PT870014E

PT870014E - Anticorpo catalítico aldolase.

Info

Publication number: PT870014E
Application number: PT96943772T
Authority: PT
Inventors: Richard A Lerner; Carlos F Barbas Iii; Juergen Wagner
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 2007-05-31
Also published as: AU1292397A; EP0870014A4; DE69636923T2; DK0870014T3; EP0870014A1; US5985626A; DE69636923D1; ATE354644T1; JPH11510063A; SI0870014T1; US5733757A; CA2239167C; WO1997021803A1; ES2283009T3; EP0870014B9; EP0870014B1; AU729055B2; CA2239167A1; JP3996642B2; US6368839B1

Description

ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Anticorpo catalítico aldolase"

Campo do invento: O invento refere-se a um anticorpo catalítico possuindo actividade de aldolase. Mais particularmente, o invento refere-se a anticorpos catalíticos possuindo actividade de aldolase e que são gerados por um imunoconjugado possuindo um hapteno de β-dicetona com actividade de substrato suicida em relação a esses anticorpos catalíticos.

Antecedentes: A reacção de adição aldólica é uma reacção reversível envolvendo a combinação de duas moléculas reagentes e a formação de um produto possuindo uma nova ligação carbono-carbono. Cada um dos reagentes contém um grupo carbonilo, í.e., quer um aldeído quer uma cetona. Durante a reacção, um dos reagentes perde um protão do átomo de carbono próximo do seu carbonilo, tornando-se desse modo nucleófilo. O carbono nucleófilo do primeiro reagente ataca então o grupo carbonilo do segundo reagente. O inverso desta reacção de condensação pode também ocorrer e implica a clivagem de uma ligação carbono-carbono e a dissociação de uma molécula em dois componentes. A reacção de adição aldólica é importante no percurso glicolítico e é catalisada por enzimas aldolase. A reacção de adição aldólica é também fundamental em química orgânica para a formação e dissociação de ligações carbono-carbono. Em química orgânica, a reacção pode ser catalisada por base. Têm sido estabelecidas duas classes de mecanismos de enzimas aldolase, viz., aldolases Classe I e Classe II. (W.J. Rutter, Fed. Proc. Amer. Soc. Exp. Biol. (1964): vol. 23, pág. 1248.) As aldolases da classe I utilizam o grupo ε-amino de uma Lys no centro activo para formar uma base de Schiff com um dos substratos, o que activa o substrato como um doador de aldol. O mecanismo para as aldolases de classe I está ilustrado na Figura 1. A reacção é bimolecular e prossegue por catálise covalente através de múltiplos intermediários. Forma-se um ião 2 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ imínio ou base de Schiff que actua como um escoadouro de electrões, o que diminui a energia de activação (Ea) para subtracção de um protão do Ca e formação da enamina subsequente. A enamina actua como o nucleófilo de carbono, ou doador de aldol, que reage com um electrófilo de aldeído, o aceitador de aldol, para formar uma nova ligação C-C. A base de Schiff é depois hidrolisada e o produto é libertado. A essência do mecanismo é a formação da enamina que é o nucleófilo de carbono emergente.

As aldolases de classe II são metaloenzimas que facilitam a formação de enolato por coordenação ao oxigénio de carbonilo do substrato. Têm também sido revelados modelos do estado de transição para reacções de aldol envolvendo metais. (H.E. Zimmerman et ai., J. Am. Chem. Soc. (1957): vol. 79, pág. 1920.) No entanto, o mecanismo para as aldolases de classe II está ainda por ser completamente caracterizado.

Um certo número de enzimas catalisa a condensação de aldol. Os mecanismos destas enzimas têm sido bem caracterizados. (C.Y. Lai, et al., Science (1974), vol. 183, pág. 1204; e A.J. Morris et al., Biochemistry (1994) vol. 33, pág. 12291.) No entanto, as enzimas aldolase aceitam uma gama relativamente limitada de substratos (C.-H. Wong et al., Enzymes in Synthetic Organic Chemistry (Permagon, Oxford, 1994); M.D. Bednarski em Comprehensive Organic Synthesis, B.M. Trost, Ed. (Pergamon, Oxford, 1991), vol 2, págs. 455-473; C.F. Barbas III, et al., J. Am. Chem. Soc. (1990): vol. 112, pág. 2013; H.J.M. Gijsen et al., J. Am. Chem. Soc. (1995): vol. 117, pág. 2947; C.-H. Wong et al., J. Am. Chem. Soc. (1995): vol. 117, pág. 3333; L. Chen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1992): vol. 114, pág. 741.) Ainda que as enzimas aldolase naturais exibam uma ampla especificidade em relação ao aceitador de aldol, o doador de aldol está usualmente limitado ao substrato natural. A especialidade da síntese orgânica beneficiaria significativamente se pudessem ser produzidos catalisadores possuindo a especificidade pelo substrato desejado para regular a catálise das reacções de adição aldólica desejadas.

As reacções de adição aldólica catalisadas por base não enzimática são amplamente utilizadas em química orgânica para formar novas ligações carbono-carbono. Tem também sido desenvolvida uma variedade de reagentes eficazes para 3 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ controlar a estereoquímica do aldol. Contudo, estes reagentes são estequiométricos e requerem enolatos pré-formados e química exaustiva de grupos protectores. (C.H. Heathcock, Aldrichim. Acta (1990): vol. 23, pág. 99; C.H. Heathcock, Science (1981): vol. 214, pág. 395; D.A. Evans, Science (1988): vol. 240, pág. 420; S. Masamune, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1985): vol. 24, pág. 1; D.A. Evans, et al., Top. Stereochem. (1982): vol. 13, pág. 1; C.H. Heathcocket et al., em Comprehensive Orqanic Synthesis, B.M. Trost, Ed. (Pergamon, Oxford, 1991), vol. 2, págs. 133-319 (1991); e I. Paterson, Pure & Appl. Chem. (1992): vol. 64, 1821.) Recentemente, têm sido desenvolvidas reacções catalíticas de aldol que utilizam enolatos pré-formados, incluindo o aldol de acoplamento cruzado de Mukaiyama. (S. Kobayashi, et al., Tetrahedron (1993): vol. 49, pág. 1761; K. Furuta, et al., J. Am. Chem. Soc. (1991): vol. 113, pág. 1041; T. Bach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1994): vol. 33, pág. 417 e referências aí citadas; e E. M. Carreira, et al., J. Am. Chem. Soc. (1995): vol. 117, pág. 3649.)

Para algumas reacções, o problema de intermediários complexos pode ser resolvido por utilização de compostos relativamente reactivos, em vez dos antigénios inertes mais usuais, para imunizar animais ou seleccionar anticorpos a partir de bibliotecas tal que o processo de indução de anticorpo envolve uma reacção química real no local de ligação. (C.F. Barbas III, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1991): vol. 88, pág. 7978 (1991); K.D. Janda et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994): vol. 191, pág. 2532.) Esta mesma reacção torna-se então parte do mecanismo catalítico, quando o anticorpo interactua com um substrato que partilha reactividade química com o antigénio utilizado para o induzir.

