JP7008014B2 - 有効な部位特異的バイオコンジュゲーションのためのトランスグルタミンタグ - Google Patents
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Description
生体分子のコンジュゲーションのために現在利用されている化学的戦略は、システインおよびリシン残基が容易に改変され得るという事実を使用している。システイン残基は、それらをα-ハロケトンまたはマイケル反応受容体、例えばマレイミド誘導体などと反応させることによりアルキル化することができる。リシン残基の改変は、リシンの第1級アミノ基を介してタンパク質を標識する最も古く最も簡単な方法である。対象のタンパク質内のリシンのε-アミノ基は、活性化されたエステル、スルホニル塩化物、イソシアネートおよびイソチオシアネートと容易に反応して、対応するアミド、スルホンアミド、ウレアおよびチオウレアを生じることができる(例えば、Takaoka et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 4088-4106を参照されたい)。バイオコンジュゲーションのためには非常に効率的であるが、これらの化学的手法は必然的に不均一な混合物を生じる。この効果は、リシンを少ししか有しないより小さい分子で、例えばIgGタイプの分子と比較してFc領域を欠く抗体フラグメントにおいて、より顕著になる。バイオコンジュゲーションのさらなる例は、蛍光性タンパク質、染料のコンジュゲーション、または機能性分子、例えばPEG、ポルフィン、ペプチド、ペプチド核酸、および薬物を繋ぐことを含む(Takaoka et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 4088 - 4106)。
ヒトインターロイキン2(hlL-2)の場合には、単一の反応性グルタミン(Gln74)が見出され、12kDaのPEGまたはガラクトースが末端の3つの触覚をもつグリコシドとコンジュゲーションされる。
mTGの好ましい基質配列も、約1011個の線状ペプチドのはるかに大きいライブラリーを利用するファージディスプレイペプチドライブラリーを使用して評価した。大部分の同定されたクローンは、芳香族アミノ酸(W、F、またはY)を-5~-3位に、アルギニンまたは疎水性残基を+1または+2位に、および疎水性残基を-2および-1位に含有した(例えば、Sugimura et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 477 (2008) 379- 383を参照されたい)。
抗体薬物コンジュゲートの生成のためのmTG2の使用は、機能的ペイロードのモノクローナル抗体対応物とのバイオコンジュゲーションを必要とする。抗体薬物コンジュゲート(ADC)において、抗体は、非常に強い毒素のがん細胞への取り込みおよび放出を特異的に指示して、がん患者のための新規なおよび効果的な新しい治療の選択肢として近年大きい関心を引くようになった技法である。
WO2012/059882は、特異的に操作されたポリペプチドコンジュゲートおよびトランスグルタミナーゼを使用してそのようなコンジュゲートを作製する方法をさらに開示している。
WO2015/097267は、mTG2に媒介されるコンジュゲーション反応のために利用され得るS.モバラエンシスのmTG2などのトランスグルタミナーゼと、グルタミン供与体として、選択的に反応するペプチド配列を開示している。
タンパク質とmTG2とのバイオコンジュゲーションに関する研究およびバイオコンジュゲーション反応のためのグルタミン供与体として利用することができる新しい配列モチーフの探査にもかかわらず、天然MTGの基質部位の配列も構造的環境も知られていない。
したがって、バイオコンジュゲートのより効率的な製造のための、特に抗体:薬物の化学量論が十分限定されたADCの製造のためのmTG2により認識される基質の範囲を広げる必要がある。
1実施形態により、本発明によるアミノ供与体を含む基質は、少なくとも1個のε-アミノ基、または第1級アミノ末端アミノ基を有するGGGの配列を有する少なくとも1個のトリペプチドを含む。
1実施形態において、本発明によるアミノ供与体を含む基質は、リシン残基、リシン誘導体、リシン薬物コンジュゲート、少なくとも1個のリシン残基を含むポリペプチドである。
1実施形態により、本発明の上の実施形態のいずれか1つによりアミノ供与体を含む基質は、さらなる分子に共有結合している。
1実施形態により、アミノ供与体を含む基質のトリペプチドGGGは、そのカルボキシ末端を介してさらなる分子に共有結合している。
1実施形態において、本発明によるさらなる分子(moelcule)は、染料、放射性同位体、薬物、リボザイム、ナノボディ、酵素、またはリンカーのいずれか1つである。
1実施形態において、本発明によるさらなる分子は、切断可能であるかまたは非切断性であるリンカーである。
1実施形態により、本発明によるリンカーは、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングまたは共有結合している。
