ES2934984T3 - Procedimiento para la modificación específica del sitio de un anticuerpo - Google Patents

Procedimiento para la modificación específica del sitio de un anticuerpo Download PDF

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Abstract

La presente solicitud se refiere a un proceso para preparar un anticuerpo bioconjugado específico de sitio con un quelante de metales, el anticuerpo bioconjugado y su uso en medicina nuclear. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la modificación específica del sitio de un anticuerpo
[0001] La presente invención se refiere al campo de la medicina nuclear en particular para diagnosticar o tratar el cáncer.
[0002] Para la administración de iones o radionúclidos médicamente interesantes, los agentes quelantes adecuados que forman complejos estables son de importancia fundamental. De manera adicional, los agentes quelantes se pueden conjugar con anticuerpos monoclonales para lograr la administración dirigida a las células cancerosas. Las construcciones tal como se producen (los llamados anticuerpos bioconjugados, conjugados anti-carga corporal o conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC)) encuentran un mayor interés por el tratamiento dirigido del cáncer. El anticuerpo modificado puede entonces acumularse en las células tumorales, concentrando los efectos de la radiactividad del radionúclido.
[0003] Los ADC han obtenido la aprobación de la FDA (Adcetris, Kadcyla, Besponsa y Mylotarg), todos los cuales tienen su carga útil unida químicamente al anticuerpo de una manera no específica del sitio. Por lo tanto, el producto resultante es altamente heterogéneo, tanto con respecto a la relación estequiométrica entre el anticuerpo y la carga útil (relación de anticuerpos de carga útil, o relación de fármaco a anticuerpo, o DAR), como con respecto a los sitios de conjugación en el anticuerpo. Cada una de las especies resultantes, aunque en el mismo producto farmacéutico, puede tener propiedades distintas que podrían conducir potencialmente a una amplia gama de diferentes propiedades y actividades farmacocinéticas in vivo.
[0004] Los estudios han demostrado que una unión al fármaco específica del sitio puede conducir a una absorción tumoral significativamente mayor y una disminución de la absorción en los tejidos no dirigidos en comparación con el ADC no específico del sitio. Estos datos sugieren que los ADC bien definidos estequiométricamente muestran una mejor farmacocinética y mejores índices terapéuticos en comparación con los ADC modificados químicamente.
[0005] Como tecnología específica del sitio, la conjugación enzimática ha mostrado gran interés ya que estas reacciones de conjugación son típicamente rápidas y se pueden realizar en condiciones fisiológicas. Entre las enzimas disponibles, la transglutaminasa microbiana (MTG) de la especie Streptomyces mobaraensis ha encontrado un interés creciente como una alternativa atractiva a la conjugación química convencional de proteínas de restos funcionales que incluyen anticuerpos. El MTG cataliza en condiciones fisiológicas una reacción de transamidación entre una glutamina 'reactiva' de una proteína o péptido y un residuo de lisina 'reactivo' de una proteína o péptido, mientras que este último también puede ser una amina primaria sencillo de bajo peso molecular, tal como un grupo 5-aminopentilo.
[0006] Jeger et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995-9997) y Dennler y col. (Bioconjugate Chemistry 2014, 25, 569-578) informan que solo unas pocas glutaminas son típicamente objetivo del MTG, por lo que el MTG es una herramienta atractiva para modificaciones de proteínas estequiométricas y específicas del sitio. La glutamina 295 (Q295) se identificó como la única glutamina reactiva en la cadena pesada de diferentes tipos de IgG a los que se dirigió específicamente MTG con sustratos de amina primaria de bajo peso molecular (Jeger y col.).
[0007] Dennler y col. han demostrado que la conjugación cuantitativa con Q295 solo fue posible tras la eliminación del resto de glicano en el residuo de asparagina 297 (N297) con PNGasa F, mientras que los anticuerpos glicosilados no se pudieron conjugar de manera eficiente.
[0008] El documento WO 2017/025179 describe un procedimiento de bioconjugación específico del sitio proteico para producir una proteína que comprende al menos una secuencia de aminoácidos donante que contiene acilglutamina unida covalentemente mediante un enlace y -glutamil-amida a un sustrato que comprende un donante amino, donde la al menos una secuencia de aminoácidos donante que contiene acilglutamina comprende al menos la secuencia de aminoácidos TYFQAYG. Por lo tanto, el procedimiento de WO 2017/025179 requiere de antemano un procedimiento de ingeniería engorroso sobre la proteína para unirla a la etiqueta de aminoácidos que contiene acilglutamina.
[0009] Por lo tanto, todavía es deseable proporcionar un procedimiento sencillo y eficiente para lograr anticuerpos bioconjugados con agentes quelantes con un DAR definido y de una manera específica del sitio.