Um dos principais objectivos da química orgânica é utilizar a compreensão dos mecanismos de reacção para desenhar novos catalisadores. Muitas vezes isto não é fácil porque tem de se recorrer intermediários que são de energia elevada e de estrutura complexa. Os catalisadores de anticorpo oferecem uma solução potencial para este problema pelo facto de poderem ser programados pelo experimentador para interactuar com o estado de transição limitador de velocidade de uma reacção, diminuindo desse modo a sua energia e aumentando a velocidade de reacção. (R.A. Lerner, et al., Science (1991): vol. 252, pág. 659.) No entanto, mesmo aqui, a capacidade do 4 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ experimentador para programar ο catalisador está usualmente limitada aos aspectos mais globais do estado de transição em vez de ao mecanismo detalhado da reacção. Assim, embora se possa lidar com alterações de energia elevadas, particularidades estereoelectrónicas e geométricas que surgem ao longo da coordenada da reacção, a organização de múltiplos intermediários de reacção complexos continua a ser difícil.

Reymond et al. (Tetrahedron Lett. 36 (15), 2575, 1995) revelam anticorpos catalíticos para a reacção de aldol, gerados utilizando haptenos de amónio quaternário. O que é necessário é um método para induzir anticorpos que utilizem os mecanismos de reacção para proporcionar às aldolases a sua eficiência, mas que tirem vantagem da gama de substratos e especificidades estereoquímicas disponíveis com anticorpos. O que é necessário é uma estratégia que combine as melhores caracteristicas das abordagens de química simples e enzimática ao problema da formação de ligações carbono-carbono via condensação de aldol que é, provavelmente, a reacção de formação mais básica da ligação C-C em química e em biologia.

Sumário: O invento refere-se à geração de anticorpos que catalisam a reacção do aldol. Os anticorpos catalíticos são gerados por imunização com um composto reactivo que captura covalentemente um residuo Lisina (Lys) no bolso de ligação do anticorpo por formação de uma amida viníloga estável, í.e., um complexo covalente anticorpo/hapteno. O mecanismo catalítico para estes anticorpos catalíticos é revelado como mimetizando o mecanismo catalítico utilizado por enzimas aldolase de classe I naturais. O mesmo mecanismo de reacção, utilizado para formar o complexo covalente anticorpo/hapteno, é também utilizado para catalisar a reacção de aldol. Durante a catálise, os anticorpos utilizam o grupo ε-amino de Lys para formar uma enamina com substratos de cetona e depois utilizam esta enamina como um nucleófilo de carbono emergente para atacar o segundo substrato, um aldeído, para formar uma nova ligação carbono-carbono. Os anticorpos catalíticos aqui revelados são caracterizados pela sua larga especificidade por substrato se pela sua capacidade para controlar a selectividade 5 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ diastereofacial da reacção em ambas as direcções Cram-Felkin e anti-Cram-Felkin. O presente invento é conforme se descreve nas reivindicações. Mais particularmente, um aspecto do invento é dirigido a moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo que catalisam uma reacção de adição aldólica entre um doador de cetona alifática e um aceitador de aldeido. Estes anticorpos são caracterizados por serem susceptiveis de serem gerados por imunização de um animal imuno-responsivo com um imunogénio que inclui um hapteno de 1,3-dicetona da fórmula geral:

O ° o O 5 acoplado a uma proteína transportadora e adicionalmente caracterizado por ter uma lisina com um grupo ε-amino. Estes são adicionalmente caracterizados por serem submetidos a inibição com o hapteno de 1,3-dicetona por formação de um complexo entre o hapteno de 1,3-dicetona e o grupo ε-amino da lisina do anticorpo catalítico. A entidade complexa pode ser uma amida viníloga covalente estável, uma enamina conjugada ou uma base de Schiff. Numa concretização preferida, as moléculas de anticorpo controlam a selectividade diastereofacial da reacção de adição aldólica em ambas as direcções Cram-Felkin e anti-Cram-Felkin. Doadores de cetona alifática preferidos incluem compostos representados pelas estruturas seguintes:

O

Aceitadores de aldeído preferidos incluem compostos representados pelas estruturas seguintes: 6 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ

Ο η AcNH

Ή 6 7 ο

Ή 12

Outro aspecto do invento é dirigido a moléculas da reivindicação 1 que são segregadas pelo hibridoma 38C2, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12005 ou pelo hibridoma 33F12, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12004.

Outro aspecto do invento é dirigido a células que, quando cultivadas num meio, produzem as moléculas de anticorpo monoclonal ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo acima indicadas que catalisam reacções de adição aldólica. Numa concretização preferida, as células são de um tipo que segrega as moléculas de anticorpo monoclonal ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo para o meio de cultura. As células de hibridoma são uma concretização preferida, viz., células de hibridoma de hibridoma 38C2, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12005 e células de hibridoma de hibridoma 33F12, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12004.

Um aspecto adicional do invento é dirigido a um método para catalisar uma reacção de adição aldólica entre um doador de cetona alifática e um aceitador de aldeído. O método começa por se misturar uma quantidade cataliticamente eficaz das moléculas de anticorpo monoclonal ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo da reivindicação 1 com o doador de cetona alifática e o referido aceitador de aldeído num meio aquoso para formar uma mistura reaccional. Após a mistura reaccional ser formada, esta é mantida por um período de tempo suficiente para as moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo catalisarem a reacção de adição aldólica entre o doador de 7 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ cetona alifática e o aceitador de aldeído. Num modo preferido do método de síntese anterior, as moléculas de anticorpo ou moléculas contendo suas porções de local de combinação de anticorpo são segregadas pelo hibridoma 38C2, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12005 ou pelo hibridoma 33F12, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12004.

Um modo alternativo do invento é dirigido a um processo para realização de uma reacção de adição aldólica por formação de uma mistura reaccional por mistura de um doador de cetona alifática, um aceitador de aldeído e uma quantidade cataliticamente eficaz de anticorpos monoclonais ou porções contendo paratopo dos anticorpos monoclonais num meio aquoso a um valor de pH entre cerca de 6 e 10. Os anticorpos monoclonais ou suas porções contendo paratopo são susceptíveis de serem gerados por imunização de um animal imuno-responsivo com um imunogénio que inclui um hapteno de 1,3-dicetona da fórmula geral:

5 acoplado a uma proteína transportadora e são de um tipo que inclui uma lisina com um grupo ε-amino que reage com o doador de cetona alifática para formar um intermediário de enamina. Após a mistura reaccional ser formada, esta é mantida sob condições de reacção biológica por um período de tempo suficiente para que o intermediário de enamina reaja com o aceitador de aldeído para formar um produto de adição aldólica.