X1は、疎水性アミノ酸であり、
X2は、負に荷電したアミノ酸であり、
X3は、CまたはNであり、
X4は、CまたはNであり、
X5は、極性の非荷電側鎖を有するアミノ酸の1つであり、
X6は、負に荷電したアミノ酸である。
X1が、A、V、I、L、MまたはGのいずれか1つであり、
X2が、DまたはEの1つであり、
X3が、Cであり、
X4が、CまたはNであり、
X5が、S、T、またはNであり、
X6が、D、またはEの1つである
配列番号2のアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態によれば、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、
X1が、A、V、I、L、MまたはGのいずれか1つであり、
X2が、DまたはEの1つであり、
X3が、Cであり、
X4が、Cであり、
X5が、S、T、またはNであり、
X6が、DまたはEの1つである
配列番号2のアミノ酸配列を含む。
X1が、A、V、I、L、MまたはGのいずれか1つであり、
X2が、Eであり、
X3が、Cであり、
X4が、Cであり、
X5が、Tであり、
X6が、Eである
配列番号2のアミノ酸配列を含む。
さらにより好ましい実施形態によれば、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、配列番号90のアミノ酸配列を含む。
1実施形態において、本発明によるタンパク質は、抗体、抗原結合抗体フラグメント、Fcドメイン、酵素、非免疫グロブリンスキャフォールド(scaffold)の1つである。
1実施形態において、本発明によるタンパク質は、モノクローナル抗体、二価抗体、VHH、Fab、F(ab)2またはscFvである。
好ましい実施形態により、本発明によるタンパク質は、ヒトのまたはヒト化されたモノクローナル抗体またはそれらのフラグメントである。
1実施形態において、本発明の方法のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体は、抗体、抗原結合抗体フラグメント、酵素、または非免疫グロブリンスキャフォールドである。
1実施形態により、本発明の方法のアミノ供与体を含む基質は、染料、薬物、リボザイム、ナノボディ、酵素、またはリンカーとカップリングまたは共有結合する。
本発明の1実施形態により、リンカーは、切断可能であるかまたは非切断性であり、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングする。
1実施形態において、本発明は、本明細書で開示された本発明の方法により得ることができるタンパク質を提供する。
1実施形態において、本発明は、本明細書で開示された実施形態のいずれか1つによる本発明の方法における、配列番号2のいずれか1つによるポリペプチド配列の使用を提供する。
1実施形態により、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むタンパク質を提供する。
1実施形態において、本発明は、配列番号2のポリペプチドを提供する。
1実施形態において、本発明は、本発明の配列番号2のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。
1実施形態において、本発明は、配列番号2のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
1実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本明細書で開示された本発明によるベクターを含む宿主細胞を提供する。
1実施形態において、本発明は、配列番号2の少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、本発明による抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、二価抗体、またはVHH抗体を提供する。
したがって、本発明の抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、二価抗体、またはVHH抗体は、ヒト化されているかまたはヒトのものである。
好ましい実施形態において、上で開示された本発明による抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、ヒト化されているかまたはヒトモノクローナル抗体である。
好ましい実施形態において、上で開示された本発明の抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはIgMタイプの抗体である。
1実施形態において、上で開示された本発明の抗体は、上で開示された少なくとも1つのリンカーと、上で開示された本発明の方法により共有結合でカップリングさせる。
1実施形態により、本発明のモノクローナル抗体の少なくとも1つのリンカーが、染料、放射性同位体、または細胞毒とさらにカップリングさせる。
