PT78142B

PT78142B - Substance gelifiante semi-syntthetique son procede de preparatin et ses applications pour la culture de microrganismes

Info

Publication number: PT78142B
Application number: PT78142A
Authority: PT
Original assignee: Korano Sarl
Priority date: 1983-02-23
Filing date: 1984-02-22
Publication date: 1986-07-15
Also published as: PT78142A; FR2541307B1; ATE29264T1; US4668779A; DE3465750D1; JPS59210898A; FR2541307A1; EP0118376A1; EP0118376B1

Description

DESCRIÇÃO DO INVENTO

i

J"

A presente invenção diz respeito ao processo de preparação de uma substância gelificante semi-sintêtica, e suas aplicações designadamente como substituto do agar-agar nos meios de cultura para micro-organismos.

As operações de isolamento de microrganismos correntemente realizadas nos laboratórios de análise microbiológica impõem efectuar uma sementeira destes microrganismos em ou sobre um meio de cultura onde eles se desenvolvem em condições fisicoquímicas bem determinadas. Esta sementeira faz-se frequentemente à superfície dum meio de cultura sóli do constituído por elementos nutritivos contidos num gel. Cada bactéria desenvolvendo-se forma uma colónia isolada.

Conhecem-se numerosas substâncias susceptíveis de formar, em meio aquoso, geles susceptíveis de solidificarem? é o caso, por exemplo, de produtos macromoleculares sintêti. cos (poliacrilamida, policarboxivinilo...) ou substâncias minerais como os silicatos. Mas estas substâncias não são adaptadas à formação nem à preparação fácil de meios de cul tura porque não são reversíveis; além disso, no caso de macromolêculas de síntese, a necessidade de lhes juntar um agente de polimerização para provocar a formação de gel to_r na-os incompatíveis com a preparação de meios de cultura a partir de pós secos por simples adição de água.

Existem igualmente numerosas macromoleculares naturais susceptíveis de formar geles sob a acção da temperatura? é o caso, por exemplo, da gelatina e das pectinas, que são compatíveis com os meios de cultura mas tem aplicações limitadas em bacteriologia? com efeito, estes geles são atacados por numerosas bactérias.

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Até hoje, só o agar-agar natural possui as carajç terísticas que permitem a sua utilização universal em bacteriologia. E o único produto a dar geles reversíveis e estáveis cuja temperatura de fusão (lQOSC) ê muito superior à temperatura de gelificação (40SC). Trata-se, alóm disso, duma substância que não Ó atacada rapidamente pelas bactérias e que não apresenta nenhuma toxicidade.

0 agar-agar natural ou gelose é obtido por extrac, ção a partir de diferentes algas marinhas que pertencem à classe das Rodoféceas. Trata-se de uma mistura complexa de polissacaridos que apresentam todos o esqueleto duma poliqa lactana formada pela repetição alternativa de unidades de (l-3) (p-D-galactose e de (l-4)3,6-anidro-\ -L-galactose, designada sob o nome de agarose e que, sob a sua forma comercial, é sempre mais ou menos substituída; a agarose pura não existe com efeito na natureza.

Trata-se dum produto praticamente insolúvel em âgua a 25SC, que se dispersa em água perto de 100SC dando soluções coloidais cuja viscosidade varia em função da ori gem e da concentração; a uma concentração de pelo menos 0,5% forma, por arrefecimento, geles que tem uma boa estabilidade e são reversíveis (fundem a quente e regelificam-se a temperatura inferior a 402C), Os geles são caracterizados pelas suas temperaturas de gelificação dinâmica (passagem do estado de solução ao estado de gel por arrefe cimento) e isotérmica (temperatura mínima à qual uma solução de agar-agar pode ser mantida indefenidamente sem formar gel). Estes parâmetros variam igualmente em função da origem do agar-agar, do seu peso molecular, dos lotes de fabricação e da concentração do gel.

A preparação de meios de cultura sólidos que uti.

lizam o agar-agar como produto gelificante consiste em mis.

turar este agar-agar às substâncias nutritivas convenientes,

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-4depois, após adição de água, para solubilizar o conjunto

tornando-o estéril por passagem no autoclave.

