^-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg29 (N -isopropil)Lis-Leu-Leu_Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-OH;
/~N *-pentil-Tir^ 7GRF(1-29)NH2 que é
10 (N -pentil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20 Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-LeuGln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2; e /N^-Isopropil-Tir1, N ^-isopropil-Lis12'21_7GRF(1-29) que é
10
N -Isopropil-Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20 Arg-(N ^-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(N -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-OH;
Outros peptídeos de libertação da hormona de crescimento do presente invento incluem os peptídeos per-alquilados, particularmente os per-isopropilados, para humanos, porcos, gado vacum, cabras, carneiros e ratos. Estes peptídeos podem ser caracterizados como se segue:
HUMANO
Ί Ο Ο *1 /-N-isopropil-Tir; Ν ^-isopropil-Lis- ' _7GRF(1-44)ΝΗ2 que é
10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20
Arg-(N t -isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Argf 30 * (N -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln40
Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gli-Ala-Arg-Val-Arg44
Leu-NH2;
SUINO /“N-isopropil-Tir1, N-isopropil-Lis-^ ' 21 7GRF(1-42)NH2 que é
10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20
Arg-(N Õ-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg, 30 (N •'-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln40 42
Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Gli-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-NH2;
BOVINO /~N-isopropil-Tir^, N ^-isopropil-Lis^3''3^_7GRF(1-42)NH2 que é
10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20 Arg-(N ^-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg30 (N £-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-10-
έ 40
Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Gli-Ala-(N -isopropil)Lis-Val42
Arg-Leu-NH2;
CAPRINO /“N-isopropil-Tir1, NÓ -isopropil-Lis12'21'41_7GRF(1-44)NH2 que é
10 (N-isopropil-Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20
Arg-(N t-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg30 (N €-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln40 Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gli-Ala-(N ^-isopropil)
Lis-Val-Arg-Leu-NH2;
OVINO /-N-isopropil-Tir, NÓ -isopropil-Lis·1·2 ’21'41_7GRF (1-44 ) NH2 que é
10 (N-isopropil-Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20
Arg-(N €-isopropil)Lis-Ile-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg30 (N €-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln40
Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Ala-(N ‘C—isopropil)Lis- 43
Val-Arg-Leu-NH2;
RATO /!isopropil-His, N t-isopropil-Lisz _7GRF(l-43)OH que é
10 (N-isopropil-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Ser-Ser-Tir20
Arg-Arg-Ile-Leu-Gli-Gln-Leu-Tir-Ala-Arg-(N ^-isopropil)
Lis-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gli-Glu40 43
Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Fen-Asn-OH;
BOVINO /N-isopropil-Tre-, N ^-isopropil Lis1^'2^_7GRF(1-29)NH2 que é
10 (N-isopropil)Tre-Ala-Asp-Ala-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20
Arg-(N 6-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg25 28 (N -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-NH2;
OVINO / N-isopropil-Tir, N ^-isopropil-Lis^2'2^ 7GRF(1-29)NH2 que é
10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir, 20
Arg-(N &-isopropil)Lis-Ile-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg29 (N-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH2;
RATO — 21 /~N-isopropil-his, N-isopropil-Lis _7GRF(1-29)NH2 que é
10 (N-isopropil)His-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Ser-Ser-Tir20 Arg-Arg-Ile-Leu-Gli-Gln-Leu-Tir-Ala-Arg-(N-isopropil)29
Lis-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2; e
CAPRINO /-N-isopropil-Tir^, N -isopropil-Lis^^'^^_7grF(1-30)OH que é
10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20
Arg-(N ^-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg29 (N έ-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gli-OH;
Mantendo a nomenclatura convencional, as abreviaturas usadas atrás para os resíduos deaminoácidos quirálicos e usadas ao longo da presente especificação e reivindicações são como se segue:
Código para L- e D-aminoácido, segundo Commission on Biochemical Nomenclature da IUPAC-IUB: Biochemistry 11, 1726-1732 (1972)
His= Histidina
Ser= Serina
Asp= Acido aspártico
Ala= Alanina
Tir=Tirosina
Arg=Arginina
Leu= Leucina
Lis= Lisina
Nle= Norleucina
Val= Valina
Fen= Fenilalanina
Tre= Treonina
Asn= Asperagina
Glu= Glutamina
Met= Metionina
Ile=Isoleucina
Glu=Acido glutâmico
NorVal=nor Valina
D-Ala=D-Alanina
D-Asp= Acido D-aspártico
D-Ser=D-Serina
D-Tir=D-Tirosina
D-His=D-Histidina
D-Fen=D-Fenilalanina
N-Me-D-Ala= N-metil-D-alanina
D-Asn= D-Asparagina
Em adição, deve-se notar que a menos que de outro modo seja especifiçado, os resíduos de aminoácidos que aqui são designados sem o prefixo L referem-se de facto, à configuração absoluta natural L.
Outras abreviaturas usadas na presente especificação são:
Fmoc = fluorenilmetiloxicarbonilo
Boc = t-butiloxicarbonilo
Tos = jo-toluenossulf onilo hplc = cromatografia líquida de alta resolução tlc = cromatografia em camada fina
TFA = ácido trifluoroacêtico
Ac = acetilo
Z = benziloxicarbonilo
O termo sais farmacêuticamente aceitáveis conforme aqui usados, refere-se a sais não tóxicos de metais alcalinos, metais alcalinos terrosos, amónio, organoamónio e metálicos vulgarmente usados na indústria farmacêutica. Estes sais incluem, mas não estão limitados a sais de sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, zinco, amónia e trimetilamónio que são preparados por métodos conhecidos. 0 termo também inclui sais de adição ácida não tóxicos, tais como hidrocloreto, hidrobromato, acetato, fosfato, sulfato, citrato, laurato, estearato, palmoato e oleato, mas não lhes estão limitados. Estes sais de adição de ácidos também são prepara-14-
dos por métodos bem conhecidos.
Ainda, o termo organoamónio é definido como um grupo constituindo um átomo de azoto carregado positivamente ligado a grupos alifáticos, entre um e quatro, cada um contendo entre um e 20 átomos de carbono. Entre os grupos amónio orgânicos gue são ilustrativos para a preparação dos sais de amónio alifáticos deste invento encontram-se: monoalquilamónio, dialquilamónio, trialquilamónio, tetra-alquilamónio, monoalcenilamónio, dialceniloamónio, trialcenilamónio; monoalquinilamónio, dialquinilamónio, trialcanolamónio, cicloalquilamónio Cg-Cg, piperidinio, morfolínio, pirrolidínio, benzilamónio e seus equivalentes.
A síntese em fase sólida dos peptídeos da Fórmula (I) e da Fórmula (II) do presente invento acima descritos pode ser efectuada num sintetizador de peptídeos automático Beckman 990. A HPLC preparativa pode ser efectuada numa coluna de vidro de parede espessa (2,5x45 cm) contendo fase reversa Whatman LRP-1 (Ο^θ sílica 13-22 pm) bombeada com uma bomba da Fliud Metering Company e amulador de pulsações. As análises de aminoácidos podem ser feitas num analisador Beckman 119-CL e processados com um integrador de computação System AA.