好ましい実施形態において、本明細書で開示された本発明のモノクローナル抗体は、がん細胞表面抗原に特異的に結合する。
より好ましい実施形態では、上で開示された本発明のモノクローナル抗体はモノクローナル抗体c225(セツキシマブ)である。
1実施形態により、本発明は、本発明の抗体および少なくとも1種のさらなる薬学的活性成分を含む組成物を提供する。
1実施形態において、本発明は、本明細書で開示された本発明の抗体を含む医薬または本発明による組成物および少なくとも1種のさらなる成分を含む医薬を提供する。
1実施形態において、本発明は、治療を必要とするがんに罹患した対象を治療する方法であって、前記患者に治療有効量の本発明による医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
配列番号1~配列番号294に記載の配列は本発明によるものであり、本発明の実施形態に従って使用することができる。
配列番号1 TYFQAYG
配列番号2 X1X2X3 TYFQAYG X4X5X6
配列番号3 X1X2C TYFQAYG NX5X6
配列番号4 X1X2C TYFQAYG CX5X6
配列番号5 X1X2N TYFQAYG NX5X6
配列番号6 X1X2N TYFQAYG CX5X6
配列番号7 ADC TYFQAYG CSD
配列番号8 VDC TYFQAYG CSD
配列番号9 IDC TYFQAYG CSD
配列番号10 LDC TYFQAYG CSD
配列番号11 MDC TYFQAYG CSD
配列番号12 GDC TYFQAYG CSD
配列番号13 AEC TYFQAYG CSD
配列番号14 VEC TYFQAYG CSD
配列番号15 IEC TYFQAYG CSD
配列番号16 LEC TYFQAYG CSD
配列番号17 MEC TYFQAYG CSD
配列番号18 GEC TYFQAYG CSD
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配列番号20 VDC TYFQAYG NSD
配列番号21 IDC TYFQAYG NSD
配列番号22 LDC TYFQAYG NSD
配列番号23 MDC TYFQAYG NSD
配列番号24 GDC TYFQAYG NSD
配列番号25 AEC TYFQAYG NSD
配列番号26 VEC TYFQAYG NSD
配列番号27 IEC TYFQAYG NSD
配列番号28 LEC TYFQAYG NSD
配列番号29 MEC TYFQAYG NSD
配列番号30 GEC TYFQAYG NSD
配列番号31 ADC TYFQAYG CSE
配列番号32 VDC TYFQAYG CSE
配列番号33 IDC TYFQAYG CSE
配列番号35 MDC TYFQAYG CSE
配列番号36 GDC TYFQAYG CSE
配列番号37 AEC TYFQAYG CSE
配列番号38 VEC TYFQAYG CSE
配列番号39 IEC TYFQAYG CSE
配列番号40 LEC TYFQAYG CSE
配列番号41 MEC TYFQAYG CSE
配列番号42 GEC TYFQAYG CSE
配列番号43 ADC TYFQAYG NSE
配列番号44 VDC TYFQAYG NSE
配列番号45 IDC TYFQAYG NSE
配列番号46 LDC TYFQAYG NSE
配列番号47 MDC TYFQAYG NSE
配列番号48 GDC TYFQAYG NSE
配列番号49 AEC TYFQAYG NSE
配列番号50 VEC TYFQAYG NSE
配列番号51 IEC TYFQAYG NSE
配列番号52 LEC TYFQAYG NSE
配列番号53 MEC TYFQAYG NSE
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配列番号226 LDN TYFQAYG CTE
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配列番号228 GDN TYFQAYG CTE
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配列番号294 GEN TYFQAYG NNE
配列番号295 GGGSLLQG
配列番号296 5’-TGGCTGAACGGCAAAGAGTAC
配列番号297 5’-CCTGAAAGTAGGTGCACTCGCCGCCAGGGCTCAGGGACAG
配列番号298 5’-CGGGGGATCCTCATTCGGTGCAGCCGTAGGCCTGAAAGTAGGTGCACTCG
配列番号299 5’-CTGAAAGTAGGTGTTCTCGCCGCCAGGGCTCAGGGACAG
配列番号300 5’-CGGGGGATCCTCATTCGGTATTGCCGTAGGCCTGAAAGTAGGTGTTCTCG
配列番号301 5’-NNN1NNN2NNN3ACNTAYTTYCARGCNTAYGGN NNN4NNN5NNN6
配列番号302 LPXTG、X=D、E、A、N、Q、またはKである。
配列番号303 GGGYK
