PT695307E - Farmacos de proteinas e peptidos modificados - Google Patents

Description

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DESCRICÃO "Fármacos de proteínas e péptidos modificados"

Agradecimento ao apoio governamental A presente invenção foi realizada com apoio governamental sob o contracto NIH n°. N01 -HD-9-2922, concedido pelos National Institutes of Health. O Governo tem certos direitos sobre esta invenção.

Campo técnico A presente invenção refere-se ao campo da administração de fármacos de péptidos e proteínas biologicamente activos. Mais particularmente, a invenção refere-se à utilização de péptidos e proteínas modificados que contêm certos prolongamentos que representam o péptido do terminal carboxi da gonadotropina coriónica humana ou seus fragmentos.

Arte anterior O pedido PCT WO 90/09800, publicado em 7 de Setembro de 1990, descreve várias formas modificadas de hormonas reprodutoras. Como descrito no pedido PCT, qualquer proteína biologicamente activa, tal como um hormona, uma citóquina, um regulador de hormonas e semelhantes, pode ser modificada de modo a melhorar as suas características de depuração dotando-a de uma sequência de aminoácidos prolongada no seu terminal carboxi em que o prolongamento é o péptido do terminal carboxi da gonadotropina coriónica humana ou uma sua variante. Tal como descrito naquele pedido, as posições necessárias para o péptido do terminal carboxi (CTP) consistem em qualquer uma das posições 112-118 até à posição 145 da sub-unidade β da gonadotropina coriónica humana. Tal como adicionalmente explicado no pedido PCT, obtêm-se variantes do prolongamento CTP através de substituições conservativas de aminoácidos de modo a que a capacidade do CTP para alterar as características de depuração não seja destruída. Fragmentos mais curtos do que a sequência que se prolonga das posições 112-118 até à 145 não estão especificamente descritas, nem o são prolongamentos que não do terminal

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Resultados especificamente com a sub-unidade β prolongada com CTP de FSH estão também descritos em dois artigos dos inventores: LaPolt, P.S. et alr, Endocrinoloqy (1992) 131: 2514-2520 e Fares, F.A. et ai) Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992) 89: 4304-4308 (veja-se também WO 93/06844).

Verificou-se agora que a alteração das propriedades de depuração desejadas pode ser conseguida quando o CTP está ligado ao terminal N em vez de ao terminal C do péptido não modificado ou ligado a ambos, ou colocado em qualquer região não crítica do péptido, e que este efeito pode também ser conseguido utilizando apenas porções ou fragmentos do CTP que contudo têm que conter pelo menos um local de glicosilação em O. Os efeitos desejados são conservados quando são empregues prolongamentos em série.

Descricão da invenção A invenção proporciona formas modificadas de proteínas e péptidos que possuem actividade biológica, formas modificadas que possuem alteradas as propriedades de depuração mais desejáveis do que as do péptido ou da proteína não modificados. A modificação compreende proporcionar uma sequência de aminoácidos adicional numa região não crítica do péptido ou da proteína, incluindo no terminal N ou no terminal C ou em ambos os terminais, em que o prolongamento compreende pelo menos uma sequência derivada de CTP. A sequência derivada de CTP é a sequência de aminoácidos nativa nas posições 112-118 a 145 ou uma sua variante como aqui definida, e tem que ser ou apenas um fragmento desta sequência ou uma forma em série da sequência quando apenas é assim prolongado o terminal carboxi do péptido.

Assim, num aspecto, a invenção refere-se a um fármaco de proteína ou péptido modificados em que a modificação compreende um prolongamento ou inserção na sequência de aminoácidos da proteína ou do péptido, consistindo a referida inserção ou prolongamento essencialmente em pelo menos uma sequência que represente o péptido do terminal carboxi (CTP) da sub-unidade β da gonadotropina coriónica humana ou sua variante, ou uma sua porção contendo pelo menos um local de glicosilação em O. A referida porção contém

83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 3 pelo menos um aminoácido a menos do que a sequência de aminoácidos 118-145 do referido CTP. Se apenas o terminal C do péptido ou da proteína biologicamente activos for prolongado, o referido prolongamento tem que consistir essencialmente na referida porção, e não na unidade CTP completa.

Em outros aspectos, a invenção refere-se a materiais e métodos recombinantes para produzir as proteínas e os péptidos modificados de acordo com a invenção e a composições farmacêuticas que os contêm.