Outro aspecto do invento é dirigido a um método para preparação de células que, quando cultivadas num meio, produzem moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo que catalisam uma reacção de adição aldólica entre um doador alifático e um aceitador de aldeído. O método inicia-se pela imunização de um animal com um imunogénio que inclui um hapteno de 1,3-dicetona da fórmula geral 8 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ ο ο

ΗΟ

Depois, ο animal é mantido por um período de tempo suficiente para que este segregue anticorpos que imuno-reagem com o ligando hapténico. Depois, genes que codificam moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo são transferidos das células produtoras de anticorpo do animal imunizado, mantido, para células hospedeiras para formar células hibridas. As células hospedeiras hibridas contêm genes de pelo menos duas fontes. As células hibridas formadas têm duas caracteristicas, viz., (i) produzem moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo a partir dos genes transferidos quando cultivadas e (ii) podem ser cultivadas substancialmente indefinidamente. Então, as células híbridas são cultivadas num meio de cultura apropriado, por um período de tempo suficiente para que produzam moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo. Em seguida, as moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo são recuperadas a partir das células híbridas cultivadas. Depois, as moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo obtidas são rastreadas quanto a actividade catalítica dirigida à reacção de adição aldólica. E finalmente, são cultivados clones da célula híbrida identificada que produz moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo que catalisam a reacção de adição aldólica entre o doador alifático e o aceitador de aldeído. Células híbridas preferidas são as células de hibridoma.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 ilustra o mecanismo geral de uma reacção de adição aldólica catalisada por aldolase da classe I (Lai et al. Science 183, 1204 (1974); Morris et al. Biochemistry 33, 12291 (1994); Rutter et al. Fed. Proc. Amer. Soc. Exp. Biol. 23, 1248 (1964)) (Enz, enzima; B, base). 9 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ A Figura 2 ilustra ο mecanismo de captura do grupo ε-amino essencial de um residuo Lys no bolso de ligação de anticorpo (Ab) utilizando o hapteno de 1,3-dicetona 5. A formação da amida viniloga covalente estável (desenho à direita em baixo) pode ser detectada a λ= 316 nm (ε é o coeficiente de extinção = 15000) . R= p(HOOC(CH2)3CONH)C6H4-. A Figura 3 ilustra a estrutura de hapteno de 1,3-dicetona que contém os elementos de uma armadilha quimica e entrópica. O bolso de ligação induzido com o hapteno 5 não impede a realização de um ângulo de Heathcock razoável para ataque do doador de aldol ao aceitador. É conseguida uma geometria de ataque apropriada por simples rotação de ambas a faces de enamina e aldeido. A Figura 4 ilustra a sintese do hapteno 5. Os passos são como se segue: (a) LDA [2 equivalentes (eq)], THF, 40°C, 1 hora; (b) brometo de 4-nitrobenzilo, hexametilfosforamida, -78°C a -40°C, 48% de rendimento; ® (I) Pd/C, H2, etanol; (ii) anidrido glutárico, CH2C12, 74% de rendimento. A Figura 5 ilustra o rastreio de anticorpos para a formação do intermediário de amida viniloga (estrutura em baixo à direita; Figura 2) . Adicionou-se hapteno 5, 5 eq, a soluções 20 mM de cada anticorpo em tampão PBS (pH= 7,5) num formato de placa de microtitulação. Os anticorpos com actividade catalítica de aldolase apresentaram o máximo de absorção típico da amida viniloga a 316 nm (exemplo mostrado na linha de cima), enquanto que nenhum dos anticorpos inactivos o fez (exemplo mostrado na linha de baixo). Dois anticorpos em 20 formaram intermediário de amida viniloga (estrutura em baixo à direita; Figura 2) e determinou-se subsequentemente que eram catalíticos. Este método eficiente proporciona um rápido rastreio de um grande número de anticorpos. A Figura 6 (A) ilustra a determinação do coeficiente de extinção do intermediário de amida viniloga (estrutura em baixo à direita; Figura 2). Adicionou-se uma concentração fixa (100 mM) de hapteno 5 às concentrações indicadas de anticorpo 33F12. O complexo de anticorpo enamina pôde ser facilmente detectado para uma concentração tão baixa quanto 2 mM. A Figura 6(B) ilustra que os sítios activos do anticorpo 38C2 foram titulados com acetilacetona. Fixou-se a concentração de 10 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ anticorpo (20 mM) . Adicionou-se acetilacetona (0 a 4,5 eq) e mediu-se a absorção a 316 nm. A intersecção das duas linhas corresponde a uma razão de 1,9 de acetilacetona para anticorpo 38C2, indicando que ambos os sítios de liqação do anticorpo formam o aducto de enamina (estrutura em baixo à direita; Figura 2). A Figura 7 ilustra a distribuição do produto da reacção catalisada por anticorpo de (6+7) com acetona após 30% de conversão com uma coluna de suporte quiral de HPLC de fase normal. A Figura 8 ilustra a reacção de adição aldólica de aldeído (6+7) e acetona, conforme monitorada ao longo de um período de 36 horas, na presença de 1,5% de catalisador. O catalisador mostrou múltiplas rotações (~ 2 rotações/hora) e virtualmente nenhuma inibição pelo produto. Pôde-se obter uma conversão de 90% na presença de um excesso de acetona (5% v/v) para minimizar a reacção de retroaldol. O balanço mássico perfeito (linha de cima) indica que, ao longo desse período, não ocorreram quaisquer reacções secundárias, tais como eliminação ou polimerização. Assim, a reacção de aldol catalisada por anticorpo é um método excepcionalmente suave de formação da ligação C-C. A Figura 9 ilustra a especificidade por substrato do anticorpo 38C2. Os parâmetros cinéticos kcat e KM de cada reacção foram calculados em relação ao aldeído (12 ou 6 + 7) . Os doadores de aldol (acetona, 2-butanona, 3-pentanona, 2-pentanona e acetaldeído) foram fixos numa concentração constante de 5% v/v em cada experiência. Os produtos 15/16 e 18/19 foram formados em proporções de 94 para 4 e 73 para 27, respectivamente. A Figura 10 ilustra a síntese de aldeídos (6+7) e 12 a partir da p-iodoanilina utilizando a reacção de Heck (Jeffrey et al. J. Chem. Comm. 1984, 1287). Obtiveram-se misturas de produto para a adição aldólica a partir dos compostos (6+7) e 12, utilizando NaOH, água e acetona. A Figura 11 ilustra a cinética da reacção de aldol utilizando os anticorpos 38C2 e 33F12 derivados do hapteno 5, aldeído 12 e acetona para proporcionar o composto 13/14 a pH= 7,02. kcat= 4,0 x 10~3 [min-1] ; KM= 5,8 [μΜ] . 11 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ A Figura 12 ilustra as cinéticas de aldol e retroaldol utilizando anticorpos 38C2 e 33F12 derivados a partir do hapteno 5, aldeido 12 e acetona para obter o composto 13/14. Seta para a frente: Reacção de aldol a pH= 7,44: kcat= 6.7 x 1CT3 [min-1]; KM= 17 [μΜ] ; Seta inversa: Reacção de retroaldol a pH= 7,22: kcat= 4,4 χ 1CT3 [min-1] ; KM= 54 [μΜ] . A Figura 13 ilustra a cinética da reacção inversa de aldol utilizando anticorpos 38C2 e 33F12 derivados de hapteno 5 e do produto 13/14 para formar aldeido 12 e acetona. Procedimento como se segue: Uma solução, 100 ml, pH= 7,22, contendo EDTA 0,2 mM, Tris 100 mM, 4,5 mg de álcool- desidrogenase de levedura, 0,43 mg de NADH e β-hidroxicetona 4 mM, foi introduzida em quatro poços de uma placa de microtitulação. Os anticorpos 38C2 e 33F12 (100 ml, 34,6 mM, tampão Tris, pH= 7,22) foram adicionados a dois poços diferentes; aos poços restantes adicionaram-se apenas 100 ml de tampão, que forma os brancos. Mediu-se a absorvância de ultravioletas a 340 nm com intervalos de 15 minutos durante 24 horas. Subtraiu-se a absorvância dos brancos às reacções catalisadas, e determinou-se a velocidade utilizando ε= 6220 M-1 cm-1. Reacção inversa de aldol a pH= 7,22; kcat= 3.7 χ 10-3 [min-1]; KM= 46 [μΜ] .

