PT848011E

PT848011E - Metodo para acoplar polisacaridos a proteinas

Info

Publication number: PT848011E
Application number: PT96203556T
Authority: PT
Inventors: Peter Hoogerhout
Original assignee: Staat Nl Verteg Door Min Welzi
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 2001-08-30
Also published as: US6361777B1; DK0848011T3; WO1998027107A1; EP0848011B1; ATE199908T1; DE69612205T2; WO1998027107A8; CA2274852C; DE69612205D1; CA2274852A1; AU5347898A; GR3035918T3; ES2156611T3; EP0848011A1; JP4619459B2; JP2001509144A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

MÉTODO PARA ACOPLAR POLISACARIDOS A PROTEÍNAS A presente invenção refere-se ao uso de compostos de aminotiol como enlaces para preparar vacinas polivalentes.

Demonstrou-se que a união covalente entre um polisacárido o outro hapteno e um peptídeo ou proteína imunogênica ou outra molécula biorgánica sendo um método adequado para preparar vacinas eficazes, por exemplo, contra organismos patológicos como o Haemophilus influenzae tipo b (meningite, otite media), a Bordetella pertussis (tosse ferina), o Clostridium tetani (tétanos), os meningococos (Neisseria meningitidis, meningite, otites media) e os pneumococos (Streptociccus pneumoniae, pneumonia, meningite, otites media). Descreveu-se este tipo de vacinas polivalentes, por exemplo, na US-A-4,762,713. Segundo esta patente de EUA, o vínculo entre o polisacárido e a proteína transportadora leva-se a cabo mediante a aminação redutiva das funções aldeídos ou hemiacetais dos polisacáridos com os grupos de aminos na proteína. Outro método adequado para se levar a cabo a união covalente entre um polisacárido e um material proteínico consiste em activar as funções hidroxilas com o objectivo de produzir uma cadeia secundária que conta uma função que possa ver-se unida à proteína. Deste modo, pode-se activar o polisacárido e, depois, acopla-lo a um grupo que inclua tiol como pode ser a cisteamina, que se pode acoplar a um aminoácido activado na proteína. O uso da cisteamina para acoplar oligosacáridos à proteína aparece descrita em Verheul et al (Infect. Immun. 59 (1991) 843-851). Este uso compreende a activação do sacarídeo convertendo um grupo carboxílico em um éster N-succinimidilo (NSu), segundo o seguinte esquema:

Ps-COOH + XONSu — Ps-CO-ONSu + HOX (1)

Ps-CO-ONSu + h2n-ch2-ch2-s-s-ch2-ch2-nh2 -* — Ps-CO-NH-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2 + HONSu (2)

Ps-CO-NH-CHtCHtS-S-CH-i-CH-i-NH-, + DTT-rd — 4 * 4, 4. * — Ps-CO-NH-CH2-CH2-SH + HS-CH2-CH2-NH2 + DTT-ox (3)

Ps-CO-NH-CH2-CH2-SH + Br-CH2-CO-NH-Pr — -* Ps-CO-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-NH-Pr + HBr (4) onde Ps representa um polisacárido, Pr representa uma proteína ou um peptídeo e DTT-rd representa o ditiotreitol na sua forma reduzida, (ditiol) e DTT-ox ou representa na sua forma oxidada (1,2-ditiano). Este enfoque, requer a presença de grupos de carboxilo no polisacárido, enquanto muitos polisacáridos interessantes desde o ponto de vista biológico não contém um grupo carboxilo. Descobriu-se que os polisacáridos podem ser enlaçados eficazmente a enlaces com forma de cisteamina sem a necessidade que haja presente outro funcional ou parte do grupo hidróxilo mediante a activação de bromuro cianógeno segundo o seguinte esquema:

Ps-OH + Br-CN — Ps-O-CN + HBr (5)

Ps-O-CN + h2n-ch2-çh2-s-s-ch2-ch2-nh2 — — Ps-0-C(=NH)-HN-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH2 (6) 2 A reacção (5) é seguida de uma série de reacções secundárias entre as que se inclui uma reacção com um segundo grupo hidróxilo para produzir um imidocarbonato cíclico que também pode ter como resultado um acoplamento com um grupo de aminos como na reação (6).