用語「a」および「an」および「the」および本発明を記載する文脈で(特に請求項の文脈中で)使用される同様な言及は、特に断りのない限り、または文脈で明らかに矛楯しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の記載は、範囲内に入る別々の各値を個々に言及する省略方法として役立つことが単に意図されているものである。明細書で他のように指示されない限り、個々の各値は、恰もそれが本明細書で個々に記載されたように本明細書に組み込まれる。本明細書中の如何なる言語も、本発明の実行に必須の如何なる特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
数件の文献が本明細書の本文全体にわたって引用されている。本明細書で引用された文献の各々(全ての特許、特許公開、科学的発表、メーカーの仕様書、使用説明書、その他を含む)は、前出であっても後掲であっても、それらの全体で参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中の如何なるものも、先行発明のおかげで、本発明がそのような開示に先んずる権利を与えられないと承認するものと解釈されるべきでない。
例えば、1実施形態において、本発明によるアミノ供与体を含む基質は、L-アスパラギナーゼなどの酵素に共有結合していてもよい。
1実施形態により、本発明によるリンカーは、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングまたは共有結合している。したがって、本発明のアミノ供与体を含む基質に共有結合している本発明によるリンカーは、例えば、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングまたは共有結合していてもよい。用語「カップリングしている」は、本発明によるリンカーについて使用される場合、染料、放射性同位体または細胞毒(cytoxin)が、本発明によるリンカー分子に、非共有結合で、例えばイオン性、または疎水性相互作用により結び付けられている事実を指す。例えば、リンカーは、ストレプトアビジンを含むことができ、染料、放射性同位体または細胞毒がビオチン(biotion)に共有結合していてもよい。例えば、放射性同位体の場合に、放射性同位体が、ビオチン(biotion)に共有結合していてもよい、上で開示されたキレート化剤の1種にキレートされていてもよい。あるいは、放射性同位体は、例えば、ビオチン、例えば[8,9-3H]ビオチン中に組み込まれていてもよい(例えば、Robinson et al., J Biol Chem. 1983 May 25; 258(10): 6660-4を参照されたい)。
好ましくは、リンカーは、例えば「ペイロード」と称されることもある細胞毒に例えば共有結合で結合されていてもよい(例えばPerez et al. Drug Discovery Today Vol 19 (7)、July 2014を参照されたい)。
X1は、疎水性アミノ酸であり、
X2は、負に荷電したアミノ酸であり、
X3は、CまたはNであり、
X4は、CまたはNであり、
X5は、極性、非荷電側鎖を有する1つのアミノ酸であり、X6、は負に荷電したアミノ酸である。
より好ましい実施形態によれば、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列において、配列は配列番号90(GECTYFQAYGCTE)によるアミノ酸配列を含む。
1実施形態において、上で開示された本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列を含むタンパク質は、抗体、抗原結合抗体フラグメント、Fcドメイン、酵素、非免疫グロブリンスキャフォールドであってもよい。したがって、本発明のアシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列は、抗体、抗原結合フラグメント、Fcドメイン、酵素、非免疫グロブリンスキャフォールドに共有結合で結合していてもよい。
用語「ヒトモノクローナル抗体」は、本発明によるタンパク質について使用される場合、ヒトの生殖細胞系列の免疫グロブリン配列から誘導された可変領域および定常領域を有するモノクローナル抗体を指す。用語「ヒト化」は、本発明に関して使用される場合、好ましくは、抗体のその標的抗原に結合する能力を担当するその相補性決定領域(CDR)セグメントの一部が非ヒト起源であるが、アミノ酸配列がヒトバリアントのものと本質的に同一であるモノクローナル抗体を指す。用語「キメラモノクローナル抗体」は、本発明で使用される場合、マウスのFabフラグメントがヒトFcに接合されたモノクローナル抗体を指す。
