PT86144B - Processo para a preparacao de uma proteina tendo actividade semelhante a factor g-tsf humano e de composicoes farmaceuticas que o contem - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DUMA PROTEÍNA TENDO ACTIVIDADE SEMELHANTE A FACTOR G-TsF HUMANO E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE O CONTÊM que apresenta

SANDOZ, S.A. suiça, industrial, com sede em Basileia, Suiça.

3_E_£_U_M_O

A invenção refere-se ao processo para a preparação de factor supressor de células T (G-TsF) sob a forma substancialmente pura. Para isso, isolou-se, clonou-se e expri iniu-se ácido nucleico que codifica G-TsF e o seu peptido precursor em vários sistemas. Recupera-se o G-TsF de culturas transformadas para uso em diversas modalidades terapêuticas.

A pretente invenção diz respeito ao processo cara a purificação duma proteína supressora de células T a par tir de fontes naturais, à sua preparação mediante métodos reuombinantes e à sua utilização.

1.- Enquadramento geral

Surgiu uma nova família de factores polipéptidos que regulamentam o crescimento e diferenciação das células.

podem-se distinguir três linhas de pesquisa principais, as quais conduziram a factores relacionados com os polipéptidos da presente invenção, nomeadamente os factores β de transformação de crescimento (1'GF-^s), os factores provocadores de cartilagem (CIFs) e o factor supressor de células T derivado de glioblastoma (G-TsF). A presente invenção dirige-se e aplica-se principalmente ao factor supressor de células T derivado de glioblastoma (G-TsF). Como se torna aparente após os dados prioritários que são reivindicados pela invenção, o G-TsF podia ser idêntico aos TGF-/32 e/ou CIF-B.

1.1.- Os factores β de transformação de crescimento (TGF-^s)

Os TGF-ySs são homodímeros ligados a 25 Kd disulfβίο e heterodímeros originalmente purificados de plaquetas humanas. Encontraram-se igualmente outros factores que estão funcionalmente e/ou estruturalmente relacionados com os TGF-fls_t como por exemplo novas formas de TGF-/3s, activinas, ini binas e a substância inibidora de Mtiller (MIS) nos mamíferos, bem como o produto do complexo genético decapentaplégico em Drosophila.

A síntese destes polipéptidos faz-se normalmente como fazendo parte de precursores secretórios maiores como se deduz alguns deles mediante a análise de cDNAs correspondentes. A homologia destas proteínas umas com as outras reside principalmente nos domínios terminais C dos péptidos completos, nas partes que são geralmente clivadas do precursor para formar os dímer-os bioactivos maduros. Ê particularmente notável a conservação de cisteínas múltiplas envolvidas em intra-cadeias e inter-cadeias da formação da ligação de disu..

fetos. Comum a vários membros desta família de polipéptidos é o facto de aparentemente se envolverem em processos de diferenciação tais como embriogenese e reparação de tecidos.

Subsequentemente à primeira data prioritária r vindicada para a presente invenção, tornou-se aparente de que existem três formas de TGF-^, nomeadamente TGF-/91, TGFque resultam da combinação hcmodimérica e heterodimérica das sub-unidades βΐ e /32 (S. Cheifetz et al. Ce11 48 [Fevereiro 13, 19871 409-415)· 0 polipéptido origi nalmente descrito como sendo TGF-/3 consistia de facto em duas sub-unidades /31. As sub-unidades βΐ e β 2. estão mais proximamente relacionadas uma com a outra do que com quaisquer outros membros conhecidos da sua família genética e apresentam cerca de 70% na semelhança de sequência de aminoácidos nas suas metades de terminal N.

Outro aspecto notável dos membros da família TGF-β, que só muito recentemente surgiu, é o elevado grau da conservação por sequência, como por exemplo 99% entre as sequências TGF-βΐ humanas e dos ratos. Isto argumenta em prol do papel biológico crítico dos TGF-jâs nas espécies.

A função biológica dos TGF'-/Js ainda não foi comple tamente esclarecida embora, como atrás se mencionou, seja muito diversificada. Deste modo in vitro eles inibem a proliferação de linhas de células epiteliais derivaâas de tumores normais, mas provocam a proliferação de algumas células mesenquimas como uma possível resposta secundária a uma elevada recuperação de mitogenes autocrinos. A recuperação de fenotipos específicos por células com um potencial de diferenciação é frequentemente profundamente alterada pelos TGF-fts. Deste modo eles bloqueiam a adipogénese, miogénese e lie matopoiése enquanto promovem a condrogénese e a diferenciação de células epiteliais in vitro, e podem igualmente modular funções diferenciadas em linfócitos, células granulosas

e adrenocorticais.

Cs efeitos dos TGF-/$s in vivo têm sido menos tigados mas uma vez que eles se encontram presentes, em veis relativamente elevados, ( ' * va e em plaquetas sanguíneas, torna-se-lhe similar o mento activo na génese tas ao desenvolvimento trização de feridas.

invés i /

m.em centros cLe diferenciação act:.envolvi·· de muitos tipos de tecidos em resposnormal bem como em respostas à cicaNão existem dúvidas de que muitas células mesenqu:.· mais e epiteliais, cuja diferenciação e proliferação são afec· tadas pelos TGF-^s, respondem a estes factores com uma elevada expressão de fibronectina, vários tipos de colageno e outras proteínas de adesão de células. In vivo, a administração subcutânea provoca uma abundante deposição de colageno.

Deste modo os TGF-^s parecem afectar a diferenciação e a morfogénese por influenciarem ou regularem a interacção de células com a matriz extracelular, como por exemplo controlando a abundância e arquitectura da matriz extracelular bem como a capacidade das células em inter reagirem com ela, ou regulando os receptores e alvos intracelulares por outros factores de crescimento.

As funções do TGF-βΐ e TGF-^2 não são idênticas e possuem diferentes propriedades de receptor-reconhecimento. Podem existir diferentes receptores para o TGF-βΙ e TGF-/32, alguns dos quais reagem transversalmente. Tal sugere uma função única para o TG?-y?2. Ambos os factores parecem, contudo, serem equipotentes ao inibirem a poliferação d© células epiteliais e a adipogénese e ao provocarem a expressão da fibro nectina e colagénio.

A acção dos TGF-^s é fortemente anábólica, especialmente no tecido correctivo, conduzindo à fibrose e angiogé nese.

539-540.

As aplicações práticas vão assim, em prol da recuperação dos tecidos danificados causados por trauma, queimaduras, intervenções cirúrgicas ou debilidade dos mais idosos na ostenporose; e, em vista da sua acção supressiva nos linfócitos T e B, aplicam-se igualmente como agentes anti-irfls matórios ou imuno supressivos.

Os TGF-/3s, particularmente o TGF-^1, pode igualmei te ser envolvido na regulação da hematopoiése (M. Ohta et a] Nature 529 [Õutubro 198

As sequêiicias de aminoácidos e sequências nucleótidas para 0 TGF-βΙ humano (originalmente denominado TGF-/3) e seu precursor são conhecidas a partir de, p^r exemplo, R. Derynck et al., Fature 516 (1985) 701-704; R. Derynck et al. J. Oell. Biochem (1986) Supl. 10 0, 105; R· Derynck et al., J. Biol. Chem. 261 (5 Abril, 1986) 4577-4579; θ Genentech EF 200 541 (publicado em 10 de Dezembro, 1986).

Aparentemente 0 TGF-^2 não tinha sido identificado como tal na primeira prioridade da presente invenção· Subsequentemente, publicaram-se sequências de aminoácidos parciais, como por exemplo para 0 primeiro TGF-/S2 d© porco, maduro de 29-N aminoácidos terminais em S. Cheifetz et al., Oell 48 (15 Fevereiro, 1987) 409-415 θ para 0 primeiro terminal de aminoácidos 51N de TGF-^2 humano maduro em T, Ikeda et al., Biochemistry 26 (meio 1987) 2406-2410; a sequência completa de aminoácidos do TGF-/92 humano maduro foi então publicado em H. Marquardt et al., J. Biol.j3h.em. 262 (5 de Setembro, 1987) 12127-12151, isto é mais tarde que as datas prioritárias para a presente invenção.

1.2.- Factor B provocador de cartilagem (CIF-B)

Uma outra linha de pesquisa envolveu-se no isolamento, purificação e caracterização dos GIFs, mais precisa/ * Ζ/ / - b mente do factor B (CIF B) provocador de uma proteína demineralizadora óssea dos bovinos denominada cartilagem (CIF-B), descrita por exemplo por S.M. Seyedin et al., PITAS 82 (1985' 2267-2271, e vários métodos de extracção ou purificação parciai deste mesmo factor B ou factores relacionados estão des critos, por exemplo, em Collagen EP 121 976 e USP 4 627 982<

factor CIF-B está envolvido na formação óssea endocondral uma vez que é um potente produtor de condrogánese in vitro. Sm Collagen EP 182 485 descrevem-se composições para implantação para efectuar a recuperação óssea, compreendendo um factor osteoindutivo de proteínas que podem possivelmente incluir CIF-B. A Collagen EP 215 77 θ divulga o uso de factores CIF-B para o tratamento de inflamações ou para o tratamento de uma disfunção ou malfunção da hematopoiése ou linfopoiése.

Divulgaram-se, parcial mas inexactamente, sequências de aminoácidos para os 5C aminoácidos de terminal N de factores CIF-B maduros isolados de ossos de bovinos como por exemplo em Collagen EP 165 016 e, durante o ano prioritário para esta invenção, em Collagen EP 215 776 (publicado em 11 de Março, 1987); a correcta sequência de aminoácidos para os 50 primeiros aminoácidos de terminal N do factor CIF-B ma duro de bovino, foi publicad.a durante o ano anterior para a presente invenção em S.I/I. Seyedin, J. Biol. Chem. 262 (15 de Fevereiro, 198?) 1946-1949.

Sabe-se que o factor [32 de transformação de crescimento (TGF-/S2) e o factor β produtor de cartilagem (CIF-B) são provavelmente idênticos.

1.5·- Factor supressor de células T derivado de glioblastomas (G-TsF)

A terceira linha de pesquisa debruçou-se com o faç

tor supressor de células T derivado de glioblastomas (G-TsF).

Os doentes com glioblastoma possuírem uma imunidade mediada por células diminuída. Tal já era aparente em 1972 (W.H. Brnoks et al., J. Exp. ked. 136 [1972] 1641-1647)· Tar to os linfócitos periféricos sanguíneos e os linfócitos in filtrados no tumor dos doentes com glioblastoma apresentavam respostas proliferativas in vitro diminuídas. Além disso os doentes mostravam, uma reactividade debilitada em testes in vivo da pele em relação a antigenes ubiauitários. Gomo no fluído e sôro do quisto tumorígeno se encontra presente uma actividade imunossupressiva, antes e não depois se ter removido o tumor, a imunidade mediadora de células defeituosas tem sido atribuídas à produção de péptidos imunosupressivos pelas células de glioblastomas. Como apoio a esta concepção está a observação de que os sobrenadantes em bruto produzidos por várias linhas de células de glioblastomas cultivados pelo tumor inibem a proliferação de timécitos produzidos pela lectina bem como o crescimento de células T clonadas provocadas pela interlencina e a produção de células T citotÓxicas aloreactivas (A. Fontana et al., J. Immunol. 152 [1984j 1837-1844; LI. Schwyser e A. Fontana, J. Immunol 134 [1985j 1003-1009).

reza,

G-TsF tem sido descrito, em diversas obras literárias e em vários estados de pu patenteado sem uma informação sequencial na sua forma natural, parcialmente purifi cada, como por exemplo em Sandoz EP......15'9 289, que descreve a caracterização bioquímica e purificação parcial do factor G-:

-TsF. Outras publicações são, por

J. Immunol. 132 [1984

J. Immunol. 134 1985

1837-1844 e

1003-1009· exemplo, A. Fontana et al.

Li. Schwyser e A. Fontana,

Este factor supressor de células T aumenta a forma çao de tecido correctivo, possui uma forte actividade anabélica e origina a fibrase e angiogénese.

Durante o ano prioritário para a presente invenção, a purificação do G-TsF até à homogeneidade e a sequência de amino terminal para os primeiros 20 aminoácidos da proteína madura, foram descritos, por exemplo, em iá. Wrann et al.,

HL BC -J. 6 (Junho de 1987) 1653-1636.

2.- Sumário da Invenção

Da descrição precedente parece que existe a necessidade de se ter os factores isolados na sua forma pura e, além disso, tê-los disponíveis em quantidades suficientemen te grandes para possibilitar a preparação de derivados, a realização de mais testes e o seu uso em várias modalidades terapêuticas, isto é, ter esses factores disponíveis em for ma recombinante.

A presente invenção consegue alcançar tal fim atra vés dum processo que compreende

a) isolar-se o factor G-TsF humano em forma substancialmente pura duma fonte natural como sejam as células de gliblastoma e

b) preparar-se G-TsF recombinante e o seu percursor péptido l'o que respeita a a), tal é conseguido usando-se técnicas da química proteica. Obtiveram-se duas variantes ds G-TsF possíveis, uma das quais foi totalmente caracterizada.

produto G-TsF possui uma pureza de, pelo menos, 90%. A sua actividade específica é de, pelo menos, 5 x 10^ unidades/mg nos ensaios de timócitos. A inibição máxima média é obtida numa concentração de 1 x 10~ ou menos nesses mesmos ensaios.

Quanto a b), a presente invenção torna disponíveis, pela primeira vez, $ sequências completas dos aminoácidos e nucleótidos para G-TsF maduro e G-TsF precursor e os cDNAs correspondentes.

- 9 A presente invenção proporciona assim G-TsF recombinante maduro e um processo para a preparação de G-TsF madu ro por técnicas de DNA recombinante, e cDNAs correspondentes.

Além disso, a invenção proporciona ainda um percur so de G-TsF recombinante e um processo para a preparação de percursor de G-TsF por técnicas de DNA recombinante e cDNAs correspondentes.

Proporciona ainda uma parte precursora de G-TsP re combinante e um processo para a preparação de um precursor de G-TsF recombinante por técnicas de DITA recombinante, e cD NA s re c omb i nante s.

factor G-TsF maduro recombinante ou G-TsP precur sor pode ser humano ou não-humano, como por exemplo uma forma de mamíferos. A preferida é a forma humana.

A presente invenção torna deste modo possível, pela primeira vez, a produção de G-TsF maduro, precursor de G-TsF e parte precursora de G-TsF em quantidades suficientes para aplicações terapêuticas, uma maior investigação das suas actividades biológicas multi-facetadas e, com. base no reconhe cimento das sequências, a produção de derivados.

Na fig. 2d) ilustra-se uma forma de realização preferida das sequências de GDNA e de aminoácidos para o factor G-TsF. As sequências completas são para o precursor G-TsF. A seta separa as sequências para a parte de G-TsF percursor das sequências de G-TsF maduro, as sequências para o G-TsF madura aparecem igualmente na fig. 2a).

As expressões precursor” e parte percursora como aqui são utilizadas, possuem significados diferentes ente a dendo-se por percursor a cobertura do péptido completo incluindo o péptido madura, enquanto a expressão parte precur sora significa as sequências para o péptido completo menos • / — 10 —

as sequências para o péptido maduro.

As variantes alélicas (isto é, as alterações de ba se das sequências que ocorrem naturalmente numa espécie que podem ou não alterar a sequência de aminoácidos) do nucleótido e sequências de péptidos correspondentes das figs. 2a) e 2b), e as variações na sequência de nucleátidos resultante da generação do código genético são igualmente incluídas na utilização prevista pela invenção, onde vão codificar um polipéptido possuindo actividade de G—TsF.

As variações nas sequências das figs. 2a) e 2d), que são causadas por mutuações pontuais ou modificações mais amplas para intensificar a actividade ou produção da proteína, não deveriam alterar, por expressão, as principais propriedades funcionais e estruturais da proteína madura ou per cursora para a qual a sequência codifica.

Por conseguinte, tais variações na sequência são abrangidas na invenção. Tais modificações nos nucleótidos, deriberadamente arquitectadas na sequência DNA, podem ser feitas por alguém conhecedor deste campo utilizando técnicas conhecidas. Tal modificação pode causar a anulação, inserção ou substituição de aminoácidos na sequência do péptido ou do prepéptido para G-TsF. Por exemplo, a substituição de um ou mais dos resíduos de cisteinasequênciacodificação

eliminar a ponte disulfeto correspondente. Adicionalmente, a substituição, inserção ou anulação de um aminoácido num ou mais locais de reconhecimento da glicozilação ligada à asparagina tripéptida na sequência precursora pode resultar numa não-glicosilação nesse local. São bem conhecidas as técnicas mutagénicas utilizadas em tal substituição ou anulação.

Conhecem-se os processos para a selecção de células hospedeiras apropriadas e os métodos para a transformação, cultura e visionamento bem como para a produção e purificação

do. produto.

As células dos mamíferos podem ser empregues como células hospedeiras para a produção de G-TsF. Uma linha de células de mamífero particularmente apropriada é a linha de célula do Ovário do Criceto Chinês (CDO). Outra linha de células de mamífero apropriada é a linha de célula do macaco COS-1 ou a linha de célula CU-1.

Podem-se também utilizar células de levedura. Adicionalmente, as células de insectos podem igualmente ser empregues como células hospedeiras em combinação com vectores de insectos, como por exemplo vectores virais, no método da presente invenção. Além disso, pode-se utilizar a vaccinia viruses recombinante para produzir G-TsF numa vasta variedade de mamíferos, como por exemplo células humanas.