Os derivados de aminoácidos usados na preparação dos compostos do presente invento podem ser adquiridos em várias casas fornecedoras de produtos químicos: Bachem, Inc., Torrance, Califórnia e Chemical Dyanamics, Inc., Plainfield, New Jersey.
Os peptídeos tendo a configuração da fórmula (Dou da fórmula (II) podem ser convenientemente preparados por técnicas de fase sólida convencionais; por exemplo, o aminoácido protegido C-terminal pode ser ligado a uma resina de clorometilo, uma resina de hidroximetilo, uma resina de benzidrilamina (BHA) ou uma resina p-metilbenzilidrila-15-
mina (p-Me-BHA). Uma destas resinas clorometiladas é vendida com a marca registada Bio-Beads SX-1 por Bio. Rad Laboratories, Richmond, Califórnia. A preparação da resina hidroximetilada está descrita por Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597 (1966 ). A resina BHA foi descrita por Pietta e Marshall, Chem. Commun. 650 (1970) e adquirida comercialmente à Bachem, Inc., Torrance, Califórnia.
De acordo com uma execução do invento os peptídeos das Fórmulas (I) e (II), são preparados por meio de síntese de peptídeos em fase sólida através de processos convencionais, se bem que possam também ser preparados por tratamento do peptídeo resina com amónia para dar a amida pretendida de cadeia lateral protegida ou com uma alquilamina para dar uma alquilamida ou dialquilamida de cadeia lateral protegida.
O grupo protector de c\z -amino é Fmoc para o aminoácido na posição um e o grupo protector de cadeia lateral é Boc em vez de Z para o aminoácido precedente adequado, quando fôr usada a resina clorometilada ou hidroximetilada.
A protecção de cadeias laterais pode então ser removida como é habitual por tratamento com HF para dar as amidas, alquilamidos ou dialquilamidas de peptídeos livres.
Na preparação dos ésteres deste invento podem ser empregues as resinas usadas para preparar os áci dos das Fórmulas (I) e (II) (onde J é COOH ou R^g ou R^^ é OH) e o peptídeo de cadeias laterais protegidas podem ser clivadas com uma base e álcool adequado, i.e. metanol. Os gru pos protectores das cadeias laterais podem então ser removi dos como habitualmente por tratamento com HF para se obter o éster pretendido. A alquilação no extremo N e concomitante alquilação dos aminoácidos básicos com a cadeia peptídica, como
seja lisina nas posições 12,21 e 41, podem ser conseguidas por remoção dos grupos protectores BOC do extremo N e os aminoácidos básicos com a resina, sujeitando a resina peptídica assim preparada a uma redução com um cianoboro-hidreto de metal alcalino na presença de DMF e ácido acético e alquilação da resina assim preparada com o aldeído ou cetona adequado para dar a resina GRF alquilada pretendida que pode então ser clivada com HF para dar a amina GRF alquilada.
Diagrama de fluxo I
Preparação de / N °Í-Etil-Tir\ Nle^^ 7GRF(1-29 )NH2
Resina Me-BHA + Boc-Arg(N -Tos) (ch3)2ch-n=c=n-ch(ch3)2 >
ch2ci2
Resina Boc-Arg(Tos-me-BHA)
| (a) | lavagem | com | ch2ci2 | |
| (b) | 33% TFA/CH2C12, duas vezes | |||
| (c) | lavagem | com | ch2ci2 | |
| (d) | lavagem | com | EtOH | > |
| (e) | lavagem | com | ch2ci2 | |
| (f) | Et3N/CHCl3, | duas vezes | ||
| (g) | lavagem | com | ch2ci2 |
Resina Boc-Arg(Tos)-me-BHA
| (1) (2) | Boc-Ser(0CH2), | A, | B | ||
| Boc-Nle, | A, | B | |||
| (3) | Boc-Ile, | A, | B | ||
| (4) | Boc-Asp(0CH2 | ), | A, | B | |
| (5) | Boc-Gln, | A, | B | ||
| (6) | Boc-Leu, | A, | B | ||
| (7) | Boc-Leu, | A, | B | ||
| (8) | Boc-Lis | (2-C10CH2 | OCO) , | ||
| (9) | Boc-Arg(Tos) | f | A, | B | |
| (10) | Boc-Ala, | A, | B | ||
| (11) | Boc-Ser(0CH2 | ), | A, | B | |
| (12) | Boc-Leu, | A, | B | ||
| (13) | Boc-Gln, | A, | B | ||
| (14) | Boc-Gli, | A, | B | ||
| (15) | Boc-Leu, | A, | B |
A, B
Diagrama de fluxo I (continuação)
| (16) | Boc-Val, A, B | ||
| (17) | Boc-Lis (2-C10 | ch2 | OCO ) , A, B |
| (18) | Boc-Arg(Tos), | A, | B |
| (19) | Boc-Tir(2-Br/C | h2o | CO), A, B |
| (20) | Boc-Ser(0CH2), | A, | B |
| lavagem com Me | OH, | ciclo B | |
| (21) | Boc-Asn, A, B | ||
| (22) | Boc-Tre(0CH2), | A, | B |
| (23) | Boc-Fen, A, B | ||
| (24) | Boc-Ile, A, B | ||
| (25) | Boc-Ala, A, B | ||
| (26) | Boc-Asp(0CH2), | A, | B |
| (27) | Boc-Ala, A, B | ||
| (28) | Boc-Tir, A, B |
v
- 1 2 7
Desbloquear a resina / Tir , Nle 7GRFÍ1-29) (1) DMF/HOAc (2) NaBH3CN (3) Alquilar com aldeído ou cetona x- 1
Resma / N -Etil-Tir ,
Nle
7GRF(1-29)metilbenzilidrazi laminà (a) HF, anisol (b) lavagem com Et2O (c) AcOH, cromatografia em coluna de Sephadex G-50 (d) Liofilizar (e) Cromatografia:silica com octadecilsilano, 15-20% CH3CN/H2O/0,1% TFA/80 psi (f) Liofilizar / N'^-Etil-Tir1, Nle27_7GRF(l-29 )NH2
Os peptídeos do presente invento são úteis para tratamentos de sintomas relacionados com deficiências em hormona de crescimento. Eles são úteis para aumentar o crescimento de lã, para aumentar a velocidade de crescimento de animais produtores de carne, para melhorar a qualidade da carcaça de animais produtores de carne (i.e., mais proteína e menos gordura), para aumentar a eficácia de alimentação em animais produtores de carne e em vacas leiteiras e para aumentar a produção de leite em explorações leiteiras.
Conforme indicado, os compostos do presente invento são eficazes para aumentar a libertação da hormona de crescimento em mamíferos, incluindo humanos. Na prática encontrou-se que os referidos compostos do invento são eficazes quando administrados a mamíferos numa quantidade suficiente para proporcionar aos referidos animais tratados 0,000001 a 0,1 mg/kg de peso de corpo de mamífero/dia dos compostos da fórmula I ou II do presente invento.
Para facilitar uma melhor compreensão do invento, são apresentados os exemplos que se seguem primáriamente com a finalidade de ilustrar certos detalhes mais específicos. O invento não deve ser considerado como limitado por eles excepto como definido nas reivindicações.
