PT708093E

PT708093E - Quinoxalina processo para a sua preparacao e sua utilizacao

Info

Publication number: PT708093E
Application number: PT95116094T
Authority: PT
Inventors: Rosner Dr Manfred; Riess Dr Gunther; Irvin Winkler; Uta-Maria Billhardt-Troughton; Kirsch Dr Reinhard; Kleim Dr Jorg-Peter; Meichsner Dr Christoph
Original assignee: Aventis Pharma Gmbh
Priority date: 1994-10-19
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 2001-06-29
Also published as: NZ280258A; SI9500329A; IL115641A0; BR9504456A; PL184860B1; DK0708093T3; KR960014108A; ES2154311T3; ATE198747T1; TW328954B; FI954946A0; HU9503005D0; CN1135483A; SK128495A3; DE4437406A1; FI954946A; EP0708093B1; HUT73485A; JPH08225544A; NO954139D0

Description

DESCRIÇÃO "QUINOXALINA, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E SUA UTILIZAÇÃO" 0 objecto da presente invenção é a quinoxalina, processo para a sua preparação e sua utilização como virusestático, em especial no tratamento de infecções causadas pelo "Hurnan Immunodeficiency Virus" (HIV).

No requerimento de patente europeia EP-509398-A descrevem--se derivados de quinoxalina para esta aplicação.

Verificou-se agora, de forma surpreendente, que um grupo particular de quinoxalinas substituídas de fórmula I

H

bem como a suas formas tautoméricas de fórmula geral

bem como os seus sais ou pró-medicamentos fisiologicamente aceitáveis, apresentam uma acção antiviral, em especial 1

contra retrovirus, como por exemplo o "Human Immunodeficiency vírus" (HIV).

Nos compostos de fórmula I ou Ia de acordo com a invenção: n significa zero ou um, R1 é flúor, cloro, hidroxi, - alcoxi-Ci-C3, R2 é alquilo Ci-C4, eventualmente substituído com hidroxi, alcoxi-Ci-CU ou alquil-Ci-C4-tio R3 é alquil-Ci-C4-oxicarbonilo ou alquenil-C2-C4-oxicarbonilo, X é oxigénio ou enxofre

Num grupo ainda mais preferido de compostos de fórmula I ou Ia: 3) n é zero ou um, R1 é flúor, cloro, metoxi, etoxi propoxi, R2 é metiltiometilo, etilo, propilo, alquilo-Ca-C2 substituído com hidroxi ou alcoxi-Ci-C4, R3 é alquil-Ci-C4-oxicarbonilo ou alquenil-C2-C4-oxicarbonilo, X significa oxigénio ou enxofre.

Um significado muito especial têm os compostos de fórmula I ou Ia como acima descrito, em que os substituintes referidos têm o significado: 2 4) n é zero ou um, R1 é flúor, cloro, metoxi, etoxi, R2 é metiltiometilo, etilo, propilo, alquilo-Cx-Ca substituído com hidroxi ou alcoxi-Ci-C4, R3 é alquil-C-,-C4-oxicarbonilo ou alquenil-C2-C4-ox.icarbonilo, X significa oxigénio ou enxofre.

Um significado muito especial tem o composto 5-4-isopropoxicarbonil-6-metoxi-3-(metiltiometil)-3,4-dihidroquinoxalina-2(1H)-tiono (Ex. 85). Os compostos de fórmula I e Ia têm um átomo de carbono assimétrico.

Verificou-se agora, de forma surpreendente, que os compostos de acordo com a invenção têm um efeito antiviral nitidamente aumentado, inesperado. Verificou-se ainda que os enantiómeros puros são nitidamente mais facilmente solúveis do que os compostos racémicos correspondentes. Estes existem como racemato puro, isto é como compostos 1:1 de ambos os enantiómeros, com propriedades físicas individuais.

Como consequência, os enantiómeros puros são muito melhor absorvidos após administração oral a animais de pesquisa. Este constitui um pressuposto importante para o desenvolvimento de um novo medicamento. É, além disso, conhecido que para se obter uma acção farmacológica ou quimioterapêutica forte possível é de extrema importância alcançar níveis sanguíneos elevados.

Tendo em conta o facto de com muitos virusestáticos potenciais contra o HIV não se conseguir atingir um nível sanguíneo suficiente para impedir a replicação de vírus, devido à sua baixa biodisponibilidade por administração oral, 3 \

os compostos de acordo com a invenção constituem um meio antiviral eficaz e portanto um proqresso terapêutico.

Os enantiómeros puros dos compostos de fórmula I e Ia podem ser preparados directamente por métodos conhecidos, ou por analogia a métodos conhecidos, ou separados posteriormente.

Os compostos de fórmula I e Ia podem ser preparados por métodos conhecidos ou modificações destes (veja-se, por exemplo EP-509398-A, Rodd's Chemistry of Carbon Compounds,S. Coffey, M. F. Ansell (editor); Elsevier, Amsterdão, 1989; Vol. IV Parte IJ, Pag 301 a 311. Heterocyclic Compounds, R.C. Elderfield (editor); Wiley, Nova Iorque, 1957; Vol. 6, pag 491 a 495).