Breve descrição dos desenhos

As Figuras 1A e 1B apresentam a construção de uma sub-unidade FSHp humana prolongada, respectivamente, com uma ou duas unidades de CTP. A Figura 1C apresenta a inserção de uma sub-unidade FSHp prolongada no vector de expressão pM2. A Figura 2 é uma fotocópia do gel obtido a partir de SDS-PAGE conduzida sobre imunoprecipitados de lisados e meios de células de CHO contendo vectores de expressão para formas nativas e truncadas de CGp humana. A Figura 3 apresenta os detalhes da fusão de uma única unidade de CTP representando as posições 115-145 ao terminal carboxi de FSHp, como descrito na Figura 1A. A Figura 4 apresenta as posições para inserção de uma sub-unidade de CTP representando as posições 118-145 no terminal amino ou carboxi da sub-unidade a. A Figura 5 apresenta um diagrama da construção da sub-unidade α prolongada no terminal carboxi com CTP (aC). A Figura 6 apresenta um diagrama da construção de Ca em que uma unidade de CTP representando as posições 118-145 de hCGp é inserida entre os aminoácidos 3 e 4 da sub-unidade a.

83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 4 A Figura 7 é uma fotocópia dos resultados de SDS-PAGE obtidos a partir de meios e lisados marcados de células de CHO transfectadas com vectores de expressão para a sub-unidade α nativa e para aC. A Figura 8 é um gráfico que apresenta a actividade biológica in vitro de FSH nativa e FSH contendo uma sub-unidade β prolongada ou aC ou ambas. A Figura 9 é um gráfico que apresenta a actividade biológica in vitro de FSH nativa e FSH contendo Ca ou ambas. A Figura 10 apresenta a sequência de aminoácidos e a numeração das posições 11 2-145 de CGp humana.

Modos de realização da invenção A gonadotropina coriónica humana (hCG) é uma de pelo menos quatro hormonas "reprodutoras" numa família que também inclui a hormona estimulante de folículos (FSH), a hormona luteinizante (LH) e a hormona estimulante da tiróide (TSH). Todas estas hormonas são constituídas por sub-unidades α que, para uma dada espécie, são idênticas na sequência de aminoácidos entre o grupo, e sub-unidades β que diferem de acordo com o membro da família. A sub-unidade β de hCG é substancialmente maior do que as outras sub-unidades β na medida em que contém aproximadamente 34 aminoácidos adicionais no terminal C, aqui referidos como a porção do terminal carboxi (CTP) que é considerado responsável pela semi-vida comparativamente mais longa no soro da hCG, quando comparada com outras gonadotropinas (Matzuk, M. et ai., Endocrinol (1989) 126:376). Na hormona nativa, este prolongamento de CTP contém quatro oligossacáridos ligados a O semelhantes a mucina.

Tal como aqui utilizadas, a sub-unidade alfa humana, e as sub-unidades beta de FHS, LH, TSH e CG humanas, bem como as formas heterodiméricas, possuem em geral as suas definições convencionais e referem-se às proteínas que possuem sequências de aminoácidos conhecidas na arte per se, ou suas variantes alélicas, suas muteínas deliberadamente construídas que mantêm a actividade da proteína nativa independentemente do padrão de glicosilação 5 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ exibido, ou suas formas mutantes possuindo pelo menos 90% de homologia, preferivelmente 95% de homologia, com as formas nativas.

As formas "nativas" destes péptidos são aquelas que possuem as sequências de aminoácidos isoladas de tecido humano, em que estas sequências são conhecidas per se, ou suas variantes alélicas.

As formas "muteína" destas proteínas são aquelas que possuem alterações deliberadas na sequência de aminoácidos produzidas através de, por exemplo, mutagénese específica do local ou através de outras manipulações recombinantes, ou que são preparadas sinteticamente. Estas alterações resultam em sequências de aminoácidos em que a actividade biológica da sub-unidade é retida e/ou em que a sub-unidade possui pelo menos 90% de homologia, preferivelmente 95% de homologia, com a forma nativa.

Apesar de reconhecido que o padrão de glicosilação tem uma profunda influência sobre a actividade, tanto qualitativa como quantitativamente, por conveniência, os termos sub-unidades beta de FSH, LH, TSH e CG referem-se à sequência de aminoácidos característica dos péptidos, tal como acontece com "sub-unidade alfa". Quando apenas é referida a cadeia beta, os termos serão, por exemplo, FSH beta; quando é referido o heterodímero, será utilizado o termo mais simples "FSH". Será evidente do contexto de que modo é afectado o padrão de glicosilação, por exemplo, hospedeiro de expressão recombinante ou alteração nos locais de glicosilação. As formas da glicoproteína com padrões de glicosilação especificados serão assim denotadas.

Tal como aqui se utiliza, "péptido" e "proteína" são utilizados indiferentemente, uma vez que a distinção de comprimentos entre eles é arbitrária.

Regiões "não críticas" de péptidos ou proteínas são aquelas regiões das moléculas que não são necessárias para a actividade biológica. Em geral, estas regiões são removidas dos locais de ligação, locais de clivagem de precursores e regiões catalíticas.

Tal como aqui se utiliza, "unidade de CTP" refere-se a uma sequência de 6 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ aminoácidos encontrada no terminal carboxi da sub-unidade β da gonadotropina coriónica humana que se prolonga do aminoácido 112-118 ao resíduo 145 no terminal C ou a uma sua porção. Assim, cada unidade de CTP "completa" contém 28-34 aminoácidos, dependendo do terminal N do CTP. A sequência nativa das posições 112-145 está apresentada na Figura 10.