[0010] La presente invención se refiere a un procedimiento para conjugar anticuerpos específicos del sitio a quelantes de una manera que produciría una relación de quelante a anticuerpo (CAR) definida, dicho procedimiento es robusto y fácilmente implementable.
[0011] Este procedimiento no implica ingeniería genética, cultivo y purificación de cada anticuerpo de interés, que es común en muchos protocolos de bioconjugación. En cambio, este procedimiento permite el uso de cualquier anticuerpo para bioconjugar a un quelante.
[0012] Según un objeto, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de un anticuerpo bioconjugado específico del sitio de la fórmula (I):
Ab-( Enlazador - Quelante)n (I)
donde
Ab es un anticuerpo, Quelante
el Enlazador es un oligopéptido con un extremo terminal de COOH y un extremo N-terminal, el quelante es un agente quelante de metal,
n es la relación de quelante a anticuerpo (CAR), donde 0<n< 2; y dicho procedimiento comprende:
- la desglicosilación enzimática de dicho anticuerpo ;
- el acoplamiento del anticuerpo desglicosilado obtenido con un compuesto de la fórmula (A):
Enlazador-Quelante (A)
en presencia de una transglutaminasa,
donde dicho procedimiento está caracterizado porque:
dicho Enlazador se une a Ab en su extremo N-terminal, y comprende una secuencia elegida entre (*G-G-G), (*K-G- G) y (*A-K-A),
donde * denota el extremo N-terminal del Enlazador que está unido covalentemente a Ab.
[0013] Ab, tal como se usa en esta invención, se refiere a un anticuerpo, notablemente un anticuerpo monoclonal, tal como anticuerpos monoclonales recombinantes humanos, en particular que son específicos para antígenos de cáncer, tal como CD38, HER2, VEGF, EGFR, etc., para dirigirse a células cancerosas. Incluye en particular inmunoglobulinas de tipo G, tales como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Los anticuerpos adecuados en el sentido de la invención incluyen bevacizumab, cetuximab, trastuzumab, daratumumab, panitumumab, mabthera.
[0014] «Específico del sitio», tal como se usa en esta invención, se refiere a la ubicación en el anticuerpo donde se produce la unión del compuesto de fórmula (A). Típicamente, esta ubicación es glutamina 295 (Q295) de IgG, donde se utiliza transglutaminasa microbiana (MTG) para la bioconjugación. Esto corresponde a la glutamina reactiva en la cadena pesada de diferentes tipos de IgG a los que se dirigirá específicamente la MTG.
[0015] "Oligopéptido" se refiere a una cadena corta de menos de 15 aminoácidos unida por enlaces peptídicos (amida). Típicamente, una cadena de oligopéptido tiene un grupo amino terminal (o extremo N-terminal) y un grupo terminal carboxilo (COOH) o extremo C-terminal. Por lo tanto, según la invención, el Enlazador se une covalentemente al anticuerpo (Ab) en su extremo N-terminal y al quelante a través de su extremo C-terminal.
[0016] Como se usa en esta invención, los aminoácidos se pueden designar por su código de 1 letra, de la siguiente manera
G Glicina Gly P Prolina Pro
A Alanina Ala V Valina Val
L Leucina Leu I Isoleucina Ile
M Metionina Met C Cisteína Cys
F Fenilalanina Phe Y Tirosina Tyr
W Triptófano Trp H Histidina His
K Lisina Lys R Arginina Arg
Q Glutamina Glm N Asparagina Asn
E Ácido glutamico Glu D Ácido aspártico Asp
S Serina Ser T Treonina Thr
[0017] Según una realización, el Enlazador se elige entre los de la fórmula: -*G-G-G-(X)p-, -*K-G-G-(X)p-, -*A-K-A-(X)p-[0018] Donde * denota el extremo N-terminal del Enlazador que está unido covalentemente a Ab.
[0019] X es un aminoácido y p es un número entero tal que 0<p<10.
[0020] Según una realización, dicho Enlazador comprende al menos la secuencia G-G-G. Típicamente, dicho Enlazador puede elegirse de entre -G-G-G- o -G-G-G-G-.
[0021] Según una realización preferida, dicho Enlazador es G-G-G.
[0022] CAR se refiere a la relación quelante-anticuerpo. Se entiende que el compuesto de la fórmula (I) como se definió anteriormente puede ser una mezcla de compuestos (I) que tienen diversos CAR. Por lo general, se da como un valor medio. n representa, por lo tanto, la CAR media (en número) para dicha mezcla.
[0023] Se puede medir mediante análisis de masa intacta, tal como se describe en Wong y col. "Precise characterization of intact monoclonal antibodies by the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TF, Application Note, Agilent Technologies, 2017".