Existem actualmente pós secos, prontos para empregar, incluindo, em mistura, o agar-agar e as substânci as nutritivas convenientes; estes pós, não estéreis, são comercializados por lotes de pelo menos 500 g. A prepara ção dum meio de cultura a partir destes pós impõe a sequêjg cia das seguintes operações:

pesagem da quantidade desejada (p. ex. 40 g para 1 litro de ãgua)

- dissolução, à ebulição, deste pó em água

- passagem desta solução na autoclave a 120SC durante pelo menos 20 minutos

- repartição pelos recipientes de cultura (caixas de Pétri...) manualmente ou por intermédio duma máquina.

0 conjunto destas operações necessita pelo menos uma hora, o que exclui o acondicionamento destes pós em d_o se unitária (quantidade de pó necessária para fazer um só teste de cultura). Preparam-se sempre pelo menos 20 a 40 caixas de Petri ao mesmo tempo, o que apresenta outros inconvenientes por causa designadamente das variações quotidianas de consumo dum laboratório que é muitas vezes difícil de prever.

A presente invenção visa atenuar estes inconvenientes .

Os inventores conseguiram afinar uma nova substância gelificante semi-sintética susceptível de substituir

o agar-agar e cujo emprego, designadamente nos meios de cul

tura, sob a forma de pós secos, permite reduzir de uma forma importante a duração da preparação destes meios suprimijn

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do designadamente a necessidade da passagem pela autoclave para obter a sua dissolução e assegurar a sua esterilidade; é assim possivel preparar estes meios de cultura sob a forma de doses unitárias acondicionando, num mesmo recipiente estéril e manipulável de forma estéril, a substância gelificante e a quantidade doseada de pó estéril de substâncias nutritivas.

£ assim que a invenção tem por objectivo uma nova substância gelificante cuja originalidade consiste em que ê essencialmente constituída por cadeias entrecruzadas e relativamente curtas de poligalactanas nâo ramificadas, ou alternam as formas D e L, como no agar-agar, o que cons titui a originalidade essencial da invenção porque nâo exis te nenhuma outra substância obtida por extracção ou por sín tese química que possua este esqueleto. Esta substância dj. fere todavia do agar-agar porque estas cadeias sâo mais cuj? tas, emaranhadas e reúnem grãos de óxidos metálicos inertes tais como os óxidos de alumínios, de silicio e de titânio.

A proporção de óxidos metálicos em relação às poligalactanas é inversamsnte proporcional ac comprimento das cadeias poligalactanas e situa-se vantajosamente entre 10 e 80%„

A substância gelificante segundo a invenção, que designaremos daqui em diante sob o nome de poligalactana de síntese-óxido ou PGS-O, apresenta propriedades físico-químicas vizinhas das do agar-agar: ê praticamente ins^o lóvel na água a 25SC mas dispersa-se na água a partir de 8020: forma-se um gel por arrefecimento; em solução na

água, dá dispersões cuja viscosidade varia com a concentra, çâoj na concentração de pelo menos 0,5%, forma geles está veis e reversíveis.

0 PGS-0 apresenta todavia, em relação ^agarose, as seguintes diferenças essenciais e caracteristicas:

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A partir de 809C, o PGS-0 forma soluções, enquanto qu,e à mesma temperatura os grãos de agar-agar, mesmo pulve rulentos, incham sem se dissolverem. A característica essencial do PG3-0 ó então dissolver-se completamente em Sgua desde 80SC.

As cadeias de agarose não formam pontes senão entre elas, o que conduz à obtenção de geles de aspecto cristalizado; pelo contrário, as cadeias de PGS-0 reúnem grãos de óxidos metálicos e gelificam portanto dando uma suspensão de grãos de óxidos em água. A figura 1 do desenho esquemático anexo representa esta estrutura.

As cadeias de PGS-0 são muito mais pequenas que as cadeias de agarose. 0 comprimento das cadeias ê medido pelos pesos moleculares uma vez que se trata da repetição do mesmo dissacarido não substituído, de peso molecular 325 (H^O). As cadeias utilizáveis de PGS-0 tem um peso molecular que varia entre 6 000 e 15 000, o nó mero de dissacaridos jn varia portanto de 19 a 40-50.

Na agarose jn á muito variável segundo as origens dos agares naturais (entre 20 e 500). 0 peso molecular do

PGS-0 ê medido para cada lote de fabrica e á indicado ao utente (p. ex.: produto contendo um PGS-0 6 000,

8 000...) o que não é possível com o agar-agar; esta determinação exigiria uma verificação sobre tamis molécular sendo o agar-agar sempre constituído por uma mistura de polissacaridos que tem um mesmo esqueleto mais ou menos substituído.