Cutro aspecto da presente invenção proporciona vec tores para serem utilizados no método de recuperação de G-TsF, que contêm as mesmas, ou substancialmente as mesmas, sequências de nucleótidos como atrás se registou. Os vectores contêm igualmente sequências de contrôle apropriadas que permitem a recuperação da sequência de G-TsF. Alternativamente, os vectores que englobem sequências alélicas modificadas ou que surgiram naturalmente constituem igualmente formas de realização da presente invenção. 0 vector pode conter sequên cias reguladoras seleccionadas em associação operativa com as sequências que codificam G-TsF por técnicas de DEA que atrás se descreveram, as quais são capazes de dirigir a sua reaplicação e recuperação em células hospedeiras seleccionadas. Conhecem-se neste campo sequências regulatérias úteis para tais vectores e que podem ser seleccionadas dependendo das células hospedeiras escolhidas.

método para preparar G-TsF recombinante compreende a recuperação de G-TsF segregado duma célula hospedeira transformada com um gene que codifica para G-TsE.

Sm particular, este método compreende

a) a construção dum vector que inclui ácido nucleico que codifica para G-TsF,

b) a transformação de uma célula hospedeira heteréloga com o vector,

c) a cultura da célula hospedeira transformada e

d) a recuperação de G-TsF segregado pela cultura.

processo da presente invenção proporciona o ácido nucleico que codifica para G-TsF maduro ou precursor G-TsF, sendo útil na construção dos supracitados vectores. Este ácido nucleico ou um ácido nucleico capaz de hibridizar pode igualmente ser classificado e usado em ensaios

tico para DKA ou mRNA que codificam G-TsF, seu precursor ou proteínas que lhe são relacionadas.

A preparação de derivados de G-TsF por métodos recombinantes foi tomada possível pelo conhecimento da sequência que codifica para G-TsF ou a sequência que codifica G-TsF e seu percursor aqui divulgadas. Estes derivados incluem mutantes silenciosos ou segregados no ácido nucleico que codifica para o G-TsF maduro ou que codifica para o G-TsF precursor.

Os montantes silenciosos envolvem a substituição de um codou degenerado por um outro em que ambos codificam para o mesmo aminoácido, cuja substituição podia exercer um efeito salutar na produção de G-TsF em cultura recombinante, como por exemplo por modificação da estrutura de mEKA secundária. ial substituição pode ser identificada pela peneiração de produções de G-TsF a partir de transformantes.

Os mutantes de G-TsF segregados classificam-se poi uma ou mais do que uma destas classes: anulações, substituições ou inserções. As anulações caracterizam-se pela elimina ção dos resíduos de aminoácidos sem a introdução de um resíduo de substituição. 0 G-TsF DEA anulado por mutação é útil para fazer fragmentos, por exemplo que seja desejado anular um epítote imune.

As mutações de substituição são aquelas em que se substituiu um resíduo de aminoácido por outro. Tais mutações são extremamente difíceis de realizar por métodos diferentes do da síntese recombinante, especialmente as substituições programadas para o interior da primeira sequência de aminoácidos.

São úteis para modificar a actividade biológica do

G-TsF.

Os mutantes de inserção são aqueles em que se colo cou um ou mais resíduos dentro de ou em qualquer uma das extremidades do ácido nucleico de G-TsF. As fusões são tipicamente uma espécie de mutantes de inserção em que a inserção se dá nos resíduos terminais carbóxi ou amino do G-TsF.

·“ Breve Descrição dos_ pesenhos

A Figura 1 mostra os oligonucleótidos usados para escolher a biblioteca do CD1TA. As duas amostras basearam-se nas

A posição 22 mostrouA amostra A consistia um 39-mer e um 42-mer, na sua extremidade 5 *· Apó sequências de aminoácidos ilustradas, -se mais tarde como sendo isolencina. em dois oligonucleótidos sobrepostos, com 12 nucleótidos complementares i.

se terem fundido e enchido com o fragmento Klenow da polimerase de DKA I, obtiveram-se os dois 69-mers correspondentes aos cordões de codificação ou não-codificação. Sstão indicadas por asteriscos as posições da sequência nucleótida correspondentes a sequência de cDDA determinada. A amostra B consistia numa mistura de dezasseis 29-mers. Inseriram-se, em posições ambíguas, os resíduos de deoxinosina ou deoxicé- 14

tidina e de deoxitimidina como se indica.

A Figura 2a) mostra as sequências completas de mucleótidos e de aminoácidos do G-TsF maduro humano. As semelhanças de aminoácidos para TGF-^l estão sublinhadas. A sete indica o local da clivagem da protease e o início da proteína madura.

A Figura 2b) ilustra a estratégia de sequência que se seguir para se chegar à sequência do cDNA na região do G-Tsl· maduro. Após se sub-clonar a inclusão EcoHi de SUP25 lambda em pBS.M15, parte da sequência foi estabelecida pelo método Sanger de terminar a cadeia com dideóxi usando a Amostra B (ver a Fig. 1) como iniciadora. Procedeu-se â sintese de doi oligonucleótidos mais correspondentes a partes da sequência obtida foram utilizados para obter a sequência que codifica para a maior péptida de G-TsF, como se mostra.

A Figura 2c) é um diagrama esquemático e um mapa pareis: da restrição da enâonuclease do G-TsF cDITA. A sequência que codifica está encaixada e o peptido maduro está indicado pela parte sombreada na extremidade 5’· Sobre o diagrama estãc alinhadas as inclusões do cDhA em sequência de lambda SUP25, lambda SUP4O e lambda SUP42.

A Figura 2d) mostra as sequências de nucleótidos e de aminoácidos para o precursor G—TsF humano. AÍ se mostra a sequência de nucleótidos da região de lambda SUP25 por dois outros clones independentes (posição 1-1695)· Uma torsão hidrofóbica de 15 aminoácidos, constituindo provávelmente parte da pré-peça da parte do precursor G-TsF, e o peptido do G-TsF maduro na extremidade do terminal carbóxi estão sublinhados por um traço grosso. 0 sítio da clivagem da protease postulada está indicado por uma seta numa das extremidades do peptido G-TsF. A torsão dos aminoácidos básicos que precedem a clivagem está indicada por uma linha a tracejado.

Sublinham-se com um traço fino três possíveis locais de glicosilação na sequência do precursor.

A Figura 2e) é uma comparação entre as sequências de aminoácidos dos percursores C—TsF e TGF-^1, analisados de acordo com o programa de alinhamento padrão da Intelegenética. Introduzem-se intervalos para maximizar as semelhanças de sequências entre as duas proteínas. Indicam-se aminoácidos idênticos por asteriscos. As 112 formas de grandes aminoácidos maduros dos péptidos estão encaixados.

A Figura 3a) mostra o vector de recuperação de células CliO- e COS denominado p91023(B)-SUP25-l contendo a dimensão completa cDNA AdíLLP = promotor do último adenovirus maior; DHFR = cDNA de reductase de dihidrofolato.

A Figura 3b) ilustra a recuperação de plasmido denominada ρΏΙΤ3·πθο7/3υΡ40-1 para as células C.EC- e COS- com cDEA 3UP40. AdMLP = promotor do último adenovirus maior; TKP = promotor auinaso timidina do virus Hermes simples; D’I?3 = cDNA de reductase de dihidrofolato.

A Figura 4 mostra a última fase de purificação para G—TsF a partir de 508 células de glioblastoma do cobrenadante 11 glioblastoma em Pro-EPC com acido trifluoracetico/ /isopropanol. As fracções do FPLC de fase inversa sobre FroT·¹ 1 M #

-RPC foram testadas por causa da proliferação de timocitog provocada pelo ConA a uma diluição final de 1:5.000. Adicionalmente, liofilizaram-se 100-microl aliquotas das fracções na presença de 1 gr. de manitol sendo analisadas por SDS-PAGE sob condições de diminuição numa composição de 10-15% de gel de poliacrilamida e estanhado de prata. As faixas 29, 30 e 31 mostram as proteínas presentes nas três fracções cot. actividade G-TsF. Indica-se a migração dos marcadores de prç teínas de peso molecular (BE.).

A Figura 5 mostra a actividade de G-TsF humano puro em dois sistemas de ensaios:

A - Efeito inibitório do G-TsF (·) e do TGF -p- (*) dependente da dose na proliferação de timócitos provocados por

CON-A. C dissolvente (0,1% de ácido trifluoracético em

25% de 2-propanol v/v) usado na eluição do G-TsF da coΤ' ¹ i *V luna Pro-RPC‘ final foi tirado como um tampao de contro le para 0 G-TsF.

B - A supressão do crescimento de célula T dependente de IL-2 pelo G-TsF e TGF-yôl. Cultivaram-se as células auxilia res T específicas da ovalbumina na presença de várias concentrações de IL-2 recombinante juntamente com G-TsF (·) a uma concentração de 1,6 x 10 ou TGF- 1 (A) a uma concentração de 1C M. Os controles consistiam em dissolventes (veja atrás) ou em meio no qual se diluiu 0 TGF-/91 (Ο/Δ).

A Figura 6 mostra a purificação final de G-TsF a partir Ti / de 10 1 de sobrenadante de glioblastoma em Pro-RPO com aci do trifluoracético/isopropanol. Testaram-se as fracções provenientes da fase inversa de FPLG sobre Pro-RPO^¹ no ensaio de proliferação de timócitos. A inserção mostra 0 SDS-PAGE de 100 microl aliquotal a partir das fracções 28 a 34 como se descreveu para a Fig. 4.

A Figura 7a) é um mapa do plasmídeo denominado pp_81-SUP25-1 para recuperação do G-TsF em E.coli com base num promotor lambda. P^ = promotor lambda.

A Figura 7b) mostra a construção do plasmídeo de recuperação pP^ S1-SUP25-1. 0 fragmento parcial Hae III-XbaI do G-TsF cDNA derivou convertendo-se primeiro 0 local Hae III na posição 2141 do lambda SUP25 cDKA com elos Xbal para um local Xbal. Realizou-se então a clivagem parcial do cDKA com Hae III e Xbal.

A.....Figura 8 mostra a recuperação e purificação do G-TsF

- 17 recombinante de E. coli:

A. - Imunomancha da proteína E. coli total recuperada a se- guir à indução do promotor lambda Iv à temperatura de 42°C. As faixas 0 a 6 são dos vários tempos de incubação.

B. - SDS-PAGE das fracções 50 e 51 do FPLQ de fase inversa rm·· sobre Pro-EPO mostrando que se recupera essencialmente G-TsF puro a partir do Pro-EPO *.

A Ei pura 9 indica a inibição da proliferação de timócitos da proteína E. Goli pelo G-TsF recombinante

A Figura 10 mostra a demonstração de recuperação do G-TsF recombinante numa imunomancha de células sobrenadantes obtidas de células GHO.

Faixa 1 - Sobrenadante das células de contrôle GuC intersectadas com o vector livre de cD17A (pXíiâT3 · neo7).

Faixa 2 - sobrenadante das células GHO intersectadas com o vector contendo G-TsF cDNA (ρΧΜΤ5·ηθο 7/SUP40-1) e seleccio·· nadas em 1 nM metotrexato.

Faixa 5 ~ à semelhança da faixa 2, mas seleccionada em 10 nlí metrotexato.

A Figura 11 mostra a inibição da proliferação de timócitos com G-TsF recombinante a partir de células GHO. Diluição = diluição final de GHC sobrenadante em ensaio de timócitos.

D = sobrenadante das células de contr-Ôle GHO intersectadas com pXMT3.neo 7, sem activação ácida

D = como □ , mas sem activação, com llu de ácido acético du rante a noite sob temperatura ambiente.

M = sobrenadante das células GAO intersectadas com pimT5· neo 7/SUP40-1 e seleccionadas em 10 nm metotrexato,

sem activação ácida.

φ = como em fll, mas com activação ácida como em O .

É visível alguma inibição endogenosa, por células GHO activadas pelo ácido, o que poderia ser causado por G-TsF ou qualquer outro factor tal como o TGF-yâl produzido pelas células GHO; contudo, a produção de material recombinante origina um aumento na actividade supressiva de pelo menos 2 ordens de magnitude.

4. - DESCRIÇÃO.. DETALHADA

4.1 - Num primeiro aspecto o factor G-TsF foi purificado até atingir a homogeneidade e fez-se a sequência de 20 primeiros aminoácidos da proteína humana madura:

lurificou-se o G-TsF após a concentração e defiltragem dos sobrenadantes derivados das células de glioplastoma, num processo que incluiu uma cromatografia sobre hidrí xilapatite e Pro-RFC*^¹, cromotografia de permuta de catiões sobre Mono-S^ e uma fase final invertida de FPLC sobre Pro-RPG™. A fase decisiva do esquema de purificação foi a cromatografia de permuta de catiões sobre Mono-S que resultou numa purificação dobrada em 16 e permitiu a correlação da actividade biológica para uma faixa de proteínas 12,5 Kd sobre SDS-PAGE. Tal foi confirmado pela fase da cromatografia final de fase inversa (vidé Fig. 4) uma vez que após SDS-PAGE e o estanhamento a prata se detectou em três fracçoes ums única faixa de 12,5 Kb. As intensidades destas faixas correlacionavam-se com a actividade G-TsF ao ensaio de timócitos. Além disso, a actividade específica de 5 x 10? unidades/mg calculada para a faixa 12,5 Kd, é comparável a outras citoquinas.

A partir deste material obtiveram-se os primeiros 20 aminoácidos de terminal amino de G-TsF maduro (vidé tam- 19 -

bém Fig. 2a), por sequência de fase gasosa da fracção de pico : AlaLeuAspAL^aAlaTirCisPheArgAsnValGlnAspAsnCisLeuArgFro ^Leu20’

Como se demonstrou na Fig. 2e) tanto o factor G-TsF como o TGF-/31 das plateletas de porco (Sistema R & D) inibiram a resposta proliferativa de timócitos provocada pox Concanavalina A. A concentração necessária para uma activa_ Ί Π ção da inibição de timócitos média e IO” para TGF-/31. Obse va-se uma curva de resposta à dose quase idêntica usando-se G-TsF purificado em vez de TGF-A1, dando-se a inibição média -12 * em 8 x 10 1C. Como o sobrenadante em bruto de 308 células de glioblastoma suprimia, como se descobriu originalmente, a actividade das células T por interferir com o efeito de IL-2, analisaram-se o G-TsF e TGF-y$l purificados numa linha de células T auxiliares específicas da ovalbumina (0UA-7T), estabelecida a partir do 057 BL/6 de ratos. Nas concentrações testadas (G-TsF em 1,6 x 10 TGF-ySl em 10 ambos os factores inibiram o crescimento de células 0VA-7T» de pendente de IL-2, quase completamente (Figura 5> parte B).

grau de inibição era independente de concentrações de IL-2 entre 1 e 256 unidades/ml.

Na sua forma biologicamente activa o G-TsF humano é um dímero de duas sub-unidades idênticas unidas por uma in tercadeia de união cruzada sobre pontas disulfeto. A dimerização pode preceder o processamento proteolítico. são igualmente biológicamente activos os heterodímeros com factor TGF-y31.

G-TsF biologicamente activo é aqui descrito com o G-TsF que é capaz de inibir a proliferação de timócitos provocada por Ooncanavaliva-A, e o crescimento de clones de células T provocado por IL-2. Estes ensaios estão descritos no Exemplo que adiante se descreve e em várias publicações.

- 20 Isto define igualmente o significado da expressão actividade similar à do G-TsF.

Quando se usa G-TsF maduro sem qualquer outra qualificação, significa possuindo mais do que uma semelhança de 71%, da sequência de mainoácidos estando a sequência de aminoácidos indicada na Fig. 2d) a seguir à seta, como por exemplo 90%.

Quando se utiliza G-TsF precursor sem qualquer outra qualificação significa uma proteína com uma semelhança da sequência de aminoácidos superior a 30% com a sequência completa de aminoácidos na Fig. 2d), como por exemplo > 60%.

Num dos seus aspectos a invenção proporciona assim, para G-TsF humano substancialmente puro e para um processo para a preparação de G-TsF humano substancialmente puro compreendendo uma dose de cromatografia de permuta d© catiões, preferencialmente uma fase de cromatografia de permuta de ca tiões sobre Μθηο-S á mm particular, 0 processo compreende;

a) concentração e defiltragem de sobrenadantes de células de uma fonte natural de G-TsF, tal como células de glioblastoma,

b) cromatografia sobre hidróxi lapatite,

Ti⁷

c) cromotografia de fase inversa sobre Pro-RPC usando-se, como eluente, ácido trifluoracético/acetonitrilo (2x),

d) cromatografia de permuta de catiões, preferencialmente so

TM ~ bre mono-S , e

e) cromatografia de fase inversa sobre Pro-BPO^¹ usando-se, como eluente, ácido trifluoracético/2-propanol.

Uma maior purificação do G-TsF a partir de 10 1 de glioblastomas sobrenadantes produziu um vasto pico duplo do material 12,5 Kb durante a última FPLO de fase inversa sobre

TM

Pro-RPC , o que indicou a presença de dois picos sobrepostos de dois péptidos ligeiramente separados, material referente a toda a área do pico duplo mostrou haver uma bioactividade similar no ensaio da proliferação de timócitos (vidé Fig. 6). Deste modo sujeitou-se o material do primeiro e segundo pico à uma sequência de fase gasosa. O material do prâ, meiro pico (fracção JO) deu uma sequência aminoterminal idêr. tica à primeira ilustrada na Fig. 2a). Contudo, o material recuperado do segundo pico (fracção 52) produziu a seguinte sequência aminoterminal:

TirlleBlankPheVal . 25

Esta sequência parcial difere da sequência correspondente na Fig. 2a) porque tem Ile em vez de Cis na posiçãc 16 e Vai em vez de Lis na posição 25 (Não se conseguiu deter minar com toda a certeza o aminoácido correspondente ao Asp na posição 25 do material a partir da fracção 50).