Outro objecto da presente invenção é ainda um processo para a preparação de compostos de fórmula I e Ia como descrito acima em 1) a 4), caracterizado por:

A) se transformar, para a preparação de compostos de fórmula I em que X é oxigénio e os resíduos R1, R2 e R3 são como definido em 1) a 4), um composto de fórmula II

(II)

em que R1 e R2 são como definido em 1) a 4), com um composto de fórmula III R3-Z (III) 4 7 em que R3 tem o significado indicado em i) a 4) e Z é um grupo rejeitado, como por exemplo cloro, ou B) se prepararem compostos de fórmula I, em que X é enxofre e R1, R2 e R3 são como definido em 1) a 4), por reacção de um composto de fórmula I, em que X é oxigénio e R1, R2 e R3 são como definido em 1) a 4), com um reagente de sulfuraçáo.

No método A).acima descrito, a transformação é realizada de preferência com um éster alquílico alquenílico de ácido-halogenofórmico ou, um carbonato de dialquilo ou dialquenilo ou um éster dialquilico ou alquenílico de ácido pirocarbónico. 0 substituinte Z na fórmula III é assim um grupo rejeitado adequado, como por exemplo cloro, bromo ou iodo, um resíduo de alcoxi ou alqueniloxi ou um grupo alcoxi-ou alqueniloxicarboniloxi. De preferência, Z é cloro. A transformação é realizada, de forma conveniente, num solvente inerte. São adequados, por exemplo, hidrocarbonetos aromáticos como o toluol ou xilol, álcoois inferiores como o metanol, etanol ou 1-butanol, éter como tetrahidrofurano ou éter glicoldimetilico, solventes apróticos dipolares como a N,N-dimetilformamida, N-metil-2-pirrolidona, acetonitrilo, nitrobenzol, dimetilsulfóxido ou misturas destes solventes. Também se podem utilizar sistemas de duas fases com soluções aquosas de bases, na presença de um catalizador de transferência de fases, como por exemplo cloreto de benziltrietilamónio. A presença de uma base adequada, por exemplo carbonato ou hidrogenocarbonato de um metal alcalino ou alcalino-terroso, como carbonato de sódio, carbonato de cálcio ou bicarbonato de sódio, um hidróxido de um metal alcalino ou alcalino-terroso, como hidróxido de potássio ou hidróxido de 5

bário, um alcoolato como etanolato de sódio ou terc-butilato de potássio, um composto orgânico de litio, como butil-lítio ou lítiodiisopropilamida, um hidreto de um metal alcalino ou alcalino-terroso como hidreto de sódio ou hidreto de cálcio, um fluoreto de metal alcalino como fluoreto de potássio ou uma base orgânica como a trietilamina, piridina, 4-metilpiridina ou 4-(dimetilamino)piridina para neutralização do ácido libertado pela reacção, pode ser útil.

Nalguns casos, é necessária a adição de um sal de., iodo, por exemplo iodeto de potássio. A reacção é realizada normalmente a temperaturas entre -10 e 160 °C, de preferência à temperatura ambiente.

Para esta transformação, os substituintes nucleófilos como, por exemplo, grupos hidroxi, mercapto ou amino com a excepção da posição-4 em compostos de fórmula II para a realização da reacção, são derivatizados de forma adequada ou são providos de grupos protectores usuais, cindiveis como, por exemplo, acetilo, benzilo, tritilo, tetrahidropiranilo ou terc-butoxicarbonilo.

Para a transformação como anteriormente descrito em B) , utiliza-se de preferência como reagente de sulfuração 1,3--ditia-2, 4-difosfetan-2,4-dissulfureto 2,4--Bis (4-metoxifenilo) (reagente de Lawessons), sulfureto de Bis(triciclohexilestanho), sulfureto de Bis(tri-n--butilestanho), sulfureto de Bis (trifenilestanho), sulfureto de Bis(trimetilsililo) ou pentassulfureto de fósforo. A reacção é adequadamente realizada num solvente orgânico ou numa mistura de solventes orgânicos, de -10 a 120 °C, de preferencia desde a temperatura ambiente a 60 °C e possivelmente em condições isentas de água. São adequados, por exemplo, sulfureto de carbono, toluol, xilol, piridina, diclorometano, 1-2-dicloroetano, tetrahidrofurano, éster 6

etílico de ácido acético ou éster butilico de ácido acético. Utilizando o snlfureto de estanho ou de sililo mencionado realiza-se a reacção de sulfuração na presença de um ácido de Lewis, como o tricloreto de boro. A presença de um grupo carbonilo no resíduo R3 nos compostos de fórmula I não prejudica a sua menor reactividade, sendo possível uma sulfuração selectiva.

Os materiais de partida necessários para as sínteses descritas de quinoxalina de fórmula geral II são conhecidos na literatura, ou podem ser preparados a partir de métodos conhecidos, como por exemplo, os processos descritos no pedido de patente EP-509398-A.

Também são objecto da presente invenção os compostos descritos em 1) a 4) como medicamentos, de preferência para o tratamento de doenças virais, em especial de doenças causadas por HIV. A invenção refere-se também a medicamentos contendo pelo menos um composto de acordo com a invenção, bem como a utilização dos compostos referidos para a preparação de medicamentos, de preferência para o tratamento de doenças virais, em especial para o tratamento de doenças causadas pelo HIV.

Constitui também um objecto da presente invenção a utilização de compostos da fórmula I ou Ia acima referidas, para a preparação de medicamentos para o tratamento de doenças virais.

Para esta utilização preferem-se os compostos referidos e pormenorizados em 1) a 4). 7

Os medicamentos de acordo com a invenção podem ser administrados por via entérica (oral), parentérica (intravenosa), rectal, subcutânea, intramuscular ou local (tópica).