Assim, a invenção refere-se a um método para acoplar um polisacárido ou outro biopolímero onde o polisacárido é activado mediante um haluro cianógeno e onde o polisacárido activado reage ante um enlace de aminotiol que tem a fórmula 1 H2N-[(CH2)m-CHR1-CR2R?-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 1 na que A, m, p, q, R1, R2, R3, R4, R5, R6 e R7 são tal e como aparecem definidos na reivindicação 1 adjunta, para produzir um polisacárido à base de tiol que apresenta a fórmula 2

Ps-0-C(=NH)-NH-[(CH2)m-CHRI-CR2R:'-A]<)-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 2 na que Ps representa um resíduo de polisacárido e A, m, p, q, R1, R2, R3, R4, R5, R6 c R7 são tal e como estão definidos anteriormente, contínuo da eliminação optativa do grupo protector R7 e reacção do polisacárido à base de tiol ante um biopolímero activado. Os enlaces preferidos são tal e como aparecem definidos nas reivindicações 3-8. Um exemplo adequado de enlaces é a cisteamina ou sua forma oxidada cistamina. 3

Este método funciona de maneira satisfatória para a maior parte de polisacáridos incluído a maioria dos polisacáridos bacterianos. Mas, não se encontra nenhum acoplamento que seja útil em grau algum com alguns polisacáridos como o polisacárido capsular pneumococal tipo 19F.

Ainda que os presentes inventores não desejam estar sujeitos a uma teoria específica, uma possível explicação para as faltas ou as falhas que se produzem no acoplamento mediante cisteamina reside em que o aduto da cisteamina, uma vez formado, pode voltar aos materiais originais mediante um deslocamento intra-molecular.

Além disso, também se descobriu que se pode resolver qualquer acoplamento insuficiente usando enlaces de aminotiol, com o que se cumpre com a fórmula 3, (= fórmula 1 com q = 1) H2N-(CH2)m-CHR1-CR2R3-A-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 3 na que A, m, p, q, R1, R2, R3, R4, R5, R6 e R7 são tal e como aparecem definidos na reivindicação 1 anexa e as formas de realização preferidas são no modo em que aparecem definidas nas reivindicações adjuntas. Estes enlaces têm como resultado um acoplamento eficaz com qualquer polisacárido com um rendimento aperfeiçoado do acoplamento mediante cisteamina (reacções (6) e (3)). 4

Os enlaces de aminotiol segundo a fórmula 3 podem ser derivados simples ou ramificados de α,ω-aminotiol com ao menos 4 átomos de carbono e, opcionalmente, um ou mais heteroátomos na cadeia, como 4-aminobutanotiol, 5-aminopentanotiol, 2-(2-aminoetilamino)etanotiol e similares. Os compostos preferidos são aqueles nos que H2N-(CH2)m-CHR -CR R - representa um aminoácido como a glicina, a alanina, a β-alanina, a serina, a glotamina, o ácido γ-aminobutirico, a lisina e o ácido ε-aminocaproico, ou um oligopéptido como a Na-glicil-lisina e homólogos mais elevados dos Na-peptidil-qtD-diaminoácidos. O grupo H2N-(CH2)m-CHR1 -CR2R3-A- também pode representar um oligopéptido lineal como a glicil-glicina.

Nos enlaces de tanto a fórmula 1 como da 3, o grupo A-CHR4-(CHR5)P-CHR6-S-R7 pode, por exemplo, ser um derivado de 2-aminoetanotiol (cisteamina), 2-mercaptoetanol, 1,2-etanoditiol, 2-amino-2-metilpropanotiol, 3-aminopropanotiol, 2-hidroxi-3-aminopropanotiol, monotio e ditio-treitol ou -eritritol, cisteína, homocisteina e seus ésteres ou amidas e similares. Os compostos mais preferidos segundo a fórmula 3 são N-glicil-cisteamina e seu disulfuro precursor Ν,Ν’-diglicil-cistamina. A maior parte dos compostos que cumprem com as fórmulas 1 e 3, como N,N’-di-glicilcistamina e N-alanil-S-actilcisteamina, são conhecidos a partir da WO 85/00167 como agentes radioprotectores.

Os biopolímeros que podem ser enlaçados mediante o presente processo compreendem qualquer composto macromolecular (MW > 1 kDa) natural ou seminatural que conta grupos de hidróxilo, mercapto e/ou amino. Em particular, este tipo de biopolímeros inclui polisacáridos naturais ou modificados, peptídeos e proteínas naturais, modificadas ou sintéticas, lipoproteínas, 5 glicoproteínas e ácidos nucléicos. Com preferência, os presentes enlaces utilizam-se para vincular um ou mais polisacáridos a uma proteína ou peptídeo.