本発明によるアミノ供与体を含む基質と本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体とを、トランスグルタミナーゼ、好ましくはmTG2の存在下で接触させて、上で開示された本発明のタンパク質を得るステップを含む。したがって、本発明の方法では、上で開示された本発明によるアミノ供与体を含む基質と本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体、例えば、本明細書で開示された配列番号7~294のいずれかとを、mTG2の存在下で接触させて上で開示された本発明のタンパク質を得る。用語「接触させる」は、本発明の方法で使用される場合、2個以上の分子、例えば、本発明によるアミノ供与体を含む基質およびアシルグルタミン含有アミノ酸供与体などが、互いに密接して物理的接触にもたらされ、例えば同じ反応混合物または水溶液の一部を形成する任意の状況を指す。例えば、本発明の方法によるmTG2に媒介される反応は、本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体を、1~60モル当量の、または1~50モル当量の本発明によるアミノ供与体を含む基質と、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49モル当量で、または例えば、約2モルから約45モル、約5モルから約40モル、約10モルから約35モル、約12.5モルから約30モル、約15モルから約32.5モル、約7.5モルから約27.5モル、約17.5モルから約25モル、約0.5モルから約1モルのモル当量で反応させることを含むことができる。本発明によるアシルグルタミン含有アミノ酸供与体の濃度は、約0.1mg/mlから約100mg/ml、例えば約0.5mg/mlから約75mg/ml、約1mg/mlから約50mg/ml、約2.5mg/mlから約45mg/ml、約5mg/mlから約40mg/ml、約10mg/mlから約35mg/ml、約12.5mg/mlから約30mg/ml、約15mg/mlから約25mg/ml、約17.5から約20mg/ml、例えば、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4、mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、19mg/ml、23mg/ml、27mg/ml、31mg/ml、33mg/ml、37.5mg/ml、41mg/ml、42mg/ml、43mg/ml、44mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/mlであってもよい。
5’-NNN1NNN2NNN3ACNTAYTTYCARGCNTAYGGNNNN4NNN5NNN6-3’(配列番号301)、
式中、Nは任意のヌクレオチド(A、C、T、G)、Yは、ピリミジン塩基(CまたはT)を表し、Rはプリン塩基(AまたはG)を表す。塩基の命名法は、生化学国際連合命名委員会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry(NC-IUB))によった、例えばJ. Biol. Chem., 1986, 261, 13-17を参照されたい。NNN1~NNN6はコドン1~6を示し、ここで、コドンNNN1は配列番号2のアミノ酸X1をコードし、NNN2は配列番号2のアミノ酸X2、NNN3は配列番号2のアミノ酸X3、NNN4は配列番号2のアミノ酸X4、NNN5は配列番号2のアミノ酸X5、およびNNN6は配列番号2のアミノ酸X6を示す。例えば、ポリヌクレオチドの意図される使用に依存して、コドンの使用法は、特定の宿主に対して、例えばポリヌクレオチドが、上で開示された本発明のペプチドまたは本発明のタンパク質を、哺乳動物、原核生物または真核生物の宿主で発現させるために使用された場合、最適化されるべきであり、それぞれの宿主により異なったコドン用法が考慮されるべきである。例えば、本発明のポリヌクレオチドが、治療薬を製造するために、齧歯目またはヒトの細胞系統、例えばCHOまたはHEK293細胞などで発現させるために使用される場合に、対応するコドン用法は、例えばタンパク質の製造を増大させるように使用されるべきである(Trends in Molecular Medicine, November 2014, Vol. 20, No. 11)。しかしながら、本発明によるコドンNNN1~NNN6は、停止コドン、例えばTAG(琥珀色)、TAA(黄土色)、またはTGA(オパール色)をコードすることができない。
(例1)
ペプチドの固相合成および精製
ペプチドは、AmphiSpheres 40RAM樹脂(Agilent、0.27mmol/g)上で、マイクロ波に補助されるFmoc-SPPSにより、Liberty Blue TMマイクロ波ペプチド合成機を0.1mmolスケールで使用して合成された。それぞれのカルボキシ官能性アミノ酸の活性化は、Oxyma/Ν,Ν’-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)により実施した。アミノ末端Fmoc基の脱保護は、DMF中20%のピペリジンをOxymaの存在で使用して達成した。合成サイクル中、全てのアミノ酸を90℃に(システインは50℃に)加熱した。ペプチドを、樹脂から、94%TFA、2%トリエチルシラン、2%アニソール、2%H2Oの標準的切断カクテルにより切断した。システインを含有するペプチドは、ジチオトレイトール(DTT)の存在下で切断してシステインの望ましくない酸化を抑制した。2時間切断した後、ペプチドを冷ジエチルエーテル中で沈殿させて、ジエチルエーテルで2回洗浄した。ジスルフィドで架橋された粗ペプチドを100mM(NH4)2CO3水溶液(pH8.4)中において1mgml-1で酸化して、酸化はRP-HPLCによりモニターした。その後、ペプチドを分取RP-HPLCによって単離した。