Podem ser administrados na forma de soluções, pós (comprimidos, cápsulas, incluindo microcápsulas), pomadas (cremes ou geles) ou supositórios. Como adjuvantes para as diversas·'· formulações podem-se referir os agentes farmacêuticos normais, de enchimento e disp-ersantes, solventes, emulsionantes, lubrificantes, correctores de sabor, corantes e/ou substâncias tampão, líquidos ou sólidos.

Como dosagens adequadas administram-se 0,1 a 10, de preferência de 0,2 a 8 mg/kg de peso corporal uma ou mais vezes por dia. As dosagens utilizadas regem-se adequadamente pela farmacocinética da substância utilizada ou pela preparação galénica. A dosagem utilizada dos compostos de acordo com a invenção é de por exemplo 1 a 1500 mg, de preferência de 50 a 500 mg.

Os compostos de acordo com a invenção podem também ser administrados em combinação com outros meios antivirais, como por exemplo análogos de nucleósidos, inibidores de proteínas ou inibidores de adsorsão, imunoestimuladores, interferões, interleucinas e factores estimuladores de colónias (por exemplo, GM-CSf, G-CSF, M-CSF).

Como enantiómcros puros consideram-se os compostos em que a proporção de enantiómeros é de pelo menos de 95:5, de preferência pelo menos 97:3. 8

A invenção será melhor explicada, através dos exemplos seguintes, hem como pelo conteúdo das reivindicações.

Exemplo 1: N-(5-flúor-2-nitrofenil)-S-metil-L-cisteina 16 g de (-)-S-metil-L-cisteina (0,1 mol) são suspendidos numa mistura de 120 ml de água e 120 ml de acetona num balão de quatro tubuladuras sob N2. Adicionam-se rapidamente 30,4 ml (22,2 g) de trietilamina (0,22 mol) sob agitação. Adicionam-se à solução amarela resultante-, -sob agitação, 15,9 g de 2,4-dilfuoronitrobenzol (0,1 mol).

Sob agitação, aquece-se durante 7,5 horas até ao refluxo (solução alaranjada), remove-se a acetona num evaporador rotativo sob pressão reduzida e o sedimento aquoso é introduzido numa ampola de separação e extraído 2x com ca. 50 ml de éter metil-terc-butílico (éter MTB) . Este extracto consistia essencialmente de 2,4-difluoronitrobenzol e foi desprezado. A fase aquosa é vazada para um balão de quatro tubuladuras, misturada com 150 ml de éter-MTB e, sob arrefecimento (< 25 °C), acertada para pH 1 com cerca de 25 ml de ácido sulfúrico a 38%. Agita-se até se obter uma fase clara. A fase éter é removida e a fase aquosa é extraída mais uma vez com 50 ml de éter-MTB.

Os extractos são secos sobre sulfato de sódio e evaporados num evaporador rotativo. Obtêm-se 27 g de um óleo amarelo, o qual solidifica de imediato, p.f. 147° (em água/metanol) MS: ionização química, (M+H)+ = 275 Análise calculado encontrado c 43, 8¾ 43, 0% H 4, 0% 4,1% N 10,2% 10, 0% S 11, 7% 11,3% 9

Exemplo 2: N- (5-metoxi-2-nitrofenil)-S-metil-L-cisteína

Dissolvem-se 27 g de N-(5-flúor-2-nitrofenil)-S-metil-L-cisteína, (0,1 mol) do exemplo 1 num balão de quatro tubuladuras em 150 ml de metanol absoluto e sob agitação vigorosa, argon e arrefecimento por meio de banho de gelo em 20 minutos, adiciona-se, em porções, 14,4 g de etilato de sódio a 95% (0,25 mol). Aquece-se até ao refluxo, sob agitação durante 2 'horas.. Após o controlo-DC a reacção é finalizada. - A maior parte do metanol é removido num evaporador rotativo sob pressão reduzida. O sedimento é adicionado a 200 ml de água gelada e acertado para pH 1 com ca. 25 ml de ácido sulfúrico a 38% e agitado com 150 ml de éter-MTB. A fase éter é removida e a fase aquosa é mais uma vez extraída com 30 ml de éter-MTB e agitada sob pressão reduzida.

Resultado: 21,5 g de um óleo castanho-avermelhado que cristaliza lentamente. MS: ionização química, (M+H)* = 287

HPLC: 99,3% de enantiomero-R

Análise calculado encontrado 47,3% 5, 6% 9,1% 10, 6% C 46,2% H 4,9% N 9,8% S 11,1%

Exemplo 3

R-6-metoxi-3- (metiltiometil)-3,4-dihidroquinoxalina-2(1H)-ona Dissolvem-se 20,7 g do composto do exemplo 2 (0,065 mol) em 250 ml de metanol e hidrata-se sob argon, com 0,5 ml de ácido acético glacial e ca. dc 20 g dc Níquel de Raney sob pressão normal à temperatura ambiente. Quando após a DC não se detecta mais material de partida a hidratação está acabada. O 10