Descrição detalhada:

Os haptenos são desenhados tanto para capturar o resíduo Lys requerido no centro activo do anticorpo, para induzir o anticorpo a formar o intermediário de enamina essencial, como para induzir os sítios de ligação apropriados para os dois substratos, para vencer a barreira entrópica intrínseca a esta reacção bimolecular. O hapteno simples de 1,3-dicetona 5 proporciona elementos para uma armadilha tanto química como entrópica, conforme ilustrado na Figura 2. Em água, a forma ceto do hapteno mostrada predomina sobre a forma de enol numa razão de 3 para 1. (M. Moriyasu, et al., J. Chem. Soc. Perkin

Trans. II (1986): pág. 515.) As coordenadas da reacção de adição aldólica e o mecanismo de reacção esperado, quando o hapteno interactua com alguns anticorpos, partilham vários intermediários comuns. Em ambos os casos, forma-se um intermediário de carbinolamina tetraédrico que se desidrata para dar o imínio catiónico que tautomeriza na enamina. Esperava-se que anticorpos induzidos de acordo com o mecanismo de reacção hapténico estabilizassem os análogos de estado de transição e os intermediários catiónicos ao longo da 12 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ coordenada de reacção de uma reacção de aldol. A força motriz para a reacção do hapteno de 1,3-dicetona com o anticorpo é a formação de uma amida viniloga covalente estável ou enamina conjugada entre o hapteno e o grupo ε-amino da lisina. Os cálculos utilizando as regras de Woodward para enonas indicaram que a amida viniloga teria um máximo de absorção numa região do espectro dos ultravioletas apropriada para permitir a sua identificação, Àmáx= 318 nm. (E. Pretsch, et al., Tables of Spectral Data for Structure Determination of Organic Compounds, (Springer-Verlag, Berlin, ed. 2, 1989), pág. U20.) A estabilidade e as características espectrais deste tipo de composto foram anteriormente assinaladas nos estudos de acetoacetato-descarboxilase por Westheimer e colaboradores. (W. Tagaki, et al., Biochemistry (1968): vol. 7, pág. 905.) Esperávamos uma vantagem entrópica por incorporação do segundo substrato (aceitador de aldol) na armadilha tipica de dicetona. Tem sido sugerido que os efeitos entrópicos podem proporcionar tanto quanto 108 a 1011 em aceleração da velocidade de enzimas naturais. (M.I. Page et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1971): vol. 68, pág. 1678 .)

Um exemplo preferido da reacção revelada é a adição aldol de acetona a derivados de 3-fenilpropionaldeido. O segundo substrato é representado pela porção 3-fenilpropiononilo do hapteno. A amarração dos dois substratos, no hapteno de dicetona, apresentaria um complexo de substrato onde o ângulo de Heathcock para ataque da enamina no aldeído seria distorcido até ao extremo de 90°, no estado de transição determinante da velocidade de formação da ligação C-C. (E.P. Lodge et al., J. Am. Chem. Soc. (1987): vol. 109, 3353.) Não era de esperar nem isto provou ser um impedimento importante na reacção catalítica, porque a rotação de ambas as faces de enamina e aldeído deveria proporcionar um ângulo de Heathcock, conforme ilustrado na Figura 3. O conceito central do invento aqui revelado é que catalisadores utilizando um mecanismo de reacção covalente podem ser induzidos por imunização com compostos reactivos. Exemplos deste principio aqui proporcionados incluem mas não estão limitados aos mecanismos de base de Schiff ou enamina. Esta abordagem é particularmente útil sempre que a química a ser efectuada está para além da que é facilmente conseguida, mesmo por uma concertação de interaeções não covalentes. 13 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ

Exemplos: Síntese do composto 3 (Figura 4)

3

Composto 3: Dissolveu-se di-isopropilamina (1,43 ml, 2,1 eq), destilada sobre CaH2, em THF seco (80 ml). Arrefeceu-se a solução até 0°C e adicionou-se lentamente butil-lítio 1,6 M em hexano (6,4 ml, 2,1 eq) . A solução incolor de LDA (lítiodi-isopropilamida) foi mantida a 0°C durante 30 minutos e adicionou-se hexametilfosforamida (0,8 ml, 0,9 eq) . Adicionou-se lentamente 2,4-pentanodiona (0,5 ml, 1,0 eq; Aldrich) destilada de fresco, dissolvida em THF seco (20 ml) . Aqueceu-se a mistura a 40°C durante 1 h. A solução amarelada do dianião foi arrefecida até -78°C e adicionou-se lentamente brometo de 4-nitrobenzilo (1,052 g, 1,0 eq; Aldrich Chemical Company), dissolvido em THF seco (20 ml). Elevou-se a temperatura lentamente (~ 20 min.) até -40°C (controlo por TLC; AcOEt/éter de petróleo 1:3). Verteu-se a mistura reaccional numa mistura arrefecida em gelo de CH2C12 e de solução saturada de NH4C1 (100 ml) . Após separação de fases, reextraiu-se a fase aquosa com CH2C12. Secaram-se as fases orgânicas combinadas sobre MgS04 e evaporou-se o solvente. Purificou-se o resíduo por cromatografia de coluna (Si02, 230-400 mesh, AcOEt/Éter de petróleo 1:3) para dar 3 (544 mg, 48%) como um sólido amarelado, que pode ser recristalizado em AcOEt/éter de petróleo 1:3. RMN XH (CDCI3, 300 MHZ) : forma de enol d 8,12-8,19 (m, 2H), 7,33-7,41 (m, 2H) , 5,47 (s, 1H), 3,05 (t, J= 7,5, 2H) , 2,65 (t, J= 7,5, 2H) , 2,08 (s, 3H) ; RMN 13C (CDC13, 125 MHz) : forma de enol d 192, 7, 190,3, 148,5, 129,2, 123,7, 100,1, 39,2, 30,9, 24,5; forma ceto parcial d 146,5, 57,7, 44,2, 28,9; IV (simples) nmax 3078, 2928, 2853, 1706, 1600, 1516, 1343, 1108, 854 cm"1; MS m/z (intensidade relativa) 236 (M+H+, 100); Ci2Hi3N04 (235,239). 14 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ Síntese de hapteno de dicetona 5 (Figura 4)