Os pôs de PGS-0 são brancos e sob a forma de finas paIhetas de menos de um centésimo de milímetro de espessura. Para os PGS-0 utilizados em bacteriologia, a sua densidade aparente ó mais fraca do que a do agar-agar.

Por exemplo um PGS-0 de qualidade bacteriológica, de

7ΡΜ 12 000 e contendo Al^O^, TiO^ e SiO^ nas proporções 66.17.16.01 (ver exemplo ,l) tem uma densidade aparente de 0,118 enquanto que o agar-agar bacteriológico, utilizado para as mesmas aplicações, tem uma densidade apst rente de 0,384 e forma grãos. (A densidade aparente dum pó é uma medida utilizada em farmácia galénica. De fine o peso dum certo volume de pó não calcado: por exemplo, um litro de PGS-0 66.17.16.01 não calcado pesa 118 g).

Pelo contrário, a densidade real é maior com o

PGS-0 que com o agar-agar (vizinha de 1 para o agar-agar e de 1,3 para um PGS-0 66,17.16.01, por causa da presença de Óx idos metálicos.

- Os pós de PGS-0 são compatíveis com a granulação e a compressão: as partículas de PGS-0 são capazes de se

aglutinarem e de permanecerem ligadas umas às outras após a compressão. Obtém-se granulados ou comprimidos sólidos, não friáveis e que se elidem na água a 8Q-100SC o que é impossível com o agar-agar do comércio.

Nos geles de agarose, as cadeias são paralelas e ordena das, enquanto que nos geles de PGS-0 são entrelaçadas como as fibras de celulose do papel. Esta característi ca é fácil de verificar por difracção aos rais X: a agarose mostra uma estrutura repetitiva (domínio cristã lino) enquanto que o PGS-0 não deixa aparecer senão halos de difracção e não apresenta regularidade de estrutura (domínio amorfo),

A análise química permite, bem entendido, diferenciar a agarose (que nõo contém senão poligalactanas) dos diferentes PGS-0 segundo a invençõo, que são caracterizados pelo seu teor em diferentes óxidos metálicos.

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-8Os espectros de R MN da agarose e do PGS-O, tal como eles são representados nas figuras 5 e 4 do desenho esquemáti co anexo, embora sejam vizinhos, são muito reconhecíveis

Os espectros obtidos pelo RMN ao carbono 13 a pa_r tir do agar-agar (fig. 5) do comércio permitem por em evidência 12 sinais diferentes principais correspondendo aos átomos de carbono e indicam que a agarose possui uma estrutura regular ou que se repete uma mesma unidade de dissacarido. Os sinais registados a 103,4 e 99,2 p.p.m. são atribuídos aos carbonos do (3 -O-galactopiranosilo e 0^ do

3,6 anidro-c/ -L-galactopiranosiloJ o sinal a 62,4 p.p.m. é atribuído ao carbono em da D-galactose. Os outros sinais correspondem seja aos outros 9 carbonos que constituem a unidade de dissacaridos, variando a altura dos picos com a natureza dos substituintes sobre estes carbonos, seja aos substituintes como os grupos metoxilo a 60 p.p.m..

Com os PGS-0 (figura 4), os óxidos dão absorções caracteristicas que não se encontram na agarose. Na zona correspondente às poligalactanas, encontram-se os 12 picos principais correspondentes a cada um dos carbonos, mas os PGS-0 não dão picos correspondentes a substituintes, e a altura dos picos obtidos é fixa (contrariamente ao agar-agar do comércio). Pelo contrário encontram-se, como para o agar-agar, os picos a 103,4 e 99,2 característicos da alternância das formas D e L galactose.

Os espectros F!í'N dc carbono 13 aparecem então como o melhor processo de controle de fabrico dos PGS-0.

Enfim, a peso de matéria seca igual, o gel de PGS-0 é branco mais ou menos opaco, enquanto que o gel de agarcse é mais ou menos transparente.

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Convém, por outro lado, notar que a simples adição à agarose, de proporções de óxidos metálicos semelhantes às que contám o PCS-0 não modifica as propriedades da

agarose e não lhe comunica nada das do PGS-O, em particular dar soluções a cerca dos 8030.