EXEMPLO 1
7
Resina Nle -GRF(11-29)-metilbenzidrilamina
A resina metilbenzidrilamina-polistireno (Vega Biochemicale, Inc.) (3,80 g, 2,0 mmoles) na forma de ião cloreto foi colocada no vaso de reacção de um sintetizador de peptídeos Beckman 990B programado para efectuar o seguinte ciclo de reacções: (a) cloreto de metileno; (b) 33% de ácido fluoroacético em cloreto de metileno (2 vezes durante 1 e 25 min cada); (c) cloreto de metileno; (d) etanol;
(e) cloreto de metileno; (f) 10% de trietilamina em clorofórmio .
A resina neutralizada foi agitada com Boc-N -tosil-Arg (6 mmoles) e diisopropilcarbodiimida (6 mmoles) em cloreto de metileno durante 1 hora e a resina com aminoácidos resultante foi então passada pelos passo (a) a (g) no programa de lavagem acima. Os aminoácidos que se seguem (6 mmoles) foram então acoplados sucessivamente pelo mesmo processo (Glu e Asn na presença de 1-hidroxibenzotriazol equimolar)):
Boc-O-benzil-Ser, Boc-Nle, Boc-Ile, Boc-benzil-Asp-Boc-Gln, Boc-Leu, Boc-Leu, Boc-N -2-clorobenzoxi-Lis, Boc-Tosil-Arg, Boc-Ala, Boc-benzil-Ser, Boc-Leu, Boc-Gln, Boc-Gli, Boc-Leu, Boc-Val, Boc-Cl-Z-Lis, Boc-tosil-Arg.
Após secagem a resina pesa 7,4.
EXEMPLO 2
Resina /~N-Etil-Tir^, Nle^ 7GRF(l-29)-metilbenzidrilamina
A resina descrita no Exemplo 1 (2,0 g,
0,5 mmoles) foi acoplada sucessivamente com Boc-2-Brz-Tir, Boc-benzil-Ser, Boc-Asn, Boc-O-benzil-Tre, Boc-Fen, Boc-Ile-Boc-Ala, Boc-benzil-Asp, Boc-Ala e Boc-Tir. O último grupo Boc foi então removido e a resina seca para dar 2,65 g de material.
A resina (1,32 g, 0,25 mmoles) foi suspensa em DMF/1% de ácido acético a que se adicionou NaBH^CN (3 mmoles) seguido de acetaldeído (1 ml). Após 1 hora, a resina estava completamente negativa para o teste da ninidrina de Kaiser.
EXEMPLO 3
- c/ 1 27
Resina / N '-isopropil-Tir , Nle /GRF(l-29)metilbenzidrilamina
A resina descrita no Exemplo 1 (2,0 g,
0,5 mmoles) foi acoplada sucessivamente com Boc-2-BrZ-Tir, Boc-benzil-Ser, Boc-Asn, Boc-O-benzil-Tre, Boc-Fen, Boc-Ile-Boc-Ala, Boc-benzil-Asp, Boc-Ala e Boc-Tir. Este último grupo Boc foi então removido e a resina seca para dar 2,65 g de material.
A resina (1,32 g, 0,25 mmoles) foi suspenso em DMF/1% de ácido acético ao qual se adicionou NaBHgCN (3 mmoles) seguido de acetona (1 ml). Após 1 hora, a resina estava completamente negativa para o teste da ninidrina de K aiser.
EXEMPLO 4
Resina GRF(3-29)-metilbenzidrilamina
A resina metilbenzidrilamino-polistireno (Vega Biochemicale, Inc. ) (5,80 g, 3,0 mmoles) na forma de ião cloreto foi colocada no vaso de reacção de um sintetizador de peptídeos Beckman 990B programdo para efectuar o seguinte ciclo de reacções: (a) cloreto de metileno; (b) 33% de ácido trifluoroacético em cloreto de metileno (2 vezes durante 1 min. e 25 min. cada); (c) cloreto de metileno; (d) etanol; (e) cloreto de metileno; (f) 10% de trietilamina em clorofórmio.
A resina neutralizada foi agitada com Boc-N -tosil-Arg (9 mmoles) e diisopropilcarbodiimida (9 mmoles) em cloreto de metileno durante 1 hora, e a resina com aminoácidos resultante foi então passada pelos passos (a) a (g) no programa de lavagem acima. Os aminoácidos que se seguem (9 mmoles) foram então acoplados sucessivamente pelo mesmo processo (Gin e Asn na presença de 1-hidroxibenzotriazol equimolar).
Boc-O-benzil-Ser, Boc-Met, Boc-Ile, Boc-benzil-Asp, Boc-Gln, θ
Boc-Leu, Boc-Leu, Boc-N -2-clorocarbenzoxi-Lis, Boc-tosil-Arg, Boc-Ala, Boc-benzil-Ser, Boc-Leu, Boc-Gln, Boc-Gli, Boc-Leu, Boc-Val, Boc-Cl-Z-Lis, Boc-tosil-Arg, Boc-2BrZ-Tir, Boc-benzil-Ser, Boc-Asn, Boc-O-benzil-Tre, Boc-Fen, Boc-Ile-Boc-Ala, Boc-benzil-Asp.
A resina seca pesava 16,5 g.
EXEMPLO 5 _ y 12
Resina / N -Isopropil-Tir , D-Ala _7GRF(1-29)-metilbenzidrilamina
A resina descrita no Exemplo 4 (1,5 g, 0,5 mmoles) foi acoplado sucessivamente com Boc-D-Ala e Boc-Tir. O último grupo Boc foi então removido e a resina suspensa em DMF/1% de ácido acético a quese adicionou NaBH^CN (3 mmoles) seguido de acetona (3 ml). Após 18 horas, a resina estava completamente negativa para o teste da ninidrina de Kaiser.
EXEMPLO 6
Resina /_nX -isopropil-Tir^ 7GRF(l-29)-metilbenzidrilamina
A resina descrita no Exemplo 4 (1,5 g, 0,5 mmoles) foi acoplada sucessivamente com Boc-D-Ala e Boc-Tir. O último grupo Boc foi então removido e a resina suspensa em DMF/1% de ácido acético a que se adicionou NaBH^CN (3 mmoles) seguido de acetona (3 ml). Após 18 horas, a resina ficou completamente negativa no teste de ninidrina de Kaiser.
EXEMPLO 7
Resina /”N^-Ciclo-hexil-tir^_7GRF(1-29)-metilbenzidrilamina
A resina descrita no Exemplo 4 (1,5 g, 0,5 mmoles) foi acoplada sucessivamente com Boc-Ala e Boc-Tir. O último grupo Boc foi então removido e a resina suspensa em DMF/1% de ácido acético a que foi adicionado NaBH^CN (3 mmoles) seguido de ciclohexanona (3 ml). Após 18 horas, a resina ficou completamente negativa no teste da ninidrina de KaiEXEMPLO 8
Resina / N-Benzil-Tir^ 7GRF(1-29)-metilbenzidrilamina
A resina descrita no Exemplo 4 (1,6 g, 0,5 mmoles) foi acoplada sucessivamente com Boc-Ala e Boc-Tir. 0 último grupo Boc foi então removido e a resina foi suspensa em DMF/1% de ácido acético a que foi adicionado NaBH^CN (3 mmoles) seguido de benzaldeído (3 ml). Após 2 horas, a resina estava completamente negativa no teste de ninidrina de Kaiser.