Composto 5: Dissolveu-se a dicetona 3 (100 mg, 0,43 mmol) em EtOH (10 ml). Adicionou-se 10% de Pd/C (45 mg, 0,1 eq) e hidrogenou-se a mistura durante 45 minutos sob forte agitação (TLC: CH2Cl2/Et20 1:3). Filtrou-se a suspensão através de Celite, lavou-se com CH2C12 (—50 ml) e secou-se sobre MgS04. A evaporação do solvente deu a amina em bruto 4, que foi redissolvida em CH2C12 (15 ml). Arrefeceu-se a solução até 0°C e adicionou-se anidrido glutárico (53 mg, 1,1 eq). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1,5 h (TLC: CH2C12/Et20 1:3). Extraiu-se a solução com NaOH 0,2 N. Acidificou-se a fase aquosa até pH= 1,0 com HC1 2 N e extraiu-se 3 vezes com AcOEt (15 ml). Secaram-se as fases orgânicas combinadas sobre MgS04 e evaporou-se o solvente para dar 5 (100 mg, 74%) como um sólido branco. RMN 1h (CDC13, 500 MHz) : forma de enol d 8,08 (s, 1H), 7,39-7,42 (m, 2H), 7,06-7,10 (m, 2H), 5,47 (s, 1H), 2,86 (t, J= 8,1, 2H), 2,54 (t, J= 8,1, 2H), 2,39-2,44 (m, 4H), 2,03 (s, 3H), 1,98-2, 04 (m, 2H) ; forma ceto d 8,13 (s, 1H), 7,39-7, 42 (m, 2H), 7,06-7,10 (m, 2H), 3,56 (s, 2H) , 2,78-2,85 (m, 4H) , 2, 39-2,44 (m, 4H), 2,19 (s, 3H), 1,94-1, 98 (m, 2H) ; RMN 13C (CDCI3, 125 MHz): forma de enol d 193,3, 191,3, 178.0, 171,3, 136,7, 135,9, 128,7, 120,3, 100,1, 36,9, 36,0, 33.0, 30,8, 24,8, 20,6; forma ceto parcial d 57,8, 45,1, 32,9, 28,7, 19,6; IV (KBr) nmax 3325, 3113, 3044, 2935, 1696, 1658, 1602, 1531, 1413, 1311, 918, 830, 683 cm-1; MS m/z (intensidade relativa) 320 (M+H+, 92); C17H21NO5 (319,357).

Nota: À volta de 83% da dicetona 5 estão na forma ceto em CHCI3.

Acoplamento do hapteno à proteína transportadora O hapteno 5 foi acoplado à proteína transportadora habitualmente utilizada, hemocianina de lapa Fissurella, de acordo com as condições conforme especificadas em Harlow et. al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, 79. 15 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ

Produção de anticorpos a partir de linhas de células de hibridoma

Após imunização de 129 ratinhos GIX+ (Scripps Research Institute), obtiveram-se 20 hibridomas, produzindo anticorpos para 5, com métodos padrão conforme descrito em G. Kohler et al. Nature 256, 495 (1975). Os anticorpos de cada linha de células foram depois purificados por precipitação de sulfato de amónio, permuta aniónica e cromatografia de afinidade de proteína G, conforme descrito em V.E. Gouverneur et al., Science 262, 204 (1993); isolaram-se 20 anticorpos.

Rastreio dos anticorpos (Figura 5)

Todos os 20 anticorpos foram rastreados, num ensaio em placa de microtitulação, quanto à sua capacidade para formar a amida viníloga estável proposta, como se mostra na Figura 2, por incubação de anticorpo 20 mM com 100 mM do hapteno de dicetona 5 (Figura 5) . Dois anticorpos, 38C2 e 33F12, demonstraram um máximo de absorção forte a 316 nm característico da amida viníloga proposta, como se mostra na

Figura 2, aproximando-se do máximo de absorção calculado na ausência de proteína de 318 nm (Figura 5). A incubação de 5 com lisina sob condições idênticas não resultou em qualquer aumento de absorvância.

Determinação do coeficiente de extinção (Figura 6A) O coeficiente de extinção do complexo anticorpo-enamina determinado foi 15000 cm-1 hf1 após subtracção da absorvância do anticorpo (Fig. 6A), aproximando-se do observado na reacção de acetoacetopiruvato com a enzima acetoacetato- descarboxilase, 19000 cm-1 M_1. (W. Tagaki, et al.,

Biochemístry (1968): vol. 7, pág. 905.)

Determinação_da_estequiometria_do_complexo_de anticorpo/enamina via titulação com acetilacetona (Figura 6B)

Porque é de esperar que os anticorpos formem uma enamina com acetona na reacção de síntese, a observação do cromóforo da amida viníloga não deveria ser dependente da porção de aceitador de aldol (benzilo) do hapteno. Testámos a acetilacetona como a dicetona mínima que se esperava que gerasse o cromóforo. Ambos os anticorpos reagiram com este 16 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ composto e produziram ο espectro de absorvância esperado. Para determinar a estequiometria do complexo anticorpo/enamina, foi realizada uma titulação do anticorpo com acetilacetona, de acordo com as condições de Tagaki et al. Biochemistry 7, 905, 1968. Assumindo que a reacção que forma a enamina é irreversível, a estequiometria da titulação deveria corresponder à concentração de centros activos do anticorpo. A titulação dá uma razão de acetilacetona para anticorpo de 1,9, indicando que cada um dos dois sítios de ligação de antigénio idênticos do anticorpo forma o aducto de amida viníloga (Figura 6B) . A catálise da formação da amida viníloga ficou essencialmente completa por mistura do anticorpo com hapteno e suficientemente rápida tal que a determinação da velocidade desta reacção requererá estudos cinéticos de fluxo interrompido.

Adição de doador de aldol a aldeídos na presença de anticorpo para produzir β-hidroxicetona (Figura 9)

Os anticorpos 38C2 e 33F12 foram ensaiados quanto à sua capacidade para catalisar a adição de doadores de aldol (acetona, 2-butanona, 3-pentanona e 2-pentanona) aos aldeídos 6, 7 e 12 (Figura 9). Um procedimento típico é como se segue: introduziram-se 100 μΐ de solução tampão pH 7,5 com EDTA 0,2 mM, Tris 100 mM e uma concentração de doador de aldol de aprox. 5% v/v (volume de doador/volume de solvente) em n poços de uma placa de microtitulação. Adicionaram-se os anticorpos 38C2 e 33F12 (100 μΐ, 34 μΜ, Tampão Tris, pH= 7,5) a poços diferentes; aos poços restantes adicionaram-se apenas 100 ml de tampão, que foram os brancos. Mediu-se a absorvância de ultravioletas a 340 nm com intervalos de 15 minutos durante 24 horas. Subtraiu-se a absorvância dos brancos às reacções catalisadas, e determinou-se a velocidade utilizando ε= 6220 M”1 cm-1. Os anticorpos 38C2 e 33F12 tinham a mesma kcat= 4,53 x 10“3 min-1, o que se correlaciona bem com as medições de HPLC. O consumo e a produção da β-hidroxicetona foram monitorizados por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (HPLC) como se segue: utilizou-se uma coluna RP-C18 (MICROSORB-MV, 0,45 cm por 22 cm) com um programa isocrático de 75/25; H20 (0,1% de ácido trifluoroacético)/ H20:acetonitrilo 1:1, a 1,5 ml/minuto, monitorado a 254 nm. Os tempos de retenção do aldeído 12 e do produto aldol (13,14) são 6,35 e 8,78 minutos, respectivamente. Para os estudos cinéticos, no estudo da reacção de adição aldólica, fixou-se a concentração de cetona a 5% v/v e fez-se variar a concentração 17 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ de 12 ou de 6 + 7 de 30 a 200 μΜ. Os anticorpos foram também ensaiados após um passo de purificação adicional sobre uma coluna de permuta de aniões com resultados idênticos.