sobrenadante é aspirado sob atmosfera de azoto e lavado com 100 ml de metanol. 0 sedimento do filtro, incluindo o catalizador é agitado sob atmosfera de azoto com dimetilformamida (DMF) a 45 a 60 °C e em seguida novamente aspirado através de uma camada clarificadora. A solução de DMF que contém o produto é deixada a agitar em 1 1 de água gelada a que se adicionam 2 g de ácido ascórbico como antioxidante. Obtém-se o produto na forma dé cristais amarelo claro. Aspira-se, lava-s.e.,comj;.ca. 2 1 de água, em seguida com 500 ml de etanol e em seguida com 300 ml de pentano e seca-se sobre pentóxido de fósforo. Obtêm-se 10,8 g, mais 1,3 g podem ser recolhidas por concentração do filtrado. P.f. 186 a 187 °c, sólido amarelo-acinzentado aH RMN (200 MHz, d6-DMSO) S = 2,08 (s, 3H, SCH3) , 2,75 (dqAB, 2H, -CH2-S), 3,65 (s, 3H, MeO) , 3,95 (m, 1H, CH) , 6,05 (br, s, NH), 6,1-6,7 (m, 3H, aromático), 10,15 (s, 1H, amida), MS:Ionização química (M+H)+=239

HPLC: 97,5% de pureza, 98,2% de enantiómero-S rotação óptica [a]»22 = - 42 °C (c=l em acetona) Análise calculado encontrado C 55, 5% 55,2% H 5, 9% 5, 8% N 11,8% 11,7% S 13, 4% 13, 3% Por meio de um processo análogo, obtém-se:

Exemplo 4 R-6-etoxi-3-(metiltiometil)-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona A partir do composto do exemplo 1 com etilato de litio em etanol e redução e fecho de anel em analogia com o exemplo 2 MS: Ionização química, (M+H)+ = 253 11

λΛ'· !Η RMN (200 ΜΗζ, d6-DMSO) : grupo etoxi δ = 1,27 (t, 3Η) , 3,87 (q, 2Ι-Ι) .

Exemplo 5 R-3- (metiltiometil)-6-propoxi-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona a partir do composto do exemplo 1 com propilato de sódio em propanol. P.f. resina, MS: ionização química, (M+H)+ = 267 *Η RMN (200 MHz, dê-DMSO) : grupo propoxi δ = 0,95 (t, 3H) , 1,67 (q, 2H) , 3,79 (t, 2H) .

Exemplo 6 R-3- (metiltiometil)-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona Utilizando 2-fluornitrobenzol em vez de 2,3- difluornitrobenzol no exemplo 1 P.f. 109 °C, MS: Ionização química, (M+H)+ = 208 Exemplo 7 R-6-fluor-3-(metiltiometil)-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona Utilizando directamente o composto do exemplo 1 nas reacções de redução-e de fecho de anel de acordo com o exemplo 3. P.f. 149 °C, MS: Ionização química, (M+H)+ = 243

Exemplo 8 R-6-cloro-3-(metiltiometil)-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona Utilizando o composto 2,4-dicloronitrobenzol em vez de 2,4-difluoronitrobenzol no exemplo 1 e com hidróxido de sódio e éter glicolmonometílico à temperatura de refluxo P.f. 149 °C, MS: Ionização química, (M+H)+ = 243

Procedendo como descrito para os exemplos 1 a 8, utilizando por exemplo outros aminoácidos, podem-se obter os compostos de fórmula II correspondentes em que o substituinte-α do aminoácido utilizado é substituído em R2 na fórmula II: 12

Tabela 1 Η

Η

Exemplo Ν° R^n R* P. f. °CT 9 Η (η = 0) C2H5 Óleo 10 Η (η = 0) C3H7 Resina 11 Η (η = 0) c4h9 Óleo 12 Η (η = 0) H0-CH2 82 13 6-C1 C2H5 120 14 6-C1 C3H7 75-77 15 6-C1 c4h9 óleo 16 6-F C2H5 93 17 6-F C3H7 Resina 18 6--F H0-CH2 134 19 6-CH30 C2H5 óleo 20 6-CH3O C3H7 138 21 6-CH3O C4H9 22 6-CH3O H0-CH2 125 Zers. 23 6-CH3O CH3CH(0H)- 156 24 6-CH3O CH30-CH2 167 25 6-C2H5O C2H5 26 6-C2H5O C3H7 27 6-C2H5O CH30-CH2

Exemplo N° R1!» -i2 P.f. °c 28 6-C3H7O C2H5 28a 6-OH CH3SCH2 146

Exemplo 29: S-4-isopropoxicarbonil-6-metoxi-3- (metiltiometil)-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona

Suspendem-se 11,9 g (0,05 mol) do composto do exemplo 3 em 300 ml de cloreto de metileno, sob azoto. Sob agitação, adicionam-se rapidamente 7,0 g de 4-metilpiridina (0,075 mol) como base. Em seguida, adicionam-se, gota a gota, 60 ml de uma solução 1 molar de éster isopropílico de ácido clorofórmico em toluol (0,06 mol), em 30 minutos, à temperatura ambiente. A suspensão transforma-se lentamente em solução. Após o controlo DC, a reacção termina após 4 a 6 horas à temperatura ambiente. A solução é acidificada com ácido sulfúrico 2N, a fase orgânica é removida, a fase aquosa é extraída mais uma vez com 50 ml de cloreto de metileno. Após a evaporação do solvente sob pressão reduzida, permanece um produto semi-sólido que após agitação em éter diisopropilico cristaliza.