Esta outra sequência podia bem ser a mesma daquela da porção N-terminal dum variante do G-TsF terminal. A presente invenção engloba também esta e outras variantes.

4.2. - Eum segundo aspecto a sequência citada foi usada pare, se obter G-TsF por técnicas de DNA recombinante.

4.2.1.- Esta produção pode ser efectivada de acordo com métodos geralmente conhecidos, como por exemplo usando-se processos similares aos descritos por T. mania tis et al., molecular Cloning, A Laboratory manual^, Cold Spring Harbor Ladoratory, Eew 1‘ork (1982) .

Contudo, no que respeita o TGF-βΐ, o G-TsF recombinante demonstrou dificuldades em sintetizar durante a sua actividade. Como se pode ver pela Fig. 2 a) a sequência de aminoácidos maduros contém um grande número de resíduos de

cisteína, dos quais pelo menos alguns estão aparen.temen.te er volvidos em reticulação intercadeia na formação de G-TsF homodimérico, o qual é recuperado de fontes naturais. Além dis so o G-TsF é recuperado como uma molécula precursora possuir do uma grande região terminal amino a qual está provavelmente envolvida em direccionar o último percurso de G-TsF, istc é transportá-lo através das membranas reticulum endoplasmáticas, transposição correcta do polipéptido precursor incluindo a formação de pontes disulfeto inter - e intramolecular armazenagem em vesículas segregadoras e regulação da clivagem proteolítica seguida pela segregação do péptido bioactivo. Contudo, tem sido possível transformar as células encarió ticas de forma a segregarem G-TsF heterólogo, sem resistência por parte da dificuldade em proceder apropriadamente o primeiro produto de translacção em cultura recombinante. Cor seguiu-se igualmente a produção do péptido de G-TsF maduro em E. Coli.

A invenção abrange G-TsF maduro recombinante e a sua parte precursora, a sua síntese recombinante e a formação de G-TsF bioactivo por via do seu precursor; particularmente, o F-TsF biologicamente activo possuindo as sequências da Fig. 2d), incluindo o G-TsF precursor, o G-TsF maduro e a parte precursora de G-TsF, e fragmentos polipéptidos, inserção, substituição e/ou anulação dos seus mutantes. Compreende por exemplo a preparação de G-TsF dimérico bioactivo por via da síntese prévia do G-FsF precursor ou de partes do G-TsF precursor, essenciais ào processamento de transposição e proteolítico.

As amostras oligonucleótidas ilustradas na Fig. 1 foram deduzidas da sequência de proteínas de G-fsF parcial e foram utilizadas para proteger a biblioteca cDKA derivada da linha de células de glioblastoma humano 308. Esta biblioteca estabelecida em lambda gt 10 tinlia sido préviamente seleccio

nada pela sua dimensão para inserções maiores que 1600 bp. Após se protegerem um total de 100.000 fagos recombinantes, detectou-se apenas um clone produzindo um sinal com ambas as amostras. Usando-se a amostra --- B como uma base sequencial descobriu-se que ela continha análogos ao TGF-/31. Este clone, denominado lambda SUP25, foi subsequentemente usado para isolar clones cDNA adicionais para G-TsF (lambda SUP40 e lambda SUP42).

A estratégia sequencial seguida para estabelecer a sequência nucleótida na zona que codifica para o péptido maduro, está ilustrada na Fig. 2b).

lía Fig. 2c) mostra-se um mapa parcial de restrição de enzimas do G-TsF cDEA. ha Fig. 2d) mostra-se a sequência de nucleótidos, que é determinada ao fazer-se a sequência das duas torsões ao inserto no clone lambda SUP25 da posição 1 para a 1695 θ a sequência de aminoácidos deduzida, incluir ao a sequência da proteína precursora. Fez-se a sequência das inclusões dos clones lambda SUP4C e lambda SUP42 para am bas as extremidades de 500 nucleótidos e para toda a região que codifica para o péptido G—lsF maduro com a ajuda de iniciadores oligonucleótidos internos específicos. Estes cDIiAs começam dentro de vários nucleótidos desde a extremidade 5’ do lambda SUP25 e terminam nas posições 1534 e 1695» respectivamente. Estas consequências foram por outro lado consideradas como sendo iàênticas às do inserto de lambda SUP25, que no entanto é maior na extremidade 3’·

A região 5’ do G-TsF DEA não traduzida é AT rico (71% AT) e nas posições 182-184 localiza-se um codou de iniciação de translacção ATG. Este codon é na maioria das vezes utilizado para o início da translacção visto que é o primeiro ATG numa estrutura de leitura aberta para um aminoácido 414 - proteína longa contendo a sequência terminal amino do péptido G-TsF nas posições 3OJ-525 dos aminoácidos. Adicionalmente é imediatamente precedido por vários codons de paragem na mesma estrutura de leitura aberta e os vinte primei ros aminoácidos da referida proteína mostram a forte caracte rística hidrófobica dos péptidos de sinal. 0 primeiro grupo de significativa homologia em relação ao dito TGF-/51 precursor dá-se a partir dos aminoácidos 21 para 24. Pão se encontrou qualquer homologia para a sequência de consenso observada à volta do local de iniciação de translacção de outros mRNAs, excepto uma purina na posição -5. Contudo os codons ATG que se seguem nas posições 266, 278 e 505 não são seguidos por uma sequência que codifica para uma corrida significativa de amoniácidos hidrofóbicos.

A clivagem pós-translaccional do precursor origina o G-TsF maduro. Não se conhece a disposição da parte precursora mas pode dar origem a outros péptidos biologicamente activos. 0 G-TsF precursor contém vários pares de resíduos básicos que poderiam igual seguir uma clivagem pés-translacional e originar entidades de polipéptidos separados.

4.2.2. - Construção de uma biblioteca cDITA

Isolou-se RSA usando-se o método da ureia-LiCl e seleccionou-se ERA poliadenilado por cromatrografia de oligo (dt) celulose. A primeira torsão cDIíA foi então alvo de síntese com transcriptase de fase inversa, convertendo-se o ERA/ /DRA em cDNA de dupla torsão. Tornou-se as extremidades cjjI.à cegas com nuclease SI e polimerase 14 DRA, metilados com metilase EcoRI, ligado aos elos EcoRI fosforilatados sendo os produtos digeridos com quantidades EcoRI em excesso. Seleccionou-se o cDNA pelas suas dimensões e recuperaram-se os fra gmentos acima de 1600 bp por extracção de fenol e precipitação de etanol. Após ligação ao lambda gt 10, incubou-se o DNa recombinante com uma extracção de embalagem in vitro, estabe-lecendo-se a biblioteca a seguir à infecção de E.Coli 0600

- 25 hfl por galvanização sobre chapas agar BBC e eluindo-se as fagos da camada cimeira agar.

4.2.5· ” Peneiramento da biblioteca

Aproximadamente 10.000 fagos recombinantes foram placados em E. Coli 0600 fazendo-se uma cópia das placas em filtros de nylon. Processaram-se e peneiraram-se então os filtros usando-se duas amostras provenientes dos amir.oácido£ de G-TsF de terminal amino (Fig. 1). As amostras de oligomecleótidos foram sintetizadas com um sintetizador DLA. Uma amostra consistia duma mistura de dezasseis 29-mer correspor. dentes a uma porção longa de dez aminoácidos. Foi etiquetada com T4 polinucleótida cinase e jjgama-^pJ ATP. A segunda amostra consistia de um 39~mer e um 42-mer (Fig. 1) com 12 bases complementares na sua extremidade 3’, que podia deste modo ser enchida após aquecida usando &-³²â dGTP e o fra-l gmento Klenow da polimerase I do D1:A. Pré-hibridizaram-se os filtros durante um período entre 4 até 6 horas hibridizando-se então os filtros com as amostras durante 16 horas à temperatura de 42°C. Lavaram-se os filtros em 5 x 1LP à temperatura de 42°C, 0,2% SUS, lavando-se depois novamente sob temperaturas gradualmente aumentadas até um máximo de 55°O· Rechapearam-se e repeneiraram-se áreas das placas dando sinais com ambas as amostras à temperatura de 47°C. Apenas uma placa deu sinais reproduzíveis com ambas as amostras e o cDNA dela recuperado foi mais tarde usado para repeneirar a biblioteca.

4.2.4. - Subclonação e sequenciamento

Extraiu-se lambda DKA de clones positivos após se efectuar um processo de minipreparação. As inclusões cDEA foram recuperadas após a clivagem EcoRI e subclonadas no vec tor de sequência pBS. KL3 (Stratagene). Realizou-se a sequên cia DNA usando-se o método de Sanger da cadeia terminada em ,/

dideéxi. Para se obter um conjunto de sequências sobrepostas em ambas as direcções, digeriu-se primeiro o inserto com Hind III. Obtiveram-se assim subclones dos fragmentos de Hind III quer por meio de exonuclease e digestões de úuclease de feijão mungoquer por clivagem em sítios de restrição revelados em dados parciais da sequência. Obteve-se uma informação adicional sobre a sequência na região do péptido G-TsF maduro com ajuda de iniciadores oligonucleótidos sintéticos. Resolveram-se áreas ambíguas que permaneceram após o sequenciamento de toda a zona em ambas as direcções com po limerase de Klenow DEA, usando-se transcriptase de fase inversa para a reacção de alongamento da cadeia.

sequenciamento (vidé Fig. 2d) mostrou que o G-TsF é traduzido como uma proteína precursora da qual se teu que libertar a proteína madura por clivagem proteolítica. ms da proteína activa é um dimero constituído por duas partes péptidas maduras. A sequência de aminoácidos do péptido G-TsF maduro começa na posição dos aminoácidos 303 do precursor. 0 precursor G-TsF contêm três locais potenciais para a N-glicosilação.

É de 12.320 daltons o peso molecular calculado para o G-TsF maduro da Fig. 2d). A molécula completa, incluindo tanto a parte precursora como a madura, possui um peso mo lecular calculado de 45540 daltons (desconsiderando uma possível glicosilação).

G-TsF maduro pode ser O-glicosilado e o precursor G-TsF pode ser 0- e/ou N-glicosilado. Tais formal glicosiladas formam igualmente parte da invenção, bem como as for mas alélicas e/ou variantes.

A comparação entre da sequência de G-TsF maduro com as sequências publicadas para factores relacionados durante o ano prioritário para esta invenção, nomeadamente pa-

ra os primeiros aminoácidos de terminal 29IT de TGF-/S2 de porco (S. Cheifetz et al., Cell 48 [13 de Fevereiro, 193?] 409-415) ou para os primeiros aminoácidos de terminal 51-H de TGF-/32 humano (T. Ikeda et al., Biochemistry 26 [| de maio, 1987] 2406-2410), ou para os primeiros aminoácidos de terminal 3CN de OIF-B bovino (S.m. Seyedin et al., J. Biol. Chem. 262 Ê? de Fevereiro, 1987] 1946-1949) demonstram uma completa identidade: deste modo o G-TsF é o análogo humano dos factores citados e a considerável semelhança estrutural confirma a muito forte conservação de sequências entre as espécies, que também pode ser observada no caso do TsF- /31.

Como já atrás se mencionou em 1, a sequência completa de aminoácidos do TGF-^2 humano maduro tem sido independentemente publicada durante o ano prioritário para a pre, sente invenção (H. marquardt et al., J. Biol. Chem. 262 (5 de Setembro, 1987) 12127-12151); essa sequência é idêntica à sequência deaminoácidos para o G-fsF maduro na Fig. 2d).

C G-TsF mostra ainda uma semelhança da sequência de aminoácidos de 71% relação ao fGF-βΙ. Esta semelhança é extremamente elevada dos aminoácidos 329 para 346 e para os aminoácidos de terminal 14 0 (Fig. 2e)). Isto pode igualmente ver-se nos dois péptidos mais distantemente relacionados e na substância inibidora fiíuelleriana, em que as regiões correspondentes são as partes mais conservadas das moléculas. A semelhança estrutural é mais reforçada pela conservação nc G-TsF de todos os nove resíduos de cisteína. É de 30% a semelhança entre a sequência de aminoácidos do G-TsF precursor e o TGF-y§l precursor.

Nas partes precursoras do TGF-βΙ e G-TsF conservau-se também alguns padrões estruturais. Os péptidos maduros são obviamente libertados por clivagem proteolítica nos resíduos Lis-Arg. A homologia estrutural entre os precursores

G-TsF e TGF- /91 é muito menos pronunciada do que entre as prd teínas maduras mas existem grupos definitivos de homologia de sequência espalhados sobre a parte precursora. Isto indica uma grande divergência evolucionária, uma regulação possí velmente diferente na produção do factor e um papel biológico possivelmente modificado. Os grupos de sequência conserva dos podem constituir domínios funcionais da molécula precursora envolvida no transporte e processamento da molécula e no contrôle da libertação do péptido G-TsF.

As características, tais como o peso molecular e similares, para o G-TsF maduro nativo ou do tipo selvagem da Fig. 2d) obtido das células de glioblastoma, são descritivas apenas para as espécies nativas de G-TsF. Os mutantes aqui considerados podem mudar consideravelmente as características do G-TsF nativo, podendo isto constituir na realidade o objectivo da mutagénese. Enquanto o G—TsF como aqui é considerado inclui G-TsF nativo, outros polipéptidos relacionados biológicamente activos serão abrangidos por essa definição. As espécies de G-TsF como mutantes de inserção, mutantes de anulação ou proteínas de fusão trarão o mutante para fora do peso molecular estabelecido para o G-TsF nativo. Por exemplo, as proteínas de fusão com G-TsF maduro ou precursor de G-TsF terão um peso molecular superior que o G-ísF nativo e G-TsF maduro ou precursor do G-TsF, enquanto os mutantes de anulação do G-TsF maduro ou precursor de G-fsF terão um peso mole cular mais baixo. Similarmente o precursor de G-TsF ou o GTsF podem ser calculados de forma a introduzir locais de gli cosilação ou de substituir serina por cisteína em locais que não sejam críticos para a actividade biológica. Além, disso, o processamento pós-translaccional do pré-G-TsF humano, como por exemplo em linhas de células derivadas de mamíferos não

produzir micro-heteroganeidade no terminal ami no da região do G-TsF maduro, de forma a que a alanina não mais será o terminal amino dos aminoácidos.

Outros precursores poderão ser proteínas de fusão nas quais o G-TsF está unido, por uma ligação péptida no sei. término carboxil, a uma proteína insolúvel ou gelatinosa. A sequência na região ou dentro da região desta ligação péptida é seleccionada de forma a ser susceptível à hidrólise pro teolítica em que é libertado G-TsF, quer in vivo em geração in situ, quer in vitro como parte dum protocolo de fabricação.

G-fsF recombinante significa ordinariamente G-TsF de mamíferos, preferencialmente humano, recombinante; contudo o G-TsF recombinante de fontes tais como ratos, suínos, equinos ou bovinos está incluído na definição de G-TsF recom binante desde que doutra forma se enquadre nos padrões atrás descritos para a actividade biológica. 0 G-TsF não é específico à espécie, ror isso o G-TsF de uma espécie pode ser utilizado na terapia duma espécie.

Ji’,A que codifica o G—TsF pode ser obtido por sín tese química, peneirando-se transcriptos de fase inversa de MRNA dos glioblastomas ou outras células, ou peneirando-se bibliotecas genómicas a partir de células encarióticas. Este DNA não necessita dos codons representados na Fig. 2d) desde que a célula hospedeira reconheça os codons que são utilizados e pode-se, sem dúvida, optimizar os codons a fim de melhorar a produção, de· acordo com o sistema de recuperação.

4.J. - A Segregação pode ser obtida por qualquer apropriado sistema de recuperação pro-encariótico ou encariótico usando-se métodos conhecidos, como se descreve por exemplo em Genentech EP 200 341.

4.5.I. - Os vectores de recuperação apropriados são sequências DNA que codificam G-TsF e que ligam operacionalmei.

I .%% tf-αχ-vi •i te com apropriadas sequências de contrêle capazes de efectuar a recuperação de G-TsF na célula hospedeira. Tais sequências de contrôle incluem um promotor transcripcional, uma sequência operadora opcional para controlar a transcrição, uma sequência que codifica apropriados locais de união dos rebossomas de mREA e sequências de contrôlem a terminação ou transcrição e tra dução. Para recuperar o G-TsF em células encariéticas o vector deverá igualmente incluir DuA que codifica um gene selectivo. 0 gene de selecção pode ser fornecido por um plasmídeo desligado em contransformação.

Cs vectores compreendem plasmídeos, viroses (incluindo fago) e fragmentos de DEA integráveis, isto é fragmentos que são integráveis, por recombinação, no gemoma hos pedeiro.

As regiões DLA estão operacionalmente ligadas quan do estão funcionalmente relacionadas umas com as outras. Po:' exemplo, 0 DlúA para uma presequência ou para uma liderança de degregação está operacionalmente ligado ao DKA para um polipéptido se estiver recuperado como uma pré-proteína que participe na secreção do polipéptido. Um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência que codifica se ela con trolar a transcrição da sequência. Um local de ligação de ribossomas está operacionalmente ligado a uma sequência que codifica se estiver posicionado de forma a permitir a trams lacçao. Geralmente, os meios contíguos de união operacional e, no caso de líders de secreção, contíguos e em fase de le:_tura.