Unidade de CTP "parcial" significa uma sequência de aminoácidos que ocorre entre as posições 112-118 a 145 inclusive, mas que possui pelo menos um aminoácido delecionado da mais curta possível unidade de CTP "completa" (i.e. das posições 118-145). As unidades de CTP "parciais" incluídas na invenção têm que conter pelo menos um local de glicosilação em O. A unidade de CTP contém quatro destes locais nos resíduos serina nas posições 121 (local 1); 127 (local 2); 132 (local 3); e 138 (local 4). As formas parciais do CTP úteis na invenção conterão um ou mais destes locais dispostos na ordem em que aparecem na sequência de CTP nativa. Assim, a unidade de CTP "parcial" útil na invenção pode incluir todos os quatro locais de glicosilação; os locais 1, 2 e 3; os locais 1, 2 e 4; os locais 1, 3 e 4; os locais 2, 3 e 4; ou simplesmente os locais 1 e 2; 1 e 3; 1 e 4; 2 e 3; 2 e 4; ou 3 e 4; ou pode conter apenas um dos locais 1, 2, 3 ou 4.

Prolongamentos "em série" significa que a inserção ou prolongamento contém pelo menos duas "unidade de CTP". Cada unidade de CTP pode ser completa ou um fragmento, e nativa ou uma variante. Todas as unidades de CTP no prolongamento ou inserção em série podem ser idênticas, ou podem ser diferentes umas das outras. Assim, por exemplo, o prolongamento ou inserção em série pode genericamente ser parcial-completo; parcial-parcial; parcial-completo-parcial; completo-completo-parcial, e similares em que cada uma das unidades de CTP denotadas parcial ou completa, pode independentemente ser uma variante ou a sequência nativa. A natureza das variantes é adicionalmente esclarecida abaixo.

Variantes A "unidade de CTP" pode corresponder exactamente à sequência de CTP nativa, ou pode ser uma variante em que 1-5 dos aminoácidos contidos na sequência é substituído por um análogo conservativo do resíduo de aminoácido 7 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ nativo nessa posição, e em que as referidas substituições, tomadas cumulativamente, não resultam numa alteração substancial na estabilidade conferindo propriedades da unidade de CTP. "Análogo conservativo" significa, no sentido convencional, um análogo em que o resíduo que vai substituir é da mesma categoria genérica de aminoácidos que aquele que vai ser substituído. Os aminoácidos foram classificados em grupos, tal como se reconhece na arte, por, por exemplo, Dayhoff, M. et a/., Atlas of Protein Seauences and Structure (1972) 55: 89-99. Em geral, os aminoácidos ácidos caiem num grupo; os aminoácidos básicos noutro grupo; os aminoácidos neutros hidrófilos em outro; e assim por diante.

Mais especificamente, os resíduos de aminoácido podem ser genericamente subclassificados em quatro subclasses principais, como se segue: Ácido: O resíduo tem uma carga negativa devido a perda do ião H a pH fisiológico e o resíduo é atraído por uma solução aquosa de modo a procurar as posições da superfície na conformação de um péptido em que está contido quando o péptido está em meio aquoso a pH fisiológico. Básico: O resíduo possui uma carga positiva devido a associação com o ião H a pH fisiológico e o resíduo é atraído por uma solução aquosa de modo a procurar as posições da superfície na conformação de um péptido no qual está contido quando o péptido está em meio aquoso a pH fisiológico.

Neutro/não polar: Os resíduo não têm carga a pH fisiológico e o resíduo é repelido por uma solução aquosa de modo a procurar as posições internas na conformação de um péptido no qual está contido quando o péptido está em meio aquoso. Estes resíduos são aqui também designados por "hidrófobos".

Neutro/polar: Os resíduos não têm carga a pH fisiológico, mas o resíduo é atraído por uma solução aquosa de modo a procurar as posições exteriores na conformação de um péptido no qual está contido quando o péptido está em meio aquoso.

Entenda-se, evidentemente, que numa colecção estatística de moléculas 8 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ de resíduos individuais algumas moléculas serão carregadas, e outras não, e haverá uma atracção ou uma repulsão relativamente ao meio aquoso numa maior ou menor extensão. Para se enquadrar na definição de "carregado", uma percentagem significativa (pelo menos aproximadamente 25%) das moléculas individuais estão carregadas a pH fisiológico. O grau de atracção ou repulsão requerido para classificação como polar ou não polar é arbitrário, e, portanto, os aminoácidos especificamente contemplados na invenção foram classificados como um ou outro. A maioria dos aminoácidos não especificamente nomeados podem ser classificados com base no comportamento conhecido.