Obtêm-se: 15,0 g, p.f. 115 °C TH RMN (200 MHz, d6-DMSO):ô = 1,3 (2d, J=7 Hz, 6H, 2 isopropil-CH3 ), 2,1 (s, 3H, SCH3), 2,35 + 2,7 (dqAB, 2H, CH2- S), 3,73 (s, 3H, MeO), 4,87 (q, 1H, CH), 4,97 (m, J= 7Hz, 1H, Isopropil-CH) , 6,7-7,25 (m, 3H, aromático), 10, 65 (s, 1H, Amida) MS:Ionização química, (M+H)+= =325 HPLC: 98% de pureza, 99,9% de enantiómero-S Rotação óptica: [<x]22D=39° (c = 1 em metanol) Análise calculado encontrado C 55,6% 55,5% - 14 - V. H 6,2% 5,8% N 8, 6% 8,4% S 9, 8% 9,7%

Através de um processo análogo ao do exemplo 29, podem-se obter os compostos seguintes de fórmula I com X = 0, utilizando, por exemplo, os compostos de fórmula II, como descritos, por exemplo nos exemplos 3-28, por transformação dos compostos de fórmula III correspondentes:

Tabela 2

Exemplo N° i3— P.f. °c 30 H (n = 0) C2H5 COOCH(CH3)2 163 31 H (n = 0) C3H7 COOCH(CH3)2 117 32 H (n = 0) C4H9 COOCH(CH3)2 120 33 H(n = 0) HO-CH2 C00CH(CH3)2 34 H (n = 0) CH3SCH2 COOCH(CH3)2 119 35 6-C1 C2H5 COOCH(CH3)2 145-147 36 6-C1 C3H7 COOCH(CH3)2 37 6-C1 C4H9 COOCH(CH3)2 38 6-C1 CH3SCH2 COOCH(CH3)2 105 39 6-F C2H5 COOCH(CH3)2 123-125 40 6-F C3H7 COOCH(CH3)2 110 15 \) « _/

Exemplo N° R\l RJ P.f. °c 41 6-F C4H9 COOCH(CH3)2 42 6-F CH3SCH2 COOCH(CH3)2 136 43 6-CH3O C2H5 COOCH(CH3)2 Óleo 44 6-CH3O C3H7 COOCH(CH3)2 153 45 6-CH3O C4H9 COOCH(CH3)2 46··..... 6-CH3O HO-CH2 COOCH(CH3)2 - Resina 47 6-CH3O CH3CH(0H)- COOCH(CH3)2 Resina 48 6-CH3O CH3O-CH2 COOCH(CH3) 2 98 49 6-C2H5O C2H5 COOCH(CH3) 2 50 6-C2H5O C3H7 COOCH(CH3)2 51 6-C2H5O CH3O-CH2 COOCH(CH3)2 52 6-C2H5O CH3SCH2 COOCH(CH3)2 112 53 6-C3H7O C2H5 COOCH(CH3) 2 54 6-C3H7O CH3SCH2 COOCH(CH3)2 105 55 H(n = 0) C2H5 COOC(CH3)=CH2 56 H (n = 0) CH3SCH2 COOC(CH3)=ch2 57 6-C1 C2H5 COOC(CH3)=ch2 143 58 6-C1 C2H5 cooch2ch=ch2 122-124 59 6-C1 CH3SCH2 COOC(CH3)=ch2 182 60 6-Cl CH3SCH2 COOC3H7 68 61 6-C1 CH3SCH2 COOC2H5 143 62 6-F C2H5 COOC(CH3)=CH2 125 63 6-F C3H7 COOC(CH3)=ch2 64 6-F CH3SCH2 COOC(CH3)=ch2 65 6-CH3O C2H5 COOC(CH3)=CH2 66 6-CH3O C3H7 COOC(CH3)=CH2 67 6-CH3O CH3O-CH2 COOC(CH3)=CH2 16

Exemplo N° R\i RJ P.f. °c 68 6-CH30 CH3SCH2 COOC(CH3)=CH2 152 70 6-C2H50 C2H5 COOC(CH3)=CH2 71 6-C2H5O C3H7 COOC (CH3) =ch2 72 6-C2HbO CII3O-CH2 COOC(CH3) =ch2 73 6-C2H5O ch3sch2 COOC(CH3)=CH2 74 H(n = 0) C2H5 COOC2H5 75 H (n = 0) C3H7 COOC2H5 76 H (n = 0) ch3sch2 COOC2H5 77 6-C1 c2h5 COOC2H5 78 6-F C2H5 COOC2H5 116 79 6-F ch3sch2 COOC2H5 80 6-CH3O C2H5 COOC2H5 81 6-CH3O ch3o-ch2 COOC2H5 82 6-CH3O CH3SCH2 COOC2H5 83 6-C2H50 C2H5 COOC2H5 84 6-C2H50 CH3SCH2 COOC2H5 84a 6-OH CH3SCH2 COOCH(CH3)2 182 84b 6-OH C2H5 COOCH (CH3) 2 201 84c 6-C1 ch3 COOC2H5 151 84d 6-C1 C4H9 COOC(CH3)=CH2 153 84e 1—1 0 1 KO CH3SCH2 COOC2H5 143 84f 6-C1 CH3SCH2 COOC3H7 68 84g 6-CH30 ch3sch2 COOCH (CH3)-C2H5 86 84h 6-CH30 CH3SCH2 COOCH2CH(CH3) 2 60 84i 6-F ch3 COOCH(CH3)2 151 17 \

Exemplo N° R1n RJ Hl 0 n 84 j 6-F C2H5 COOCH(CH3)-C2H5 Resina 84k 6-F C2H5 COOCH3 50 841 6-F C2H5 COOC4H9 92 84m 6-F C2H5 COOCHz (CH3) 2 90 84n 6-F CH2OH COOCH(CH3)2 Resina 84o 6-F CH30-CH2 C00CH(CH3)z 114