EXEMPLO 9
Resina /_N^ -5-nonil-Tir^ 7GRF(1-29)-metilbenzidrilamina
A resina descrita no Exemplo 4 (1,5 g, 0,5 mmoles) foi acoplada sucessivamente com Boc-Ala e Boc-Tir. O último grupo Boc foi então removido e a resina suspensa em DMF/1% de ácido acético a que se adicionou NaBHgCN (3 mmoles) seguido de 5-nonanona (3 ml). Após 3 dias, a resina estava muito positiva no teste de ninidrina de Kaiser e foi agitada a 50°C durante a noite após o que se obteve um teste negativo .
EXEMPLO 10
Resina -3-pentil-Tir1 7GRF(1-29)-metilbenzidrilamina
A resina descrita no Exemplo 4 (1,6 g, 0,5 mmoles) foi acoplada sucessivamente com Boc-Ala e Boc-Tir. O último grupo Boc foi então removido e a resina suspensa em DMF/1% de ácido acético a que se adicionou NaBHgCN (3 mmoles) seguido de 3-pentanona (3 ml). Após 18 horas, a resina estava muito positiva no teste da ninidrina de Kaiser e foi agitada a 50 C durante 3 horas apos o que se obteve um teste negativo.
EXEMPLO 11 /N -Etil-Tir1, Nle27_7GRF(l-29)NH2
A resina com peptídeos do Exemplo 2 foi misturada com anisol (5 ml) e fluoreto de hidrogénio anidro (35 ml) a 0°C e agitado durante 45 min. 0 fluoreto de hidrogénio em excesso foi evaporado rápidamente sob uma corrente de azoto e o peptídeo livre precipitado e lavado com éter. 0 peptídeo bruto foi então dissolvido num pegueno volume de 2M AcOH e eluido numa coluna (2,5x100 mm) de Sephadex G-50 no mesmo tampão. As fracções contendo um componente principal por absorção de uv e cromatografia em camada fina foram então reunidas, evaporadas para um volume pegueno e aplicadas numa coluna (1,5x45 cm) de octadecilsilano Vydac (15 um).
Isto foi eluido com um gradiente linear de 15-45% de acetonitrilo em 0,1% de ácido trifluoroacético em água. Examinaram-se as fracções por cromatografia em camada fina e cromatografia líquida de alta resolução analítica e reuniram-se para dar um máximo de pureza. A liofilização repetida da solução a partir de água dá 34 mg do produto na forma de um pó branco fofo.
Por hplc e tlc verificou-se que o produto é homogéneo. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e espectrometria de massa com bombardeamento de átomos rápidos confirmou a composição do heptapeptídeo.
EXEMPLO 12 /N°(-Isopropil-Tir1, Nle27_7GRF(1-29)NH2
A resina com peptídeo do Exemplo 3 foi clivada com HF e purificada nas condições descritas no Exemplo 11 para dar 82 mg do produto na forma de um pó branco f of o.
Por hplc e tlc verificou-se que o produto é homogéneo. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e espectrometria de massa rápida com bombardeamento com átomos rápidos confirmou a composição do heptapeptídeos.
EXEMPLO 13 /“^Isopropil-Tir1, D-Ala2 7GRF(1-29 )NH2
A resina com peptídeo do Exemplo 5 foi clivada com HP e purificada nas condições descritas no Exemplo 11 para dar 80 mg do produto na forma de um pó branco fofo.
Por hplc e tlc verificou-se gue o produto é homogéneo. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos confirmou a composição do heptapeptídeo.
EXEMPLO 14 /~N X-Isopropil-Tir1_7GRF(1-29)NH2
A resina com peptídeo do Exemplo 6 foi clivada com HF e purificada nas condições descritas no Exemplo 11 para dar 170 mg do produto na forma de um pó branco fofo.
Por hplc e tlc encontrou-se que o produto é homogéneo. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos confirmou a composição do heptapeptídeo.
EXEMPLO 15 /N ’^-Ciclo-hexil-Tir1_7GRF(l-29)NH2
A resina com peptídeo do Exemplo 7 foi clivada com HF e purificada nas condições descritas no Exemplo 11 para dar 132 mg do produto na forma de um pó branco f of o.
Por hplc e tlc encontrou-se que o produto é homogéneo. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos confirmou a composição do heptapeptídeo.
EXEMPLO 16 /_N°'-Benzil-Tir1_7GRF(l-29)NH,
A resina com peptídeos do Exemplo 8 foi clivada com HF e purificada nas condições descritas no Exemplo 11 para dar 82 mg do produto na forma de um pó branco fofo.
Por hplc e tlc verificou-se que o produto era homogéneo. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos confirmou a composição do heptapeptídeo.
EXEMPLO 17 /N °(-5-nonil-Tir1_7GRF(l-29)NH2
A resina com peptídeos do Exemplo 9 foi clivada com HF e purificada nas condições descritas no Exemplo 11 para dar 68 mg, do produto na forma de um pó branco e f of o.
Encontrou-se que o produto é homogéneo por hplc e tlc. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos confirmou a composição do heptapeptídeo.
EXEMPLO 18 /NO<-3-pentil-Tir1_7GRF(l-29 )NH2
A resina com peptídeos do Exemplo 10 foi clivada com HF e purificada nas condições descritas no Exemplo 11 para dar 143 mg do produto na forma de um pó branco fofo.
Por hplc e tlc encontrou-se que o produto é homogéneo. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e espectrometria de por bombardeamento com átomos rápidos confirmou a composição do heptapeptídeo.
EXEMPLO 19 /N ^-isopropil-Tir-l, N -isopropil-Lis^2'2^_7GRF(1-29 )NH2
GRF(1-29)NH2 (35 mg, 1 jpmole) foi dissolvido em DMF/1% AcOH (3 ml) e acetona (0,5 ml). Adicionou-se então NaBHgCN (4 mg) e a mistura foi agitada durante 4 horas. Após remoção dos componentes voláteis, o peptídeo foi purificado, nas condições descritas no Exemplo 11 para dar 25 mg do produto na forma de um pó branco fofo.
Por hplc e tlc encontrou-se que o produto é homogéneo. A análise do aminoácido de um hidrolisado ácido e a espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos confirmou a composição do heptapeptídeo.
EXEMPLO 20 /~N -isopropil-Tir^, N -isopropil-Lis^2'7GRF(1-29)OH
GRF(1-29)OH (35 mg, 1 ^timole) foi dissolvido em DMF/1% AcOH (3 ml) e acetona (0,5 ml) NaBHgCN (4 mg) foi então adicionado e a mistura agitada durante 4 horas. Após remoção dos componentes voláteis o peptídeo foi purificado nas condições descritas no Exemplo 11 para dar 28 mg do produto na forma de pó branco e fofo.
Por hplc e tlc encontrou-se que o produto é homogéneo. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e a espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos confirmou a composição do heptapeptídeo.
EXEMPLO 21
Avaliação dos efeitos dos peptídeos na libertação da hormona de crescimento em mamíferos usando o rato como a espécie de ensaio
Nesta avaliação foram empregues os processos descritos para W.A. Murphy et al., Endocrinology 109: 491-495 (1981).