Os resíduos de aminoácido podem ainda ser subclassificados como cíclicos ou não cíclicos, e aromáticos ou não aromáticos, classificações auto-explicativas em relação aos grupos substituintes da cadeia lateral dos resíduos, e como pequenos ou grandes. O resíduo é considerado pequeno se contém um total de 4 átomos de carbono ou menos, inclusive o carbono do carboxilo. Os resíduo pequenos são, evidentemente sempre não aromáticos.

Para os aminoácidos de proteínas de ocorrência natural, a subclassificação de acordo com o esquema anterior é como se segue. Ácido: Ácido aspártico e Ácido glutâmico; Básico/não cíclico: Arginina, Usina; Básico/cíclico: Histidina;

Neutro/polar/peaueno: Glicina, Serina e Cisteína;

Neutro/não polar/peaueno: Alanina

Neutro/polar/arande/não aromático: Treonina, Asparagina, Glutamina; Neutro/polar/arande/aromático: Tirosina;

Neutro/não oolar/grande/não aromático: Valina, Isoleucina, Leucina, Metionina; Neutro/não polar/orande/aromático: Fenilalanina e Triptofano. 0 aminoácido secundário prolina, codificado por genes, embora tecnicamente no grupo neutro/não polar/grande/cíclico e não aromático, é um caso especial devido aos seus conhecidos efeitos sobre a conformação secundária de cadeias peptídicas, e não está portanto incluído neste grupo definido. 9 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ

Se os péptidos modificados da invenção forem construídos por modificação do gene, as unidades de CTP conterão apenas substituições com aminoácidos codificados por genes; contudo, se a unidade de CTP for sintetizada por métodos de síntese de péptidos Standard, por exemplo, em fase sólida, e ligada, por exemplo enzimaticamente, ao terminal C do péptido ou proteína aceitante, podem também substituir as suas contrapartidas análogas aminoácidos não codificados por genes, tais como ácido aminoisobutírico (Aib), fenilglicina (Phg) e similares.

Estes aminoácidos não codificados incluem, por exemplo, betaralanina (beta-Ala) ou outros omega-aminoácidos, tais como 3-aminopropiónico, 4-aminobutírico e assim por diante, sarcosina (Sar), ornitina (Orn), citrulina (Cit), t-butilalanina (t-BuA), t-butilglicina (t-BuG), N-metilisoleucina (N-Melle) e ciclo-hexilalanina (Cha), norleucina (Nle), ácido cisteico (Cya); 2-naftilalanina (2-Nal), ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolino-3-carboxílico (Tic); ácido mercaptovalérico (Mvl); β-2-tienilalanina (Thi); e sulfóxido de metionina (MSO). Estes caem também, convenientemente, em categorias particulares.

Com base nas definições anteriores,

Sar e beta-Ala e Aib são neutros/não polares/pequenos; t-BuA, t-BuG, N-Melle, Nle, Mvl e Cha são neutros/não polares/grandes/não aromáticos;

Orn é básico/não cíclico;

Cya é ácido;

Cit, Acetil Lys, e MSO são neutros/polares/grandes/não aromáticos; e Phg, Nal, Thi e Tic são neutros/não polares/grandes/aromáticos.

Os vários omega-aminoácidos são classificados de acordo com o tamanho como neutros/não polares/pequenos (beta-Ala, i.e., 3-aminopropiónico, 4-aminobutírico) ou grandes (todos os outros).

Assim, as substituições por aminoácidos que não os codificados no gene podem também estar incluídas nos compostos peptídicos dentro do âmbito da invenção e podem ser classificados dentro deste esquema geral de acordo com a sua estrutura.

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Concretizações preferidas de unidades de CTP A notação utilizada para as unidades de CTP da invenção é como se segue: para porções da unidade de CTP completa, as posições incluídas na porção são designadas pelos seus números conforme aparecem na Figura 11. Quando ocorrem substituições, o aminoácido substituto é proporcionado juntamente com um expoente que indica a sua posição. Assim, por exemplo, CTP (120-143) representa a porção de CTP que se estende das posições 120 a 143; CTP (120-130; 136-143) representa uma sequência de aminoácidos fundida a que faltam as posições 118-119, 131-135, e 144-145 da sequência nativa. CTP (Arg122) refere-se a uma variante em que a lisina na posição 122 é substituída por uma arginina; CTP (lie134) refere-se a uma variante em que a leucina na posição 134 é substituída por isoleucina. CTP (Val128Val143) representa uma variante em que foram feitas duas substituições, uma da leucina na posição 128 e a outra da isoleucina na posição 142. CTP (120-143; lle128Ala130) representa a porção relevante da unidade de CTP em que foram feitas as duas substituições indicadas. preferidas as unidades São particularmente seguintes: de CTP com as fórmulas #1 CTP (116-132) #2 CTP (118-128; #3 CTP (117-142) #4 CTP (116-130) #5 CTP (116-123; #6 CTP (115-133; #7 CTP (117-140, #8 CTP (125-143, #9 CTP (135-145, #10 CTP (131-143, #11 CTP (118-132) #12 CTP (118-127) #13 CTP (118-145) #14 CTP (115-132) 130-135) 137-145) 141-145) Ser123 Gin140) Ala130)