Exemplo 85 S-4-isopropoxicarbonil-6-metoxi-3-(metiltiometil)-3,4-clihidroquinoxalin-2 (1H) -tiona

Dissolvem-se 16,1 g do composto do exemplo 29 (0,05 mol) em 2 00 ml de dimetoxietano seco e misturam-se com 13 g de pentassulfureto de fósforo (0,06 mol) finamente pulverizado, sob argon e com agitação e agita-se à temperatura ambiente. Após 24 horas a transformação ainda não está completa, de modo que se adicionam mais 4 g de pentassulfureto de fósforo. Após 24 horas à temperatura ambiente, agita-se durante mais 3 horas a 30 °C. Para a separação do material sólido aspira-se através de uma camada clarificadora e lava-se mais uma vez com dimetoxietano. Os filtrados reunidos são evaporados sob pressão reduzida. 0 óleo escuro remanescente é recolhido em 250 ml de éter-MTB e agitado com 200 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio. As fases são separadas, a fase aquosa é extraída mais uma vez com 20 ml de éter-MTB. Os extractos orgânicos são secos sobre sulfato de magnésio ou sulfato de sódio e concentrados em balão rotativo. 0 óleo amarelo-acastanhado resultante é dissolvido a quente em 30 ml de éter diisopropílico. Cristaliza por arrefecimento com agitação. Os cristais precipitados são lavados com uma 18

pequena porção de éter diisopropílico e n-pentano e secos num exsicador.

Obtêm-se 91,4 g, p.f. 103 °C RMN (200 MHz, d6-DMSO) :δ = 1,27 (2d, J = 7 Hz, 6H, 2 isopropil-CHs) , 2,1 (s, 3H, SCH3) , 2,34 + 2, 79 (dqAB, 2H, CH2- S) , 3,75 (s, 3H, MeO), 4,97 (m, J= 7Hz, 1H 5,25 (q, 1H, CH) , 6,75-7 , 3 (m, 3H, aromático tioamida) MS:Ionização química, (M+H)+=341 HPLC 99,6% de pureza, 99 ,4% de enantiómero-S' Rotação óptica: [a]22D=18' 3 (c = 1 em metanol) Análise calculado encontrado C 52, 9% 52, 9% H 5, 9% 5, 3% N 8,4% 8,3% S 18, 8% 18, 6% Utilizando um processo análogo ao descrito podem-se preparar os seguintes compostos de fórmula I com X = S, por exemplo utilizando compostos de fórmula I com X = O, como por exemplo se descreve nos exemplos 30 a 84, por transformação com os reagentes de sulfuração correspondentes:

Tabela 3

19

Exemplo N° RXn R" RJ P.f. °c 86 H (n = 0) C2H5 COOCH(CH3)2 114 87 H(n = 0) C3H7 COOCH(CH3) 2 128 88 H(n = 0) C4H9 COOCH(CH3) 2 78 89 H (n = O) HO-CH2 COOCH(CH3) 2 90 H(n = 0) CH3SCH2 COOCH(CH3)2 Óleo 91 6-C1 C2H5 · COOCH(CH3)2 161 92 6-C1 C3H7 COOCH(CH3) 2 93 6-C1 C4H9 COOCH(CH3) 2 94 6-C1 CH3SCH2 COOCH(CH3)2 124 95 6-F C2H5 COOCH(CH3)2 93 96 6-F C3H7 COOCH(CH3)2 60 97 6-F C4H9 COOCH(CH3)2 98 6-F CH3SCH2 COOCH(CH3) 2 122 99 6-CH3O C2H5 COOCH(CH3) 2 74 100 6-CH3O C3H7 COOCH(CH3)2 140 101 6-CH3O C4H9 COOCH(CH3) 2 102 6-CH3O HO-CH2 COOCH(CH3)2 103 6-CH3O CH3CH(OH)- COOCH(CH3)2 104 6-CH3O CH3O-CH2 COOCH(CH3) 2 137 105 6-C2H5O C2H5 COOCH (CH3) 2 106 6-C2H5O C3H7 COOCH(CH3) 2 107 6-C2H5O CH3O-CH2 COOCH(CH3) 2 108 6-C2H5O CH3SCH2 COOCH(CH3)2 Óleo 109 6-C3H7O C2H5 COOCH(CH3)2 110 6-C3H7O CH3SCH2 COOCH(CH3)2 Resina 111 H (n = 0) c2h5 COOC(CH3)=ch2 112 H (n = 0) CH3SCH2 COOC(CH3)=CH2 20

Exemplo N° R° P.f. °C 113 6-Cl C2H5 COOC{CH3)=CH2 170 114 6-C1 C2H5 cooch2ch=ch2 123 115 6-Cl CH3SCH2 COOC(CH3)=CH2 128 116 6-Cl CH3SCH2 cooc3h7 117 6-Cl CH3SCH2 COOC2H5 118 6-F C2H5 C00C(CH3)=CH2 119 6-F C3H7 COOC(CH3)=CH2 120 6-F CH3SCH2 C00C(CH3)=CH2 121 6-CH3O C2H5 COOC(CH3)=ch2 122 6-CH3O C3H7 COOC(CH3)=CH2 123 6-CH3O CH3O-CH2 COOC(CH3)=CH2 124 6-CH3O CH3SCH2 COOC(CH3)=CH2 152 126 6-C2H5O C2H5 COOC{CH3)=CH2 127 6-C2H5O C3H7 COOC(CH3)=CH2 128 6-C2H5O CH3O-CH2 COOCÍCH3)=CH2 129 6-C2H5O CH3SCH2 COOC(CH3)=CH2 130 H(n = 0) C2H5 COOC2H5 131 H (n = 0) C3H7 COOC2H5 132 H (n = 0) CH3SCH2 COOC2H5 133 6-Cl C2H5 COOC2H5 134 6-F C2H5 COOC2H5 Resina 135 6-F CH3SCH2 COOC2H5 136 6-CH3O C2H5 COOC2H5 137 6-CH3O CH3O-CH2 COOC2H5 138 6-CH3O CH3SCH2 COOC2H5 21