Análise da reacgão de retroaldol (Figura 13)

Ambos os anticorpos demonstraram catálise da reacção de adição aldólica que seguiu uma cinética de Michaelis-Menten. A capacidade destes dois anticorpos para gerar acetona e aldeido 3 a partir da β-hidroxicetona 4 na reacção de retroaldol foi monitorada, por seguimento da diminuição na absorvância de UV a 340 nm, num ensaio enzimático acoplado com álcool-desidrogenase e dinucleótido de β-nicotinamida adenina, forma reduzida (NADH). Um procedimento tipico é como se segue: Introduziu-se uma solução, 100 ml, pH= 7,5, contendo EDTA 0,2 mM, Tris 100 mM, 4,5 mg de álcool-desidrogenase de levedura, 0,43 mg de NADH e β-hidroxicetona 4 mM (13,14) em quatro poços de uma placa de microtitulação. Adicionaram-se os anticorpos 38C2 e 33F12 (100 ml, 34,6 mM, tampão Tris, pH= 7,5) a dois poços diferentes; aos poços restantes, adicionaram-se apenas 100 ml de tampão, que foram os brancos. Mediu-se a absorvância de ultravioletas a 340 nm com intervalos de 15 minutos durante 24 horas. Subtraiu-se a absorvância dos brancos às reacções catalisadas, e determinou-se a velocidade utilizando ε= 6220 M”1 cm-1. Os anticorpos 38C2 e 33F12 tinham a mesma kcat= 4,53 χ 10“3 min”1, o que se correlaciona bem com as medições de HPLC. A produção de aldeído 12 foi monitorada pela sua redução subsequente por álcool-desidrogenase e consumo de NADH. A reacção de retroaldol foi também estudada por HPLC e obtiveram-se os mesmos resultados. Os valores da constante de Michaelis KM e da constante de velocidade catalítica foram 54 μΜ e 4,4 χ IO”3 min”1, respectivamente para o anticorpo 38C2. Os restantes 18 anticorpos foram incapazes de catalisar as reacções de síntese e de retro-síntese de aldol, indicando que apenas os que formaram o intermediário crítico eram activos (Figura 13).

Inibição de substrato na reacgão de aldol A capacidade do hapteno 5 e da acetilacetona para inibir a reacção de aldol foi caracterizada por envolver um intermediário de enamina. Quando se proporcionaram 3 equivalentes quer do hapteno 5 quer de acetilacetona, antes dos ensaios de adição aldólica ou retroaldol, a actividade 18 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ catalítica foi completamente inibida, mostrando que o aprisionamento do intermediário de enamina com as 1,3-dicetonas impossibilita a catálise envolvendo o grupo ε-amino de Lys. Para estabelecer que a formação de enamina com o hapteno no ensaio de captura e de acetona no ensaio catalítico estavam dependentes do mesmo resíduo Lys, anticorpos incubados com acetona foram tratados com NaBH4. A redução com NaBH4 do intermediário imina, formado na reacção de acetona, com o grupo ε-amino de Lys nos anticorpos, resultaria na isopropilação irreversível da amina essencial (Chang et al. Science 183, 1204 (1974); A.J. Morris et al. Biochemistry 33, 12291 (1994)). Após tratamento, os anticorpos foram completamente inactivados na sua capacidade para formar a amida viníloga com as dicetonas. Estas experiências proporcionam evidência de que o mecanismo de reacção e os resíduos induzidos com o hapteno de 1,3-dicetona são os mesmos que foram recrutados nas reacções catalíticas. As aldolases de anticorpo mostraram um intervalo de pH óptimo largo entre 6 e 10, aproximando-se do observado com aldolases naturais da classe I.

Eficiências dos doadores de aldol

Os anticorpos aceitam acetona, fluoroacetona, cloroacetona, 2-butanona, 3-pentanona, 2-pentanona e di-hidroxiacetona, como substratos de doador de aldol. Em reacções com 2-butanona e 2-pentanona, os anticorpos exibem algum controlo da regio-selectividade da adição aldólica por formação preferencial da enamina mais substituída. A eficiência relativa de catálise com estes substratos diminui 42 vezes conforme é reflectido por kcat/KM na série de acetona até pentanona (Figura 9, entradas 1, 3 a 5). Os anticorpos não conseguiram aceitar acetaldeído como um doador o que demonstra que a adição aldólica é dirigida com uma cetona como o doador de aldol. Os dois catalisadores que isolámos estão limitados por dirigirem a adição aldólica com acetona ou com cetonas alifáticas como doadores e com derivados de 3-fenilpropionaldeído como aceitadores.

Reacção de aldol com aceitador de 3-fenilpropionaldeído (6+7) para formar produtos de β-hidroxicetona (9,10) A reacção do aceitador de 3-fenilpropionaldeído (6+7) ramificado (Figura 9, entrada 1) com acetona foi a mais eficiente e mostrou pouca inibição do produto (Figura 8) . De 19 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ facto, menos de 1 por cento molar de catalisador é suficiente para conseguir uma conversão elevada de substrato num tempo relativamente curto. A reacção apenas produz o produto de aldol desejado à medida que cada mole de aldeído consumido é convertida no produto de β-hidroxicetona (9,10) (Figuras 8 e 9) . Para esta reacção, determinou-se a velocidade da reacção residual não catalisada, a pH= 7,5, sob condições idênticas às utilizadas nos ensaios de anticorpo, knão cat= 2,28 x 10“7 M_1 min-1 (Reymond et al. Tetrahedron Lett. 36, 2575 (1995)). Isto permite determinar a eficiência da catálise mediada por anticorpo. Para ambos os anticorpos, 38C2 e 33F12, (kcat/KM)/knão cat é -109. A eficiência da catálise é devida, em grande parte, a uma vantagem entrópica na reacção catalisada por anticorpo o que se reflecte numa molaridade efectiva elevada, kcat/knã0 cat >105 Μ. A eficiência catalítica (kcat/KM) de aldolases de anticorpo é apenas -4000 vezes mais lenta do que a da enzima muito estudada frutose-1,6-bisfosfato-aldolase (Chang et al. Science 183, 1204 (1974); Tolan et al. Biochemistry 33, 12291 (1994)). A eficiência catalítica do anticorpo 38C2 para a reacção indicada na entrada 1, Figura 9, é 6 4 vezes mais elevada do que a obtida com catálise pela enzima 2-desoxirribose-5-fosfato-aldolase.