Glu139)

Mvl142 Cha143) 11 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ #15 CTP (115-127) #16 CTP (115-145) #17 CTP (112-145) #18 CTP (112-132) #19 CTP (112-127) Péptidos e proteínas modificados

Qualquer péptido ou proteína com significado biológico está sujeito a modificações de acordo com o método da invenção. Estão portanto incluídos entre estes candidatos para modificação, hormonas peptídicas, tais como as quatro hormonas "reprodutoras" humanas anteriormente mencionadas, incluindo as suas cadeias β; a insulina; a hormona do crescimento humana e a hormona do crescimento de outras espécies; a encefalina; a ACTH; glucagon; e similares. São também úteis como sujeitos a modificação de acordo com a invenção vários factores de crescimento tais como os factores de crescimento semelhantes a insulina; factores de crescimento epidérmico; factores de crescimento de fibroblastos ácidos e básicos; factores de crescimento derivados de plaquetas; os vários factores estimulantes de colónias, tais como CSF de granulócitos, CSF de macrófagos, e similares; bem como as várias citóquinas tais como IL-2, IL-3 e a pletora de proteínas interleucinas adicionais; os vários interferões; factor de necrose de tumores; e similares. As enzimas como a tPA (que tem uma semi-vida muito curta), a uroquinase e a trombina podem também ser modificados. São também candidatas para o método da invenção sequências peptídicas curtas tais como a hormona de libertação da hormona luteinizante (LHRH); a somatostatina; o factor de libertação da hormona do crescimento (GHRF); e as endorfinas. Medicamentos proteicos adicionais tais como proteínas tensioactivas alveolares; factores natriuréticos; adesões; péptidos receptores; ligandos de ligação a receptores em geral; anticorpos e seus fragmentos; e qualquer outro péptido ou proteína útil com uma função biológica desejada, podem ser modificados de acordo com os métodos aqui descritos.

Entenda-se, evidentemente, que o péptido ou a proteína em que a(s) unidade(s) de CTP está(estão) inseridas ou a que a(s) unidade(s) de CTP está(estão) adicionadas como prolongamento, também podem estar em formas modificadas a partir daquela em que ocorrem biologicamente de modo vulgar,

83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 12 desde que seja conservada a actividade biológica.

Um candidato particularmente preferido para modificação com as unidades de CTP de acordo com a invenção é a sub-unidade α das hormonas reprodutoras. Esta tem a vantagem de que o acoplamento da sub-unidade α modificada com as unidades β correspondentes resulta num conjunto completo de hormonas para as quais a bioactividade pode ser prolongada. A unidade de CTP ou unidades em série podem ser fundidas a cada um ou a ambos os terminais carboxi e amino da sub-unidade a; contudo, prefere-se o terminal amino. As provas disponíveis mostram que o terminal amino não está envolvido em montagem com a sub-unidade β nem está associado com determinantes de ligação a receptores.

Como anteriormente mencionado, as inserções ou prolongamentos com a(s) unidade(s) de CTP tem que ser numa região do péptido ou da proteína que não seja crítica para a actividade biológica desejada. Assim, regiões críticas para a indução da dobragem adequada, para a ligação a receptores, para a actividade catalítica e semelhantes, devem ser evitadas. De modo semelhante, as regiões que são críticas para assegurar a conformação tridimensional da proteína devem ser evitadas. A determinação de regiões não críticas é prontamente conseguida por deleção ou modificação de regiões candidatas e conduzindo um ensaio apropriado à actividade desejada. As regiões onde as modificações resultam em perda de actividade são críticas; as regiões em que a alteração resulta na mesma actividade ou em actividade semelhante são consideradas não críticas.

Em muitos casos, as localizações de regiões críticas são conhecidas. Por exemplo, para a sub-unidade a, pensa-se que as posições 33-59 são necessárias para o sinal de transdução e que o trecho de 20 aminoácidos no terminal carboxi é necessário para sinal de transdução/ligação a receptores. Os resíduos críticos para a montagem com a sub-unidade β incluem pelo menos os resíduos 33-58, particularmente 37-40.