Exemplo N° RXn RJ P.f. °c 139 6-C2H5O C2H5 COOC2H5 140 6-C2H5O CH3SCH2 COOC2H5 140a 6-OH CH3SCH2 COOCH(CH3)2 113 140b 6-OH C2H5 COOCH(CH3) 2 Resina 140c 6-C1 ch3 cooch2ch=ch2 144 140d 6-C1 ch3 COOC(CH3)=CH2 149 140e 6-C1 C4H9 COOC(CH3)=CH2 132 140f 6-CH3O CH3SCH2 COOCH(CH3)-C2H5 60 140g 6-CH3O CH3SCH2 COOCH2CH(CH3)2 89 140h 6-F C2H5 COOCH3 146 140i 6-F C2H5 COOC4H9 103 14 0 j 6-F C2H5 COOCH2CH(CH3)2 Resina 140k 6-F C2H5 COOCH(CH3) -c2h5 51 1401 6-F CH30CH2 COOCH(CH3)2 143

Teste de eficácia

Teste de preparados contra HIV na cultura de células Descrição dos métodos Meio: RPMI, pH 6,8 0 meio completo contém 20% de soro fetal de vitela e 40 IU/nl de interleucina 2 recombinante. Células

Faz-se a cultura de linfócitos de sangue de dadores, fresco, isolado por centrifugação em gradiente de Ficoll* , adicionados de 2 g/ml de fitohemaglutinlna (Wellcome) em meio completo, durante 36 horas a 37 °C sob CO2 a 5%. Após adição de DMSO a 10% a uma camada de células de 5 x 106, as células são congeladas e armazenadas em azoto líquido. Para a 22

pesquisa descongelam-se as células, lavam-se em meio RPMI e faz-se a cultura em meio completo, de 3 a 4 dias.

Sedimento

Os preparados de teste são dissolvidos a uma concentração de 16,7 mg/ml em DMSO e diluídos para 1 mg/ml com meio completo. Adicionam-se 0,4 ml de meio a uma placa de 24 poços. Após adição de 0,1 ml do preparado dissolvido à fila superior da placa e por transferência- de cada 0,1 ml obtém-se uma sequência de diluição, geométrica. Os controlos isentos de preparado contêm 0,4 ml de meio completo com 0,5% de DMSO.

As culturas de linfócitos com um número de células de 5 x 106 células/ml são infectadas por adição de 1/50 em volume do sobrenadante de uma cultura de linfócitos infectados com HIV. 0 título deste sobrenadante de cultura foi determinado através da diluição de ponto final com 1-5 x 106 unidades infecciosas/ml. Após 30 min. de incubação a 37 °C os linfócitos infectados são centrifugados e recolhidos em volume igual de meio. Adicionam-se 0,6 ml desta suspensão celular a cada poço da placa teste. Os sedimentos são incubados durante 3 dias a 37 °C.

Avaliação:

As culturas de células infectadas são pesquisadas por microscopia quanto à presença de células gigantes, que apresentam uma multiplicação activa de virus na cultura. A menor concentração de preparado à qual não surgem nenhumas células gigantes, é determinada como a concentração de inibição contra o HIV. Para controlo, avaliam-se os sobrenadantes de placas de cultura quanto à presença de antigénios-HIV, com auxílio de um teste de antigénio-HIV correspondente aos dados do fornecedor (Organon). 23

Resultado: Tabela 4

Composto do exemplo Nr T-teste de cultura de células MHK EC5o (ng/ml) 29 <8 30 <40 31 50 34 <1 35 <80 38 <1 42 <8 43 <1 44 <8 0 52 <8 54 40 57 1 58 10 59 20 60 40 61 2 68 8 85 O 86 1 87 4 88 <4 0 90 <8 91 2 94 <8 95 2 24

Composto do exemplo Nr T-teste de cultura de células MHK EC50 (ng/ml) 99 <1 100 4 108 <5 110 4 113 0, 8 114 1, 6 115 1, 6 124 <8 39 8 40 80 62 80 78 <80 8 4 j 80 84 j <8 0 841 80 84o 80 96 80 98 3 104 8 134 8 140a 40 140b <80 140c 40 140d 10 140f 8 14 Og 40 14 Oh 10 140i 10 140 j 10 25

Composto do exemplo Nr T-teste de cultura de células MHK EC5o (ng/ml) 140k 8 1401 8

Pesquisa das substâncias por inibição da "transcriptase inversa" de HIV. · · A actividade da transcriptase inversa(RT) foi determinada com auxílio de um "Scintillation Proximity Assay" (SPA) . O kit de reagentes para c RT-SPA foi adquirido da Amersham/Buchler (Braunschweig). A enzima RT (de HIV clonado em E. coli) era da firma HT-Biotechnology Ltd, Cambridge, UK.