Os polisacáridos que podem ser enlaçados incluem materiais celulósicos e são parecidos ao amido, porém o método actual é especialmente adequado para enlaçar os polisacáridos microbianos como podem ser os haptenos ou os imunogens. Alguns exemplos são os polisacáridos capsulais pneumococales de diversos tipos incluído, por exemplo, os tipos dinamarqueses 1, 3, 4, 6A, 6B, 7S, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, polisacáridos estreptococales do grupo B, polisacáridos capsulais de Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae incluído o tipo b de polisacáridos, Neisseria meningitidis (grupos a e C), Pseudomonas aeruginosa ou Escheríchia coli. Faz-se constar que o termo “polisacáridos” no modo em que se usa aqui, compreende os polímeros e oligômeros que contém açúcar, tanto se só contém enlaces glicosídicos como também se contém enlaces de fosfodiésteres ou de outro tipo. Também podem conter ffacções que não contenham açúcares como podem ser os grupos ácidos, os grupos fosfatos, os grupos aminos, os poliálcoóis e os aminoácidos, e estes podem estar despolimerizados ou não. A continuação ilustra-se as unidades repetidas dos tipos de polisacáridos capsulais pneumococales 6B, 14, 19F e 23 e o polisacárido capsular tipo b H. influenzae:

Pn 6B -4 2)-oc-D-Galp-( 1 —»3)-a-D-GIcp-( 1 -»3)-a-L-Rhap-( 1 -»4)-D-Ribitol-5-(P04'—»

Pn 14 -> 4)-P-D-Glcp-(l-*6)-P-D-Glcp*Nac-(l->3)-P-D-Galp-(l-> *: incluindo um grupo secundário de P-D-Galp-(l—»4)

Pn 19F -> 4)-p-D-ManpNAc-( 1 —>4)-a-D-Glcp-( 1 -»2)-a-L-Rhap-( 1 -P04'-4

Pn 23F 4)-p-D-Glcp#-(l-44)-p-D-Galp&-(l->4)-p-L-Rhap-(l-> 6 : incluindo um grupo secundário de fosfogliceril-(—>3) incluindo um grupo secundário de a-L-Rhap-(l—>2)

Hib 3 )-P-D-Ribf-( 1 -»1 )-D-Ribitol-5-(P04'—>

Pode-se encontrar um resumo sobre polisacáridos bacterianos de interesse em: Lennart Kenne e Bengt Lindberg, “Bacterial polysaccharides" em The pulysaccharides, Vol. 2, Ed. G.O. Aspinall, 1983, Ac. Press, págs. 287-363.

As proteínas e os peptídeos que podem ser enlaçados mediante o presente método incluem proteínas imunogênicas e não imunogênicas. Alguns exemplos são as albuminas de soro e as diferentes toxinas e toxoides bacterianas, como pode ser a toxina da difteria, o toxoide dos tétanos, a pneumolisina, o pneumolisoide, as toxinas de outros organismos como o Pseudomonas, Staphylococcus, Bordetella pertussis, Escherichia coli, opcionalmente destoxificados, o chamado material das reações cruzadas (por exemplo, CRM 197) e as hemocianinas. Também podem ser proteínas da membrana externa de organismos como a Neisseria meningitidis ou a Bordetella pertussis. As proteínas também podem ser anticorpos utilizados para trasladar outro bio-material a um lugar desejado. As proteínas e peptídeos também podem ser utilizados como imunogenes independentes ou para fazer que outros materiais, como por exemplo, os haptenos, voltem mais imunogénicos. Podem ser nativos, destoxificados ou mutados. Os termos peptídeos e proteínas são utilizados na presente invenção de maneira indiscriminada, até quando as proteínas denotem, em general, materiais com um peso molecular mais elevado que o dos peptídeos.

Os enlaces da fórmula 3 podem ser preparados mediante métodos conhecidos per se, como os que se descrevem na EP-A-131500. Por exemplo, pode-se obter o composto de enlace a partir do aminotiol, ditiol ou mercaptoalcohol adequado, segundo a natureza do grupo A, como o 2-aminoetanotiol(cisteamina), 3- 7