[0024] Según una realización, el procedimiento de la invención permite lograr una CAR comprendida entre 0,5 y 2, notablemente entre 1 y 2, típicamente alrededor de 1,5 /- 0,5.
[0025] La desglicosilación enzimática se refiere a la eliminación de un resto de glicano del anticuerpo, típicamente en el residuo de asparagina 297 (N297).
[0026] Según una realización, la desglicosilación enzimática se lleva a cabo con una N-glicosidasa.
[0027] «N-glicosidasa» se refiere a enzimas que catalizan la escisión de un enlace glicosídico interno.
[0028] Típicamente, la N-glicosidasa es PNGasa F (proteína N-glicosidasa F de Flavobacterium meningosepticum).
[0029] PNGasa F está disponible en el mercado y se puede comprar, por ejemplo, en ROCHE o en R&D SYSTEMS.
[0030] El término "quelante" en el sentido de la invención se utiliza para calificar un compuesto químico que es capaz de quelar un metal (es decir) para formar dos o más enlaces de coordenadas separados con un solo átomo metálico central. Dichos quelantes o agentes quelantes son típicamente compuestos químicos cuyas estructuras permiten la unión de sus dos o más átomos donantes (o sitios) al mismo ion metálico simultáneamente y producen uno o más anillos por quelación.
[0031] Según una realización, el quelante se elige entre agentes quelantes que pueden quelar isótopos metálicos radiactivos.
[0032] Según una realización, -Quelante puede ser de la fórmula (II):
Figure imgf000004_0001
Donde en la Fórmula (II):
R5 , R6 y R8 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo (C-i-Ca), alquilo (C1-Ca) - C(=O)-OR25 y alquilo (C1-Ca)-C(=O)-N (-R25)-R26;
R9 , R10, R11, R12, R15, R16, R17, R18, R19, R2°, R21, R22, R23 y R24 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo (C1-Ca);
R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo (C1-Ca), alquilo (C1-Ca)-C(=O)-N(-R25)-R26 y L1-; R13 y R14 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, alquilo (C1-Ca) y L1 Cada uno de R25 y R26 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo (Ci -Ca) y alquilo (Ci -Ca)-C (=O)-OH;
El quelante- está unido al Enlazador- a través de L1-;
Si un L1- está presente en R7, R13 o R14, siendo el otro R7 , R13 y R14 H, alquilo (Ci -Ca) o alquilo (Ci -Ca)-C(=O)-N(-R25)-R26 respectivamente, tal como se definió anteriormente;
L1- se selecciona independientemente de un grupo que consiste en
(C1-Ca)alquil-C(=O)-NH-(C1-Ca)alquil-C(=O)-NH-, (C1-Ca)alquil-(CaH4)-NH-C(=S)-NH-,
C(-CO2H)-(C1-Ca)alquil-(CaH4)-NH-C(=S)-NH-, (C1-Ca)alquil-C(=O)-NH-, (C1-Ca)alquil-C(=O)-NH-(C1-Ca)alquil-NH-,
(C1-Ca)alquil-(CaH4)-NH-y (C1-Ca)alquil-C(=O)-(O-CH2-CH2)1-20-C(=O)-NH-.
[0033] En particular, en la fórmula (II):
R5 , Ra y R8 representan (C1-Ca)alquil-C(=O)-N(-R25)-R2a;
R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R1a, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23, R24, R25 y R2a representan H; R7 representa L1;
Y L1- representa C1-Ca)alquil-C(=O)-NH-(C1-Ca)alquil-NH- o (C1-Ca)alquil-(CaH4)-NH-;
[0034] De acuerdo con una realización alternativa, el quelante- deriva de los siguientes precursores quelantes:
Figure imgf000005_0001
DTPA ca-DTPA ibca-DTPA
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
N-NOTA
Figure imgf000008_0001
4-isotiociantobenzi-TCMC 4-aminobencil-TCMC
[0035] Como se usó anteriormente, el precursor quelante se define como un compuesto que es adecuado para formar el compuesto de la fórmula (A) anterior cuando se acopla con el Enlazador.
[0036] Típicamente, el precursor quelante es DOTA, DOTAM, DOTAM-CH2-CH2-NH2 NCS-TCMC o NH2-TCMC, más preferentemente NH2-TCMC.
[0037] Los metales, tal como se usan en esta invención, se refieren típicamente a isótopos radiactivos de metal, que pueden ser útiles en medicina nuclear. Dichos radionucleidos incluyen: 66Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 111In, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 89Zr, 177Lu, 225Ac, y más preferentemente 212Pb (Plomo-212).
[0038] "Transglutaminasa" se refiere a una enzima que puede catalizar la formación de un enlace isopéptido entre los grupos y- carboxamida (-(C=O)NH2) de las cadenas laterales de residuos de glutamina y los grupos £-amino ( -NH2) de las cadenas laterales de residuos de lisina con la posterior liberación de amoníaco (NH3).