As células hospedeiras preferidas são as células que derivam de organismos multi-celulares. Em princípio qualquer cultura elevada de células encarióticas é trabalhável, quer seja duma cultura de invertebrados ou vertebrados. Exen pio de linhas de células úteis são as linhas de células de

ovário de criceto chinês (OhC) e linhas de células CCS-?·

G-TsF é recuperado de células transformadas de lisina e detritos de células solúveis separados por centrifugação. Alternativa os sobrenadantes da cultura das células transformadas de segregam G-TsF são simplesmente separados das células por centrifugação. Então o G-TsF é geralmente purificado por métodos conhecidos neste campo, como por exeg pio usando-se filtragem por gel na presença de ácido seguids de HPLC e eluição sobre um gradiente de acetonitrilo.

Gomo uma outra fase de purificação ou fase de puri ficação substituta os lisatos celulares ou sobrenadantes são aquecidos durante um certo período e a uma temperatura que seja suficiente para desnaturalizar e para precipitar proteínas contaminantes mas não G-TsF.

Similarmente ao TGF-$1, o G-TsF é uma proteína de calor remarcadamente estável, talvez como resultado da formação prolongada da união disulfeto. Como sequência o aquecimento devia ser conduzido num meio que contenha baixos cor teúaos de reagentes disulfeto tais como ditiotreitol. 0 aque cimento pode igualmente ser combinado com uma acidificação já que o G-TsF é estável ao ácido 1 m acético.

G-TsF maduro não é glicosilado. Deste modo ele é separado de quaisquer glicoproteínas estáveis ao calor e ao ácido contaminantes e residuais, por adsorção das glicoproteínas sobre colunas lectinas tais como sefarose ligada a lentil lectina.

Se se pretender um produto altamente purificado a mistura., crua ou parcialmente purificada fica depois sujeita a cromatofocagem.

Podem-se usar métodos similares para purificar o peptido precursor.

4.3.2. - Recuperação em células CEQ

Numa forma de realização efectuou-se a recuperaçãc em células CLiO segundo duas variantes:

4.5.2.1. - primeira vari ante; com ρ91023 (b )-SU22 5~ 1

01onou-se o comprimento total do SUP25 cDDA dentre do vector p91O23 B de segregação de células CnO e COS (G.G-. Wong et al., Science 228 [1985] 810-815) e seleccionou-se um clone, possuindo a orientação correcta, por restrição da análise enzimática (vidé Fig. 3a)). 0 DiíA plasmídeo obtido foi então transferido, por electroporação, para dentro da linha de células DUKX-B de CnC deficiente em dihidrofolato redutase. Todos os clones que incorporaram o DNA p91O23(B)~ -SUP25-1 foram então seleccionados sob condições dum meio (-), em que só as células que produzem reductase dihidro-| folatos sobreviverão. Uma vez que o vector p91023(B) forneci;

um gene para a dihidrofolatoreductase de ratos, podem-se se· leccionar clones de células transferidas. Os genes transferidos podem ser ampliados por ulterior selecção utilizando o metrotrexato das drogas em concentrações aumentativas começando com 1 n.i. Os clones podem ser seleccionados até 10 nm de metotrexato ou mais, podendo-se mostrar que produzem

G-TsF maduro bioactivo por inunomanchamento e pelo ensaio de proliferação de timócitos como se descreveu no mxMiPLO.

4.3.2.2. - Segunda variante: com_ p_ }4-Τ5^ηΘθ_7/3υP40ç· 1

Em mais outra construção o comprimento total do cDNA SUP4C (vide Fig. 2c)) foi incluído no vector ρΧι2Τ3²¹θ°7 de segregação de células COS e CRC. Este vector é um modificação do pXm (I. long et al., Oell 4? [1986] 5-10), que con tém os mesmos elementos básicos que 0 p91C23 (B), embora es teja reunido de forma diferente. Deste modo, à semelhança do p91023(B), 0 pXia confere igualmente às células os elemen tos necessários para a réplica de DEA ligado em hospedeiros

- 35 procarióticos e encarióticos e, adicionalmente, o último prç, motor maior do forte adenovirus para segregação dos cDNAs clonados num local próximo do promotor e seus elementos ligados. 0 pXMT3«neo 7 derivou do ρϊΜ pela inserção de múltiplos sítios de clonação e o novo gene badericida para conveniente selecção de células transferidas com o antibiótico G418 ·

A construção contendo o comprimento total do SUP 40-cDNA em pXMT3*neo7 na correcta orientação transcriccional, denominado pXivT3»r.eo 7/3UR 40-1 (vide Fig. 3b)) e transferido para dentro de E. Coli HB 101, foi depositada em 27 de Agosto de 1987 com 0 EÚmero B3m 4226 com 0 Deutsche Saramluns von mikroorganismen (DSL1), Grisebachstr, 8, D-3400, Gõttingen, República Federal da Alemanha e convertido em 6 de Novembro de 1987 para um depósito sob 0 Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional de Depósito de _lviicr0organismos para os Purposes of Patent Procedure (1977), ^G0^ 0 mes mo número de Acesso.

Este plasmídeo foi transferido para a linha de células CRO BUKX deficiente em dihidrofolato e os clones contendo 0 plasmídeo DNA foram primeiramente seleccionados por 0,5 mg/ml de G418. Realizaram-se mais selecções para sequên cias amplificadas de dihidrofolatoredutase usando-se um meio

O<(-) e aumentando as concentrações do metrotexato como atrá se descreveu e como se descreveu no TEMPLO. Poderia ser de· mostrado sem ambiguidade que os clones das células seleccionados com 10 niii de metrotexato produziram G-TsF recombinante maduro humano por SDS-PAGE e pela inuno-manchamento das proteínas segregadas pelas células (Figura 10). Este material era igualmente bioactivo no ensaio de poliferação de timócitos com uma actividade específica estimada-------- (Fig. 11) a qual está próxima do material isolado das células de glioblastoma humanas. As células seleccionadas em 10 mM metotrexato, denominadas CKO/SUP4O-1/lOmTZ --- foram depositadas em de Novembro de 193/ sobre o Numero de Acesso NOA 00871111 sob o Tratado de Budapeste com European Collection of Animal

Cell Cultures, Porton Dov.n, Salisbúria, Niltshire SP4 OJG,

Reino Unido.

θ cff θ És 3. Ç 3.0 θ-ΠΙ diz · Colli plasmídeo usado para segregação em J. Coli baseia-se no promotor lambda. Procedeu-se à síntese dum oligonucleótido e ligou-se a extremidade 5’ da sequência G-TsF com o local Ndel do vector.

plasmídeo resultante, denominado pxlSI-SUP25-1 (vidé Figs. 7^a) ^e 7b)), transferido para dentro de E.coli ΞΒ 101, foi igualmente depositado em 27 de Agosto de 1987 com o Número de Acesso DSm 4225, com o Deutsche Sammlung vor Mikroprganismen (DSm), e foi convertido em 6 de Novembro de 1987 para um depósito sob a alçada do Tratado de Budapeste, com o mesmo Numero de Acesso.

Esta construção foi usada para transfectar a torsão E. coli ,»5110 lambda H59 que produz um receptor lambda sensível às temperaturas. 0 produto segregado foi muito caracterizado. Como se pode ver pela Fig. 8, o G-TsF recombinante do E. coli foi purificado até a homogeneidade, dando uma simples faixa no SDS-PAGE. Adicionalmente, a proteína de sequência revelou os correctos aminoácidos no terminal amino do material, demonstrando assim sem ambiguidade que o G-TsF pode ser eficazmente segregado em sistemas procarióticos.

A Fig. 9 indica, embora a um baixo nível, que se pode obter alguma actividade biológica com o material recombinante de E. coli. A baixa actividade específica sugere que a forma dimérica bioactiva do G-TsF não se pode formar espon tâneamente a partir do G-TsF monomérico desnaturalizado.

Para segregação no m. coli tem que se inserir um

resíduo de metionina à frente do cDM G-TsF maduro. 0 met-G-TsF faz igualmente parte da presente invenção. A inserção do resíduo de metionina pode ser efectuada de maneira já conhecida.

4.3.4. - Segregação noutros sistemas m evidente possível uma segregação noutros sistemas usando-se técnicas convencionais, que pode resultar numa eficácia aperfeiçoada, como por exemplo começando pelos clones referidos anteriormente e utilizando técnicas de amplificação de genes por via duma selecção com concentrações aumentativas de metótrexato.

Dever-se-á notar que a proteína pode-se apresentar em forma insolúvel que deve ser solubilizada, ou nalgumas outras formas que podem exigir retransposição por meio de m.é todos convencionais (vide por exemplo T.E. Oreighton,......Progr.

Biophys. molec. Biol. 33 [1978] 251-297)·

G-TsF é segregado corao uma proteína latente, pos sivelmente associada com porções da sua parte precursora, e com uma proteína de ligação, podendo assim exigir algum, processamento mais, tal como interrupção dum complexo não covalente, para possuir actividade biológica completa. Este processamento pode, por exemplo, consistir de uma acidificação prévia sobrenadante de células produtoras, mediante, por exe. pio, diálise contra o ácido acético ou bicarbonato de amónio. Alternativamente, são igualmente considerados como agentes activadores os agentes alcali ou caotrópicos. 0 processamento preferido é a acidificação com, por exemplo, ácido acético.

4.3.5. “ Embora este aspecto ainda não esteja completamente entendido, 0 péptido precursor parece ser da maior importância na segregação com êxito dum produto biológicamente activo. Poderia ser útil ou até mesmo essencial na transposição ‘ de moléculas, na formação de pontes disulfeto ou clivagem proteolítica. Após a libertação proteolítica de G-TsF maduro a parte precursora do péptido pode ainda desempenhar um papel importante em, por exemplo, potenciar a função biológica do G-TsF, talvez em relação à união celular, ou a parte percursora do péptido pode formar, após a clivagem protec, lítica, o complexo não covalente atrás aludido (vidé 4.5.4) com o dímero de duas submidades de G-TsF maduro, talvez juntamente com outro componente, tal como a protease envolvida na clivagem do precursor. De acordo com uma linha de pensamento, o crescimento de células epiteliais não regular pode ser o resultado dum falhanço para activar a forma latente de G-TsF autócrino.

Qualquer que sejam as incertezas mencionadas, uma vez que a activação in vivo é um passo regulador crucial na especificidade pretendida da acção do G-TsF, e sendo o precursor clax^amente da maior importância neste processo de acti vação, a importância da presente invenção pode residir ainda mais na estipulação das sequências para a parte precursora do péptido do que das sequências para o G-TsF maduro.

Poder-se-ia igualmente realizar a síntese da proteína precursora completa enquanto tal em E. Ooli, ser trans, posta e dimerizada, recuperando-se mais tarde o péptido maduro por clivagem proteolíticas. Poder-se-ão obter igualmente bem, formas de precursor não-clivadas naturais ou modificadas, a partir de células como por exemplo células GmC trais fectadas com cDNAs correspondentes a serem clivadas após a purificação do precursor. Podem-se segregar formas híbridas do precursor adicionando-se pré-peças não relacionadas, por exemplo aquelas do interlencina-2 ou Grn-OSF, a certas posições internas do precursor. Asuas proteínas híbridas podem ser mais eficazmente segregadas e podem ou não ser correctamente clivadas nas células, podem-se também isolar das linhas de células formas não clivadas que seriam depois clivadas ir vitro. 0 local da clivagem protease poderia ser mutagenizado para rpoduzir sequências reconhecidas por diferentes proteases. Uma vez mais, os precursores não clivados contendo estes locais de clivagem modificados poderão ser isolados e clivados pelos respectivos enzimas.

C Exemplo que se segue ilustra a presente invenção não pretendendo ser limitativo.

5. EXEmPLO

5.1.1.- As células de glioblastoma 31 508 (A. Fontana et al., J. Immunol, 152 [1984] 1837-1844) são cultivadas em frascos de cultura de tecidos ou em tabuleiros (Nunc) 0 meio utilizado é 0 Dulbecco’s modified Eagle's médium contendo 10% de sêro fetal de bezerro e 500 microgr./ml de L-glutamina. Após se obter a confluência lavam-se as células com a solução Hank, tratam-se com Trypsin/versen (Gibco) e semeiam-se a uma densidade de 8 x 10 de celulas/175 cm¹* frasco ou 4 x 10 células/tabuleiro. Após se ter alcançado a con fluência as células são incubadas durante 5 dias num meio isento de sêro com 1 microgr./ml de indometacina. Colhem-se então os sobrenadantes e usam-se para purificar o G-TsF, como se descreveu em 5·ί·2. Alter nativamente, as células são colhidas um dia após a confluência e sao usadas para isolar 0 inRNA, como se descreveu em 5·2.1.

5.1.2 - Concentra-se 1 litro de sobrenadante isento de soro (no seu conjunto são 1,1 x lCr unidades no ensaio de timócitos) para 139 ml tio sistema de cassettes Pelli-con^' e uma membrana PTGC^^W (Hillipore), sendo diafih· trado contra 0 volume de 10 mk de Tris.HCl, ρϊΐ 7,5·

5.1.3.- Faz-se então a cromatografia da amostra numa coluna

- 58 de hidróxilapatite:

dimensões: 1,6 x 24 cm; 49 ml tampão A; 10 mlvi tris. .101, pH 7,5 + 10 microiví CaCl^ tampão B: 0,5 M de fosfato de sódio, pH 7,5 velocidade de fluxo: 2 ml/min.

A actividade biológica elui a 100-250 mM de fosfato (tampão B).

5.1.4.- Isto é seguido por uma cromatografia de fase inversa sobre Pro-P.PC¹'¹’'¹ (Pharmacia) com ácido trifluoracético/acetonitrilo como eluente:

dimensões: HE 5/10; 2 ml tampão A: 0,1% de ácido trifluoracético em água tampão B: 0,1% de ácido trifluoracético em acetonitrilo

Adiciona-se 0,1% de ácido trifluoracético ao conjunto com a actividade biológica (29 ml), centrifuga-se a solução e adiciona-se o sobrenaclante (11,4 mg) à coluna. A actividade biológica elui a 1-25% do tampão B (sob condições de excesso de proteínas).

Ti;·;

5·1.5·~ Recromatografia sobre Pro-RPO *^,χ: dilui-se o conjunto de actividade biológica em 1:5 com o tampão A e adiciona-se à coluna. A actividade biológica elui a 30-52% do eluente B.

rn

5.1.6.- Cromatografia de permuta de catioes sobre mono-S^Xi,i (Pharmacia):

dimensões: HR 10/10; δ ml tampão A: 25 mia de formiato de amónio, 50% de 2-propanol, pH 4,0 tampão B: 500 mia EaCl no tampão A

Dilui-se o conjunto com a actividade biológica a 1:10 com. o tampão A. A actividade elui a 68-6¾¾ do tampão B.

Τ'^1: 5.1.7·” Cromatografia de fase inversa sobre Pro-jETO com ácido trifluoracético/2-propanol: dimensões: HR 5/2; 0,4 ml tampão A: 0,1% de ácido trixluoracético/água tampão B: 0,1% de ácido trifluoraéético/2-propanol

Dilui-se o conjunto com a actividade biológica 1:5 com o tampão A e adiciona-se à coluna. A eluição da actividade biológica tem lugar a 24-26% do tampão B. Inicia-se a cromatografia por ----- adição da amostra no tampão A, seguida de eluição gradual com o aumento de concentrações do tampão B.

resultado encontra-se na Fig. 4. A fracção de pico desta soluna da cromatografia possui as seguintes carac terísticas:

- A proliferação dos timócitos estimulados é inibida a metade do seu máximo a uma diluição de 1:5*000 numa amostra de 200 microl. Isto equivale a uma actividade de cerca de 25.000 unidades/ml.

método seguido no teste é 0 seguinte: adicionam-se amostras de 50 microl de sobrenaclante com várias diluições a 6 x 10·? timócitos de ratos C3H/HeJ-------em suspensão em 150 microl dum meio FPiuI com um suplemento de 500 mi-5 crogr/ml de L-glutamina, 1 x 10 2-mercaptoetanol e 5% de sôro fetal de borrego. As células são incubadas em chapas mi crotituladas de fundo plano durante 72 horas e na presença de Concanavalin-A (0,5 microgr/depressa). Dezasseis horas ar tes da colheita adicionam-se 0,5 microci de [/Hl- timidina ( Ci/mmole) por depressa. Os resultados são expressos como a r7, percentagem de supressão comparada com a resposta concanavalin-A dos timócitos tratados com um controle do meio. Para fins de padronização a percentagem de supressão pode ser par celada para se obter uma curva-padrão a partir da qual se po

- 4C de fazer a conversão para unidades da actividade do G-TsF. Uma unidade de G-TsF e definida cosio a quantidade de G-TsF contida num ml do meio do ensaio final o qual causa uma inibição de metade, no seu máximo, no ensaio.

A proliferação de células auxiliares T específicas dos antigenes dependente da interleu,cina-2 é igualmente inibida era valor superior a 90% em concentrações de G-TsF de 10'(vidé Fig. 5» parte B).

C método seguido no teste é o seguinte: Oultivam-se 2 x 1C^A células auxiliares 2? OVA-7'2 em chapas microtitulares na presença de várias concentrações de IL-2 (Amersham AHN 1010, matéria 10) e de fracções a testar. 0 meio utilizado é Iscove's Complete médium (Bahringwerke Cat. lfê.7852), 5 x 1(4 de k 2-mercapto etanol e JOC microgr/ml de 2-glutamina. Mede-se a incorporação de Jlí-Tdr (1 micro Ci/depressa) passadas 16 horas. Os resultados são medidos como valores cpm de 3H-Tdr.-absorção e expressos como a percentagem de inibição.