Distribuição de produto dos produtos de aldol

Caracterizou-se a distribuição de produto da reacção catalisada por anticorpo de (6+7) com acetona. Após uma conversão de 30%, a distribuição de produto foi determinada com uma coluna de suporte quiral de HPLC de fase normal (Figura 7). Ambos os anticorpos catalisam a adição diastereo-selectiva de acetona à re-face de (6+7), independentemente da estereoquímica em C-2 deste substrato. Os quatro diastereoisómeros foram separados numa coluna DAICEL Chiralpak OJ com um programa isocrático 7/1; hexano/etanol, 1 ml/minuto, 254 nm. Os tempos de retenção para os quatro isómeros foram: 19,74 (4R,5R), 23,32 (4R,5S), 25,15 (4S,5R) e 27,91 minutos (4S,5S) . A configuração relativa tinha sido determinada anteriormente [Utilizou-se uma coluna RP-C18 (MICROSORB-MV, 0,45 cm por 22 cm) com um programa isocrático de 77/23; H20 (0,1% de ácido trifluoroacético)/ H20:acetonitrilo 1:1, a 1,5 ml/minuto, monitorado a 254 nm]. Os tempos de retenção para o aldeído (6+7) e para a β-hidroxicetona (13,14) são 19,20 e 21,92 minutos, respectivamente. A configuração absoluta foi deduzida a partir de uma experiência onde o catalisador era 2-desoxirribose-5-fosfato-aldolase (DERA). A DERA forma 20 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ exclusivamente ο produto de aldol possuindo a configuração (S) em C-4 (C.-H. Wong e G.M. Whitesides, Enzymes in Synthetic

Organic Chemistry (Permagon, Oxford, 1994). O produto de aldol gerado por DERA consiste de uma mistura 1:4,5 de (4S,5R)-(composto 9) (92% de excesso diastereomérico, de) e (4S,5S)- (composto 10) (>95% de). Os parâmetros cinéticos desta transformação particular foram koat= 4,5 x 10“2 min-1 e KM= 3400 mM. As reacções de aldol seguem o modo de ataque de Cram-Felkin no (S) — (6) para gerar o produto (4S, 5S) —9 e o modo de ataque anti-Cram-Felkin no (R)—(7) para gerar o produto (4S,5R)-10. Os anticorpos formaram estes produtos com rendimentos químicos similares, não demonstrando qualquer resolução cinética do aldeído racémico na adição aldólica. Os anticorpos distinguem-se eles próprios pela sua capacidade para controlar a selectividade diastereofacial da reacção, o que reflecte a capacidade dos catalisadores para se orientarem (6+7) no bolso de ligação do anticorpo, em relação ao anticorpo nucleófilo-enamina de acetona. Esta ligação diferencial é também reflectida nas diferenças em KM para (6+7) nos anticorpos (Figura 9). Síntese do composto 20 (Figura 10)

20

Composto 20: Suspenderam-se 1,0 equivalentes de 4-iodoanilina (Aldrich) em diclorometano 0,10 molar e arrefeceu-se até 0°C. Em seguida, adicionaram-se 1,1 equivalentes de anidrido acético e 1,1 equivalentes de trietilamina e agitou-se a mistura durante 2 horas a 0°C. Após a reacção estar completa, conforme monitorizada por tlc, extinguiu-se a mistura com lavagens sucessivas de solução saturada de cloreto de amónio, água e secou-se sobre sulfato de magnésio. Evaporou-se o composto e purificou-se por cromatografia "flash" para dar o composto 20 com um rendimento global de 81%. 21 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ Síntese de compostos (6+7) (Figura 10)

Compostos 6+7: Procedimento utilizando a reacção de Heck conforma adaptada de Jeffrey et al. J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1287 (1984): suspenderam-se 1,0 equivalentes de composto 20 em dimetilformamida 0,10 molar a 25-30°C sob azoto. Em seguida, adicionaram-se 1,1 equivalentes de bicarbonato de sódio, 1,1 equivalentes de 2-metil-2-propen-l-ol (Aldrich) e 2% molar de PdCl2 e agitou-se a mistura durante 12 horas. Após a reacção estar completa, conforme monitorado por tlc, diluiu-se a mistura com acetato de etilo e extinguiu-se com lavagens sucessivas de solução saturada de cloreto de amónio, água e secou-se sobre sulfato de magnésio. Evaporou-se o composto e purificou-se por cromatografia "flash" para dar os compostos 6+7 com um rendimento global de 81%. Síntese de compostos (12) (Figura 10)

Compostos 12: Procedimento utilizando a reacção de Heck conforme adaptada de Jeffrey et al. J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1287 (1984): suspenderam-se 1,0 equivalentes de composto 20 em dimetilformamida 0,10 molar a 25-30°C sob azoto. Em seguida, adicionaram-se 1,1 equivalentes de bicarbonato de sódio, 1,1 equivalentes de álcool alilico (Aldrich) e 2% molar de PdCl2 e agitou-se a mistura durante 12 horas. Após a reacção estar completa, conforme monitorado por tlc, diluiu-se a mistura com acetato de etilo e extinguiu-se com lavagens sucessivas de solução saturada de cloreto de amónio, água e secou-se sobre sulfato de magnésio. Evaporou-se o composto e purificou-se por cromatografia "flash" para dar os compostos 12 com um rendimento global de 81%. 22 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ Síntese de compostos (8-11; 13,14 - Figura 10)

Tipicamente, agitaram-se 50 a 100 mg de aldeído, 1 ml de cetona, 4 ml de h20 e 10 ml de sol. saturada de NaOH durante

1 hora. Separaram-se os produtos e purificaram-se por HPLC preparativa de fase reversa.

Caracterização da especificidade catalítica:

Ainda que as enzimas naturais exibam uma ampla especificidade no que se refere ao aceitador de aldol, o doador de aldol está usualmente limitado ao substrato natural. O aspecto mais limitante da aplicação de enzimas naturais em síntese é a sua aceitação um tanto fraca de uma gama de substratos. Em contraste, a especificidade por substrato do doador e dos anticorpos aldolase aqui revelados está grandemente aumentada em comparação com as enzimas naturais. Por exemplo, entre as cetonas estudadas para catálise de anticorpo (Figura 9) apenas a acetona é um substrato para uma enzima natural. Em contraste, as aldolases de anticorpo podem utilizar vários doadores e aceitadores de aldol. Os anticorpos aceitam acetona, fluoroacetona, cloroacetona, 2-butanona, 3-pentanona, 2-pentanona e di-hidroxiacetona, como os substratos de doador de aldol. Em reacções com 2-butanona e 2- pentanona, os anticorpos exibem algum controlo da regio-selectividade da adição aldólica por formação preferencial da enamina mais substituída. A eficiência relativa de catálise com estes substratos diminui 42 vezes conforme reflectido pelo kCat/KM na série acetona até pentanona (Figura 9). A falência dos anticorpos em aceitarem acetaldeído como um doador demonstra que a adição aldólica é dirigida com uma cetona como doador de aldol. Em princípio, o hapteno de dicetona deveria induzir anticorpos que reagissem em qualquer das duas posições ceto do hapteno 5, gerando desse modo catalisadores que dirigem a adição aldólica em qualquer direcção (Figura 9) . Os dois catalisadores que isolámos estão limitados pelo facto de dirigirem a adição aldólica com acetona ou cetonas alifáticas como doadores e com derivados de 3-fenilpropionaldeído como aceitadores. O rastreio de anticorpos adicionais deverá proporcionar catalisadores para a reacção onde derivados de 3- fenilpropanona são aceites como doadores de aldol e aldeídos alifáticos servem como aceitadores, conforme indicado na Figura 9. 23 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ

Depósito de hibridomas:

Os depósitos para o hibridoma 38C2 (JW 3862), possuindo o número de acesso na ATCC HB12005 e para o hibridoma 33F12 (JW 33F12), possuindo o número de acesso na ATCC HB12004, foram efectuados em conformidade com os requisitos do Tratado de Budapeste de que a duração dos depósitos deverá ser por 30 anos desde a data de depósito no depositário ou durante a vigência de uma Patente dos E.U.A. que emane deste pedido de patente, o que for mais longo. A linha de células será reabastecida se se tornar não viável no depositário.