aminopropanotiol ou a cisteína, na que o grupo tiol é protegido preferentemente, por exemplo, por um grupo de ácilos ou o modo de disulfuro. Se o grupo A contém um cadeia com a fórmula -(Z-CHR'-CHR2R3)n-, esta pode ser introduzida por reacção com, por exemplo, etilienoimina, óxido de propileno, baixo a condições adequadas para obter um aduto que tenha o valor n desejado. Altemativamente, se -(Z-CHR'-CHR2R3)n- representa uma cadeia de oligopéptidos, dito grupo pode ser introduzido mediante métodos de sintetização para péptidos convencionais. O grupo terminal H2N-(CH2)m-CHR1-CHR R - pode ser introduzido por reacção do composto activado apropnado ^ com o precursor HA-CHR4-(CHR5)P-CHR6-S-R7. Nos casos em que H2N-(CH2)m-CHR -CR R - representa um resíduo de aminoácidos como a glicina, a alanina ou a lisina, este poderá ser novamente enlaçado mediante métodos convencionais. O uso dos enlaces de aminotiol compreende o acoplamento do enlaçador, preferivelmente com um grupo tiol protetor, com um primeiro biopolímero, especialmente um polisacárido, que pode ser activado opcionalmente. A activação pode levar-se a cabo mediante métodos conhecidos como, por exemplo, a activação dos grupos carboxilos sobre o polisacárido (em caso de que esteja presente), por exemplo, com uma carbodiimida, ou introduzindo um grupo aldeído, por exemplo, por oxidação. Vantajosamente, o acoplamento leva-se a cabo mediante a reacção com bromuro de cianógeno. Isto tem como resultado a presença de grupos isocianatos que reagem rapidamente com a função de aminos do enlaçador para produzir um enlace de isourea. A activação CNBr leva-se a cabo de maneira que ao menos se introduza uma parte activada de 0,1 por unidade de repetição (RU) (em um polisacárido: uma unidade de repetição mono o oligosacárida). O acoplamento tem como rendimento preferivelmente 1 função de aminos por 1-10 RU. 8 O grupo tiol protetor, caso esteja presente, é extraído então, por exemplo, por reação do disulfuro de protecção com um agente redutor, por exemplo, um mercaptano como o 2-mercaptoetanol ou ditiotreitol ou uma trialquilofosfma. A redução preferivelmente ocasiona 1 grupo tiol por 5-15 RU. A função de tiol pode então reagir ante uma função activa de um segundo biopolímero, como um grupo bromoacilo, um grupo yodoacilo, um grupo piridilditio ou um grupo maleimido-alquilo (ou -arilo ou -cicloalquilo), preferivelmente vinculado a um resíduo de lisina da proteína. Pode-se introduzir a função activada mediante uma pós modificação química da proteína, como uma reacção com N-succinimidil-bromoacetato ou Ν-(ω—maleimidoalquiloxi) succinimida, ou mediante síntese peptídica utilizando um ou mais precursores de aminoácidos que já contenham a função activa.

Os intermediários e o conjugado final podem ser purificados sempre que seja necessário mediante métodos conhecidos per se, como a cromatografia (intercâmbio de iões, interacção ou afinidade hidrofóbica), filtração de gel, diálise, filtração de membranas, precipitações selectivas utilizando sulfato de amónio ou álcool e similares.

Os conjugados podem ser incorporados numa formulação de vacina de um modo que já é conhecido no campo da vacinação, usando os adjuvantes, diluentes, estabilizadores, tampões, etc., apropriados. Pode-se utilizar as vacinas para proteger seres humanos frente a agentes patogênicos ou para proteger animais. Altemativamente, o enlace de bio-polímeros apropriados pode ser utilizado em terapias humanas ou veterinárias ou o modo de agente diagnostico. Outro uso vantajoso do método da presente invenção concerne a imobilização de proteínas e peptídeos sobre um polisacárido como a agarose de dextranas, sefarose para purificar antígenos, anticorpos e outras moléculas biologicamente relevantes, por exemplo, mediante um cromatografia de afinidade, ou para osilizá-las em ensaios de imunidade e semelhantes.

Exemplos

As abreviaturas seguintes são utilizadas nos exemplos

Boc BrAc DTE EDTA • Gly GP(C) HPLC p. m. NSu ONSu PBS

Pn PS RP RU TNBS TTd terc-butiloxicarbonilo

Dromoacetilo

Ditioeritritol Ácido etilenodiaminatetracético Glicilob

Permeação por gel (cromatografia)

Cromatografia líquida de alto rendimento peso molecular N-succinimidilo N-oxisuccinimidilo

Soro fisiológico tapado com fosfato, 10 mM de fosfato de sódio em solução fisiológica, com um Ph de 7.2 pneumococo, pneumococal

Polisacárido fase inversa unidade(s) de repetição do polisacárido ácido trinitrobencenosulfónico toxoide del tétanos

Nota: Utilizou-se a classificação holandesa para a classificação do serotipo pneumococal; o tipo americano é mencionado entre parêntese. 10

Exemplo 1

Preparação de um enlaçador N, N ’-Bis[terc-butiloxicarbon ilgl icilj cistamina (N, N'-bis[Boc-Gly] cistamina Agregaram-se N,N’-Dimetilacetamida (42 ml) e N,N-diisopropiletilamina (14,6 ml, 83,8 mmol) a uma mistura de Ν’-succinimidil N-(terc-butiloxicarbonil)glicinato, Boc—Gly—ONSu, (11,4 g, 41,9 mmol) e dihidrocloruro de cistamina (3,77 g, 16,7 mmol).