A invenção tem igualmente por objecto um processo de fabrico bio-sintático de poligalactana de síntese-óxido, segundo o qual se utilizam microrganismos produtores de enzimas para sintetizar, a partir de oligossacaridos provenientes de matérias primas que contêm já D e L galaotoses, um esqueleto de poligalactana não ramificada ou alternam as formas D e L, sendo a cultura dos ditos microrganismos efeç: tuada através de uma membrana porosa sobre a qual são espalhados pás finos de óxidos metálicos.

Segundo urn modo de realização preferido da inveri ção, os microrganismos são primeiramente isolados a partir de oligo-sacaridos que provêm da hidrólise da agarose. Sabe-se que certos microrganismos possuem enzimas que hidroli, sam a agarose e libertam oligo-sacaridos:

4-0- -D-galactopiranosil (l—^4)3,6 anidro- 0( -L-galajç tose, correspondendo â repetição de unidades de AGAROEIO SE (oligossacaridos A-B).

0-3,6 anidro-'X -L-galactopiranosil (l—->3)- /S-D-galactose correspondendo à repetição de unidades de NEOAGARRO BIOSE (oligossacaridos B-A).

Estes enzimas cortam as ligações /0 ) _eú(

—L—(l—)>3)-galactose, segundo o esquema seguinte:

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A GA ROSE

Há a notar que os enzimas têm uma acção reversível e que o mesmo microrganismo que possui a propriedade de hidrolizar pode possuir inversamente a propriedade de polimerisar.

Estes oligossacaridos, preparados a partir da ag_a rose, servirão para seleccionar os microrganismos produtores de polimerases.

0 isolamento dos microrganismos capazes de sintetisar a agarose ou a poligalactana de síntese a partir de oligossacaridos faz-se segundo o processo seguinte:

- Com os oligossacaridos provenientes da hidrólise da agarose, prepara-se por via est^eril um meio de

cultura sólido sintético. A superfície deste meio, isolam

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-se variedades mixoides de bactérias conhecidas para produzir polissacaridos capsulares. Estas bactérias são numerosas (Pseudomonas, Agrobacterium, Enterobactérias..,). °ode então utilizar-se com vantagem uma bactéria bem conhecida para hidrolisar a agarose Pseudomonas Atlantis e seleccionar variedades mixoides (que têm aspectos mucosos devidos aos polissacaridos).

- Por isolamento e por colénias procuram-se as estirpes capazes de sintetizar um polissacárido cuja estrutura é vizinha da da agarose quer dizer que são procuradas estirpes que são capazes, a partir dos oligossacaridos do meio, de fazer cadeias mais- longas. Estes oligossacaridos, que contêm 2, 3 ou mais unidades de dissacaridos são utilisados como iniciadores. Os microrganismos 'capazes de alo_n gar as cadeias fazem-no com o auxílio da hexose transferase (enzima que alonga as cadeias adicionando hexose epés hexose). Podem extrair-se as hexoses transferases dos microrganismos e faze-las funcionar in vitro segundo processos conhecidos em enzimologia, Hexoses transferases específicas das ligaçães (l—>3) e (l—>4) alongam as cadeias segundo processos de polimerização conhecidos em biologia.

A alternância das formas D e L galactose e das ligaçães (l—+ 3) e (l—> 4) é obtida fazendo actuar sobre os oligossja caridos A-B uma (l —rl· 3) fi -D-galactose transferase e sobre os oligossacaridos B-A uma (l—£4) θ( -L-galactose transferase.

Se bem que este isolamento seja relativamente loji go, mesmo partindo de bactérias marinhas, ele é relativamejg te facilitado porque se procura um polissacárido insolúvel em água fria ou mesmo a 5QSC. Podem portanto lavar-se centenas de colénias para não reter senão aquelas que formam uma massa insolúvel.

E assim possível isolar estirpes microbianas boas

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-12produtoras e melhora-las por transferência genética.

As bactérias capazes de sintetisar poligalactanas próximas da agarose a partir dos oligossacaridos desta agarose podem também fazer esta síntese a partir de oligos. sacaridos provenientes de outras matérias primas.