Nas experiências com hormona de crescimento (GH), ratos machos (Charles Rivers) foram anestesiados com NEMBUTAD-^ (6 mg por 100 g de peso do corpo) que também serviu para manter estimulados os níveis de GH no plasma. Exactamente 30 minutos depois os ratos foram anestesiados e administrou-se 2,5 ml de soro fisiológico ou do peptídeo a testar em soro fisiológico na forma de bolus SC. Retirou-se uma amostra de 1 ml de sangue da veia jugular 15 minutos após a injecção do peptídeo em soro fisiológico. Os níveis de GH foram determinados usando componentes de RIA para GH de rato NIADDKD.
l/J
TEMPO (MIN)
AtlffiPriyr1, NEiPrLys 12>2,]GRF(1-29)NH2
B:[lfiPrTyrJ]GRF(1-29} NH2
C: [D-AIq2] GRFU-29) NH2
D: [D-Ala2]GRF(1-29)NH2
E: [NaiPrTyr1]GRF(1-29INH2
F:GRF(1-29)NH2
G- [tfiprTyr \ NLys12,21 ] GRF (25ug/100g BW) (25ug/IOOgBW) (25ug/100gBW) (0.5ug/100gBW) (0. 5ug/100g BW) (25ug/100g BW) (O.Sug/lOOg BW)
Actividade biológica de análogos de GRF(1-29)NH2 em ratos anestesiados com ponto barbital
Substância a testar
A *
Dose GH do Plasma# Potência (|xg/100g PC) (ng/ml)
| Soro fisiológico | - | 243 | + | 25 | (8) | |
| N MeTir^ | 30 | 1843 | + | 196 | (6) | 0,42 |
| II | 75 | 2613 | + | 418 | (6) | (0,30-0,60) |
| Soro fisiológico | - | 246 | + | 36 | (7) | |
| N^EtTir1, Nle27 | 4 | 2031 | + | 294 | 5,0 | |
| II | 10 | 3878 | + | 288 | (6) | (3,6-7,0) |
| Soro fisiológico | - | 243 | + | 25 | ||
| N iPrTir^, Nle27 | 0,12 | 685 | + | 25 | (8) | 41 |
| 11 | 0,30 | 1020 | + | 208 | (6) | (28-54) |
| Soro fisiológico | — | 325 | + | 52 | (9) | |
| N ^iPrTir1 | 0,2 | 1334 | + | 394 | (6) | 60 |
| II | 2 | 3250 | + | 362 | (6) | |
| II | 20 | 3290 | + | 241 | (6) | |
| N^iPrTir1, D-Ala2 | 0,2 | 1608 | + | 274 | (6) | ~70 |
| 11 | 2 | 3836 | + | 397 | (6) | |
| 11 | 20 | 3099 | + | 485 | (6) | |
| Soro fisiológico | - | 59 | + | 9 | (9) | |
| N *ciclo-hexil Tir^ | 0,2 | 58 | + | 21 | “2 | |
| II | 2 | 56 | ± | 10 | (6) | |
| II | 20 | 727 | + | 144 | (6) | |
| N ^benzil Tir^ | 0,2 | 213 | + | 32 | (6) | ~50 |
| II | 2 | 606 | + | 51 | (6) | |
| II | 20 | 1063 | + | 140 | (6) | |
| Soro fisiológico | - | 63 | + | 8 | (9) | |
| Ν^-5-nonil Tir1 | 0,2 | 46 | + | 4 | (6) | Z-0,5 |
| II | 2 | 85 | ± | 31 | (6) | |
| II | 20 | 104 | + | 12 | (6) |
Continuação
| Substância a testar | Dose (jug/lOOg PC) | GH do Plasma4+ (ng/ml) | A * Potência |
| Soro fisiológico | - | 91+11 (9) | |
| GRF(1-29)NH2 | 10 | 222+50 (4) | |
| H | 25 | 622 +63 (6) | |
| 1 . . 12 21 N iPrTir , N iPrLis ' | 0,08 | 308 +24 (6) | 106 |
| II | 0,20 | 467 +86 (6) | (70-161) |
| Conjunto de padrões GRF(1-29)NH2 | 10 | 1185 +74 (78) | 1 |
| Π | 25 | 2579 + 121 (70) | |
** Na RIA foram usadas duas preparações de referência diferentes.
NIADEK-rGH-PP-a para ensaios com valores de testemunha mais elevados e NIADEK-rGH-RP-2 para ensaios mostrando valores de testemunha mais baixos.
As potências são calculadas usando GRF(1-29)NH2 como padrão por ensaio de 4 pontos (os limites de CI 95% são dados dentro de parêntesis) quer por comparação com os conjuntos de padrões GRF(1-29)NH2 ou com corrida padrão no mesmo bioensaio. As potências com CI de 95% foram estimadas por comparações de doses isoladas relativamente a respostas de conjuntos de padrões.
EXEMPLO 22
Usando o método do Exemplo 19 prepararam-se os seguintes peptídeos perisopropilados:
1) (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-SerTir-Arg-(N t-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-AlaArg-(N £ -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-SerArg-Gln-Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gli-Ala-ArgVal-Arg-Leu-NHg.
2) (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-SerTir-Arg-(N €-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-AlaArg-(N -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-ArgGln-Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Gli-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-NHg.
3) (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-SerTir-Arg-(N í -isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-AlaArg-(N í -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-ArgGln-Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Gli-Ala-(N -isopropil )LisVal-Arg-Leu-NHg.
4) (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-SerTir-Arg-(N &-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-AlaArg-(N b-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-ArgGln-Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gli-Ala-(N -isopropil )Lis-Val-Arg-Leu-NHg.
5) (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-SerTir-Arg-(N 6 -isopropil)Lis-Ile-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-AlaArg-(NÍ -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-ArgGln-Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gli-Ala-(N -isopropil)Lis-Val-Arg-leu-NHg.
6) (N-isopropil)His-Ala-Asp-Ile-Fen-Tre-Ser-Ser-TirArg-Arg-Ile-Leu-Gli-Gln-Leu-Tir-Ala-Arg-(N -isopropil) Lis-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gli-GluArg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Fen-Asn-OH.
7) (N-isopropil)Tre-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-SerTir-Arg-(N 6-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-AlaArg-(N t-isopropil) Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NF^ .
8) (N-isopropil)His-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-SerTir-Arg-(N^ -isopropil)Lis-Ile-Leu-Gli-Gln-Leu-Ala-Arg(N-isopropiljLis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Nf^.
9) (N-isopropil)his-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Ser-SerTir-Arg-Arg-Ile-Leu-Gli-Gln-Leu-Tir-Ala-Arg-(N-isopropil) Lis-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH2.
10) (N-isopropil)tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-SerTir-Arg-(N -isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-AlaArg-(N 6 -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-IIe-Met-Ser-ArgGln-OH.
EXEMPLO 23
HpGRF(1-29)-Gli-OH
Usando o processo descrito por K. Horiki et al., em Chemistry Letters, 165-168 (1978), Boc-Gli foi acoplado à resina clorometilada de Merrifield usando KF em DMF a cerca de 60°C, durante 24 horas com agitação.