Continuou-se agitando a suspensão durante toda a noite à temperatura ambiente (o dihidrocloruro de cistamina dissolveu-se gradualmente em umas horas). Dissolveu-se a solução clara com água (16,7 ml), coisa que produziu uma separação de fases. Depois de agitar a mistura durante 1 h, agregou-se éter dietílico (170 ml) e lavou-se a mistura obtida com água (170 ml). Trás a separação das fases, extraiu-se a capa de água mediante éter dietílico (85 ml). Combinaram-se as fases orgânicas, lavaram-se com 1 M de NaHC03 (3 x 85 ml), água (3 x 85 ml) e 1 M de NaH2P04 (3 x 85 ml), sucessivamente, e secaram-se com MgS04. Extrai-se o MgS04 por meio de filtragem e concentrou-se o filtrado ao vazio para dar como resultado N,N’-bis[Boc-Gly]cistamina (4,81 g, 62 %) o modo de sólido vítreo. RP—HPLC mostra um único valor máximo. N,N’—bis[glicil]cistamina (ditrífluoroacetato)

Dissolveu-se N,N’-bis[Boc-Gly]cistamina (4,81 g, 10,3 mmol), no modo em que se havia obtido na fase precedente, em diclorometano (16,7 ml). Agitou-se a solução e agregou-se-lhe ácido trifluoroacético (16,7 ml). A formação de isobuteno e de dióxido de carbono mostraram visíveis durante mais ou menos 5 minutos. Depois de um período total de 30 minutos, agregou-se a mistura da recação gota a gota a uma mistura agitada vigorosamente composta de éter dietílico (170 ml) e pentano (170 ml). Deixou-se de agitar a mistura e deixou-se 11 que o precipitado se assentara durante 5 minutos. Extraiu-se o éter dietílico/pentano mediante decantação e lavou-se o sólido com uma mistura de éter dietílico (50 ml) e pentano (50 ml). Novamente, extraiu-se o éter dietílico/pentano mediante decantação. Dissolveu-se o sólido higroscópico em água (40 ml). Extraíram-se traças de éter dietílico/pentano ao vazio à temperatura ambiente. Depois, liofilizou-se a solução para dar dirifluoroacetato de N,N’-bis[glicil]cistamina (4,93 g, 97 %). Finalmente, dissolveu-se o composto em água a uma concentração de 1,0 M e armazenou-se de forma que permanecera congelado a -20°C. RP—HPLC mostra um único valor máximo.

Exemplo 2

Preparação de uma vacina polivalente de Pn PS 19F/TTd utilizando N,Ν’-bis [glicil] cistamina

Despolimerização parcial de Pn PS 19F

Para conseguir a despolimerização parcial dos polisacáridos pneumococais utilizou-se um processo de sonicação. Dissolveu-se um serotipo de polisacárido pneumococal 19F (Tipo americano 19, programa de vacinação RTVM, lot. Num. 19FEXP2A/S13; 275 mg, peso em seco) em 20 ml de água e sondou-se em períodos de ~15 minutos, durante um total de 125 minutos, com um microtip de 1/4 (Branson Sonifyer 250, ciclo de serviço ao 7, 50% do nível de saída). Reduziu-se o peso molecular do PS de ~980 a 49 kDa (de ~1660 a ~83 RU). Filtrou-se a solução sobre uma membrana de 0,45 pm com o que se conseguiu recuperar um 94 % de PS (teste de antrona).

Modificação de Pn PS 19b' (49 kD) com N,N’-bis[glicil]cistamina Para conseguir uma modificação, misturaram-se 3,25 ml de solução de PS 19F em água (6,15 mg/ml) com um volume igual de 1 M de solução de carbonato de sódio (pH ~12). Esfriou-se a mistura a ~2°C. Enquanto se agitava, agregaram-se 250 μΐ de reativo CNBr (100 mg/ml em acetonitrilo). Depois de 10 minutos,

submeteu-se a solução a uma permeação por gel com Sephadex G25M (Pharmacia) a ~4°C (eluente: 0,2 M de tampão de carbonato-bicarbonato de sódio com um pH de 9.25). Misturou-se a fração que continha PS com 4,73 ml de uma solução previamente esfriada de 0,2 M de tampão de carbonato-bicarbonato de sódio com um pH de 9.25/ 1,0 M de N,N’-bis[glicil]cistamina (dei-trifluoroacetato), 1/1, v/v. O pH descendeu a 6.5 porém voltou a ajustar-se a 9.3 com 6 M de hidróxido sódico. Durante 1,5 horas, comprovou-se ocasionalmente o pHe, em aqueles casos nos que era necessário, voltou-se a ajustar. Depois, manteve-se a mistura a ~4°C durante toda a noite. Finalmente, à amostra trocou-se-lhe o tampão com um tampão de 0,1 M de fosfato de sódio, que continha 5 mM de EDTA, com um pH de 8, e concentrou-se a um volume de 2 ml em um concentrador Centriprep-10 (Amicon). Os análises dos grupos aminos primários deram 1 NH2/4,2 RU (teste de TNBS).