A liofilização na presença do veículo seguida por SDS-PAGE (gradiente gel 5-15%) ® coloração de prata dá uma faixa visível de 12,5 Kd de peso molecular (extrapolado a partir de padrões com 95, 67, 45, 51» 21 e 14 Kd), (vidé Fig. 4). Estima-se que a concentração de proteínas seja de 0,5 mi crogr/ml com base nas quantidades-padrão utilizadas, correspondente a uma actividade biológica específica da proteína de 5 x 10' unidades/mg no ensaio de proliferação de timócitos e uma inibição metade do máximo do ensaio a uma concentração de 10^-11m (vidé Kg. 5» parte A).

Estes dados relativos à actividade específica da proteína purificada, conjuntamente com a demonstração de uma só marca em SDS-PAGE, demonstram sem ambiguidade que o G-TsF biologicamente activo foi purificado até atingir a homogenei dade.

- 41 5.2. - Olonação e Seguenciamento do cDNA

5.2.1. - Isolamento do mRiTA

As células de 50 chapas --- cultivadas como se des creveu em 5·1·1·» são daí retiradas, centrifugadas, e faz-se suspendar a pelete em 40 ml de uma solução que realiza a lise (6m de ureia, 3m de LiOl, 50 mm de acetato de sódio com 5,0 de pH, 200 microgr/ml de heparina e 0,2% de sulfato dodecil de sódio) e homogenizam-se por três vezes durante 50 segundos num sorvall Qmnimix, após 0 que se armazena durante a noite à temperatura de 4°0. Após a sua centrifugação a 10.000 rpm e à temperatura de 4°0 ------, 0 precipitado é la vado uma vez com 8 de ureia-------, 4 m de LiOl, sendo er tão dissolvido em 50 ml de tampão acetato (200 mia de acetato de sódio com 5,0 de pH, 0,2% de sulfato dodecil de sódio e 1 mm de EDTA) e é extraído com fenol saturado com água. Após a centrifugação separa-se a fase aquosa e extrai-se novamente com uma mistura 1:1 de fenol e clorofórmio. 0 RIA é precipitado com 2 volumes de tanol durante toda a noite à temperatura de -2C°C. Após a centrifugação durante 10 minutos a 10.OCO rpm, dissolve-se o precipitado em 10 ml Z1S. A solução é trazida para /.5 m de EaCl e percorre uma coluna com 500 mg de oligo(dT)-celulose (i?L, tipo 7). Após uma lavagem intensiva com 0,5 m liaCl, 10 mm Tris ph 7,5, 1 mm EDTA, elui-se a união mnlTA contendo poli (A) com água estéril. Adi cionam-se 0,5 de acetato de sódio de pH 7,θ θ 2,5 volumes de etanol, precipita-se 0 mRi.A durante toda a noite à temperatura de -20°0 e centrifuga-se a solução a 10.000 rpm. Dissolve-se o precipitado em água 0 qual é trazido para uma con centração de cerca de 1 microgr/microl. Recuperam-se aproximadamente 40-60 microgr de mRí;A a partir de 50 chapas com 14 cm.

5.2.2. - síntese do cDIIA

A primeira torsão cDNA é sintetizada a partir de microgr. de mtd.A em 200 microl duma solução contendo 50 mix de Tris.HG1 pH 8,5, 50 ml £01, 8 mm mgOlg» 1 mxi õitiotrei tol, 50 microgr/ml oligo (dí), 0,1 microgr/ml actinomicina

D, 1 ml de cada dATP, dOTF, dGlT Τ’,

RNAse inibi dor EliAsin¹¹ (Promega) e dTTP, 1 unidade/microl e 1,5 unidade/microl de tra ns criptase de fase inversa do virus micloblastose avian (Life

Sciences). Efectua-se a incubação durante 4 horas à tempera tura de 42°C. A reacção e parada com 1/10 volumes de 0,5 m

E.DTA e percorre uma pipeta Pasteur cheia coai Sephadex G 150 a fim de remover os trifosfatos não incorporados, actinomicina D e sais. Adiciona-se 0,5 E de acetato de sódio com 7,C de pH ao híbrido c3EA/mESA eluído e precipita-se a mistura com 2,5 volumes de etanol à temperatura de -20 0. Eecupera-se o precipitado por centrifugação, o qual é lavado uma vez com 80% de etanol e dissolvido em microl TEN.

Faz-se síntese da segunda torsão pelo método de

U. Gubler e B.J. Hoffman, Gene 21 (198%) 265-269 com as seguintes modificações numa mistura reaccional de 400 ml consistindo de 20 mii de Tris.HOl de ô,C de pH, 5 mm de agO^, 10 ml de (EH^SO^, 100 ml KC1, 0,05 ml cada de dATP, dOTF, dGTP e dTTP, 0,1 1 de ditiotreitol, 20 microCi dOTP, (Amersham, 3.000 Oi/imaole), 20 microl FEAse H (Bethesda Eesearch Laboratories, 3 unidades/microl), 10 microl de polimerase I BNA (Eew England Biolabs, 10 uniâades/microl) e o cDNA/mENA híbrido atrás obtido. A incubação dura 90 minutos à temperatura de 12 0 e 5 horas à temperatura de 22 0. A reac ção é parada com 1/20 volumes de 0,5 1 de EDTA e os componen tes de baixo peso molecular são separados sobre uma coluna Sephaaex G150. 0 cDEA de torsão dupla é então precipitado coo. etanol e dissolvido em 20 microl TEn.

cDNA e então metilado nos locais EcoEl mediante tratamento durante uma hora à temperatura de 57°0 em 50 mi-

/9 ί I // ί·* /· /

crol de 50 mm Tris.HM plí 8,0, 0,1 mk EDTA, 80 microH de ade nosil metionina (Sigma) e 5 microl de metilase EooEI (líew England Biolabs, 20 unidades/microl).

Além disso, qualquer formação aberta com o diâmetro de um alfinete de cabelo que se forme é cortada com nuclease SI mediante tratamento, durante 50 minutos à temperatura de 22°0, em 40C microl de 250 mi de NaCl, 50 mm de acetato de sódio com um pH de 4,5, 1 mm de ZnSO^ e 10 unidades de nuclease SI (PL).

Após extracção com 1:1 de fenol/clorofórmio o cDO é precipitado com etanol, dissolvido em 1C0 microl ΤΕΐϊ e sãc descarregados pequenos fragmentos de LBA mediante a sua passagem numa coluna G150. Após a precipitação com etanol o cDNA é dissolvido num pequeno volume (10-20 microl) de T21,.

As extremidades do cDHA são então preparadas para uma ligação de união mediante incubação com polimerase T4 de DM durante 50 minutos à temperatura de 57°O em 40 microl de 55 mit de Tris-acetato com pH de 7,9, 86 mm de acetato de potássio, 10 mm de acetato de magnésio, 2,5 mi de ditiotreitol. 0,1 mm cada um de dATF, dCTP, dG-TP e dTTP e 4 microl de polimerase I de DM 24 (New England Biolabs, 10 unidades/micrcL 0 enzima é inactivado mediante tratamento durante 10 minutos à temperatura de 70°C·

Os elos EcoEI sintéticos (New England Biolabs) recebem então uma cinase nas suas extremidades 5’, como se segue: 20 microgr. de DHA de ligação são incubados durante 40 minutos à temperatura de 57°O em 200 microl de 7θ mm de Tris. HC1 pH 7,5, 10 mm de mgOlp, 5 M; de ditiotreitol, 2 < de ATP e 10 microl de cinase polinucleótida.

Os elos fosforilatados em 5' são então ligados ao cDNA; a mistura reaccional do cDNA inactivada por acção do calor é trazida para 100 microl e para as seguintes concen44 -

trações: 35 Tris.HCl PH 7,5, 7 mm HgClg, 1 2ώί ATP e 5 < de ditiotreitol. Adiciona-se 1,6 microgr. de elos EcoRI que receberam cinase e efectua-se a ligação durante a noite à temperatura de 15°0 com 10 microl de ligase DNA T4 (Hew England Biolabs). A ligase é então inactivada à temperatura de 70°0 durante 10 minutos e os elos EcoRI são completamente clivados mediante tratamento durante 4 horas à temperatura de 37°C com um grande quantidade em excesso de EcoRI (R'er England Biolabs), 1.000 unidades. Extrai eia-se os enzimas coa. 1 volume de fenol e de cDEA precipitado com etanol. Os fragmentos dos elos monoméricos podem ser separados do cMA sobre uma coluna Sepharose 4B. cPM com mais de 500 bp elui no volume de exclusão, é precipitado com etanol e dissolvido numa placa de gel agarose Sea de 1% em tampão de electroforese (40 mm Tris, acetato pH 7,8, 1 mm EDTA) 50 V, revestido com brometo de etídio, e os fragmentos de DPA maiores que 1600 bp foram cortados e extraídos do gel. Fragmentos Hinfl de pBR 322 são usados como marcadores de tamanho (J.G. Sutcliff, Nucl. Acids Res. 5 [1973) 2721-2728). Adiciona-se um volume igual de TE e 5 m de acetato de sódio com. 7,0 úe pH, funde-se a agarose durante 5 minutos à temperatura de 70°C e arrefece-se durante 5 minutos à temperatura de 57°C. Extrai-se a agarose por duas vezes com. um volume igual de fenol e do cDNA recuperado da fase aquosa por precivjitação com etanol.

5.2.5. - Glonação para lambda gtlO cDNA fraccionado nas suas dimensões é clonado em fago lambda gt 1C (T.V. duynh et al., MA Oloning, Glover Ed. IEL Press, vol. 1 [1985^49-7θ· Braços de lambda gt 10 defosforilados com fosfotase podem ser obtidos pelos sistemas de Glonação Stratagémica. Um microgr. de braços de lambda gt 1C são ligados, num volume total de 8 microl, como se descreveu em 5.2.2., com 0 cDNA total obtido de 20 microgr. de rnREA, usando-se 1,6 microl de ligase DITA ϊ’4. Os fagos são então encubados com um extracto de embalagem (Gigapack, Sistemas de Clonação Stratagénicos) seguindo-se as instruções do fabricante, e as células E. coli G6CC hfl (Stragénicas) são ir jectadas. A embalagem dos fagos tem lugar com 20 microlitos de produto de congelação é 50 microl de extracto sónico durante 2 horas à temperatura de 22°C. Diluiem-se então os fa gos com 1 ml de tampão de diluição (5,8 gr de ITaOl, 2 gr. MgSO^. 7 H2O, 50 mm de Tris. H01 pH 7»5) θ estabilizam-se com 40 microl de clorofórmio. Uma cultura fresca de 0600 hf] é então centrifugada e suspensa numa metade de volume de 10 mlvi MgSO^. 1 ml desta suspensão de bactérias é injectada com um terço da suspensão dos fagos durante 20 minutos à temperatura de 57°O θ as células E.coli são placadas em 30 ml Top-Agar em meio BBI» --------(0,8% Bactoagar Difco, 10 gr tripticase, ---- 5 gr UaOl pH 7,2) sobre 1,5% agar num disco biológico (Eunc) de 245 x 245 mm, e incubadas durante 5-6 horas à temperatura de 57°O. E.etira-se 0 Top-Agar com as pis cas sendo agitado durante a noite num tampão fago de 20 ml à temperatura de 4°C. 0 agar e centrifugado a 6.000 rpm e a suspensão eluída de fago é estabilizada com 80C microl de clorofórmio. Desta maneira obtêm-se 500.000 fagos recombinai. tes de 3 placas, contendo insertos cDIA com mais de 1600 pb em comprimento.

5.2.4. - síntese de amostras oligonucleótidas radioactivas

CR

5.2.4.1.- Os oligonucleóticos para a Amostra A e Amostra B como se mostra na Fig. 1 são preparados usando-se um aintetizador de DM de Biosistemas Aplicado de acordo com. as instruções do fabricante (para a Amo tra A o aminoácido assumido na posição 22, Ala, descobriu-se mais tarde estar errado mas tal não trouxe consequências para a experiência).

“ 46 >.2.4.2. - Os cligonucleótidos são então radioactivamente rotulados como se segue:

a) Amostra A: Aquecem-se 100 microgr. de cada um dos dois oligonucleóditos da Amostra A à temperatura de 70^uC durante 10 minutos em 18 microl de água, adicionando-se então 2 microl duma solução de 1 m NaCl, 10 mm Tris • íiv 1 p.i 7,5® hibridizam-se as amostras durante uma hora à temperatura de 57°C e durante 2 horas à temperatura ambiente. A mistura é então trazida para 50 microl e estabelecem-se as seguintes concentrações: 50 mli Tris.HOl p.i 8,0, 6 mm rngOl^, 5 ditio treitol, 0,05 ímt cada de dATP, dGTP e dfTP e 100 microCi de dCTP (Amersham, 5000 Oi/mMole). Após se adicionar 2 | microl de polimerase DNA de fragmento Klenow, a mistura é incubada durante 4> minutos sob temperatura ambiente e separam-se os nucleótidos não incorporados do fragmento de DITA de dupla torsão que sofreu a síntese, sobre uma coluna Sepha

O O dex G25· Obtiveram-se entre 1 x 10 e 2 x 10° cpm/100 inanog. de Amostra A.

b) Amostra B: Ela é radioactivamente rotulada com 100 microCi PT ATP (Amersham, 500 Ci/mMole) e 2 microl de cinase polinucleátida, (Boehringer, 11 unidades/microl) numa mistura de cinase de 20 microl, sob condições iguais às

7 descritas em 5-2.2.. Obtiveram-se entre 0,5 x 10' e 1 x 10' unidades/100 nanog.

5-2-5- - Separação e selecção dos clones de G-Tsg

Revestem-se cerca de 100.000 fagos recombinantes (vidé 5-2.5.) após infecção do E.coli 0600 em 0,7% de Top. Agarose, num meio BBL * sobre discos Petri com 10 x 14 cm com 1,5% agar. Após incubação durante 6 até 9 horas à temperatura de 37°0 as placas resultantes são copiadas em filtros Nylon (Pall) seguindo-se as instruções do fabricante. Preparam-se duas cópias. 0 DITA dos filtros á primeiramente desna

- 47 turalizado com C,5 N de La OH, 1,5 m d© uma solução de NaCl durante 5 minutos sendo depois neutralizado com 5 u de acetato Na de 5? 5 úe pH durante 5 minutos. Finalmente, os filtros são secos ao ar, mergulhados em clorofórmio durante JO segundos, secos ao ar e misturados durante 1 hora à temperatura de 80°C.

Lavam-se então os filtros durante 2 horas à temperatura de 65°C numa solução de EET com 1% de SDS e pré-hibri zam-se durante 4 horas à temperatura de 42°0 numa solução de NET com 0,2% de SDS, 0,1% de Ficoll, 0,1% de polivinilpirrolidone, 0,1% de albumina de sôro de borrego e 100 microgr/ml de esperma de salmão denaturalizado DNA.

A hibridização é efectuada numa solução de ΙϊΑΐ com

0,2% de SDS, 0,1% de Ficoll, 0,1% de polivinilpirrolidone, 0,1% de albumina do soro de borrego, 100 microgr/ml de tRNA levedura e 0,05% de pirofosfato de sódio, durante toda a noi te à temperatura de 42°C.

A primeira cópia é hibridizada com 2 x 10° cpm/ml da Amostra A, a segunda cópia com 0,5 x 10° cpm/ml da Amostra B. Após a hibridização ter sido efectuada as placas são lavadas por duas vezes durante 50 minutos com um grande volume de NST com 0,2% de SDS sob temperatura ambiente. Aumenta-se então a temperatura progressivamente para 42°0, >2°0 e 57°C, realizando-se a lavagem com a mesma solução duas vezes durante 15 minutos. Após cada fase de lavagem os filtros são expostos durante 16 até 18 horas sob um filme de Raio X Kodab XAR-5 com telas de intensificação.

Podia-se identificar nos filtros, após terem sido lavados à temperatura de 52°C, a hibridização dos clon.es com ambas as-amostras. Uma àrea correspondente a estes clon.es é colhida da placa e os fagos são eluídos num tampão. Uma vez que a àrea escolhida continua a conter um número de fagos re1 - 48 -

combinantes diferentes, os fagos eluídos são usados para um renovamento da infecção de E.coli C6GC nos fagos revestidos a baixa densidade. São de novo feitas cópias em filtros de nylon como atrás se descreveu, hibridizando-se os filtros com as amostras correspondentes. Uma única placa pode agora ser escolhida da chapa. Ê eluída em 1 ml de tampão fago e a resultante suspensão de fagos é mantida à temperatura de 4°C·

Após se subclonar o inserto de cDEA deste clone (denominado lambda SUF25) ©m pBs.klõ (vidé abaixo) obteve-se uma amostra F.LA classificada mediante a transcrição do subclone pSUF25 com polimerase T3 ENA.

Isto é realizado num ensaio de 10 microl contendo 40 mM Tris.x-xCl pH 8,0, 8 mm rngCl^, 2 mM espermidina 50 miu NaCl, 75 πώι ditiotreitol, 1 mk cada de^dATP, dGTP, e dUTP, 25 unidades de BNasin^Tk, 50 microCi <K^í2P-dCTP (400-800 Ci/ /mmole), 1 microgr. de plasmídeo de ΏΠΑ linearizado e 10 uni dades de polimerase T5 ΕΕΆ. 0 tempo de incubação é de 30 minutos à temperatura de 37°C·

Usou-se aproximadamente 1 x 10 cpm ae amostra pox ml da solução de nibridização para seleccionar outras cópias preparadas após o revestimento adicional da library cDNA como atrás se descreveu. Isolaram-se mais dois clones a partii desta selecção (lambda SUF40 e lambda SUP42, vidé Fig. 2c)).