Se a abordagem ou o péptido candidato não forem estudados adequadamente, como anteriormente estabelecido, as regiões não críticas podem ser determinadas por deleção ou modificação de regiões candidatas conduzindo um ensaio apropriado à actividade desejada. Um ponto de partida 13 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ apropriado para proteínas em geral é no terminal NRC; contudo, em alguns casos particulares, estes pontos de partida não originarão necessariamente resultados bem sucedidos. Em adição ao terminal N e ao terminal N per se, a inserção em regiões próximas destes terminais também representam pontos de partida razoáveis. De modo a realizar a inserção da unidade de CTP ou uma sua porção, pode ser delecionado um pequeno número de aminoácidos da região não crítica. As concretizações preferidas das proteínas e péptidos modificados de acordo com a invenção incluem os seguintes: CGoc (1-3) - CTP#1 -(4-92) CGa (1-3) - CTP#11-(4-92) CGa (1-3) - CTP#1 2-(4-92) CGcc (1-92) - CTP#11 CGa (1-92) - CTP#1 2 CGa (1-3) - CTP#1 7 (4-92) CGa (1-3) - CTP#1 8 (4-92) CGa (1-3) - CTP#1 9 (4-92) FSHp (1-111) - CTP#11 FSHp (1-111) - CTP#1 2 FSHp (1-111) - CTP#11 - CTP#12

Proinsulina (1-3) - CTP#5 - CTP#6 (extremidade 4) FSHp (1-111)- CTP#1 3- CTP#13 TSHp (1-110) - CTP#11 TSHp (1-110) - CTP#12 LHp (1-114) - CTP#14 LHp (1-114) - CTP#15 LHp (1-114) - CTP#16 LHp (1-121) - CTP#11 LHp (1-121) - CTP#1 2 LHp (1-121) - CTP#1 3 tPA (1-2) - CTP#14 (extremidade 3) tPA (1-2) - CTP#15 (extremidade 3) tPA (1-2) - CTP#16 (extremidade 3) hGH (1-4) - CTP#11 (extremidade 5) hGH (1-4) - CTP#12 (extremidade 5) 14 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ hGH (1-4) - CTP#13 (extremidade 5) IL-3 (extremidade 1) - CTP#14 IL-3 (extremidade 1) - CTP#15 IL-3 (extremidade 1) - CTP#16

Formas acopladas

Os péptidos ou proteínas modificados de acordo com a invenção podem adicionalmente ser conjugados ou derivatizados de modos geralmente aceites para derivatizar sequências de aminoácidos, tais como fosforilação, glicosilação, desglicosilação de formas normalmente glicosiladas, modificação das cadeias laterais dos aminoácidos (e.g., conversão de prolina em hidroxilprolina) e modificações semelhantes análogas aos eventos após tradução que se verificou ocorrerem de um modo geral.

Tal como é conhecido de um modo geral na arte, os péptidos e as proteínas modificados de acordo com a invenção podem ser acoplados a marcadores, drogas, agentes de marcação, transportadores, suportes sólidos, e semelhantes, dependendo da aplicação desejada. As formas marcadas dos produtos biológicos modificados podem ser utilizadas para seguir o seu destino metabólico; os marcadores adequados para este fim incluem, especialmente, radioisótopos marcadores tais como o iodo 131, o tecnécio 99, o índio 111, e semelhantes. Os marcadores podem também ser utilizados para mediar a detecção das proteínas ou péptidos modificados em sistemas de ensaio; neste caso, os radioisótopos podem também ser utilizados, bem como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores cromogénicos, e similares. A utilização destes marcadores é particularmente útil se o péptido ou a proteína forem eles próprios um agente direccionamento para um alvo tal como um anticorpo ou um ligando de um receptor.

Contrariamente, se o péptido ou a proteína modificados forem um ligando direccionante para um alvo, principalmente, e se estiverem relativamente isentos de actividade que altera o metabolismo, o composto modificado da invenção pode ser conjugado com uma droga apropriada, tal como uma droga anti-inflamatória, um antibiótico, uma toxina, e similares. Os compostos modificados de acordo com a invenção podem também ser acoplados a 15 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ transportadores para aumentar a sua imunogenicidade na preparação de anticorpos especificamente imunorreactivos com estas novas formas modificadas. Os transportadores adequados para este fim incluem hemocianina de lapa do género Fissurella (KLH), albumina de soro bovino (BSA) e toxóide da difteria, e similares. Podem ser empregues técnicas de acoplamento Standard para ligação dos péptidos modificados da invenção a transportadores, incluindo a utilização de ligantes bifuncionais.

Podem ser empregues técnicas de ligação semelhantes, juntamente com outras, para acoplar os péptidos e proteínas modificados da invenção a suportes sólidos. Quando acoplados, estes péptidos e proteínas modificados podem ser utilizados como reagentes de afinidade para a separação de componentes desejados com os quais é exibida a reacção específica. Métodos de preparação