C pois vantajoso escolher matérias primas que contêm jâ D e L galactose. Os produtos naturais baratos contendo estas hexoses são numerosos: por exemplo, algas não produtoras de agar, como os fucus que contêm fuconases (sequências de 6-desoxi-D-galactcse e de 6-desoxi-L-galactose ou D e L-fuccse), assim como as algas produtoras de agar-agar, separa-se então o agar-agar formado segundo estes processos habituais e utiliza-se o resto (habitualmente posto no refugo) para fazer PGS-O.

A transformação do 6-desoxí-D-galactose ,e do 6-desoxi-L-galactose em D-galactose e em 3,6-anidro-L-galaç. tose é obtida por via química e biológica, segundo um processo conhecido.

Além das algas, o número de organismos terrestres (vegetais e microrganismos) que produzem sequências de D e L-galactose ou derivados da galactose (pectinas) é considje râvel. A escolha da matéria prima depende portanto da re gião geográfica ou da natureza da indústria.

Só as sequências em que alternam L e D galactoses são para reter. Além das algas produtoras de agar-agar, podem utilizar-se, por exemplo, algas não produtoras de agar-agar (fucus que crescem onde não há algas que dão agar-agar) e modificar, quimicamente, as sequências de maneira a fazer alternar as L e as D galactoses.

0 processo de fabrico industrial da poligalacta62 400

,/

na de síntese-óxido vai agora ser descrito com detalhe, com referência à figura 2 do desenho esquemático anexo, so bre a qual (2) representa o recipiente de preparação, (3) uma membrana porosa, (4) um leito de óxidos metálicos, (5) o meio nutritivo que contêm os oligossacaridos ou precurs_o res e (ó) a poligalactana de síntese-óxido obtida.

Prepara-se uma solução estéril dos oligossacaridos, por exemplo uma suspensão a 10^ do resíduo duma alga produtora de agar-agar, da qual o agar-agar foi já extraído e adicionam-se os factores de crescimento bacterianos necessários (fonte de azoto, vitaminas, hidrolizado de caseína a 0,2/...). Nesta solução (5) faz-se cultivar através da membrana porosa, segundo os processos conhecidos de cultura sobre membrana, as bactérias capazes de produzir poligalactana. Sobre esta membrana (3) são espalhados pós finos de óxido de alumínio (Al^O-^ neutro para cromatografia) e de titânio (TiC^) sobre os quais são fixados os iniciadq res. 0 conjunto forma um leito (4) onde as bactérias cultivam aderindo aos grãos de óxidos. As cadeias de oligossja caridos alongam-se progressivamente e formam uma toalha con tínua (6) que encerra óxidos e bactérias.

Periodicamente, a toalha (ó) é recolhida, autoclavada para matar as bactérias e destruir as actividades enzimâticas. A poligalactana formada, sendo insolúvel na água fria, é lavada. Sé a parte insolúvel é conservada, enxugada e obtém-se urn produto pastoso. Esta pasta ê tratada pelo álcool metílico e seca a alta temperatura (1402C) em condiçães de pH muito estritas para favorecer as formações de ligaçães hidrogénio sobre filmes de politetrafluoroetileno. Sobre estes filmes, ao secar, as poligalactanas formam uma película que não deve ultrapassar um centésimo de milimetro de espessura.

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-14Segundo a temperatura da cultura, o PH, a fonte de azoto, a origem dos polissacaridos, os tempos de cresci mento... as cadeias são mais ou menos longas. Ligadas aos óxidos, as cadeias formam uma trama cuja dureza aumenta com o seu comprimento e o seu grau de ligação.

Quando as cadeias são muito longas, podem-se eli rninar os óxidos e obter geles transparentes.

A definição de todos os parâmetros permite definir poligalactanas muito reprodutivas.

A presença de grãos de óxidos aos quais as cadeias de PGS estão ligadas confere ao gele uma porosidade maior do que a do agar-agar natural, mas a trama fica imperme_á uel ãs bactérias. Só as substâncias químicas utilizadas nos meios de cultura aí se difundem mais depressa, o que constitui uma vantagem para a preparação destes meios.

Pode-se por outro lado estimar qus quanto mais curtas são as cadeias de PGS-O:

mais elas são fáceis d/obter portanto pouco onerosas; mais baixo é o ponto defusãoj mais frágil é o gel;

mais é preciso, de PGS-0 matéria seca, para obter um gel sólido;

maior deve ser a proporção de óxidos para ter um gel sólido ;

maior é a porosidade.