ペプチドをVarian製の分析RP-HPLC(920-LC)でPhenomenex Hypersil 5μBDS C18LCカラム(150×4.6mm、5μm、130Å)を使用して、クロマトグラフィーにより分析した。ペプチドをPhenomenex Luna5μC18LCカラム(250×12.2mm、5μm、100Å)を使用して、半分取RP-HPLC(Varian)により単離した。溶離剤A(水)および溶離剤B(90%aq.MeCN)は、各々0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含有した。
ESI質量スペクトルは、Phenomenex Jupiter 5μC4LCカラム(50×1mm、5μm、300A)を備えたShimadzu LCMS-2020で、0.1%ギ酸水溶液(溶離剤A)および0.1%ギ酸を含有するアセトニトリル(溶離剤B)の溶離剤系を使用することにより収集した。
ペプチドビオチン化アッセイ
ペプチドをDMSO中に50mg/mlで溶解して、酵素によるコンジュゲーションのためにpH7.0の100mM HEPESで1.25mg/mlに希釈した。モノビオチニルカダベリンをペプチドに対して5倍モル過剰で加えて、1/50(質量/質量)の酵素/基質比で酵素反応を微生物のトランスグルタミナーゼの添加により開始した。ペプチド2(配列番号90)および参照ペプチドGGGSLLQG(配列番号295)を含むペプチドビオチン化アッセイのためには、微生物のトランスグルタミナーゼの量を、それぞれ1/385および1/182(質量/質量)の酵素/基質比に減らした。反応混合物を37℃でインキュベートした。反応混合物のアリコートを0、15、30、60、120、および180分後に採取して、反応を、遠心分離透析(Microcon-10、10.000NMWL、Merck Millipore)を使用してトランスグルタミナーゼ除去により停止させた。アリコートをRP-HPLCによって10~80%溶離剤B(MeCNの90%水溶液)の勾配を使用することにより1ml/分で20分かけて分析した(図4を参照されたい)。RP-HPLC分析から集めた分画をESI-MSによりさらに分析した。
トランスグルタミナーゼを使用する酵素抗体コンジュゲーション
抗体の発現および精製。野性型セツキシマブ(Erbitux(登録商標))をコードするプラスミドは、Merck Serono(Darmstadt)の好意で提供された。重鎖のC末端にTGタグを含有するセツキシマブ変異体を、下に記載する標準的SOEPCR技法により調製した。C末端リシンは、両方の構造でε-アミノ基とトランスグルタミナーゼに接近可能なグルタミンとの交差反応性を避けるために除去した。抗体を、HEK293F細胞からExpi293発現系(Life Technologies)を使用して一時的に発現させた。状態調節した上清をPROSEP-A培地を含むスピンカラムに適用して(Montage、Merck Millipore)、1.5Mグリシン/NaOH、3M NaCl、pH9.0で洗浄した。タンパク質をpH2.5の0.2Mグリシン/HClで溶離させて、pH9.0の1M Tris/HClで中和した。溶離したタンパク質を1×DPBS(Life Technologies)で透析して4℃で貯蔵した。
PCRを使用して、重鎖のカルボキシ末端リシン残基を欠くc225(セツキシマブ)構造を生成した。末端リシン残基および配列番号246のカルボキシ末端アミノ酸配列を含むC225をコードするプラスミドを、配列番号296、配列番号299の配列を有するプライマー(両方とも1ピコモルで)を使用して10サイクル(PCR条件:3分@98℃(初期変性)、10秒@98℃、30秒@55℃、15秒@72℃)、続いて配列番号296、配列番号300の配列を有するプライマー(10ピコモルのプライマー)を使用して、以下のサイクル条件:10秒@98℃、30秒@55℃、15秒@72℃、最終の延長5分@72℃で20サイクルにより増幅した。
抗体を0.5mg/mlに調節して、コンジュゲーション部位当たり40モル当量のモノビオチニルカダベリン(MBC)および1モル当量の微生物のトランスグルタミナーゼ(mTGアーゼ)と、pH7.0の100mM HEPES緩衝液中で3時間25℃でインキュベートした。分析結果のために、反応混合物を15%SDS-PAGEにより分析して、ビオチン化重鎖を半乾燥ウェスタンブロットによりストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲートおよびNBT/BCIPで可視化した。抗体複合体を分取で製造するために、過剰の基質およびmTGアーゼをサイズ排除クロマトグラフィーにより、50mMリン酸ナトリウム緩衝液、150mM NaCl、pH7.0(Superdex S20010/300GL、GE Healthcare、0.5ml/分)を用いて除去した。