Redução de Pn PS 19F modificado mediante N,N’-bis[glicil]cistamina Reduziu-se o Pn PS 19F modificado mediante N,N’-bis[glicil]cistamina (13 mg em 1,75 ml de tampão de 0,1 M de fosfato de sódio, que continha 5 mM de EDTA, com um pH 8) agregando um excesso molar de 11 vezes DTE (embasado no número de grupos aminos introduzidos no PS). Depois da incubação durante toda a noite à temperatura ambiente, submeteu-se a mostra a uma permeação por gel com Sephadex G25M (Pharmacia) usando 0,1 M de tampão de fosfato de sódio, que continha 5 mM de EDTA, com um pH 7 como eluente e concentrou-se a um volume de 3,5 ml com um Centriprep-10. A análise para os grupos sulfidrilos deu como resultado 1 SH/8,5 RU (teste de Ellman). 13

Bromoacetilação do toxoide dos tétanos

Ao toxoide dos tétanos (RIVM) mudou-se-lhe o tampão mediante permeação por gel com Sephadex G25M (eluente: 0.1 M de tampão de fosfato de sódio, que continha 5 mM de EDTA, com um pH 8). Modificaram-se os grupos aminos das cadeias secundárias de lisina na proteína agregando um excesso de 6 vezes (embasado no número de lisinas dentro do TTd) do bromoacetato de N-succinimidilo. Incubou-se a mistura durante 1,5 horas à temperatura ambiente e carregou-se numa coluna de Sephadex G25M (eluente: 0,1 M de tampão de fosfato de sódio, que continha 5 mM de EDTA, com um pH 7). A análise da fracção que continha proteínas mostrou que se havia modificado 40 % dos grupos aminos (quantidade inicial: 33,5 de NH2 por mol de TTd) (teste de TNBS).

Conjugação entre o Pn PS 19F modificado mediante N-(glicil)cisteamina e o toxoide do tétanos bromoacetilatedo

Misturou-se o Pn PS 19F (11,5 mg) modificado mediante N-(glicil)cisteamina com BrAc-TTd (5 mg), a um ratio molar entre PS/TTd de 7:1 à temperatura ambiente. Supervisou-se a conjugação mediante uma análise GP—HPLC (Shodex OHpak KB-805 e 804 em série, com PBS como eluente, 1 ml/min, a 35°C). Depois ~110 horas, cobriram-se os grupos de tiol restantes no PS com um excesso molar de 10 vezes bromoacetamida (envolvido no conteúdo do grupo amino inicial, no modo em que se mede com o PS antes de que se leve a cabo a redução), durante 6 horas à temperatura ambiente. Os grupos bromoacetilos restantes no BrAc-TTd cobriram-se mediante um excesso molar de 2,5 vezes 2-aminoetanotiol (embasado na quantidade de bromoacetamida agregada previamente) durante toda a noite à temperatura ambiente. Purificou-se o conjugado à temperatura ambiente mediante um GPC de baixa pressão numa coluna (100 x 1,6 cm) de Sephacryl S-400 HR (Pharmacia) utilizando PBS 14 como eluente a uma velocidade de fluxo de 0,8 ml/min. Analisaram-se as frações apropriadas (8 ml) para analisar o contido de carboidratos e proteínas (testes de antrona e Lowry), fíltrou-se de maneira estéril e armazenou-se a 4°C.

Exemplo 3

Preparação de uma vacina polivalente de Pn PS 6B/TTd utilizando cistamina

Despolimerização parcial de Pn PS 6B

Dissolveu-se o serotipo 6B do polisacárido pneumococal (tipo americano 26, programa de vacinação ATCC, lot. Núm. 2008862; 107 mg, peso em seco) em 17 ml de água e sondou-se em períodos de 15 minutos, durante um total de 150 minutos, com um microtip de 1/4 (Branson Sonifyer 250, ciclo de serviço ao 6, 50% do nível de saída). Reduziu-se o peso molecular do PS de ~1350 a 46 kDa (de -2.000 a ~65 RU). Filtrou-se a solução numa membrana de 0,45 mm recuperando o 80 % do PS (teste de Dubois).

Modificação do Pn PS 6B (46 kD) com cistamina

Para levar a cabo a modificação, agregaram-se 4 ml de solução de PS 6B com o mesmo volume de 1 M de solução de carbonato de sódio (pH ~12). Esfriou-se a mistura a ~2°C. Enquanto se seguia agitando, agregaram-se-lhe 170 ml de reactivo CNBr (100 mg/ml em acetonitrilo). Depois de 10 minutos de reacção, submeteu-se a solução a permeação por gel com Sephadex G25M a ~4°C (eluente: 0,2 M de tampão de carbonato-bicarbonato com um pH 9.25). Misturou-se a ffacção que continha PS com 3,25 ml de 0,5 M de dihidroclomro de cistamina previamente esfriado em 0,2 M de carbonato-bicarbonato de sódio, com um pH 9.25. O pH descendeu até alcançar 8.7, porém voltou-se a ajustar até alcançar um pH 9.25 com 0,3 M de hidróxido sódico. Manteve-se a mistura com um pH 9.25 durante 1,5 horas, efectuando as correcções necessárias no pH.