5.2.6. - Confirmação da identidade do clone de G-TsF

5.2.6.1. - Reclonação no vector de sequenciame nto pB3._ 1..15 rara se confirmar de que os fragmentos de cDEA, obtidos sob 5.2.1., contêm cDEA que codifica para o G-TsF de comprimento total, ele deverá ser sequenciado. Isola-se primeiramente uma pequena quantidade de DNA fago. Usam-se 50 microl da suspensão de fago obtida em 5*2.5·, para infectar uma suspensão de 1CC microl de células E.coli 06CC em 10 irm

de mgSO,., durante lp minutos a temperatura de >7 0. Adiciona _ Ti'

-se a mistura resultante a 20'ml de BBL contendo 0,2% de maltose e agitam-se 10 mu de durante um. período entre a 7 horas à temperatura de 57°0· Adicionam-se- 2 ml de clorofórmio durante 50 minutos à cultura parcialmenue lisada, sendo então centrifugada durante 10 minutos a 5-000 rpm, incubando-se o sobrenadante durante 60 minutos à temperatura de 57°C com 50 microl de DuAse I (1 mg/ml e 40 microl de £dA; (5 mg/ml). Precipitam-se os fagos durante a noite à temperatura de 4°C por adição dum volume equivalente de 20/ de poli tileno glicol 60CC, 2 P RaOl, 2 gr/1 kgSO^.7 Η-θ’ 50 ffiwi Tris HC1 pH 7,5- A pelete obtida, após centrifugação durante 20 minutos a 5-000 rpm é recebida num tampão de fago de pOC microl e extraída por uma vez 0 DiíA fago na fase aquosa é então tratado com 20% SDS e 7,5 microl de /.> u de EDTA à temperatura de 68^UC durante lp minutos, extraíndo-se as proteínas da solução coa fenol, e o MA é precipitado com etanol.

com 500 microl de clorofórmio.

5,8 microl de

- o

Dissolve-se então o D1A num pequeno volume de TE. ketade do DNA fago resultante ê clivado com EcoRI numa mistura reaccional de 1C microl e o fragmento de cDUA inserido é separado dos braços lambda sobre uma rose-Sea, como se descreveu em p.2.2.. o DNA é recuperado da agarose, como se mediante uma extracção com fenol e precipitação de Cerca de 50 ng do fragmento a·· vector pBS.mlp (Sistema d: tura de ligação de ra tal tem primeiro que se clivar o vector pBS.mlJ e defosforilá-lo nas extremidades 5’ com fosfatase de intestino de borrego (Boehringer) de acordo com ções do fabricante. Entre 1 e 2 microl da mistura de ligação são então transfectadas numa suspensão de 100 microl de E.co

Placa de gel de agaA faixa é cortada e descreveu em 5·2.2. etanol.

cDRA são ligadas com 50 ag do clonação estratagénico) numa mis10 microl como se descreveu em 5-2.2.. Pa com EcoRI alcalina as instru

8Θ li

Jii 109 competente.

As células Λ·.. 109 competentes podem ser obtidas por método-padrao tais como os descritos por T. maniatis et al., em ivíolecular OlOCTing; _A naboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ITova lork (1982). Derretem-se sobre gelo 100 micro1 da suspensão das células, adicionando-se 2 microl de mistura de ligação. A incubação tem lugar durante 20 minu tos sobre gelo, incubando-se então as células durante 45 segundos à temperatura de 37°0 agitando-se durante 1 hora à temperatura de 57°C, em 1 ml de meio 300 (2% Bacto-triptone, 0,% de extracto de levedura, 10 ΰΐ,ι de NaOl, 2,5 mm de KC1, 10 mm de MgCl^, 10 mii de higSO^, 20 mm de glucose). As bactérias são granuladas por----centrifugação, suspensar em. 1CC microl de meio SOB (meio SOO sem glicose) e espalhadas sobre um prato agar de 1,5% em meio SOB com. 50 microgr./ml de ampicilina. Após 0 prato ter sido pré-tratado com 10C microl duma solução contendo 4 mg de 5~Dromo-4-cloro-5-indolil-)J-D-galactopiranosida e 50 mg de isopropil-^-D-tiogalactopiranosida por ml de dimetilformamida, então a galactosidase-β contida no vector causa uma cõr azul nas colónias de E. coli. As colónias com inserções são incolores. Bstas colónias são semeadas em culturas de 6 ml e crescem durante a noi te. 0 meio de crescimento pode ser um meio 300 com 50 microgr/ /ml de ampicilina. Isola-se 0 DLA plasmídeo mediante 0 méto do fervente descrito por maniatis (1982, supra).

5.2.6.2. - Sequenciamento dos fragmentos cDBA

Um terço do DM plasmídeo obtido a partir de 6 ml do meio de cultura é desnaturalizado por tratamento, durante 5 minutos, com 1/10 volumes de 2 ií NaOH, 2 mia de mDTA; adiciona-se 1/5 volume de 5 E. de acetato de amónio e 0 DM. é precipitado com 2 volumes de tanol. 0 precipitado é dissolvido em 8 microl de água, adiciona-se 1,5 microl do tampão da reacção (0,5 M de NaCl, 0,1 k de Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M de mgOl-, 1 de EDTA e hibridizam-se com o cnl.A os primeiros oligonucleótidos apropriados. Após a adição das várias misturas de deóxi-nucleótidos e trifosfatos dideoxinucleótidos, o DNA e sequenciado segundo o método de F. Sanger et al., PNA3 74 (1977) 5463-5477, usando-se a polimerase I de BEA Klenow.

A estratégia do sequenciamento que confirma a ider. tidade do cDEA 3UP25, está ilustrada 11a Fig. 2b). Pode-se utilizar a Amostra B como um primeiro iniciador (vidé 3.2.4.2). Ê possível ler uma região de cerca de 200 nucleótidos por seu intermédio. Tal fornece uma suficiente informação da sequência para sintetizar mais dois outros iniciadores de sequenciamento :

Iniciador 1:

Iniciador 2:

Qom estes dois iniciadores é possível ler a regiãc completa cobrindo os 112 aminoácidos da proteína madura (vidé Fig. 2a)). A posição correcta do péptido maduro dentro da proteína precursora é deduzida a partir da sequência de péptidos de terminal amino determinada, e pode igualmenre ser inferida por comparação com a sequência publicada para TGF-^1 (R. Derinck et al., Fature 316 [1985] 701-704).

A sequência completa do cdKA entre as posições 1 e 1695 derivou após a subclonação e sequenciamento de uma série de fragmentos de cDEA transpostos obtidos pela divisão do cDKA SUP25 com vários enzimas de restrição ou por se tratarem subclones com nuclease mung-bean e exonuclease III, de acordo com 0 método de S. Henikoff, Gene 28 (1984) 551-359).

Adicionalmente sequenciaram-se os cDEAs 3UP40 e

SUP42 para 300 nucleótidos de ambas as extremidades e em reπ η giões que codificam para o péptido ma· dores internos de sequenciamento atrás • M /luro usando os iníciadescritos. jescooriu-se que as regiões sequenciadas eram idênticas ao cD!A SUF25 (vidé figs

O

2c) e 2u)).

A sequência completa para a proteína madura possui 71% de semelhança com o TGF-/91, e a sequência de proteínas está, como para o TGF$1 na extremidade de terminal caroó xi de uma proteína precursora (vidé Fig. 2b)).

Π λ Vi.

f

Tal segue da presença de um codon de terminação na extremidade 3¹ e de um resíduo de arginina como fazendo parte de um local potencial para o corte da protease situado em frente do orimeiro aminoácido na proteína madura.

5.3.1. - Eeci ζ\

Os cBlAs lambda SUF25 e lambda S1P40 2c)) são reclonados nos vectores de recuperação COS e 01-0 p91023 B e pxMT3*neo 7.

wong e υ al.

C vector pSíTJ.neo 7 foi dividido do vector pxk, o qual contém os mesmos elementos principais que o p91O23 B e encontra-se descrito por Ί. lang et al., em Bell 47 (198 6) 3-10.

Hesunidamente, ambos estes vectores contém elemen tos que permitem o crescimento em células L.coli e células encariéticas. 0 cDEA inserido pode ainda ser recuperado em células CHC e OCS. Elas possuem locais de iniciação para res ponder em procariotes e encariotes, o elemento intensificador de 3U40, o último e maior promotor de adenovirus seguido

por partes das três sequências principais do último adenovirus transcripto, um intrão de um gene de inunoglobulina, um local de poliadenilação de 3V4C e os genes VA do adenovirus que funcionam junto com as sequências principais 5’ não traia laccionadas no controle da translacção.

Adicionalmente os vectores contêm um cJHA de reduç tase dihidrofolata de rato inserido entre o local da clonação, o qual está localizado depois no intrão de inunoglobulina, e a sequência de poliadenilação de SV4G (vide Fig. 5a)). Deste modo, estes vectores podem também ser transfectados para dentro de células CmC e os genes transferidos serem ampliados conjuntamente com ocDriA de reductase dihidrofolata, por selecçao de subclones resistentes a concentrações aumentativas de metotrexato (de acordo com J. Haynes et al., Nucl. Acid. R_es. 11 (1985) 687-7C6).

vector de construção pXkT3.neo 7 deriva do vector pXiá para facilitar o procedimento da clonação mediante a inserção de múltiplos locais de clonação. Além do mais, o neo-gene bactericida sob controle do promotor da cinase de timidina do virus Herpes simplex está inserido entre a res posta da origem SV4O e os genes VA. Isto permite uma primeira fase de selecçao após a transfecção das células CmO usan do-se sulfato G418 (Gibco) de acordo com F. Colbère-Garapin et al., em J. i^ol. Biol. 150 [1981] 1-14. Em detalhe, a região Pstl-JScoRI do poli-elo de pU018 (0. Yanich-Perrou et al., Gene 33 [1985] 103) foi inserido no plasmídeo pli.< após clivagem com PstI e EcopJ, o qual retirou um fragmento de

Sp do pXi... Isto originou o clone pXmf3· Para a inserção do neo-gene, o fragmento de 1882 bp, obtido de uma clivagem parcial PvuII de pAG6C (F. Colbère-Garapin et al., J. _ài.ol. Biol.__ 150 [1981] 1-14) contendo 0 promotor da cinase de timidina acoplado ao neo-gene, foi inserido no vector pZmT3 clivado StuI e um plasmídeo contendo 0 neo-gene e 0 maior e _ 54 último promotor do adenovirus na mesma orientação transcripcional pXMT3.neo 7 foi seleccionado (vidé Fig. 3 b)).

A reclonação é efectuada como se descreveu em

5.2.6.1. para dentro do local EcoBI dos vectores (vidé Figs. 3a) e 3b)).

5.3.1.2. - Transfecção das células 010 e ampliação do cDEA de G-TsF

Eealizou-se a transfecção da reductase dihidrof0lata - dificiente em linha de células CAO ΌϋΚΧ-Β (G. Urlaub e L.H. Chasin, PNAS 77 [198θ| 4216-4220) mediante electroporação de acordo com E. ITeumann et al., ΕΜΒθ &· 1, [1982] 841-845. As células cresceram em próxima confluência num meio <x + (libco), sendo lavadas uma vez com P3S sem Ca e sem Ivig⁺⁺ e foram libertadas das placas por incubação em PBS contendo 0,5 mil· de EDTA e 0,5 de EGTA durante aproximadamente 5 minutos. As células foram centrifugadas e resuspensas em TBS (25 Eu Tris.HCl pH 7,5» 137 EaCl, 5 mi- K01, 0,7 ami O&CI2, 0,5 mm KgCl₂ e 0,6 mM Na^BPO^). Após uma centrifugação adicional as células foram suspensas em TBS frio e ajustadas para 10? células/ml. Eealizou-se a electroporação com 100 microl aliquotas desta suspensão usando-se um fornecimer to de energia ISCO de modelo 494 e uma unidade de electroporação Haefliger. As células foram incubadas juntamente com 5 yUg de DNA plasmídeo linearizado durante 30 minutos antes da pulsação e por mais 30 minutos após. Verificaram 5 impulsos em intervalos de 5 minutos. As quantidades de energia fornecida foram: 2.COO V, 5w, 3mA; limite de voltagem entre 600 e 1.80C volts como especificado, dando resistência de 3·COO ate 9.OCO V/cm. Os capacitores foram seleccionados para carregar para 169 microF. Após a electroporação as células foram semeadas em frascos de cultura cora 75 4 num meio X+. Passadas 24 horas adicionou-se G418 a uma concentração de 0,5 mg/ml, sendo seleccionadas clones celulares tendo in) corporado o LE'A plasmídeo contenj.o o neo-gene. A mistura óoê clones celulares em crescimento foi libertada das placas poi incubação em PBS contendo 0,5 de EDTA e 0,5 BGTA e resemeada num meio <=<(-) (Gibco) para seleccionar a presença da reductase dihidrofolata nas células. Outras ampliações dos genes transiectados foi então conseguida por selecçao após o reseamento das culturas em concentrações aumentativas de metotrexato,---começando-se por 1 n.x e aumentando até > e 1C n,..

5.3.1.3· ~ Confirmação da produção de G-TsF humano recomoinante bioactivo por células OmO.

Os clones das células seleccionados em 1 zm,. e 1C nm. de metotrenato bem como uma cultura de controle transfectada com os vectores sem insertos de cLnA e seleccionados pela mesma via, foram semeados a uma densidade celular de 2 até 4 x 1C° células/frasco de 75 cm e foram deixadas crescer até uma confluência de 90%. Lavaram-se então as células três vezes com PBS, a fim de se remover o metotrexato, e foram incubadas durante 48 horas com 6 ml de um meio isento de sôro °% ou um meiooccontendo 10% de soro fetal de borrego. Após a precipitação das proteínas provenientes dos sobrenadantes da cultura isenta de sôro com ácido tricloroacético, realizou-se o SDS-PAGE e a inuno-manchamento, de acordo com os protocolos-padrão como descreveu

antisôro de do mediante a inunização de coelhos

H. Tonbiri et al., em PO8 coelho utilizado foi obti com um péptido sintético correspondente à parte aminoterminal do G-Ts?. 3intetizou-se o péptido Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Tir—Ois-Phe-Arg-Asn-Val—Gln10

Asp-Asn-Cis-Cis-Leu-Arg-Pro-Leu15 20

-Tir-Ile-Asp-Phe-Lis-Arg-Asp-Leu-Gli num sintetizador do Bio sistema de Péptidos de acordo com o protocolo do fabricante e injectou-se em. coelhos de acordo com os processos-padrão.

As experiências de inuno-mancliamento identificam sem ambiguidade a produção de G-lsF humano recombinante maduro nos clones celulares seleccionados em 10 mk de metotrexato. Não se detectou qualquer material de G-TsF sob estas condições nas células de controle e nas células seleccionadas em 1 mm de metotrexato (vidé Fig. 10).

Os sobrenadantes obtidos num meio de 10% de sôro isento de metotrexato foram testados no ensaio de proliferação de timócitos como se descreveu em 5·1·7·· Sempre que os sobrenadantes das células de controle e das células seleccic nadas em 1 mu de metotrexato revelaram uma actividade inibidora muito pequena, o meio obtido dos clones celulares selec cionados em 10 nu metotrexato demonstraram ---- inibição de proliferação de timócitos;

---------.Seguidamente à activação ácida do complexo do G-Ts produzida pelos clones celulares, os clones seleccionados com-----10 ru. de metotrexato causaram uma inibição metade da máxima possível no ensaio, a uma diluição --- para além de 1:5.000 ..... (vidé Fig. 11).

Estas experiências provam definitivamente a produção de G-TsF humano recombinante bioactivo por células O.uC transfectadas com o cDEA do G-TsF. A actividade específica calculada a partir da quantidade de G-TsF estimada para estar presente no inuno-mancha (vidé Fig. 10) (aproximadamente 100 ng/ml) é pelo menos tão elevada quanto as 5 x 10' uni dades/mg calculadas para o material isolado das células de glioblastoma (vidé 5·1.5·)·

Além disso, a actividade inibitória do sobrenadante obtido das células CHC transfectadas com pZkTJ.neo 7/SUP 40-1 e seleccionadas em 10 nU de metotrexato, foi completamente neutralizada no ensaio de timócitos após a incubação

de sobrenadante isento de metotrexato diluído em 1:10 com microgr./ml de anticorpos anti—TGF-^l policlonais (H x D Sistemas), em que norinalmente isto resulta em 37% de inibição na ausência de anticorpos. Estes anticorpos demonstraram ser reactivos de nuzamento para o TGR-^l e G-fsF; eles neutralizam o G-TsF natural das células de glioblastoma.