抗体コンジュゲーション有効度をN-(テトラメチルロダミニル)カダベリン(TAMRA-カダベリン)を用いる抗体標識および547nmの励起波長および573nmの発光波長における蛍光の測定により決定した。この目的のために、抗体を、1.0mg/mlに調節してTAMRA-カダベリンのコンジュゲーション部位当たり20モル当量およびpH7.0の100mM HEPES緩衝液中0.5モル当量の微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)と3時間25℃でインキュベートした。結合していないTAMRA-カダベリンをPBSで平衡化されたタンパク質脱塩スピンカラム(Thermo Scientific)を使用して2回ゲル濾過により除去した。非抗体試料を同じ様式でインキュベートして処理し、ゲル濾過後、残存する遊離TAMRA-カダベリンを排除した。この対照から測定された弱い蛍光を、その後、抗体試料の蛍光から差し引いた。TAMRA-カダベリンのコンジュゲーションされた抗体の濃度は、PBS中9.72~0.19μΜの範囲のTAMRA-カダベリンの標準的曲線を使用して(ウェル当たり40μl)、およびプレートリーダー(Tecan Infinite M1000)を使用する蛍光読み取りにより決定した。標識された抗体/標識されていない抗体のパーセンテージは、各標識された抗体が、MTGタグに接続した重鎖における2つのTAMRA部分にコンジュゲーションされていると仮定して、全抗体濃度から計算した(280nmで決定した、9:MW=148211.72g/モル ε280=223400M-1m-1、10:MW=148259.55g/モル ε280=223150M-1m-1)。分析結果のために、反応混合物も15%SDS-PAGEにより分析して、TAMRAで標識された重鎖を蛍光読み取りにより可視化した。
細胞結合の実験
細胞系統。EBC-1およびCHO-K1細胞を、両方ともそれぞれ10%ウシ胎児(Sigma-Aldrich)で補完された4mMのL-グルタミン(Sigma-Aldrich)およびDMEM-F12+GlutaMax(商標)(Gibco(登録商標))が添加されたDMEM中において、37℃および5%CO2で培養した。
mTG2およびGGGアミノ供与体を含む基質を使用するセツキシマブ(c225)のバイオコンジュゲーション
末端のリシン残基(K447)が除去されたセツキシマブの重鎖バリアント9および10(9:配列番号90の本発明のMTGタグ付き、10:配列番号246の本発明のMTGタグ付き)を、ビオチン-カダベリン(cadavarine)、またはGGGYK-ビオチンとコンジュゲーションさせた。
mTG2に媒介されるコンジュゲーション反応を実施するためのアッセイ条件は下記の通りであった。
アッセイ条件 濃度[μΜ]
50mM Tris-HCI pH7.5、150mM NaCI 1×
mTG(0.4eq.) 1.364
セツキシマブ(本発明による) 0.5mg/ml
MBC/GGG-ビオチン/GGG-TAMRA/TAMRA-カダベリン
(50モル当量) 170.4
インキュベーション時間: 3時間@22℃
22℃で3時間のインキュベーションの後、反応を2.5μlのSDSローディング染料を加えることにより停止させ、続いて98℃で5分間変性させた。15%SDSポリアクリルアミドゲルに試料を加えて300V、40mAで、所望の分離が達成されるまで行った(図14Bを参照されたい)。ウェスタンブロットを行った(12V、400mA、45分)。蛍光の検出は、ポリアクリルアミドゲルをUVスクリーン上に置くことにより行なった(λ=260~280nm)(図14C)。
結果
本発明のMTG-タグ1、またはMTG-タグ2を含むセツキシマブだけが蛍光で標識されたが、それに対して本発明の配列番号90、配列番号246のポリペプチド配列を有しない野生型セツキシマブは蛍光で標識されず、本発明のMTGタグがmTG2により効率的に認識されたことを示した。
MTGで促進されるコンジュゲーション反応
抗体薬物コンジュゲート(ADC)を、配列番号246でタグ付けされた1mg/mlのセツキシマブ(例えば、重鎖の各々のカルボキシ末端に配列番号246を含むセツキシマブ)、20当量の細胞傷害性ペイロード1~4、および0.1当量の微生物トランスグルタミナーゼ(MTG)を含有する、MTGに触媒される反応で合成した。反応は、PBS中pH7.4、37℃で16時間実施して、1体積のHIC緩衝液Aの添加により停止させた。
ADCを、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によりTSKゲルブチル-NPRカラム(Tosoh Bioscience、4.6mm×3.5cm、2.5μm)でAgilent Infinity 1260HPLCを使用して評価した。HICの方法を、50mM NaH2P04、1.5M(NH4)2SO2 pH7.5(緩衝液A)および50mM NaH2P04 pH7.5(緩衝液B)の移動相を使用して適用し、0.75M(NH4)2SO2中のADC(45μg)を載せて、0%緩衝液Bで2.5分、それに続いて25分かけて100%緩衝液Bになる線形勾配からなる勾配で、0.9ml/分の流速で溶離させた。