Sedimento: 0 teste foi realizado de acordo com o protocolo do produtor Amersham, com as seguintes modificações: - adicionou-se ao tampão "teste" albumina de soro bovino na concentração final de 0,5 mg/ml - o teste foi realizado em tubos eppendorf com 100 μΐ de volume de sedimento. - o concentrado RT dos produtores (5000 U/ml) foi diluído em tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,2; 30% de glicerina até uma actividade de 15 U por ml - o tempo de incubação para os sedimentos era de 60 min (37 °C) 26

- Após paragem da reacção e "desenvolvimento" com a suspensão de cintilação, transferiram-se 130 μΐ de sedimento para 4,5 ml de tampão Tris-HCl, 10 mM; pH 7,4; NaCl 0,15 M e contou-se a actividade do trítio num contador-β

Teste de substâncias

Para uma teste prévio da actividade inibidora, testaram-se as substâncias dissolvidas em DMSO (solução mãe c -· 1 mg/ml) , em diluição 10_1, 10~2, 10"3, etc, em DMSO.

Para a determinação dos valores de IC50 as soluções de inibidor foram diluídas em tampão Tris-HCl, 50 mM, pH 8 e testadas nas concentrações adequadas.

Por representação gráfica da actividade de RT versus Log Cir,it, determinou-se a concentração correspondente a 50% de inibição enzimática

Os resultados da pesquisa estão na tabela 5.

Tabela 5

Composto do exemplo Nr Teste de transcriptase inversa IC50(ng/ml) 29 10-100 34 10-100 35 10 38 5 52 10-100 57 10-100 58 10-100 59 18 60 10 61 10-100 27

Composto do exemplo Nr Teste de transcriptase inversa IC50(ng/rnl) 68 16 85 8 86 11 87 27 90 5 91 4 94 15 99 11 100 16 108 8 110 10-100 113 6 114 7 115 10 125 15 39 20 40 10-100 62 92 78 80 84g 118 84i 170 84 j 87 841 150 96 16 98 12 104 134" 35 ...... 3 140a 93 140b 70 140c 110 28

Composto do exemplo Nr Teste de transcriptase inversa IC50(ng/ml) 140d 27 140f 19 140g 17 140h 8 140i 22 140 j 15 140k 16 1401 22

Lisboa, 26 de Março de 2001. y^AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

29

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Compostos de fórmulas I e Ia, H

bem como os seus sais e pró-medicamentos fisiologicamente aceitáveis, em que na fórmula I e Ia: n significa zero ou um, R1 é flúor, cloro, hidroxi, alcoxi-Ci-C3, R2 é alquilo C1-C4, eventualmente substituído com hidroxi, alcoxi-Ci-C4 ou alquil-Ci-Cí-tio R3 é alquil-Ci-C4-oxicarbonilo ou alquenil-C2~C4-oxicarbonilo, X é oxigénio ou enxofre. 1
2. Compostos de fórmula I ou Ia de acordo com a reivindicação 1, caracterj.zado.s por os substituintes nas fórmulas referidas terem os significados: n é zero ou um, R1 é flúor, cloro, metoxi, etoxi propoxi, R2 é metiltiometilo, . etilo, propilo, alquilo-Ci-Cz substituído com hidroxi ou alcoxi-Ci-C4, R3 é alquil-Ca-Ci-oxicarbonilo ou alquenil-C2-C4~ oxicarbonilo, X significa oxigénio ou enxofre.
3. Compostos de fórmulas I ou Ia de acordo com a reivindicações 1 a 2, caracterizados por os substituintes nas fórmulas referidas terem os significados: n é zero ou um, R1 é flúor, cloro, metoxi, etoxi, R2 é metiltiometilo, etilo, propilo, alquilo-Ci-C2 substituído com hidroxi ou alcoxi-Ci-C4, R3 é alquil-Ci-Cí-oxicarbonilo ou alquenil-C2-C4~ oxicarbonilo, X significa oxigénio ou enxofre.
4. Processo para a preparação de compostos de fórmulas I ou Ia de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por 2 I A) para a preparação de compostos de fórmula I em que X é azoto e os resíduos R1, R2 e R3 são como definido nas reivindicações 1 a 4, se transformar um composto de fórmula II

(II) em que R1 e R2 têm o significado dado nas reivindicações 1 a 3, com um composto de fórmula III, R3-Z (III) em que R3 tem o significado dado nas reivindicações 1 a 3 e Z é um grupo rejeitado, como por exemplo cloro, ou por B) se prepararem compostos de fórmula I, em que X é enxofre e R1, R2 e R3 têm o significado definido nas reivindicações 1 a 3, através da reacção de um composto de fórmula I, em que X é azoto e R1, R2 e R3 têm o significado definido nas reivindicações 1 a 3, com um reagente de sulfuração.
5. Medicamento que contém uma quantidade eficaz de pelo menos um composto de fórmula l ou la de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3. 3
6. Processo para a preparação de um medicamento de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se dar à quantidade eficaz de um composto de fórmula I ou Ia, uma forma de apresentação adequada com um adjuvante farmacêutico usual.
7. Utilização de compostos de fórmula I ou Ia de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3 para a preparação de medicamentos para o tratamento de doenças virais.
8. Compostos de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3 para utilização como medicamento.

Lisboa, 26 de Março de 2001. (/agente oficial da propriedade industrial 4