5.3.2. - Recuperação em células E.çoli do cDlA lambda SUP25, contendo a região péptido de G-TsF maduro e sequências não 5' até ao local Hinde III (viclé Fig. 2c) Este vector permite a recuperação do do promotor lambda. Para a construção

Uma parte que codifica para o translaccionadas em é clonado em p^Sl. cDNA sob o contrôle faz-se primeiramente a síntese dum oligonucleótido o qual faz a ligação do local IlaelII na posição 1099-1102 do cDEA do G-TsF com 0 local lidei no vector, de tal forma que cria um códore de iniciação da translacção ATG. Isto é directamer te seguido pela sequência que codifica para 0 G-TsF maduro de 112 aminoácidos no comprimento (Figs. ?a) e 7 b)). Esta

TD construção (P^r^31-SUP25~l) é transfectada numa torsão E.coli W3H0 lambda 1139? a qual produz um lambda repressor sensível à temperatura. As bactérias crescem então à temperatura de 30°0· Após se ter atingido uma densidade de 0,6 ΟΒθθθ o promotor P_T é induzido mediante 0 aumento da temperatura paO * ra 42 Q (0 que faz inactivar 0 repressor lambda). Apos de 54 horas de incubação a proteína E.coli total é isolada e con firma-se o G-TsF recombinante após a separação sobre um gel poliacrilamida, usando-se 0 anticorpo de coelho policlonal para 0 G-TsF, que se descreveu em 5·3·1·3·· Deste modo pêde-se demonstrar a produção do G-TsF, iniciando-se uma hora antes da inactivação do repressor lambda a 42°C (viãé Fig.6)

Verificou-se uma vez mais a identidade do G-TsF se gregado na proteína E.coli fazendo-se crescer 6 1 de meio de cultura contendo E.coli com 0 plasmídeo recombinante até

gir uma densidade de 0Β^θθ=0,6, induzindo durante > horas à temperatura de 42°0 e isolando o G-TsF da maneira que se se gue :

1) Segregação: As 8 gr de células obtidas foram incluídas numa suspensão com 28 ml de um tampão (10 im, de tris.XÍGl com 7,5 de pH; mm de EDTA; 1,5/ úe 3DS e C,% de 2-mercaptoetanol), aquecida à temperatura de 50 C durante 20 minutos apés o que foi centrifugada durante 15 minutos a 48.000 g.

sobrenadante foi regeitado e extraiu-se a pelete uma vez mais com o mesmo tampão mas contendo 5% de SDS. Ambos os sobre nadantes foram misturados, reduzindo-se a viscosidade por meio cie agitação energética.

2) Cromatografia sobre Biogel: A proteína extraída foi fraccionada sobre uma coluna de Biogel (Biogel P10C, 16C-2CC mecha, K 10C/1C0) e eluída com um tampão (de composição igual à fornecida em 1) (120 ml, velocidade de fluxo de 260 ml/hora Separaram-se aliquotas das fracções por meio de PAGE e imnuno-manchamento. Fundiram-se as fracções 23 e 24, liofilizaram-se, dissolveram-se em 4C ml de água destilada e dializaram-se durante 6 dias de encontro a água destilada. 0 material dializado (85 ml) foi então trazido para um pH de 2,15 com ácido trifluoracético.

3) F.p.l.c. de fase inversa sobre Pro-BPO (Pharmacia HR 16/10): Centrifugaram-se as fracções dializadas a 48.000 g durante 10 minutos e o sobrenadante claro (9 mg de proteína) foi transferido para a coluna:

Tampão A: 0,1% de ácido trifluoracético em água

Tampão 3: 0,1% de ácido trifluoracético em acetonitrilc

Dimensão das fracções: 2 ml; velocidade de fluxo: 2 ml/' /min. gradiente: 5-6C% em 45 mi1111L· O £J ·

Verificaram-se as fracções contendo G-TsF (fracçõc s

4J e 44) mediante inuno-mancliamento, sendo ainda fundidas, obtendo-se 5 mg de manitol como veículo, e liofilizadas.

4) F.p.l.c. de permuta de catiões sobre mono 3 (Pharmacia iiR 10/1C) : dissolveu-se o produto liofilizado em 2 ml dc tampão A (25 mí,. de formiato de amónio com 4,0 de pH; >0% de 2-propanol) e transferiu-se para a coluna:

Tampão B: 50C mm de RaOl no tampão A

Dimensão da fracção: 1 ml, velocidade ãe fluxo; 1 ml/' /min. gradiente: 0-100% em 60 minutos .

Determinaram-se as fracções contendo G-TsF em SD.8-PAGE após o revestimento a prata (fig. 9). As fracções 51 e J2 (eluídas com 175 mm de EaCl, aproximadamente Õ microgr. de proteínas) foram liofilizadas com 1 mg de manite.

5) F.p.l.c. de fase inversa sobre Pro-RPC (Pãarmacia HR 5/2): O produto liofilizado foi dissolvido em 1 ml do tag pão A (0,1%· de ácido trifluoracético em água) e transferido para a coluna:

Tampão B: 0,1% de ácido trifluoracético em acetonitrilo

Dimensão da partícula: 1 ml; velocidade de fluxo; 1 ml/ /min. gradiente; 5“60% do tampão B em 45 minutos.

As fracções foram caracterizadas por SDS-PAGE e pe lo revestimento a prata das aliquotas. Usa-se 0 material da fracção eluindo a 36% do tampão B (aproximadamente 1 microgr de proteínas) para fazer a sequência do terminal amino.

6) - Sequenciamento de terminal amino: 8CG microl da fracção 26 da fase 5) foram directamente transferidos para filtro de vidro dum sequenciador de fase gasosa dos Biosis temas Aplicados (Ensaio 155» 87 05 15)· A degraduação e a identificação dos aminoácidos foi feita de acordo com as ins truções do fabricante. 0 resultado (Ala-Leu-vazio-Ala-Ala-Tir-Vazio-Phe-vazio-Asn) confirma a identidade e a correcta sequência de terminalamino do G-TsF recombinante segrega· do em E.coli.

7) Testou-se uma aliquota das fracções 31 © 52 da fase

4) no ensaio de proliferação de timócitos (vidé 5·1·7·) θ mostrou possuir a actividade inibitória (vidé Fig. 10) embora se tenha observado metade da inibição máxima apenas em _ Π concentrações de aproximadamente 10 ''m. Isto indica que apenas uma pequena fracção do G-TsF monómero está apta a espontaneamente forma a forma dimérica bioactiva.

A presente invenção torna desta forma viável a pre paração de largas quantidades de G-TsF recombinante para ulterior estudo e aplicações terapêuticas.

É evidente que o G-TsF é um péptido multifuncional o qual, para além do seu efeito inuno supressor, controla igualmente a proliferação, diferenciação e outras funções em muitos tipos de células.

útil nas indicações dadas em 1-unquadra mento Geral para o lGF-^2, GIF-B e G-TsF, primeiramente como um agente imunosupressivo, de cicatrização de feridas, de formação de tecido ósseo ou anti-inflamatório, como por exem pio em condições de tumores, transplantes, antoimunidade, os teoporose, danificação de tecidos e inflamações.

C factor é biologicamente activo principalmente co mo o aímero de cerca de 25 Kd.

A actividade inunosupressora pode por exemplo ser determinada in vitro pela, inibição da proliferação de timóci· tos estimulada pela lectina e pela inibição da proliferação de células auxiliares T específicas do antigene de murino de pendente da interlencina-2. Fode-se igualmente efectuar o

ensaio in vivo, no modelo aloreactivo e citolítico das células T e no modelo da encefalomielite, como foi descrito por S.L.. Hefeneider et al., J. Immunol. 150 (1985) 222-22/ e poi A. Ben-lTun et al., J. Immunol. 129 (1982) 918-919. Outros modelos de testes são descritos em Sandoz EF 159 289« 0 G-TsF inibe os mecanismos de actividade antecipada nas células-T, incluindo fases dependentes de IL-2. Esta actividade é útil para controlar o sistema imune humano em muitas indicações que vão desde a transplantação de órgãos até doenças auto-inanológicas tais como a poliartrite crónica e a encefalite dependendo da inunidade.

Deste modo, as concentrações de 10 (baseadas no monómero) resultam numa inibição, metade do seu máximo, da proliferação de ti^ócitos provocada pelo CJoncanavalin-A e da proliferação de células auxiliares T provocada pela interleucina-2 (vidé LtmlO).

Bara além disto, o G-fsF aumenta a formação do tecido conectivo, e conduz à fibrose e angiogénese. ή desta forma útil no tratamento de lesões da pele causadas por trauma, queimaduras, intervenções cirúrgicas ou senilidade. A ca, pacidade do G-TsF em promover a formação de colagénio torna-o útil também para o tratamento de, por exemplo, osteoporose, em que a insuficiente formação de colagénio e outros com ponentes da matriz óssea conduz à patogénese.

As citadas actividades de formação de tecidos modern-se conhecer através de conhecidos modelos de testes, co mo por exemplo através de ensaio de cicatrizaçao de feridas em ratos (m.B. Sporn et al., Science 219 [1985] 1529-1550) e no ensaio de provocação celular nos músculos de ratos (S. A. Seyedin et al. PFAS 82 [198

Outras aplicações de interesse incluem o uso do

G-TsF no tratamento de locais doadores de enxertos de pele,

ferimentos na córnea, chagas provocadas pela permanência pro longada na cama e úlceras diabéticas. Pode-se até encarar o seu uso potencial na terapia do cancro.

Além disso, o conhecimento da sequência completa para o G-TsF maduro e precursor possibilita a preparação de derivados do G-TsF recombinante possuindo propriedades modificadas, como por exemplo melhoradas, em relação às propriedades do produto maduro.

É muito possível que a parte do precursor, enquanto tal, possua as suas próprias actividades farmacológicas benéficas.

Para as supracitadas indicações as dosagens apropriadas irão naturalmente depender, por exemplo, do G-TsF empregue, do hospedeiro, do modo de administração e da natureza e severidade da condição a ser tratada. Contudo, em geral, há notícia de resultados satisfatórios em animais mediante a admnistração de dosagens diárias, desde cerca de 0,5 microgramas por Kg até cerca de 15 microgramas por Kg do peso total do animal. Em mamíferos de maior porte, como por exemplo os humanos, uma dosagem diária indicada está compreendida entre cerca de 20 microgramas até cerca de 1.000 microgramas, como por exemplo entre 5θ θ até 500 microgramas de G-TsF em forma madura, convenientemente administradas até 4 vezes por dia.

G-TsF pode ser administrado por qualquer via cor vencional aos peptidos, em particular tópicamente, como por exemplo sob a forma de pomadas ou suspensões ou sistémicamer te, como por exemplo sob a forma de injecções parentéricas ou infusões.

A presente invenção compreende ainda a preparação de composições farmacêuticas contendo G-TsF em associação com pelo menos um veículo farmacêutico ou diluente. Tais com posições podem ser feitas de maneira convencional. As formas de dosagem unitária contem, por exemplo, desde cerca de 5 mi crogramas até cerca de 500 microgramas de G-TsF.

As indicações particularmente preferidas para o G-TsF são a cicatrização de feridas, que sejam feridas de superfície quer sejam feridas internas, osteoporose, transplantação de órgãos e doenças antoimunológicas.

G-TsF pode ser combinado com agentes de activação tais como TGF-yS, TGF-/31, EGF (factor de crescimento epidérmico) ou outros factores de crescimento ou de diferenciação. A quantidade de agente de activação presente depende directamente da quantidade de G-TsF nas composições activadas como são administradas ao recipiente.

- Abreviaturas

CHO - Ovário de Crieeto Chinês

CIF-B - Factor B provocador de cartilagens

DMEM - Meio Eagle modificado do Dulbecco EDTA - Ácido tetracético etileno diamina

EGTA - etileneglicol-bis-(/3-aminoetíléter)-N,N,N’ ,N’-ácido-tetraacético

FPLC^ - Cromatografia de rápida proteína líquida

G-TsF - Factor Supressor de células T derivadas de glioblastoma

H-Tdr - timidina tritnatada

IL-2 - Interlencina-2

MIS - Substância Inibidora MUlleriana

NET - 750 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 50 mL de Tris.HGl

PH 7,5

PAGE - Electroforese de gel de poliacrilamida

PBS - Salina tamponizada com fosfato; 8 gr/1 NaCl, 0,2 gr/1 KC1, 1,15 gr/1 Na^PO^, 0,2 g/1 KH₂P0₄

SDS - Sulfato dodecilo de sódio

,.4 / / - 64 TBS - 10 mM Tris.HOl pH 7,5, 140 mM NaOl

TE - 10 mM Tris.HOl pL 7,5, 1 mM ΜΤΛ

TER - 100 mM NaCl, 10 mk Tris.HOl pH 7,5, 1 mk EDTA

TES - 10 mil Tris. iiCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,2% SDS

TGF-/I - Eactor/J transformador do crescimento (=TGF- 1) TGF-/1 - Factor/9 1 transformador do crescimento

TGF-^2 - Factor^ 2 transformador do crescimento

	LA
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0	Ο ri	*	Ed	<4	r*	0
co	rd ω	*	«ri	Ed
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ri				1	CQ	«ri
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<!	rd	*	O	rq	ri- ri
<tj	*	0		H
ri				ri	H	O
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ri	<4	*	0	ri		a.
Pd				Pd		UA
ri	*	0
	φ	*	Ed
	A		O
	rd ri		O
	Ã	*	O
	«ri	*	0

Figura 2a; Sequências completas de nucleótidos e aminoácidos do G-Tsff maduro humano

Sítio de clivagem pela protease

Φ 27

CGT

GCT

TTG

GAT

GCG

GCC

TAT

TGC

TTT

AGA

AAT

GTG

CAG

GAT

AAT

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Ala Leu Asp

Ala

Ala

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Vai

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Asn

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10

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54 TGC

CTA

CGT

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GAT

CTA

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Cis

Cis

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TGG

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108 CAC

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GCC

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GGG

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GCC

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GCT

GGA

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TGC

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162 TGG

AGT

TOA

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CAG

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AGG

189 GTC

CTG

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TTA

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AAT

216 CCA

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GCT

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TGC

TGC

245 GTG-

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GAT

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Cis

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524 GTA

AAG

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TGC

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TGC

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Vai

Lis

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Lis

Cis

Ser

•

110

Figura 2b: Estratégia de Sequenciamento

IEcoRI //•—CL

Sitio de clivagem pela protease —-ff-1 .Amostra »— ------>^coRI

Primário 1·> .

Primário 2 região sequenciáda y—--fragmento de cDNA com 3,3 kb (lambda SUP25)

Figura 2c Diagrama esquemático e mapa parcial da restrição da endonuclease do cDNA do G-TsF

ÃSUP42 t-i

ÀSUP40 l—1

ÀSUP25

I---------------------------------------//-1

PstI Hindin SphT

5'1—I¹'· ' 13'

I I I I I | 1 I I I I I I I I | I I o 500 1000 1500 bp

Figura 2d Sequências de nucleortidos e de aminoácidos para o precursor de G-TsF humano

10 CAACCAGGAT	20 ACGTTTTTCT	30 GTTGGGCATT	40 CACTAGATTG	50 TTTGCAAAAG	60 TTTCGCATCA	70 AAAACAAACA
10	90	100	110	120	130	140
ACAACAACAA	AAAACCAAAC	AACTCTCCTT	CATCTATACT	TTGAGAATTG	TTGATTTCTT	TTTTTTTATT
150 CTGACTTTTA	160 AAAACAACTT	170 TTTTTTCCAC	160 TTTTTTAAAAA	196 . ATG CAC TAC TGT GTG CTG AGC GCT

RCT Hl· Tyr Cys val fu Set Ala

TTT Ph·

211 CTG fu

ATC Ile

CTG Leu

CAT ki>

CTG Leu

22« GTC val

ACG Thr

GTC val

CCG Ala

CTC Leu

241 AGC for

CTG Leu

TCT Ser

ACC Thr

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25« AGC Ser

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CTC Leu

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31«

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GAC

CAG

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AAG

CTG

AAG

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GAC

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GAG

GAA

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GTG

ATT

TCC

ATC

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GAC

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AAG

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AGC

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Leu

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GCG

GCC

GCC

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GAA

GAC

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CTG

GGA

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112« 1141 1151 1171

GTG CAG GAT AAT TGC TGC CTA CGT CCA CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG CAT CTA GGG Vai Gin Asp Am Cys Cy· teu Ar? Pro fu Tyr 11« Asp Ph· Lys Ar? Asp fu Gly

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Hll 142« 14)« 144« 145« I4«« GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC TAA AATTCTTGGA AAACTGGCAA GACCAAAATG ACAATGATGA Vai Lys Set Cya Lys Cya S*r

147«	148«	149«	150«	151«	1526	153«
TGATAATGAT	GATGACGACG	ACAACGATGA	TGCTTGTAAC	AAGAAAACAT	AAGAGAGCCT	TGGTTCATCA
154«	1556	156«	157«	151«	1596	160«
GTGTTAAAAA	ATTTTTGAAA	ACGCGGTACT	AGTTCAGACA	CTTTCGAACT	TTGTGTTCTC	TTTCTTAAAA
161«	162«	1636	164«	1656	1666	167«
CTGGCATCTG	ACACXAAAAA	AGTTGAACGC	CTTATTCTAC	ATTTCACCTA	CTTTGTAACT	GAGA GA CACA

1686

AGAAGCAAAT ΤΤΤΤΤΤΑΛΛ

&

»

Figura 2e Comparação das sequências de aminoácidos dos pre cursores de G-TsF e TqF-Al

G-TsF

TGF-81 1

21 31 41 51 61

HHYCVLSAFLItHLVTVALSLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEEVPP· hppsglrllplllpllwllvltpgppÁaglstcktidhelvkrkrieÃÍrgqÍlsklhlaspp·

60

7686

-EVISIYNSTRDLLQEKASRRA

SQGÊVPPGPLPEAVLALYNSTRD—-RV

8688

103

113

123

133

149

159

169 179 'SNLVKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTS * ......

aacerersde—eyyakevykidmppffpsenaipptfyrpyfrivrfdvsamekna·

AGESAEPEPEPEADYYAKEVTRViÍ---VETHHEIYDKFKQSTHSIYHFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRRLKLK——VEQHVELYQ·

155 172

108

115

125

135

145 •KYSN

177

279

PTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTP

HSWRYLSNRLLAPSDSPÊwLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSC-------·——-—DSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATI------HGHNRP

243 257

189

199

209

219

229

239

249

259

269

187

197

207

217

299

309

319

329

339

349

359

369

379

289 _{__}_________________________________________________

HLLLMLLPSYRLESQOTNRRKKF MDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFXRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPC *·*· * * * * *L* * · * * ♦ * * * ***** ··***·····**· *··« * **« ·» *·* · *· ··· *· **· * *

FLLLMATPLERAQHLQ267

399

409

CVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS ·· * ·*·· * *· * ·* ··*···*· *****

CVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQL5NMIVRSCKC5 376 386

414

391

389

376 »

Figura 3a: Vector de expressão das células de CHO e COS

Á

SV4O Poli(A)

Figura 3b:

Plasmidio de expressão para as células de CHO e COS com cDNA SUP40

SV 40

»

Figura 4; Fase final de purificação para o G-TsF a partir de 308 células de glioblastoma de 1 £> de sobrenadante TM de glioblastoma sobre Pro-RPC com acido trifluor acético/isopropanol

^w td w CM O¹ O-H

Qrr-1 I C CM -H

Número da fracçao

Figura 5: Actividade do G-TsF puro humano

ICM

Figura 6: Purificação final do G-TsF a partir de 10 de

TM sobrenatante de glioblastoma sobre Pro-RPC com

TFA/isopropanol

280

Número da fracção

Figura 7a; Plasmidio para a expressão de G-TsF em E. coli com base no promotor lambda

Tet

Figura 8: Expressão e purificação do G-TsF recombinante de

E. coli iMlF .

5 4 3 2 1 0 horas

31 número de fracçao

Figura 9: Inibição da proliferação de timócitos por G-TsF recombinante de E. coli

Figura 10:

*

Demonstração da expressão de G-TsF por células de CHO

12.5 kd

G-TsF

2 3

Figura 11; Inibicação da proliferação de timócitos com G-TsF recombinante de células de CHO

Diluição

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES

   13 - Processo para a preparação tendo actividade semelhante a factor G-TsF duma proteína (factor supressor de células T de glioblastomas) humano sob forma substancial mente pura, caracterizado pelo facto de se recuperarproteína de uma fonte natural ou de uma fonte obtida por técnicas de DNA recombinante.