[0039] Según una realización, la transglutaminasa es una transglutaminasa microbiana. Típicamente, la transglutaminasa puede ser una enzima transglutaminasa MTGasa de la especie Streptomyces mobaraensis.
[0040] Dichas transglutaminasas están disponibles comercialmente, por ejemplo, la enzima MTGasa comercializada por ZEDIRA.
[0041] Según la invención, el procedimiento incluye la etapa de desglicosilación del anticuerpo con N-glicosidasa F (PNGasa F). Esta enzima funciona escindiendo oligosacáridos unidos a N entre los residuos de GlcNAc y asparagina más internos de las glicoproteínas unidas a N, tal como se muestra en la Figura 1.
[0042] Según una realización, esto lleva a la eliminación del resto de glicano en el residuo de asparagina 297 (N297).
[0043] La reacción de desglicosilación generalmente se puede llevar a cabo a una temperatura de entre 20 y 40 °C, típicamente de alrededor de 23 °C a 37 °C y de entre 1 y 24 horas, típicamente de alrededor de 15 a 24 horas. La cantidad de N-glicosidasa que se utiliza puede comprender entre 100 ng/mg a 1 mg/mg, típicamente aproximadamente 500 ng/mg.
[0044] Una vez que el anticuerpo se desglicosila, se puede realizar una etapa de diafiltración para eliminar el exceso de enzima N-glicosidasa F, después de la etapa de desglicosilación.
[0045] Según una realización, el procedimiento de la invención, por lo tanto, incluye una etapa de diafiltración después de realizar la etapa de desglicosilación.
[0046] A continuación, el compuesto Enlazador-Quelante (A) se hace reaccionar con la transglutaminasa microbiana (MTGasa), que conjugará el compuesto de la fórmula (A) con el anticuerpo a través del extremo N-Terminal libre de Enlazador. Esto puede hacerse mediante la incubación del compuesto de la fórmula (A) con la transglutaminasa.
[0047] Específicamente, la transglutaminasa microbiana funciona catalizando la formación de un enlace covalente entre el grupo y- carbonilamida de glutaminas con aminas primarias de aminoácidos tales como lisina, aunque también se han utilizado otros donantes de amida (Dennler 2014, Mehta 2005). En 2010, Jeger et al. mostraron que una glutamina conservada en la posición 295 en la cadena pesada (dominio constante) del anticuerpo IgG1 desglicosilado es la única ubicación en la que reaccionarán los MTGas, lo que produce una relación de quelante a anticuerpo teórica de 2 (una en cada cadena pesada del anticuerpo). La reacción enzimática se puede operar con las siguientes condiciones:
Temperatura: entre 20 y 40 °C, normalmente entre 23 y 37 °C
Cantidad de transglutaminasa (MTGase): entre 1 y 10 U/mL, típicamente aproximadamente 6 U/mL Tiempo: entre 1 y 24 horas, normalmente entre 16 y 24 horas.
[0048] Por consiguiente, esto garantiza que la bioconjugación de la invención sea específica del sitio, ya que el acoplamiento solo se produce en esta posición del anticuerpo y el compuesto bioconjugado obtenido o la mezcla de compuestos bioconjugados es homogénea, en la medida en que se produce el sitio del acoplamiento.
[0049] Esta bioconjugación conduce a la formación del correspondiente anticuerpo bioconjugado Ab-(Enlazador-Quelante) n.
[0050] Se puede obtener una mezcla de compuestos con varios CAR (es decir, n). Por lo tanto, la CAR (n) utilizada en esta invención se refiere al valor promedio (en número).
[0051] El producto obtenido puede purificarse, típicamente mediante centrifugación-diálisis y/o intercambiarse adicionalmente en un amortiguador de almacenamiento tal como acetato de amonio.
[0052] A continuación, el anticuerpo se puede caracterizar mediante procedimientos estándar, por ejemplo, para garantizar que las enzimas intermedias se eliminaron lo suficiente, para evaluar el tamaño del anticuerpo y/o para determinar la relación de quelante a anticuerpo.
[0053] El compuesto Enlazador-Quelante (A) se puede preparar haciendo reaccionar el Enlazador en forma de su precursor correspondiente OH-Enlazador-Z (donde Z puede ser un grupo protector para aminas, tal como carboxibencilo (Cbz)) con el Quelante, en presencia de un activador de éster, tal como HATU (1­ [Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, hexafluorofosfato azabenzotriazol tetrametil uronio), junto con una base, tal como la base de Hunig (W,W-diisopropiletilamina, DIPEA), o trietilamina, en un solvente tal como dimetilacetamida (DMAc o DMA). La reacción puede llevarse a cabo a temperatura ambiente.