Depois, manteve-se a amostra a ~4°C durante toda a noite. À amostra mudou-se-lhe o tampão a 0,1 M de tampão de fosfato de sódio, que continha 5 mM de EDTA, com um pH 8 e, a continuação, concentrou-se a um volume de 2,2 ml em um concentrador Centriprep-10 (Amicon). As análises dos grupos de aminos primárias deram como resultado 1 NH2/3 RU (teste de TNBS).

Redução do Pn PS 6B modificado mediante cistamina

Reduziu-se o Pn PS 6B modificado mediante cistamina (16 mg em 0,1 M de tampão de fosfato de sódio, que continha 5 mM de EDTA, com um pH 8) agregando um excesso molar de 10 vezes DTE (embasado em grupos de aminos medidos no PS). Trás a incubação durante toda a noite à temperatura ambiente, mudou-se-lhe o tampão a amostra a 0,1 M de tampão de fosfato de sódio, que continha 5 mM de EDTA, com um pH 7 e concentrou-se a um volume de 1,8 ml em um Centriprep-10. As análises para os grupos de sulfidrilo deram como resultado 1 SH/8 RU (teste de Ellman).

Bromoacetilación do toxoide do tétanos

Ao toxoide do tétanos (RTVM) mudou-se-lhe o tampão mediante a permeação por gel em Sephadex G25M (eluente: 0,1 M de tampão de fosfato de sódio, que continha 5 mM de EDTA, com um pH 8). Modificaram-se os grupos aminos das cadeias secundárias de lisina na proteína agregando um excesso de 6 vezes (embasado no número de lisinas que se encontram dentro do TTd) de BrAc-ONSu. Incubou-se a mistura durante 2 horas à temperatura ambiente e carregou-se numa coluna de Sephadex G25M (eluente: 0,1 M de tampão de fosfato de sódio, que continha 5 mM de EDTA, com um pH 7). As análises da iracção que continha as proteínas mostram que se modificaram o 55% de todos os grupos de NH2 (teste de TNBS). 16

Conjugação do Pn PS 6B modificado com o toxoide dos tétanos bromo acetilado

Misturou-se o Pn PS 6B modificado mediante cisteamina (12 mg) com BrAc-TTd (5 mg), mantendo um ratio molar entre PS/TTd de 7,5:1 à temperatura ambiente. Supervisou-se a conjugação mediante a análise GP-HPLC (Shodex OHpak KB-805 e 804 em série, com PBS como eluente, 1 ml/min, a 35°C). Trás 91 horas, o grupo tiol remanescente no PS cobriu-se com um excesso molar de 10 vezes bromoacetamida (embasado no contido do grupo amino inicial, no modo em que se mede com o PS antes que se efectue a redução) durante 6 horas à temperatura ambiente. O grupo de bromoacetilo remanescente no BrAc-TTd cobriu-se com um excesso molar de 2,5 vezes 2-aminoetanotiol (embasado na quantidade de bromoacetamida anadida previamente) durante toda a noite à temperatura ambiente. Purificou-se o conjugado à temperatura ambiente mediante um GPC a baixa pressão numa coluna (100 x 1,6 cm) de Sephacryl S-400 HR (Pharmacia) usando PBS como eluente a uma velocidade de fluxo de 0,8 ml/min. Analisaram-se as fracções apropriadas (8 ml) para tratar de encontrar certo contido de carboidratos e proteínas (testes de Dubois e Lowry), filtrou-se de maneira estéril e armazenou-se a 4°C.

Lisboa, 31 de Maio de 2001.