   23 - Processo para a preparação de factor G-TsF humano substancialmente puro, caracterizado pelo facto de se recuperar a proteína de uma fonte natural ou de uma fonte obtida por técnicas de DNA recombinante.

   - processo para a preparação dum novo factor supressor de células T sob uma forma substâncialmente pura por técnicas de DNA recombinante, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo facto de se recuperar a proteína segregada por uma célula hospedeira transformada com um gene que codifica para essa proteína.

   43 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a proteína obtida sob a forma substancialmente pura ter uma actividade semelhante a factor supressor de células T derivado de glioblastomas (G-TsF) humano.

   53 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a proteína obtida ser G-TsF humano substâncialmente puro.

   6ã - processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se obter G-TsF recombinante.

   7§ - processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se obter G-TsF recombinante de mamíferos.

   8a - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se obter G-TsF recombinante humano .

   - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se obter um precursor de G-TsF recombinante.

   10a - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se obter uma parte de precursor de G-TsF recombinante.

   11a - processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se obter G-TsF maduro recombinante

   12a - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência completa de aminoácidos da proteína recuperada ser a seguinte

   10 20 10 <0 50 50 70 CAAGCAGGAT ACGTTTTTCT GTTOGGCATT CACTAGATTG TTTGCAAAAC TTTCGCATCA AAAACAAACA eo 90 100 110 120 130 140 ACAACAACAA AAAACCAAAC AACTCTCCTT GATCTATACT TTGAGAATTG TTGATTTCTT TTTTTTTATT 150 160 170 180 195

   CTOACTTTTA aaaacXactt ttttttccac ττττττααααα ato cac tac TGT GTG CTO ACC CCT HKT Hl» Tyr Cya Val Leu Ser Ala

   211 225 241 256 TTT CTO ATC CTO CAT CTO OTC ACC GTC GCC CTC AGC CTO TCT ACC TOC AGC ACA CTC Fh· Lau !lr Leu Hil Lau Vai Thr Val Ala Leu Ser Leu Ser Thr Cye S«r Thr Leu 271 255 301 ATt 316 GAT ATO CAC CAG TTC ATO CCC AAC AGC ATC CAG GCC ATC CGC GGG CAG CTG ACC Aí p H*t Aap Oln Fh· Hat Ar, Lya Ar, Ila Glu Ala Ila Ar, Gly Gin tle Leu Str 331 348 361 376 AAO CTG AAG CTC ACC AGT CCC CCA GAA GAC TAT CCT GAO ccc GAG GAA GTC CCC CCC Ly· Leu Lya Lau Thr 3« r Fro Fro Olu Aap Tyr Fro Glu Fro Glu Glu Val Fro Fro 391 <06 421 GAG GTO ATT TCC ATC TAC AAC AGC ACC AGO GAC TTG CTC CAO GAG AAG GCG AGC CGG Glu Vai Ila 8«r Ila Tyr Aan Ser Thr Ar, Aap Leu Leu dln Glu Lya Ala Str Ar, <35 451 466 481 AGG GCO GCC GCC TCC ΟΛΟ CGC GAO ACO AGC GAC GAA GAG TAC TAC ÇCC AAO GAG GTT Ar, Al» Ala Ala Cya Olu Ar, O1U At, Str Aap Glu Glu Tyr Tyr Ala Lya Glu val 495 511 526 541 TAC ΑΛΑ ATA GAC ATO cco CCC TTC TTC ccc TCC GAA AAT CCC ATC CCC CCC ACT TTC Tyr Ly« Ila Aap Hat rro rro rha rha Fro Ser aiu Aan Ala Ila rro Fro Thr rha 558 571 586 601 TAC AGA ccc TAC TTC AGA ATT OTT CCA TTT GAC CTC TCA GCA ATG CAG AAG AAT CCT Tyr Ar, FtO Tyr rha Ar, Ila val At, Fh· Aap Val ler Ala Met clu Lya Aan Ala 515 531 645 661 TCC AAT TTG GTG ΑΛΑ GCA GA O TTC AGA GTC TTT CGT TTG CAC AAC CCA AAA CCC AGA Itr Α·π Leu Vai Lya Ala Olu rha Ar, Val rha Ar, Leu Gin Aan Fro Ly» Ala Ar, 8 78 591 706 GTG CCT GAA CAA CGO ATT OAO CTA TAT CAG ATT CTC AAG TCC AAA GAT TTA ACA TCT Vai Fro Olu Oln Ar, Ila Olu Lau Tyr Oln lie Leu Lya lar Lya Aap Lau Thr ler 721 735 751 766 CCA ACC CAG CGC TAC ATC CAC AGC ΑΛΑ GTT GTG AAA ACA AGA CCA GAA CGC CAA TGG Fro Thr Oln Ar, Tyr Ila A»p Str Lya Val Val Lya Thr Ar, Ala Clu Gly Clu Trp 751 796 811 826 CTC TCC TTC CAT ota ACT GAT OCT GTT CAT CAA TGO CTT CAC CAT AAA GAC AGG AAC Leu lar rha Aap Vai Thr Aap Ala Val Hla Clu Trp Leu Ila Hla Lya Aap Ar, Aan 8 41 555 8 71 886 CTO OGA TTT ΑΛΑ ATA ACC TTA CAC TGT CCC TCC TCC ACT TTT CTA CCA TCT AAT AAT Lau Oly lha Lyt 11a lar Lau Hla Cye Fro Cya Cya Thr >he Val Fro Ser Aan Aan TAC ATC >01 >15 >31 >41 ATC CCA AAT ΑΛΛ AOT ΟΛΛ ΟΛΑ CTA GAA OCA AGA TTT GCA GGT ATT GAT QGC Tyr XI· Ila Fro Aan Lya lar Olu Olu Lau Olu Ala At, Th· Ala Oly Ila Aap Oly 9<1 >7« >>1 ACC TCC A CA TAT ACC AOT OOT GAT CAO AAA ACT ATA AAG TCC ACT AGC AAA AAA AAC Thr lar Thr Tyr Thr lar Oly Aap Oln Lya Thr Ila Lya ler Thr Ar, Lya Lya Aan 100« 1 021 1 035 1 051 ACT GGG AAG ACC CCA CAT CTC CTQ CTA ATG TTA TTO CCC TCC TAC AGA CTT GAG TCA 1« f Oly tya Thr Fra 1« Lau Lau L»u Hat Lau Lau Fra ler Tyr Ar, Leu Glu lar 1 Cí 4 1 011 1 015 1 111 CAA CAG ACC AAC CGO CGO AAO AAO COT GCT TTO GAT oca GCC TAT Tac TTT AGA AAT Gin Gin Thr Aan At, Ar, Lya Lya Ar, Ala Lau Aap Ala Ala Tyr Cya Fh· Ar, Aan

   1121 nu ll!l 1ΠΙ OTO CAG CAT ΛΑΤ TOC TGC CTA CGT CCA CTT TAC ATT UAI ttc AAO AOS OAt CTA G00 V. 1 Oln A«p Am Cy« Cy» L«u At J Fto t«u Tyr 11· Λιρ Fh· lyl Aty A«p L»u Qly 1111 1101 mi 11Π TOO ΑΛΑ TGO ATA C*C ΟΛΑ CCC AAA GOO TAC AAT occ AAC TTC TOT OCT OOA OCA TGC Trp Ly· Ttp 11« III Glu FtO Lyi Gly Tyr Am Ala Am Fhl Cyi Al» 01 y Al» Cy« : 1 1111 Ull 1JTÍ CCQ ΤΛΤ TTA TOG AGT TCA OAC ACT CAO CAC AOC AGO OTC CIO AGC TTA ΤΛΤ ΑΛΤ ACÇ Fí 0 Tyt L«U Ttp Itt Itt A«p Tht Gin 11« Itt At| v«l L«u l«r L«u Tyt A»n tht IMl 1 JOÍ 1)11 i))i ATA ΑΛΤ CCA GAA OCA TCT gct TCT CCT TOC TOC OTO TCC CAA OAT TTA CAA CCT CTA f 1 · A«n r ro Olu Al« itt Al· ler Tre Cyi Cy« v»l I«t Oln A»p L«U olu r ro Ltu 1 )51 1 )ll 1 J11 1 Hl ACC ΑΤΙ CTC TAC TAC ATT GGC ΛΑΑ ACA CCC FAO ATT ΟΑΛ CAO CTT TCT AAt ATO ATT Tht 11« t«u Tyt Tyt 11« Gly Ly« Tht Fto ly« 11« Olu Oln L«U til A«n Kit 11«

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   Iflf

   AGAAGCAAAT

   TTTTTTAAA

   13â Processo de acordo com a reivindicação

   3 , caracterizado pelo facto de a proteína obtida ter a sequencia de aminoácidos indicada na reivindicação 12 antes da seta.

   14§ _ processo de acordo com a reivindicação

   3 , caracterizado pelo facto de a proteína obtida ter a sequencia de aminoácidos indicada na reivindicação 12 depois da seta.

   15a Processo de acordo com a reivindicação

   3 , caracterizado pelo facto de a proteína obtida ser uma $ Λ 'H forma alélica ou uma forma variante com qualquer das reivindicações 3 a

   16§ - Processo de acordo com a reivindicação

   3 , caracterizado pelo facto de se obter uma variante alélica ou uma variante resultante duma mutação pontual ou de modificações maiores para intensificar a actividade ou a produção sem modificar as principais propriedades funcionais e estruturais duma proteína de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 14.

   17a - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 14, caracterizado pelo facto de se obter uma mutante por anulação, inserção ou substituição duma proteína de acordo com as reivindicações 3 a 14.

   18a - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 17, caracterizado pelo facto de se obter a proteína sob a forma glicosilada.

   19a - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 17, caracterizado pelo facto de se obter uma proteína sob a forma não glicosilada.

   20a - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 19, caracterizado pelo facto de se obter a proteína sob a forma dimérica.

   21§ - Processo de acordo com qualquer das reivindi

   12 ou 14, caracterizado pelo facto de se obter uma proteína que tem na posição 16 da sequência de aminoácidos a contar do cações de principio da sequência Ile Lis na posição 25.

   em vez de Cis e/ou Vai em vez

   22a - Processo de de , caracterizado pelo facto combinante usando a parte precursora de G-TsF.

   acordo com a reivindicação se obter G-TsF maduro re23a - processo de acordo com a reivindicação

   3, caracterizado pelo facto de se obter uma proteína de G-TsF maduro precedida por resíduo de metionina.

   24a _ processo de acordo com qualquer das rei. vindicações 3 a 23, caracterizado pelo facto de se obter uma proteína que tem um peso molecular da unidade monomérica madura de 12 320 dalton, desprezando qualquer glicosilação.

   25a - processo de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 23, caracterizado pelo facto de se obter um precursor monomérico de 45 540 dalton, desprezando qualquer glicosilação.

   26a _ processo de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 25, caracterizado pelo facto de se obter uma proteína que, de acordo com o ensaio de proliferação de timócitos, tem uma actividade específica igual e pelo menos

   5 x 10 unidades/mg.

   27a -Processo de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 26, caracterizado pelo facto de se obter uma proteína madura que tem mais de 71% de semelhança da sequência de aminoácidos com a sequência de aminácidos referida na reivindicação 12 depois da seta.

   28§ - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 26, caracterizado pelo facto de se obter uma proteína precursora que tem mais de 30% de semelhança da sequência de aminoácidos com a sequência completa de aminoáci- í dos mencionados na reivindicação 12.

   29§ - Processo para a preparação duma proteína com actividade semelhante a G-TsF, de acordo com a reivindição 1, caracterizado pelo facto de compreender

   a) a construção dum vector que inclui ácido nucleico que codifica essa substância,

   b) a transformação duma célula hospedeira heteróloga com o vector,

   c) a cultura da célula hospedeira transformada e
2. 3) a recuperação a partir da cultura da proteína segregada.

   30§ - Processo para a preparação de factor supr sor de células

   T derivado de glioblastomas (G-TsF) dimérico bioactivo, caracterizado pelo facto de se efectuar previamente a síntese do precursor de G-TsF ou de partes do precursor de G-TsF essencial no processamento de transposição e proteolíti co.

   31θ - processo de acordo com as reivindicações

   4 ou 5, caracterizado pelo facto de compreender uma operação de cromatografia com permuta de catiões, preferivelmente, em resina sulfónica permutadora de catiões (Mono-S).

   323 - processo de acordo com a reivindicação

   31, caracterizado pelo facto de compreender a cromatografia em hidroxilapatite e meio para cromatografia em fase inversa à base de silica contendo Cl- e cadeias de alquilo em Cg (Pro-RPC), cromatografia com permuta de catiões em resina sulfónica permutadora de catiões (Mono-S) e cromatografia em fase inversa sobre meio para cromatografia em fase inversa à base de sílica contendo Cl- e cadeias de alquilo em Cg (Pro-RPC).

   333 _ Processo de acordo com a reivindicação

   32 , caracterizado pelo facto de compreender

   a) a concentração e a diafiltração de sobrenadantes de células duma fonte natural de G-TsF como, por exemplo, células de glioblastoma,

   b) cromatografia em hidroxilapatite,

   c) cromatografia em fase inversa sobre o meio para cromatografia em fase inversa à base de sílica contendo Cl- e cadeias de alquilo em C_o (Pro-RPC) usando ácido trifluor-

   O acético/acetonitrilo (2x) como agente eluente,

   d) cromatografia com a permuta de catiões, preferivelmente sobre resina sulfónica permutadora de catiões (Mono-S) e

   e) cromatografia em fase inversa sobre o meio para cromatografia em fase inversa à base de silica contendo Cl- e cadeias de alquilo em C_g (Pro-RPC), usando ácido trifluoracético/2-propanol como agente eluente.

   l' a preparação dum cDNA í

   í >

   1 t*

   34a - processo para (complemento de ácido deoxirribonuleico) que codifica para um proteina de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 28.

   35a - Processo de acordo com a reivindicação

   34, caracterizado pelo facto de se obter um cDNA tendo a sequência de nucleótidos indicada na reivindicação 12.

   36a - processo de acordo com a reivindicação

   34, caracterizado pelo facto de se obter um cDNA tendo a sequência indicada na reivindicação 12 antes da seta.

   37§

   34, caracterizado sequência indicada

   - Processo de acordo com a reivindicação pelo facto de se obter um cDNA tendo a na reivindicação 12 depois da seta.

   38§ - processo para a preparação de um cDNA capaz de se hibridizar com um ácido nucleico de acordo com qualquer das reivindicações 34 a 37 e codificar para uma proteína que tem uma actividade semelhante a G-TsF ou de cDNA capaz de se hibridizar com o conjunto complementar desse ácido nucleico.

   39a _ Processo para a preparação dum vector para a expressão duma proteína recombinante de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 28 que inclui ácido nucleico que codifica essa proteina.

   42§

   39, caracterizado

   -SUP25-1.

   43§

   39, caracterizado /0-1.

   44a

   39, caracterizado são procariótica.

   39, caracterizado são em E.coli.

   46^

   39, caracterizado

   Processo pelo facto

   Processo pelo facto

   Processo pelo facto

   Processo pelo facto

   Processo pelo facto de de de de de de de de de de de de de de acordo com a reivindicação o vector provocar a expresacordo com a reivindicação o vector provocar a expres-