[0054] Según un objeto adicional, la presente invención también se refiere a un anticuerpo bioconjugado específico del sitio de la fórmula (I):
Ab-(Enlazador-Quelante)n (I)
[0055] Tal como se definió anteriormente, se puede obtener mediante el procedimiento de la invención.
[0056] También se refiere al compuesto de fórmula (I):
un anticuerpo bioconjugado específico del sitio de la fórmula (I):
Ab-(Enlazador-Quelante)n (I)
como se definió anteriormente para su uso como un agente de contraste o un fármaco en medicina nuclear.
[0057] Por lo general, se puede usar para el diagnóstico y/o el tratamiento del cáncer.
[0058] Otro objeto de la invención también es una composición farmacéutica, que comprende, como principio activo, un compuesto de fórmula (I) según la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. Estas composiciones farmacéuticas comprenden una dosis eficaz de al menos un compuesto según la invención, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0059] Dichos excipientes se pueden elegir según la forma farmacéutica y la vía de administración deseada, entre los excipientes habituales conocidos por un experto en la materia. Típicamente, las composiciones de la invención son adecuadas para la administración sistémica, tal como administración parenteral, tal como por vía intraperitoneal, intramuscular o intravenosa.
[0060] Según la práctica habitual, la dosis adecuada para cada paciente es determinada por el médico según la vía de administración, el peso y la respuesta del paciente. Típicamente, el principio activo de la fórmula (I) anterior, su sal o solvato se puede administrar como una forma de dosificación unitaria, en mezcla con excipientes farmacéuticos habituales.
[0061] La presente invención, según otro de sus aspectos, también se refiere a un procedimiento para el diagnóstico y/o tratamiento del cáncer, que comprende la administración a un paciente de una dosis eficaz de un compuesto de fórmula (I) según la invención, o una sal con una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0062] La presente invención se ilustra adicionalmente mediante Figuras representativas y resultados experimentales.
Figuras:
[0063] [Fig. 1] La Figura 1 es una representación esquemática de un procedimiento ilustrativo de la invención, donde (1) representa un anticuerpo de longitud completa, que:
- en la etapa 1 es desglicosilado,
- en la etapa 2: es lavado por diafiltración,
- en la etapa 3: se hace reaccionar con (2): Enlazador-Quelante y MTGasa
- en la etapa 4: es lavado por diaflitración,
- para producir el correspondiente anticuerpo bioconjugado (3)
Resultados experimentales
Definiciones
[0064]
PBS- solución salina tamponada con fosfato
EDTA - ácido etilendiaminotetraacético
MWCO - corte de peso molecular
CAR- Relación quelante-anticuerpo
HATU: (3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio hexafluorofosfato, hexafluorofosfato azabenzotriazol tetrametil uronio)
DIPEA : W,W-diisopropiletilamina
DMA: Dimetilacetamida [CH3C(O)N(CH3)2].
Materiales:
[0065] NH2-TCMC (compuesto 1), fue proporcionado por Macrocyclics y utilizado como el material de partida principal en la síntesis de GGG-TCMC. Todos los disolventes y reactivos se adquirieron de fuentes comerciales y se utilizaron tal como se recibieron.
Síntesis de GGG-TCMC :
[0066]
Figure imgf000011_0001
(Purificado en Biotage)
0% Pd/C
H2N ^O O^NHa
Figure imgf000011_0004
dimiento general)
K )
r N NT r t Y^s i O h o
*-N rT N ^ f j - ^ - ' Ny ^ 'N '*s- 'NH2
h n L 2 n N í ^O ^ x
V C v r N n r l- i L 2 Mo C H
LM pH^-r otN «,7*o0» °
.77
3 GGG-TCMC
[0067] Una solución de Z-(Gly)3-OH (3,3 g, 10,2 mmol) de fórmula:
Figure imgf000011_0002
en DMA (64 ml) se preparó seguido de la adición de DIPEA (5,20 ml, 29,9 mmol) y HATU (4,51 g, 11,9 mmol).