Claims (19)
- γ-グルタミル-アミド結合を介して、アミノ供与体を含む基質に共有結合で連結された、少なくとも1つのアシルグルタミン含有アミノ供与体配列を含むタンパク質であって、前記アシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列が、アミノ酸配列X1X2X3TYFQAYGX4X5X6
(式中
X1は、疎水性アミノ酸であり、
X2は、負に荷電したアミノ酸であり、
X3は、CまたはNであり、
X4は、CまたはNであり、
X5は、極性の非荷電側鎖を有するアミノ酸の1つであり、
X6は、負に荷電したアミノ酸である;又は
式中
X1が、A、V、I、L、MまたはGのいずれか1つであり、
X2が、DまたはEの1つであり、
X3が、Cであり、
X4が、CまたはNであり、
X5が、S、T、またはNであり、
X6が、DまたはEの1つである;又は
式中
X1が、A、V、I、L、MまたはGのいずれか1つであり、
X2が、DまたはEの1つであり、
X3が、Cであり、
X4が、Cであり、
X5が、S、TまたはNであり、
X6が、DまたはEの1つである;又は
式中
X1が、A、V、I、L、MまたはGのいずれか1つであり、
X2が、Eであり、
X3が、Cであり、
X4が、Cであり、
X5が、Tであり、
X6が、Eである;又は
式中
X1が、Gであり、
X2が、Eであり、
X3が、Cであり、
X4が、Cであり、
X5が、Tであり、
X6が、Eである(配列番号90))を含む、タンパク質。 - 前記アミノ供与体を含む基質が、少なくともε-アミノ基を含むか、または第1級アミノ末端アミノ基を有するGGGの配列を有する少なくとも1つのトリペプチドを含む、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記アミノ供与体を含む基質が、リシン残基、リシンが染料またはビオチンとカップリングしてなるリシン誘導体、または少なくとも1つのリシン残基を含むポリペプチドである、請求項1または2に記載のタンパク質。
- 前記アミノ供与体を含む基質がさらなる分子に共有結合している、請求項1から3までのいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記さらなる分子が、染料、放射性同位体、薬物、リボザイム、ナノボディ、酵素、またはリンカーの1つである、請求項4に記載のタンパク質。
- 前記リンカーが切断可能であるかまたは非切断性であり、
前記リンカーが、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングまたは共有結合している、請求項5に記載のタンパク質。 - 抗体、抗原結合抗体フラグメント、Fcドメイン、非免疫グロブリンスキャフォールド、または酵素のいずれか1つである、請求項1から6までのいずれか1項に記載のタンパク質。
- アミノ供与体を含む基質を、配列番号2のポリペプチド配列を含むアシルグルタミン含有アミノ酸供与体に共有結合でカップリングさせる方法であって、
トランスグルタミナーゼの存在下で、前記アミノ供与体を含む基質と前記アシルグルタミン含有アミノ酸供与体とを接触させて、請求項1から7までのいずれか1項に記載のタンパク質を得るステップを含む、方法。 - 前記トランスグルタミナーゼが、mTG2である、請求項8に記載の方法。
- 前記アシルグルタミン含有アミノ酸供与体が、抗体、抗原結合抗体フラグメント、非免疫グロブリンスキャフォールド、または酵素である、請求項8または9に記載の方法。
- 前記アミノ供与体を含む基質が、染料、薬物、リボザイム、ナノボディ、酵素、またはリンカーとカップリングまたは共有結合している、請求項10に記載の方法。
- 前記リンカーが切断可能または非切断性であり、染料、放射性同位体、または細胞毒とカップリングしている、請求項11に記載の方法。
- 請求項8から12までのいずれか1項に記載の方法による方法により得ることができるタンパク質。
- 請求項8から12までのいずれか1項に記載の方法における配列番号2のポリペプチド配列の使用。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質。
- 配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つの配列番号2のアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、二価抗体、またはVHH抗体。
- 請求項11または12に記載の方法により少なくとも1つのリンカーに共有結合でカップリングしている、請求項18に記載の抗体。
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