Após desbloqueamento e neutralização, a cadeia peptídica foi construída passo a passo na resina. O desbloqueamento, neutralização e adição de cada aminoácido foi efectuado de um modo geral de acordo com o processo descrito detalhadamente em Rivier, J. J. Amer. Chem. Soc., 96
2986-2992 (1974). Todos os solventes usados foram cuidadosamente desgaseados por aspersão com um gás inerte, e.g. hélio ou azoto, para assegurar a ausência de oxigénio que deverá oxidar o enxofre do resíduo Met.
O desbloqueamento foi de preferência efectuado de acordo com o Protocolo A que se segue:
PROTOCOLO A
Reagente Tempo de mistura (Min.)
| 1. | 60% TFA/2% etanoditiol | 10 |
| 2 . | 60% TFA/2% etanoditiol | 15 |
| 3 . | IPA/1% etanoditiol | 0,5 |
| 4. | Et3N (10%) em CH2C12 | 0,5 |
| 5. | MeOH | 0,5 |
| 6. | Et3N (10%) em CH2C12 | 0,5 |
| 7. | MeOH (duas vezes ) | 0,5 |
| 8. | CH2C12 (duas vezes) | 0,5 |
As acoplagens são de preferência efectuadas como estabelecido no Protocolo B gue se segue:
PROTOCOLO B
Reagente Tempo de mistura (Min.)
| 9. | DCCI | - |
| 10. | Boc-aminoácido | 50-90 |
| 11. | MeOH (duas vezes) | 0,5 |
| 12. | CH2C12 (duas vezes ) | 0,5 |
| 13. | Ac2O (3M) em CH2C12 | 15,0 |
| 14. | ch2ci2 | 0,5 |
| 15. | MeOH | 0,5 |
| 16. | CH2C12 (duas vezes) | 0,5 |
Resumidamente, usou-se uma a duas mmoles de aminoácido protegido com Boc em cloreto de metileno por grama de resina, mais um equivalente de DCCI 1,0 molar em cloreto de metileno durante duas horas. Quando Boc-Arg (TOS) está a ser acoplado usa-se uma mistura de 50% DMF e cloreto de metileno. Usou-se éter Bgl como grupo protector de hidroxilo de cadeia lateral para Ser e Tre. Também pode ser usado p-nitrofenilo (ONp) para activar o extremo carboxilo de Asn ou Gin e por exemplo Boc-Asn (ONp) pode ser acoplado durante a noite usando um equivalente de HOBt numa mistura de 50% de DMF em cloreto de metileno, neste caso não se adiciona DCC. Usou-se 2-cloro-benziloxicarbonilo (Cl-Z) como grupo protector da cadeia lateral de Lis. Usou-se Tos para proteger o grupo guanidino de Arg e o azoto imidazol de His e o grupo carboxilo das cadeias laterais de Glue Asp foi protegido com OBzl. Os aminoácidos bloqueados que se seguem
G foram então sucessivamente acoplados: Boc-N -tosil-Arg, Boc-O-Bgl-Ser, Boc-Met, Boc-Ile, Boc-benzil-Asp, Boc-Gln, Boc-Leu, Boc-leu, Boc-N -2-clorocarbobenzoxi (Cl-Z)-Lis, Boc-tosil-Arg, Boc-Ala, Boc-O-Bzl-Ser, Boc-Gln, Goc-Gli, Boc-Leu, Boc-Val, Boc-Cl-Z-Lis, Boc-tosil-Arg, Boc-Z-Br-Z-Tir, Boc-O-Bzl-Ser, Boc-Asn, Boc-O-Bzl-Tre, Boc-Fen, Boc-Ile, Boc-Ala, Boc-Bzl-Asp, Boc-Ala e Boc-Tir.
Para clivar e desproteger a resina com peptídeos protegidos, tratou-se esta com 1,5 ml de anisol, 0,5 ml de metilsulfato e 15 ml de fluoreto de hidrogénio (HF) por grama de peptídeo-resina, a -20°C durante meia hora e a 0°C durante meia hora. Após eliminação do HF sob vácuo, a restante resina-peptídeo foi lavada alternadamente com éter dietílico seco e clorofórmio e o peptídeo foi então extraído com ácido acético aquoso 2N desgaseado e separado da resina por filtração.
O peptídeo clivado e desprotegido foi então dissolvido em 0-5% de ácido acético e sujeito a purificação que pode também incluir filtração em gel de Sephadex G-50.
O peptídeo foi ainda purificado por HPLC preparativa ou semi-preparativa como descrito em Rivier et al., Peptides:Structure and Biological Function, (1979) pág. 125-8 e Marki et al J. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981). Cassetes adaptadas a Waters Associates prep LC-500 foram cheias com Silica C^g 15-20 p da Vydac (300A). produziu-se um gradiente de CHgCn em TEAP com um formador de gradientes Eldex a baixa pressão, como descrito em Rivier, J., J. Liq. Chromatography 1, cuidadosamente controlado por HPLC e apenas as fracções mostrando pureza substancial foram reunidas. A remoção do sal das fracções purificadas, independetemente testadas quanto a pureza, foi conseguido usando um gradiente de CHgCN em 0,1% de TFA. O corte do centro foi então liofilizado para dar o peptídeo pretendido, a pureza do qual pode ser superior a 98%.
Claims (25)
- REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a preparação de um peptídeo tendo a fórmula:Fórmula I1 10 R1-A-B-Ala-Ile-Fen-Tre-R2-Ser-E-Arg-R-R4-Leu-Rg-Gln20 25 29Leu-Rg-Ala-Arg-R-leu-Leu-Rg-R^-Ile-I-Rg-Arg-JFórmula II1 10 -A-B-Ala-Ile-Fen-Tre-R2-Ser-E-Arg-R-R^-leu-Rg-Gln2030Leu-Rg-Ala-Arg-R-Leu-Leu-Rg-R^-Ile-I-Rg-Arg-Gln-Gln4044Gli-Glu-Rn-Asn-Gln-Glu-R, n-Rn Ί -R, O-R-. o-Rt c-Rin9 10 11 12 13 14 15 1617' em queRx é N K -Rlg-Tir, N ^-R-^-His, N^-R-^-Fen, N^-R-^-Tir,N< -Rig-D-His , ou N<-Rlg-D-Fen;A é Ala, D-Ala ou N-Me-D-Ala;B é Asp, D-Asp;R2 é Asn, D-Asn ou Ser;E é Tir, D-Tir;R é Arg, Lis ou N^-R^g-Lis;R^ é Ile ou Vai;Rg é Gli , ¢/-aminoisobutirico ,*<-aminobutirico , Ala, Gin, Asn, Leu, Ile ou Vai;Rg é Ser ou Tir;Rg é His ou Gin;R.? é Glu ou Asp;I é Met, Leu, Nle, Ile, Vai, nor Vai, Ser, Tre, Asn ou Gin;J é NH2 ou COOH;Rg é Ser ou Asn; Rg é Ser ou Arg; R1Q é Arg ou Gin; R χ é Arg ou Gli; é Ala ou Ser; R^ é Arg ou N^-R^g-Lis; R^ é Fen,Vai ou Ala; R^g é Asn ou Arg; R^g é OH, NH£, OR^g, Gli ou Leu; R^7 é OH, OR^g, NH2' Gli ou nenhum substituinte; R^g é alquilo Cj-Cg (linear ou ramificado), cicloalquilo Cg-Cg, benzilo, naftilo, metilnaftilo ou benzilo mono-substituinte em que a substituição é com halogénio, metoxilo, nitro ou ciano; com a condição de quando o peptídeo fôr o GRF de ratazana, R^g é Asn e Rj_g pode ser apenas OH, NH2, OR^g ou Gli; e quando Gli fôr o aminoácido do extremo carboxilo, o grupo funcional é um OH de ácido; e de seus sais farmacêuticamente aceitáveis, caracterizado por:a) se proceder a uma síntese de peptídeos em fase sólida, utilizando técnicas padrão de fase sólida, por exemplo ligando um aminoácido protegido no C terminal a uma resina adequada, oub) se tratar um peptídeo-resina com amoníaco para originar a amida desejada protegida na cadeia lateral ou com uma alquilamina para originar um alquilamida ou dialquilamida protegidas na cadeia lateral, ec) removerem os grupos protectores utilizando, por exemplo, HF, ed) se desejado, se esterificar o produto obtido.