Inversamente, quanto maiores forem as cadeias

PGS-O:

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?:wⁿ*4

mais difíceis de obter elas são, portanto, mais onerosas são;

mais reduzidas poderão ser as quantidades de óxidos, o que tem por vantagem aclarar o gel e torna-lo quási trans. parente.

Em teoria, os geles compostos de longas cadeias de poligalactanas e tornados transparentes podem ter as mesmas qualidades da agarose (mas isto em detrimento do preço de revenda).

A quantidade de PGS-0 por litro, a proporção dos óxidos no PGS-O, o comprimento estimado das cadeias de poligalactana, permitem obter toda uma gama de qualidades conveniente para aplicações diferentes, e á possível predeterminar segundo o quadro a seguir, no qual W 6 o peso de PGS e x, y e z os pesos respectivos dos diferentes óxidos

(p. ex.,	x = peso de	Al^O^, y	= peso	em Ti0₂ e	z = peso	em
Si0₂)
Qualidades do PGS-0
W	60	60	84	66	30
X	20	18	2	17	30
y	20	20	10	16	30
z	0	2	4	1	10
	A aplicação	da substância	gelificante	segundo	a
invenção	â realização	de meios	de cultura vai agora ser	des.

crita com o auxílio dos exemplos seguintes, que a ilustram sem a limitar.

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osoo

. DCZ stoveo»

-16EXCMPLO 1. Preparação duma caixa de Petri contendo um meio de MAC CONKEY

Fórmula por cento:

-PGS-0 66.17.16.01 33,62

quer dizer:

66	9	de	PGS
17	9	de	ai₂0₃
16	9	de	TiO₂
1	9	de	Si0₂

- Peptona 36,34

- Sais biliares 2,72

- Cloreto de sódio 9,08

- Lactose 18,17

- Vermelho neutro 0,052

- Cristal violeta 0,018

. Verter uma dose estéril deste meio, quer dizer 1,376 g em 25 ml de água destilada estéril.

- Levar a 80SC durante 1 minuto.

- Deitar numa caixa de Pétri de 9 cm de diâmetro.

- Deixar solidificar; o meio está então pronto para ser utilizado.

Resultados

- Meio opaco rosa salmão claro.

- As colónias lactose + são encarnadas.

- As colónias lactose - são amarelas.

- Só as enterobactérias se desenvolvem

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-17Em relação a um meio de MAC CONKEY em agar-agar natural, os resultados são os mesmos mas as colónias são mais visíveis sobre o fundo opaco qualquer que seja o seu tamanho.

EXEMPLO 2. Preparação de meio com dupla camada

Podem preparar-se meios constituídos por dois geles PGS-0 de qualidades diferentes, sobrepostas.

IS. caso

Deita-se uma primeira camada espessa, porosa, absorvente e pouco dispendiosa que serve de reserva de água e de elementos nutritivos com PGS-0 30.30.30.10., quer dizer:

Camada A	30,-	de	PGS
	30/	de	ai₉o₃
	30,'	de	Ti0_n z.
	10,'	de	CaHPO, 4
Deita-se por cimí	3 uma camada muito	fina de 1

mm de um PGS-0 muito densa, translúcida mas dispendiosa para obter belas colónias: PGS-0 96,02.02, quer dizer:

Camada 0	96/	de	PGS
		de	ai_?o₃
	2/	de	tío₂

Podemos no entanto substituir a camada superior translúcida por uma camada de agarose muito pura.

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ií*

-180 conjuntc faz uma economia em relação a um. meio constituído unicamente por agar-agar (aplicação para a cul tura de plantulas onde são necessários quilos de meio).

29. caso

Deita-se uma primeira camada que dá um gel firme e nutritivo (camada A.) que á fundida, a. 1002C.

- Apás gelificação, deita-ss uma segunda camada dum gel con! ponto de fusão o mais baixo possível, por exem

60QC (camada B)	e contendo glóbulos vermelhos.
Camada .^f	i Camada B
PGS	66	40 - fibras curtas
ai₉o₃	17	30
tíc₂	16	30
sío₂	1	-

Realiza-se assim uma economia, sobre o produtc mais caro: os glóbulos vermelhos e facilidade de execução porque os glóbulos vermelhos são muito sensíveis ao calor.