Pela Requerente

Gonçalo da Cunha Ferreira

Adjunto do Agente Ojiclel da Frc-príededs Industriei

R. D. João V, 9-2° dt.e-1250 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para acoplar de maneira covalente um polisacárido a um biopolímero, caracterizado por incluir a activação do polisacárido mediante bromuro cianógeno e a posterior recação do polisacárido activado mediante um enlaçador de aminotiol que apresenta a fórmula 1: H2N-f(CH2)m-CHR1-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHRí,-S-R7 1 na que A é um vínculo directo ou um grupo que apresenta a fórmula m é um número inteiro de 0 a 5; n é um número inteiro de 0 a 3; p é o número inteiro 0 ó 1; q é o número inteiro 0 ó 1; R1 é hidrogénio ou alquilo Q-Cô, opcionalmente substituído por amino, hidroxilo, carboxilo, alcoxicarbonilo C1-C4, carbamoilo, mono ou dei-alquilocarbamoilo C1-C4OU N-(a-carboxialquilo)carbamoilo, ou, se m * 0, R1 é hidróxilo, amino ou peptidil-amino; R2 e R3 são independentemente hidrogénio ou alquilo C1-C4 ou bem formam juntos um grupo oxo; 1 R4 é hidrogénio, alquilo C1-C4, carboxilo, alcoxicarbonilo C1-C4, carbamoilo, mono ou dei-alquilocarbamoilo C|-C4 ou N-(a— carboxialquilo)carbamoilo; R5 é hidrogénio ou metilo; R6 é hidrogénio ou metilo; R7 é hidrogénio ou um grupo tiol protector ou um grupo que apresenta a fórmula -S-CHR6-(CHR5)p-CHR4-ÍA-CR1R2-CHR1-(CH2)m|<rNH2; e Z é imino, metilimino, oxigénio ou enxofre; para produzir um polisacárido à base de tiol que presente a fórmula 2 Ps-0-C(=NH)-NH-[(CH2)m-CHR1-CR1R2-A]q-CHR4-(CHR5)p-CHR6-S-R7 2 na que Ps representa um resíduo polisacárido e A, m, p, q, R1, R1, R2, R4, R5, R6 e R7 são tal e como se há definido anteriormente, trás o qual se extrai opcionalmente o grupo protector R7 e o polisacárido à base de tiol é facto reagir ante um biopolímero activado. 2 1 Método para acoplar de maneira covalente um polisacárido a um biopolímero, 2 caracterizado por incluir o uso de um enlaçador de aminotiol representado pela fórmula 3 3 HjN^CH^-CHR^C^R^-A-CH^-ÍCHR^p-CH^-S-R7 na que A, m, p, R1, R2, R3, R4, R5, R1 e R7 são tal e como se definiu na reivindicação 1.
3. Método segundo a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por R7 ser um grupo que apresenta a fórmula -s-chr1-(CHR5) -chrMa-cr^-chr^ch^j,, -nh2.
4. Método segundo a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o dito grupo tiol protector R7 consistir num grupo de ácilos, tioacilos ou iminoacilos, como por exemplo -C(=0)-R, -C(=S)-R, -C(=NR)-R, -C(=0)-SR, -C(=S)-NHR, -S02-OR o -P(=0)(0R)2 onde R representa a um hidrogénio ou a um hidrocarbilo C1-C7, como 0 metilo, etilo, alilo, terc-butilo, fenilo ou bencilo.
5. Método segundo qualquer das reivindicações 1-4, caracterizado por R1 representar a cadeia secundária de um oc-aminoácido, em particular, hidrogénio, alquilo C1-C4 ou α-hidroxialquilo C1-C4. 3 1 Método segundo qualquer das reivindicações 1-5, caracterizado por R2 e R3 formarem juntos um grupo oxo.
7. Método segundo qualquer das reivindicações 1-6, caracterizado por A ser um grupo que apresenta a fórmula -(NH-CHR1-CO)nNH-, em que N é um número inteiro de 0 a 2.
8. Método segundo qualquer das reivindicações 1-7, caracterizado R4 e R5 serem hidrogénio ou metilo, preferivelmente hidrogénio.
9. Conjugado de dois biopolímeros caracterizados por serem enlaçados de maneira covalente através de um grupo que apresenta a fórmula: -C(=NH)-NH-[(CH2)m-CHRI-CR2R3-A]q-CHR4-(CHR5)|rCHR6-S-, na que a, m, p, q, R1, R2, R3, R4, R5 e R6 são tal e como se definiu em qualquer das reivindicações da 1 a 8.
10. Conjugado de dois biopolímeros caracterizados por serem enlaçados de maneira covalente através de um grupo que apresenta a fórmula -HN-(CH2)m-CHRl-CR2R3-A-CHR4-(CHR5)p-CHRft-S-, na que A, m, p, R1, R2, R3, R4, R5 e R6 são tal e como se definiu em qualquer das reivindicações da 1 a 8. 4
11. Conjugado segundo a reivindicação 9 ou 10, caracterizados por os ditos dois biopolímeros serem um polisacárido e um peptídeo ou proteína.
12. Vacina caracterizada por conter um conjugado segundo qualquer das reivindicações da 9 a 11. Lisboa, 31 de Maio de 2001. Pela Requerente

Gonçalo da Cunha Ferreira Adjunto do Agenla Oficial da Propriedade Industrie! R. D. João V, 9-2° di.°-1250 LISBOA 5