Lisboa,

Claims

ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo que catalisam uma reacção de adição aldólica entre um doador de cetona alifática e um aceitador de aldeido e que são caracterizadas por serem susceptiveis de serem geradas por imunização de um animal imuno-responsivo com um imunogénio que inclui um hapteno de 1,3-dicetona com a fórmula geral:

5 acoplado a uma proteína transportadora e adicionalmente caracterizadas por possuírem uma lisina com um grupo ε-amino e por serem submetidas a inibição com o hapteno de 1,3-dicetona por formação de um complexo entre o hapteno de 1,3-dicetona e o grupo ε-amino da lisina do referido anticorpo catalítico, o referido complexo sendo seleccionado de entre o grupo consistindo numa amida viníloga covalente estável, uma enamina conjugada e uma base de Schiff.
2. Moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 onde: as referidas moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo controlam a selectividade diastereofacial da reacção de adição aldólica em ambas as direcções de Cram-Felkin e anti-Cram-Felkin.
3. Moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 onde: o referido doador de cetona alifática é seleccionado de entre um grupo representado pelas estruturas seguintes: n O O O

ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ 2/5
4. Moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 onde: o referido aceitador de aldeído é seleccionado de entre um grupo representado pelas estruturas seguintes:

6 7 HjC 0

/ \ O Ή 12
5. Moléculas de acordo com a reivindicação 1 que são segregadas pelo hibridoma 38C2, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12005.
6. Moléculas de acordo com a reivindicação 1 que são segregadas pelo hibridoma 33F12, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12004.
7. Células que quando cultivadas num meio produzem moléculas de anticorpo monoclonal ou moléculas contendo porções de local de combinação de um anticorpo que catalisam uma reacção de adição aldólica entre um doador de cetona alifática e um aceitador de aldeído e que são caracterizadas por possuírem uma lisina com um grupo ε-amino e por serem submetidas a inibição com o hapteno de 1,3-dicetona da fórmula geral: HO

5 ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ 3/5 por formação de um complexo entre o hapteno de 1,3-dicetona e o grupo ε-amino da lisina do referido anticorpo catalítico, o referido complexo sendo seleccionado de entre o grupo consistindo numa amida viníloga covalente estável e uma enamina conjugada.
8. Células de acordo com a reivindicação 7 que adicionalmente segregam para o meio de cultura as moléculas de anticorpo monoclonal ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo.
9. Células de acordo com a reivindicação 8 que são células de hibridoma.
10. Células de hibridoma de acordo com a reivindicação 9 que são as do hibridoma 38C2, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12005.
11. Células de hibridoma de acordo com a reivindicação 9 que são as do hibridoma 33F12, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12004.
12. Método para catalisar uma reacção de adição aldólica entre um doador de cetona alifática e um aceitador de aldeído, o método compreendendo os passos de: Passo A: misturar uma quantidade cataliticamente eficaz das moléculas de anticorpo monoclonal ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, com o referido doador de cetona alifática e o referido aceitador de aldeído, num meio aquoso para formar uma mistura reaccional; e depois Passo B: manter a referida mistura reaccional do referido Passo A por um período de tempo suficiente para as referidas moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo catalisarem a referida reacção de adição aldólica entre o referido doador de cetona alifática e o referido aceitador de aldeído.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, onde as referidas moléculas de anticorpo ou moléculas contendo suas porções de local de combinação de anticorpo são segregadas pelo hibridoma 38C2, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12005. ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ 4/5
14. Método de acordo com a reivindicação 12 onde as referidas moléculas de anticorpo ou moléculas contendo suas porções de local de combinação de anticorpo são segregadas pelo hibridoma 33F12, possuindo o número de acesso na ATCC HB 12004.
15. Processo para realização de uma reacção de adição aldólica compreendendo os passos seguintes: Passo A: num meio aquoso a um valor de pH entre cerca de 6 e 10, formar uma mistura reaccional por mistura de um doador de cetona alifática, um aceitador de aldeído e uma quantidade cataliticamente eficaz de anticorpos monoclonais ou porções contendo paratopos dos referidos anticorpos monoclonais, onde os referidos anticorpos monoclonais ou suas porções contendo paratopos são susceptíveis de serem gerados por imunização de um animal imuno-responsivo com um imunogénio que inclui um hapteno de 1,3-dicetona com a fórmula geral:

5 acoplado a uma proteína transportadora e incluem uma lisina com um grupo ε-amino que reage com o doador de cetona alifática para formar um intermediário de enamina; e depois Passo B: manter a referida mistura reaccional sob condições de reacção biológica por um período de tempo suficiente para que o intermediário de enamina do referido Passo A reaja com o aceitador de aldeído para formar um produto de adição aldólica.
16. Método para preparação de células que quando cultivadas num meio produzem moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo que catalisam uma reacção de adição aldólica entre um doador de cetona alifática e um aceitador de aldeído, o método compreendendo os passos de: Passo A: imunizar um animal com um imunogénio que inclui um hapteno de 1,3-dicetona com a fórmula geral: ΕΡ Ο 870 014 /ΡΤ 5/5 JUJVOJUl 5 acoplado a uma proteína transportadora; depois Passo B: manter o referido animal por um período de tempo suficiente para que o referido animal segregue anticorpos que imunorreagem com um ligando hapténico; depois Passo C: transferir os genes que codificam moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo a partir das células produtoras de anticorpo do referido animal mantido, imunizado, do referido passo (B), para células hospedeiras para formar células híbridas que contêm genes de pelo menos duas fontes, e células híbridas formadas que (i) produzem moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo a partir dos referidos genes transferidos quando cultivadas e (ii) podem ser cultivadas substancialmente indefinidamente; depois Passo D: cultivar as células híbridas num meio de cultura apropriado por um período de tempo suficiente para que essas células híbridas produzam moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo; depois Passo E: recuperar moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo a partir de células híbridas cultivadas; depois Passo F: rastrear as moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo obtidas que catalisam a reacção de adição aldólica; e depois Passo G: crescer clones da referida célula híbrida identificada que produzem moléculas de anticorpo ou moléculas contendo porções de local de combinação de anticorpo que catalisam a reacção de adição aldólica entre o doador alifático e o aceitador de aldeído.
17. Método de acordo com a reivindicação 16 onde as células formadas no referido Passo C são células de hibridoma. Lisboa,