Os métodos de construção de compostos biologicamente activos peptídicos e proteicos modificados de acordo com a invenção são bem conhecidos na arte. Como anteriormente estabelecido, se apenas são incluídos aminoácidos codificados por genes, a abordagem presentemente mais prática consiste em sintetizar estes materiais de modo recombinante através de modificação do ADN que codifica o péptido desejado. As técnicas para mutagénese dirigida a locais, ligação de sequências adicionais e construção de sistemas de expressão adequados são todas, actualmente, bem conhecidas na arte. O ADN que codifica a(s) unidade(s) de CTP a adicionar ao ADN que codifica o péptido ou a proteína desejados é construído sinteticamente, do modo mais conveniente, utilizando técnicas Standard em fase sólida, preferivelmente para incluir locais de restrição para facilitar a ligação, e é acoplado à sequência que codifica o péptido ou a proteína candidatos. Se o ADN que codifica o péptido ou a proteína candidatos não constituir já uma parte de um sistema de expressão contendo elementos de controlo adequados para a transcrição e a tradução da sequência codificante incluída, as sequências de ADN codificante modificadas são proporcionadas com estas características. Tal como é bem conhecido, estão actualmente disponíveis sistemas de expressão compatíveis com uma vasta variedade de hospedeiros, incluindo hospedeiros procariotas tais como bactérias e hospedeiros procariotas tais como leveduras, células vegetais,

83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 16 células de insecto, células de mamífero, células de aves, e similares.

Quando o péptido não modificado é uma hormona reprodutora incluindo a sub-unidade a, quer a sub-unidade α seja modificada ou não modificada, a produção recombinante da sub-unidade α apropriada é preferivelmente efectuada utilizando uma construção de "minigene".

Como aqui utilizado, o "minigene" da sub-unidade alfa refere-se à construção de gene revelada em Matzuk, M.M., et al, Mol Endocrinol (1988) 2:95-100, na descrição da construção de pM2/CG alfa ou pM2/alfa. Este "minigene" é caracterizado por retenção apenas da sequência do intrão entre o exão III e o exão IV, tendo sido delecionados todos os intrões a montante. Na construção particular descrita, as sequências codificantes do terminal N que são derivadas do exão II e uma porção do exão III são fornecidas pelo ADNc e são ligadas directamente através de um local de restrição Xbal na sequência codificante do exão III de modo a que estejam ausentes os intrões entre os exões I e II e entre os exões II e III. Contudo, são conservados o intrão entre os exões III e IV bem como os sinais 3' da sequência codificante. O minigene resultante pode ser convenientemente inserido na forma de um segmento BamHI/BglIl. Outros meios para a construção de um minigene comparável são evidentemente possíveis e a definição não está restrita à construção particular em que as sequências codificantes são ligadas através de um local Xbal. Contudo, este é um meio conveniente para a construção do gene, e não existe qualquer vantagem particular em outras abordagens, tais como a preparação sintética ou parcialmente sintética do gene. A definição inclui as sequências que codificam para a sub-unidade alfa que conserva o intrão entre os exões III e IV, ou qualquer outro intrão e preferivelmente nenhum outro intrão.

Para a produção recombinante, são utilizadas células hospedeiras transfectadas utilizando sistemas de expressão e são cultivadas para produzir a proteína desejada. Estes termos são aqui utilizados como se segue:

Uma célula hospedeira recombinante "transfectada", i.e., uma célula "transfectada" com os sistemas de expressão recombinantes de acordo com a invenção, refere-se a uma célula hospedeira que foi alterada de modo a conter este sistema de expressão através de qualquer modo conveniente de 17 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ introdução, incluindo transfecção, infecção virai, e assim por diante. 0 termo "transfectado" refere-se a células que contêm este sistema de expressão quer o sistema esteja integrado no cromossoma quer seja extracromossómico. As células "transfectadas" podem ser ou não estáveis relativamente à inclusão do sistema de expressão. Em resumo, células hospedeiras recombinantes "transfectadas" com o sistema de expressão de acordo com a invenção referem-se a células que incluem este sistema de expressão como resultado da sua manipulação para o incluir, quando o não incluem na forma nativa, independentemente do modo de efectuar esta incorporação. "Sistema de expressão" refere-se a uma sequência de ADN que inclui uma sequência codificante a ser expressa e às sequências de ADN de controlo que a acompanham, necessárias para efectuar a expressão da sequência codificante. Tipicamente, estes controlos incluem um promotor, sequências reguladoras da terminação, e, em alguns casos, um operador ou outro mecanismo para regular a expressão. As sequências de controlo são aquelas que são desenhadas para serem funcionais numa célula hospedeira recombinante alvo particular e portanto a célula hospedeira tem que ser escolhida de modo a ser compatível com as sequências de controlo no sistema de expressão construído.

Tal como aqui utilizados, os termos "células", "culturas de células" e "linhas de células" são utilizados indiferentemente sem atenção particular quanto a nuances de significado. Quando a distinção entre eles é importante, será claro do contexto. Quando pode significar qualquer um, pretende-se que todos estejam incluídos. A proteína produzida pode ser recuperada a partir do lisado das células se produzida intracelularmente, ou a partir do meio se for segregada. As técnicas para recuperação de proteínas recombinantes a partir de culturas de células são bem conhecidas na arte, e estas proteínas podem ser purificadas utilizando técnicas conhecidas tais como cromatografia, electroforese em gel, precipitação selectiva, e similares.