[0068] Se preparó una solución de NH2 -TCMC (1) (6,56 g, 10,1 mmol) en DMA (80 ml) con DIPEA (5,80 ml, 33,3 mmol) y se añadió a la solución peptídica preparada. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas. La monitorización de HPLC indicó que la reacción era incompleta. Se añadió al reactor un segundo equivalente de Z-(Gly)3-OH (3,35 g, 10,4 mmol) disuelto en DMA (36 ml) con DIPEA (5,20 ml, 29,9 mmol) y HATU (4,53 g, 11,9 mmol) y se agitó durante 22 horas adicionales. La solución de reacción se añadió por goteo a éter dietílico (1,50 l) para precipitar el material bruto. Se añadió éter dietílico adicional (1,0 l) al recipiente y se agitó durante 20 minutos. El precipitado se aisló mediante filtración al vacío y la torta de filtro se lavó con éter dietílico (150 ml). Se preparó una solución madre con acetonitrilo (120 ml), H2O (480 ml) y TFA (6 ml). El material bruto se purificó mediante cromatografía de fase inversa utilizando TFA al 0,1 % en acetonitrilo y TFA al 0,1 % en fase móvil de H2O. Las fracciones purificadas de 2 se concentraron por evaporación giratoria y a continuación se transfirieron a una botella agitadora Parr. Se añadió paladio al 10 % sobre catalizador de carbono y la mezcla se sometió a vacío y a continuación se presurizó a hidrógeno de 30 psi. Los lotes de hidrogenación se agitaron a temperatura ambiente hasta que el monitoreo de HPLC indicó la finalización de la reacción. La mezcla de reacción se filtró mediante un filtro de membrana PVDF de 0,2 |jm al vacío y se liofilizó para obtener 3 como un sólido.
Anticuerpo monoclonal IgG1 dirigido a la bioconjugación de CD38
[0069] Este anticuerpo se diafiltró en PBS antes de la bioconjugación. El anticuerpo se desglicosiló mediante la adición de 6 U/mg de enzima PNGasa F y la agitación a 37 °C durante la noche. La enzima se retiró y el amortiguador se intercambió a PBS EDTA 50 mM mediante diafiltración a través de un filtro MWCO de 50 kDa. El anticuerpo se incubó con 80 mol equivalentes de Enlazador-Quelante químico (GGG-TCMC) y 6 U/ml de enzima MTGasa (Zedira) durante la noche a 37 °C con agitación suave. El intercambio de amortiguador y la eliminación de enzimas se realizaron mediante diafiltración en acetato de amonio 150 mM, pH 4,5.
[0070] Se determinó una concentración final de anticuerpo de 6,4 mg/ml. La CAR se determinó mediante análisis de masa intacta en 0,8.
T l 11
Figure imgf000011_0003
continuación
Figure imgf000012_0001
Anticuerpo IgG1 monoclonal dirigido a la bioconjugación de TEM-1
[0071] Este anticuerpo se diafiltró en PBS antes de iniciar la bioconjugación. El anticuerpo se desglicosiló mediante la adición de 6 U/mg de enzima PNGasa F y la agitación a 37 °C durante la noche. La enzima se retiró y el amortiguador se intercambió a PBS EDTA 50 mM mediante diafiltración a través de un filtro MWCO de 50 kDa. El anticuerpo se incubó con 80 mol de equivalente de Enlazador-Quelante químico (GGG-TCMC) y 6 U/ml de enzima MTGasa (Zedira) durante la noche a 37 °C con agitación suave. El intercambio de amortiguador y la eliminación de enzimas se realizaron mediante diafiltración en acetato de amonio 150 mM, pH 4,5.
[0072] Se determinó una concentración final de anticuerpo de 6,5mg/ml. La CAR determinada por la masa intacta es 1.2
T l 21
Figure imgf000012_0002
Bioconjugación de anticuerpos IgG1
[0073] El anticuerpo IgG1 se diafiltró en PBS antes de iniciar la bioconjugación.
[0074] El anticuerpo se desglicosiló mediante la adición de 6 U/mg de enzima PNGasa F y la agitación a 37 °C durante la noche. La enzima se retiró y el amortiguador se intercambió a PBS EDTA 50 mM mediante diafiltración a través de un filtro MWCO de 50 kDa. El anticuerpo se incubó con 80 mol equivalentes de Enlazador-Quelante químico (GGG-TCMC) y 6 U/ml de enzima MTGasa (comprada de Zedira) durante la noche a 37 °C con agitación suave. El intercambio de amortiguador y la eliminación de enzimas se realizaron mediante diafiltración en acetato de amonio 150 mM, pH 4,5.
[0075] Se determinó una concentración final de anticuerpo de 5,1mg/ml. La CAR determinada por el análisis de masa intacta es 1.1.
T l 1
Figure imgf000012_0003
Anticuerpo IgG1 monoclonal dirigido a la bioconjugación de CD20
[0076] Este anticuerpo se diafiltró en PBS antes de iniciar la bioconjugación. El anticuerpo se desglicosiló mediante la adición de 6 U/mg de enzima PNGasa F y la agitación a 37 °C durante la noche. La enzima se retiró y el amortiguador se intercambió a PBS EDTA 50 mM mediante diafiltración a través de un filtro MWCO de 50 kDa. El anticuerpo se incubó con 80 mol de equivalente de enlazador-quelante químico (GGG-TCMC) y 6 U/ml de enzima MTGasa (Zedira) durante la noche a 37 °C con agitación suave. El intercambio de amortiguador y la eliminación de enzimas se realizaron mediante diafiltración en acetato de amonio 150 mM, pH 4,5.