EXEMPLO 3

Os PGS-0 contendo as cadeias de PG5 muito curtas e certas proporções de óxidos metEalicos, formam geles onde as substâncias químicas difundem mais rapidamente que no agar-agar. Estes geles são suficientemente sólidos par permitirem a cultura em superfície das bactérias ou dos mi· crorganismos. Podem realizar-se com eles meios de cultura em contínuo:

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-19seja, deitando o gel sobre um suporte contendo estes meios nutritivos, por exemplo um papel mata-borrâo impregnado de substâncias secas. A dissolução e s fusão das substâncias faz-se muito rapidamente;

seja, deitando o gel sobre urn suporte poroso como um papel mata-borrâo cu um suporte poroso recuperável (por exemplo ern aço inox aglutinado) impregnado em seguida de substâncias nutritivas, o que permite, se se renovar esta impregnação, realizar culturas continuas de colónias de microrganismos e em particular de plântulas. Este processo é muito vantajoso para a pesquisa de mutantes bacterianos ou vegetais.

As vantagens da nova substância gelificante segun do a invenção ressaltam bem do que ficou ditoj podemos resumi-las assim:

0 PGS-Q, que ê solúvel como os pós nutritivos sem ser autoclavado, permite acondicionar, num mesmo recipiente estóril e manipulável esterilmente, uma quantidade desejada de meio de cultura (pó estéril de substâncias nutritivas).

Visto que ele é fabricado por síntese, as suas ca racterísticas físico-químicas sâo mais féceis de dominar; permite portanto a fabricação de meios de cultura melhor de finidos e melhor normalizados.

No estado seco, absorve as substâncias nutritivas do meio â sua superfície (por causa da possibilidade de se apresentar sob a forma de pequenas palhetas pulverulentas). Isto permite acondiciona-lo directamente misturado com as substâncias nutritivas dos meios de cultura, seja sob a foj? ma duma mistura de pós estéreis num pacote, seja sob a forma de granulados ou de comprimidos, seja sob a forma duma mistura de pós, de granulados ou de comprimidos num mesmo pacote.

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0 microbiologista pode assim armazenar à tempera tura ambiente e durante um tempo muita longo (superior a um ano) uma variedade muito grande de meios de cultura secos, que pode preparar em alguns minutos e sem nenhuma pejç da em função das suas necessidades.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo de preparação de uma subst&ncia geli ficante caracterizada por esta ser constituída essencialme_n te por cadeias embaraçadas e relativamente curtas de poligalactanas não ramificadas, onde alternam as formas D e L, reunindo grãos de óxidos metálicos, óxidos e poligalactanas formando assim reunidos um complexo e não uma simples mistu, ra.
2 - Processo de preparação de urca substância geli. ficante segundo a reivindicação 1, caracterizada por os óx,i dos metálicos serem escolhidos entre os óxidos de alumínio, de silício e de titânio.
3 - Processo de preparação de uma substância geli, ficante segundo as reivindicações 1 e 2, caracterizada por a proporção de óxidos metálicos em relação às poligalactanas ser inversamente proporcional ao comprimento das cadeias de poligalactanas ou ao seu peso molecular e situar-se entre 10 e 80%.
4 - Processo de preparação de uma substância geli, ficante segundo uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada por ela ser compatível com a granulação e a co,m pressão e favorecer estes dois processos.

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5 - Processo de preparação de uma substância geli ficante segundo as reivindicações 1 a 4, caracterizada por, no estado seco, formar películas de menos de um centésimo de milímetro de espessura.
6 - Processo de preparação de uma substância geli ficante segundo qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por dar soluções em água desde S02C.
7 - Processo de preparação da substância gelificante segundo uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se utilizarem microrganismos productores de e.n zimas para sintetisar, a partir de oligossacaridos provenientes de matérias primas contendo já D e L galactoses, um esqueleto de poligalactana não ramificada onde alternam as formas D e L, sendo a cultura dos citados microrganismos efectuada através de uma membrana porosa sobre a qual são espalhados pós finos de óxidos metálicos.
8 - Processo segundo a reivindicação 7, caracterizado por os microrganismos serem primeiro que tudo isola dos a partir de oligo-sacaridos provenientes da hidrólise da agarose.
9 - Processo de aplicação da substância gelificante segundo uma qualquer das reivindicações 1 a 6 à re_a lização de meios de cultura.
10 - Processo de aplicação segundo a reivindicação 9, caracterizado por os meios de cultura serem prepara dos sob a forma de doses unitárias.