- 2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um peptídeo tendo a estrutura:1 10 R^-A-B-Ala-Ile-Fen-Tre-Rg-Ser-E-Arg-R-R^-Leu-Rg-Gln20 25 29Leu-Rg-Ala-Arg-R-Leu-Leu-Rg-R^-Ile-I-Rg-Arg-J;ondeR é NA-R18-Tir, N*<-R18-His, N^-R18-Fen, N^-R^-Tir, -R18-D-His , ou N * -R18-D-Fen;A é Ala, D-Ala ou N-Me-D-Ala; B é Asp, D-Asp; R2 é Asn, D-Asn ou Ser; E é Tir, D-Tir; R é Arg, Lis ou N-R^g-Lis;R^ é Ile ou Vai; Rg é Gli , «/-aminoisobutir ico, of-aminobutirico, Ala, Gin, Asn, Leu, Ile ou Vai;Rg é Ser ou Tir; Rg é His ou Gin; R^ é Glu ou Asp; I é Met, Leu, Nle, Ile, Vai, nor Vai, Ser, Tre, Asn ou Gin; J é NH2 ou COOH; R8 é Ser ou Asn; R^g é alquilo C^-Cg (linear ou ramificado), cicloalquilo Cg-Cg, benzilo, naftilo, metilnaftilo ou benzilo mono-substituido em que a substituição é com halogénio, metoxilo, nitro ou ciano; com a condição de quan do o peptídeo fôr o GRF de ratazana R^g é Asn e Rj_g pode ser apenas OH, NH2, OR^g ou Gli; e quando Gli fôr o aminoácido de extremo carboxilo, o grupo funcional é um OH de ácido; e seus sais farmacêuticamente aceitáveis.
- 3a. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um peptídeo tendo a estrutura:Fórmula II1 10R^-A-B-Ala-Ile-Fen-Tre-R2-Ser-E-Arg-R-R4-Leu-Rg-Gln- onde, R^, A, B, R2, E, R, R^, ^3' R5' R6' R7' θ R8 R17 s^° como descritos na referida reivindicação 1.
- 4a. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N°^-Etil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir-Arg20Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu-GlnAsp-Ile-Nle-Ser-Arg-Nf^;
- 5â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N -Isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20 Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu29Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2;
- 6â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N ^-Isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20 Arg-Lis-Val-Leu-Gln-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu29Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;
- 7ê. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:(N ^-Isopropil)Tir-D-Ala-Asp-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-10 20 Tir-Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-29 Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NL·^;
- 8ê. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:* 1 (N -Ciclo-hexil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser10 20Tir-Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu29Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NK^;
- 9è. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N 04 -Benzil )Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu29Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;lOâ. - Processo de acordocom a reivindicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N °( -Nonil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir-Arg20 Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu-GlnAsp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;lia. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:(N -Isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser10 4Tir-Arg-(N r-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala20 29Arg-(N £-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Nf^ ;
- 12a. _ Processo de acordo com a reivin dicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:. 1 10 (N A-Isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20 Arg-(N 6-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg(N -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-OH;
- 13â. - Processo de acordo com a reivin dicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N°( -pentil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20 Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu29Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;
- 14®. - Processo de acordo com a reivin dicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tird 20Arg-(N -isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg, 25 28 (N & -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-NH2;
- 15â. - Processo de acordo com a reivin dicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir, 20Arg-(N -isopropil)Lis-Ile-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg29 (N-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH2;-4516â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20Arg-(N -isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgL 29 (N -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gli-OH;
- 17â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20Arg-(N -isopropil)Lis-Ile-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg30 (N ^-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln40 Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Ala-(N &-isopropil)Lis43Val-Arg-Leu-NH2;
- 18ê. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tirt 20Arg-(N -isopropil)Lis-Vai-Leu-Gli-Gin-Leu-Ser-Ala-Arg, 30 (N *-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln- 4040 44Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-gln-Glu-Gln-Gli-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-NH2;
- 19a. _ Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20Arg-(N -isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg30 (N -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln40 42Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Gli-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-NH2;
- 20i. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20 Arg-(N 6-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgE 30 (N -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln40 Gln-Gli-Glu-Arg-Asn-Gln-Gli-Ala-(N €-isopropil)Lis-Val42Arg-Leu-NH2;
- 21i. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se preparar o peptídeo:1 10 (N-isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20Arg-(N -isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg30 (N -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-GlnGln-Gli-Glu-Arg-Asn-Glu-Gln-Gli-Ala-(Nf -isopropil)Lis-Val-Arg-Leu-NH2;