[0077] Se determinó una concentración final de anticuerpo de 5,6mg/ml. La CAR se determinó por masa intacta como 1,0.
T l 41
Figure imgf000013_0001
Anticuerpo monoclonal dirigido a la bioconjugación de HER2
[0078] Este anticuerpo se diafiltró en PBS antes de iniciar la bioconjugación.
[0079] El anticuerpo se desglicosiló mediante la adición de 6 U/mg de enzima PNGasa F (Roche) y la agitación a 37 °C durante la noche.
[0080] La enzima se retiró y el amortiguador se intercambió a PBS EDTA 50 mM mediante diafiltración a través de un filtro MWCO de 50 kDa.
[0081] El anticuerpo se incubó con 80 mol de equivalente de enlazador-quelante químico (GGG-TCMC) y 6 U/ml de enzima MTGasa (Zedira) durante la noche a 37 °C con agitación suave.
[0082] El intercambio de amortiguador y la eliminación de enzimas se realizaron mediante diafiltración en acetato de amonio 150 mM, pH 4,5.
[0083] Se determinó una concentración final de anticuerpo de 2,5mg/ml. EL CAR se determinó por masa intacta como 0,9.
T l 1
Figure imgf000013_0002
Anticuerpo IgG1 monoclonal dirigido a la bioconjugación de EGFR
[0084] El anticuerpo se diafiltró en PBS antes de iniciar la bioconjugación. El anticuerpo se desglicosiló mediante la adición de 6 U/mg de enzima PNGasa F (Roche) y la agitación a 37 °C durante la noche. La enzima se retiró y el amortiguador se intercambió a PBS EDTA 50 mM mediante diafiltración a través de un filtro MWCO de 50 kDa. El anticuerpo se incubó con 80 mol de equivalente de enlazador-quelante químico (GGG-TCMC) y 6 U/ml de enzima MTGasa (Zedira) durante la noche a 37 °C con agitación suave. Intercambio de amortiguador y eliminación de enzimas realizada por diafiltración en acetato de amonio 150 mM, pH 4,5.
[0085] Se determinó una concentración final de anticuerpo de 3,0mg/ml. EL CAR se determinó mediante análisis de masa intacta en 1,1.
Bioconjugación de anticuerpos monoclonales dirigidos a HER2 - Comparación de Enlazadores KGG y GGG [0086] El anticuerpo liofilizado se resuspendió y se diafiltró en PBS antes de iniciar la bioconjugación. El anticuerpo se desglicosiló mediante la adición de 500 ng/mg de la enzima PNGasa F (R&D systems) y la agitación a 37 °C durante la noche. La enzima se eliminó mediante diafiltración a través de un filtro MWCO de 50 kDa. El anticuerpo se incubó con 80 mol de equivalente de enlazador químico GGG-TCMC o KGG-TCMC y 6 U/ml de enzima MTGasa (Zedira) durante la noche a 37 °C con agitación suave. El intercambio de amortiguador y la eliminación de enzimas se realizaron mediante diafiltración en acetato de amonio 150 mM, pH 4,5.
[0087] Se determinó una concentración de anticuerpo final de 5,1 mg/ml para la bioconjugación con GGG-Enlazador y 7,2 mg/ml para la bioconjugación con KGG-enlazador. La CAR se determinó por masa intacta como 0,8 para KGG-TCMC-Anticuerpo y 1,9 con GGG-TCMC-Anticuerpo.
Bioconjugación del anticuerpo IgG1 monoclonal dirigido al anticuerpo HER2 de AKA-TCMC y GGG-TCMC con y sin desglicosilación de PNGasa
[0088] Este experimento tiene como objetivo encontrar si se requiere una desglicosilación de PNGasa para conjugar quelantes con anticuerpos dependiendo del enlazador utilizado. Se seleccionó AKA-TCMC ya que no debería haber requerido PNGase. AKA-TCMC se comparó con GGG-TCMC con y sin desglicosilación de PNGasa.
Procedimiento.
[0089] El anticuerpo liofilizado se resuspende y se diafiltra en PBS antes de comenzar la bioconjugación.
[0090] La mitad del anticuerpo se desglicosiló mediante la adición de 500 ng/mg de enzima PNGasa F (R&D systems) y la rotación a 37 °C durante la noche. La otra mitad no recibió PNGasa F.
[0091] La enzima se eliminó mediante diafiltración a través de un filtro MWCO de 50 kDa y se diafiltró en amortiguador de conjugación (PBS EDTA 50 mM).
[0092] El anticuerpo (desglicosilado y no desglicosilado) se incubó con 80 mol equivalentes de Enlazador-Quelante químico (GGG-Tc Mc ) o (AKA-Tc Mc ) y 6 U/ml de enzima MTGasa (Zedira) durante la noche a 37 °C con rotación suave.
[0093] Los conjugados se filtraron estériles seguidos de intercambio de amortiguador y eliminación de enzimas mediante diafiltración en acetato de amonio 150 mM, pH 4,5. Filtración estéril final realizada.
Resultados
[0094]
T l 71
Figure imgf000014_0001
[0095] Los datos sugieren que es necesaria la desglicosilación para que AKA-TCMC y GGG-TCMC se conjuguen con un anticuerpo y, además, que tanto AKA- como GGG-TCMC son capaces de conjugarse con el anticuerpo.
Anticuerpo IgG1 monoclonal dirigido a HER2Bioconjugación de GGG-TCMC y GGGG-TCMC Procedimiento.
[0096] Anticuerpo liofilizado resuspendido y diafilizado en PBS antes de iniciar la bioconjugación.
[0097] El anticuerpo se desglicosiló mediante la adición de 500 ng/mg de enzima PNGasa F (R&D systems) y girando a 37°C durante la noche.
[0098] La enzima se eliminó mediante diafiltración a través de un filtro MWCO de 50 kDa y se diafiltró en amortiguador de conjugación (PBS EDTA 50 mM).
[0099] El anticuerpo se incubó con 80 mol equivalentes de Enlazador-Quelante químico (GGG-TCMC) o (GGGG-TCMC) y 2 U/ml de enzima MTGasa (Zedira) durante la noche a 37 °C con rotación suave.
[0100] Los conjugados se filtraron estériles seguidos de intercambio de amortiguador y eliminación de enzimas mediante diafiltración en acetato de amonio 150 mM, pH 4,5. Filtración estéril final realizada.
Resultados
[0101]
Tabla 8
Figure imgf000015_0001

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de preparación de un anticuerpo bioconjugado específico del sitio de la fórmula (I): Ab-(Enlazador-Quelante)n (I)
donde dicho Enlazador es un oligopéptido con un extremo N-terminal,
el quelante es un agente quelante de metal,
n es la relación de quelante a anticuerpo (CAR), donde 0<n<2;
comprendiendo dicho procedimiento:
- la desglicosilación enzimática de dicho anticuerpo;
- el acoplamiento del anticuerpo desglicosilado obtenido con un compuesto de la fórmula (A):
Enlazador-Quelante (A)
en presencia de una transglutaminasa,
donde dicho procedimiento está caracterizado por que:
dicho Enlazador se une a Ab en su extremo N-terminal, y comprende una secuencia elegida entre (*G-G-G), (*K-G-G) y (*A-K-A),
donde * denota el extremo N-terminal del Enlazador que está unido covalentemente a Ab.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el Enlazador se elige entre los de la fórmula: -*G-G-G-(X)p-, -*K-G-G-(X)p-, -*A-K-A-(X)pdonde * denota el extremo N-terminal del Enlazador X es un aminoácido y p es un número entero tal que 0<p<10.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho Enlazador comprende al menos la secuencia *G-G-G.
4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho Enlazador es *G-G-G o *G-G-G-G.
5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho Enlazador es *G-G-G.
6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la desglicosilación enzimática se lleva a cabo con una N-glicosidasa.
7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la N-glicosidasa es PNGasa F (proteína N-glicosidasa F de Flavobacterium meningosepticum).
8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que -Quelante es - NH-CH2-CH2-DOTAM o -NH-TCMC.
9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la transglutaminasa es una transglutaminasa microbiana.
10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la transglutaminasa es transglutaminasa de la especie Streptomyces mobaraensis.
11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la CAR está comprendida entre 1 y 2.
12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se lleva a cabo un lavado de diafiltración entre la etapa de desglicosilación y la etapa de acoplamiento.
13. Un anticuerpo bioconjugado específico del sitio de la fórmula (I):
Ab-(Enlazador -Quelante)n (I)
donde Ab, enlazador y quelante se definen como en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, obtenible por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
14. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo bioconjugado específico del sitio de fórmula (I)
Ab-(Enlazador -Quelante)n (I)
donde Ab, enlazador y quelante se definen como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. Un anticuerpo bioconjugado específico del sitio de fórmula (I):
Ab-( Enlazador - Quelante)n (I)
donde Ab, Enlazador y Quelante se definen como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para su uso como agente de contraste o fármaco en medicina nuclear.
16. El anticuerpo bioconjugado específico del sitio para su uso según la reivindicación 14, para el diagnóstico y/o tratamiento del cáncer.
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