- 22ã. - Método para aumentar a libertação de hormona de crescimento em mamíferos, caracterizado por compreender a administração ao referido mamífero de 0,000001 a 0,1 mg/kg de peso do corpo de mamífero/dia de um peptídeo tendo a fórmula:Fórmula I1 10 R^-A-B-Ala-Ile-Fen-Tre-I^-Ser-E-Arg-R-R^-Leu-Rg-Gln20 25 29Leu-Rg-Ala-Arg-R-Leu-Leu-Rg-Ry-Ile-I-Rg-Arg-JFórmula II1 10R^-A-B-Ala-Ile-Fen-Tre-R2-Ser-E-Arg-R-R4~Leu-Rg-Gln20 30Leu-Rg-Ala-Arg-R-Leu-Leu-Rg-R-y-Ile-I-Rg-Arg-Gln-Gln40 44Gli-Glu-Rg-Asn-Gln-Glu-R^0-R-L^-R^2_Ri3-Ri4-Ri5-Ri5-:R]_7'
ou Ser; E z e Tir Vai; Rg é Gli, Gin, Asn, Leu, R ? é Glu ou Asp Tre, Asn ou Gin ondeR^ é N -R^g-Tir, N <-R18His, N^-R-^g-Fen, N^-R^g-Tir, -Rlg-D-His, ou N * -Rig-D-Fen;A é Ala, D-Ala ou N-Me-D-Ala; B é Asp, D-Asp; R , D-Tir; R é Lis ou N *^-Rlfl-Lis; ¢/-aminoisobutirico, , Ile ou Vai; Rg é Ser ; I é Met, Leu, Nle, ; J é NH2 ou COOH; Rg ou Asn; Rg é Ser ou Arg; R-^θ é Arg ou Gin; R^^ R^2 é Ala ou Ser; R^g é Arg ou N^-R-Lis; R Ala; R^g é Asn ou Arg; R-^θ é OH, NH2, OR-^g, é OH, OR^g, NH2, Gli ou nenhum substituinte; R^g C^-Cg(linear ou ramificado). Cicloalquilo Cg-Cg , naftilo, metilnaftilo ou benzilo mono-substituido em que a substituição é com halogéneo, metoxilo, nitro ou ciano; com a condição de guando o peptídeo fôr GRF de ratazana, R^g é2 é Asn, D-Asn R4 é Ile ou o/ -aminobutirico, Ala, ou Tir; Rg é His ou Gin; Ile, Vai, nor Vai, Ser, , é Ser ou Asn; Rg é Ser é Arg ou Gli;14 é Fen, Vai ou Gli ou Leu; R-^y é alguilo benzilo,Asn e pode ser apenas OH, NH2, OR^g ou Gli; e quando Gli fôr o aminoácido do extremo carboxilo, o grupo funcional é um OH de ácido; e de seus sais farmacêuticamente aceitáveis. - 23â. - Método de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por o referido peptideo ser um peptídeo da fórmula I tendo a estrutura:1 10 R-^-A-B-Ala-Ile-Fen-Tre-R^Ser-E-Arg-R-R^-Leu-Rg-Gln20 25 29Leu-Rg-Ala-Arg-R-Leu-Leu-Rg-R-y-Ile-I-Rg-Arg-J ondeR± é N^-Rlg-Tir, N^-R^-His, N<-Rlg-Fen, N^-R^-Tir,N * -R^g-D-His , ou N -R^g-D-Fen ;A é Ala, D-Ala ou N-Me-D-Ala; B é Asp, D-Asp R2 é Asn, D-Asn ou Ser; E é Tir; R é Arg, Lis ou N 6-R^g-Lis; R^ é Ile ou Vai; Rg é Gli, -aminoisobutirico, < -aminobutirico, Ala, Gin, Asn, Leu, Ile ou Vai;Rg é Ser ou Tir; Rg é His ou Gin; R^ é Glu ou Asp; I é Met, Leu, Nle, Ile, Vai, nor Vai, Ser, Tre, Asn ou Gin; J é NH2 ou COOH; Rg é Ser ou Asn;Rjg θ alquilo C^-Cg (linear ou ramificado), cicloalquilo Cg-Cg, benzilo, naftilo, metilnaftilo ou benzilo mono-substituido em que a substituição é com halogénio, metoxilo, nitro ou ciano; com a condição de quando o peptideo fôr o GRF de ratazana, R^g é Asn e R^g pode ser apenas OH, NH2, OR^g ou Gli; e quando Gli for o aminoácido do extremo carboxilo, o grupo funcional é um OH de ácido;e de seus sais farmacêuticamente aceitáveis.
- 24§. - Método de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por o referido peptideo ser:/N ^-5-Nonil-Tir1_7GRF(l-29)ΝΗ2;/_Ν *-Etil-Tir1, Nle27_7GRF(l-29)NH2;/ Ne‘-3-pentil-Tir1_7GRF(l-29 )ΝΗ2;/Ν 6(-BenzÍl-TÍr1_7GRF(l-29)NH2;/Ν e<-Ciclo-hexil-Tir1_7GRF(l-29)NH2;/~Ν <-Isopropil-Tir1_7GRF(1-29)ΝΗ2;/Ν <-Isopropil-Tir1, D-Ala_7GRF(1-29)ΝΗ2;/-Ν< -Isopropil-Tir1, Nle27_7GRF (1-29 )ΝΗ2 ;/-Ν-Isopropil-Tir1-N -isopropil-Lis12'21 7GRF(1-29)ΝΗ2 ; ou /~Ν ^-Isopropil-Tir1, Ν 6-isopropil12'21 7GRF(1-29)0Η.
- 25ã. - Método de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por o referido peptídeo ser:(N -Isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser10 <Tir-Arg-(N ’-isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala20 29Arg-(N &-isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-OH;
- 26ã. - Método de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por o referido peptídeo ser:(N -Isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser10Tir-Arg-(N -isopropil)Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala20 29Arg-(N -isopropil)Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;
- 27â. - Método de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por o referido peptídeo ser:1 10 (Ν -Isopropil)Tir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir20 Arg-Lis-Val-Leu-Gli-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu29Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2;
- 28a. _ Método para estimular a libertação da hormona de crescimento num animal, caracterizado por se administrar ao referido animal uma quantidade eficaz de um peptídeo sintético ou de um seu sal não tóxico tendo a estrutura :Fórmula I1 10R^-A-B-Ala-Ile-Fen-Tre-Rg-Ser-E-Arg-R-R^-Leu-Rg-Gln20 25 29Leu-Rt--Ala-Arg-R-Leu-Leu-R(--R7-Ile-I-Rfi-Arg-JFórmula II1 10R^-A-B-Ala-Ile-Fen-Tre-R2-Ser-E-Arg-R-R^-Leu-R3-Gln20 30Leu-Rg-Ala-Arg-R-Leu-Leu-Rg-R^-Ile-I-Rg-Arg-Gln-Gln40 44Gli-Glu-Rg-Asn-Gln-Glu-R^g-R1^-R^2-Ri3-Ri4_:Ri5-Ri5-Ri7 ‘ ondeR é N^-R1Q-Tir, N^-R^-His, N ^-R^-Fen, N ^-R^-Tir, -R 8-D-His, ou N y-Rig-D-Fen;A é Ala, D-Ala- ou N-Me-D-Ala; B é Asp, D-Asp; ou Ser; E é Tir; D-Tir; R é Lis ou N-R^g-LisR2 é Asn,R4 é IleD-Asn ouVai; Rg é Gli, Ύ -aminoisobutirico, o/-aminobutirico, Ala, Gin, Asn, Leu, Ile ou Vai; Rg é Ser ou Tir; Rg é His ou Gin; R? é Glu ou Asp; I é Met, Leu, Nle, Ile, Vai, nor Vai, Ser, Tre, Asn ou Gin; J é NH2 ou COOH; Rg é Ser ou Asn; Rg é Ser-51ou Arg; R^q é Arg ou Gin;R^2 é Arg ou N -R-Lis; éArg; Rlg é OH, NH2, ORlg, Gli é Arg ou Gli; R^2 é Ala ou Ser; Fen ou Vai ou Ala; é Asn ou ou Leu; R^^ é OH, OR^g, NH2,Gli ou nenhum substituinte; R^g é alquilo C^-C^ (linear ou ra mificado), cicloalquilo Cg-Cg, benzilo, naftilo, metilnaftilo ou benzilo mono-substituido em que a substituição é com halo génio, metoxilo-nitro ou ciano; com a condição de quando o peptídeo fôr o GRF de ratazana, Rlg é Asn e R^g pode ser apenas OH, NH2, ORig ou Gli; e quando Gli fôr o aminoácido do extremo carboxilo, o grupo funcional é um OH de ácido; e seus sais farmacêuticament.e aceitáveis.
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