Alternativamente, se o candidato biológico é um péptido curto ou se puder ser efectuada a transferência enzimática da sub-unidade, a(s)

83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 18 sub-unidade(s) de CTP de acordo com a invenção podem ser sintetizadas directamente utilizando técnicas de síntese de péptidos em fase sólida in vitro e sob estas condições, se desejado, a sub-unidade de CTP pode ser modificada por aminoácidos análogos que não são codificados por genes.

Anticorpos

Os péptidos e proteínas modificados de acordo com a invenção podem ser utilizados para gerar anticorpos especificamente imunorreactivos com estes novos compostos. Estes anticorpos são úteis em várias aplicações terapêuticas e de diagnóstico, dependendo da natureza da actividade biológica do péptido ou proteína não modificados.

Os anticorpos são geralmente preparados utilizando protocolos de imunização Standard em mamíferos tais como coelhos, ratinhos, ovelhas ou ratos, e os anticorpos são titulados na forma de anti-soros policlonais para assegurar a imunização adequada. Os anti-soros policlonais podem então ser recolhidos como tal para utilização em, por exemplo, imunoensaios. As células do hospedeiro que segregam anticorpos, tais como células do baço, ou leucócitos do sangue periférico, podem ser imortalizadas utilizando técnicas conhecidas e pesquisadas quanto à produção de anticorpos monoclonais imunoespecíficos com os péptidos modificados de acordo com a invenção. "Imunoespecífico para os péptidos modificados" significa anticorpos que são imunorreactivos com formas modificadas com a unidade de CTP dos péptidos ou proteínas, mas não com as porções não modificadas dentro dos parâmetros genéricos considerados para determinar a afinidade ou a não ) afinidade. Entenda-se que especificidade é um termo relativo, e pode ser escolhido um limite arbitrário, tal como uma diferença de imunorreactividade de 100 vezes ou superior. Assim, um anticorpo imunoespecífico incluído na presente invenção é pelo menos 100 vezes mais reactivo com a proteína ou o péptido modificados do que com as suas formas não modificadas.

Formulação

Os péptidos ou proteínas modificados de acordo com a invenção são 19 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ formulados e administrados utilizando métodos comparáveis com os conhecidos para os péptidos ou proteínas não modificados correspondentes às formas modificadas. Assim, os métodos de formulação e administração variarão de acordo com a forma não modificada candidata. Contudo, o nível de dosagem e a frequência de administrações podem ser reduzidos em comparação com a forma não modificada tendo em vista a semi-vida biológica prolongada do péptido ou da proteína modificados.

As formulações para os péptidos e proteína modificados de acordo com a invenção são as típicas de drogas peptídicas ou proteicas tais como as que se encontram em Reminaton^ Pharmaceutical Sciences, última edição, Mack Publishing Company, Easton, PA. Geralmente, as proteínas ou péptidos são administrados por injecção, tipicamente injecção intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intraperitoneal, ou utilizando formulações para entrega transmucosa ou transdérmica. Estas formulações incluem geralmente um detergente ou penetrante tal como sais biliares, ácidos fusídicos e similares. Estas formulações podem ser administradas na forma de aerossóis ou supositórios ou, no caso de administração transdérmica, na forma de pachos para a pele. A administração oral é também possível desde que as formulações protejam os péptidos da invenção da degradação no sistema digestivo. A optimização do regime de dosagem e da formulação é conduzida como matéria de rotina e como normalmente é realizada na arte.

Com os exemplos que se seguem pretende-se ilustrar, mas não limitar, a invenção.

Exemolo 1

Preparação da sub-unidade B humana com prolongamentos em série de duas

unidades de CTP

As Figuras 1A e 1 B mostram a construção de um vector de expressão em que a cadeia β de FSH humana é modificada de modo a incluir duas unidades de CTP. Como mostrado na Figura 1 B, o local Hindlll no terminal 3' da sub-unidade

83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 20 β de FSH humana, prolongado com uma unidade de CTP é utilizado para acoplar a unidade de CTP a partir do terminal 3' do gene β de HCG humana para obter a sub-unidade β prolongada. O gene de hFSH-β (DTP)2 é então ligado ao vector de expressão pM2 para obter um sistema de expressão capaz de produzir a forma prolongada da cadeia de FSH-β em células de mamífero. A construção dos vectores de expressão do hospedeiro é descrita por Matzuk, M.M. et a!., Proc Natl Acad Sei USA (1987) 84:6354-6358; Matzuk, M.M. et a/., J. Cell Biol (1988) 106:1049-1059.

Com mais detalhe, para criar a quimera de hFSh^ possuindo uma única unidade da região terminal ligada a 0 da sub-unidade Ιιΰΰβ, (hFSF^ (CTP)), criou-se um local Hindlll no codão de paragem do gene de hFSh^ no codão 111 e no gene de Κ^Ωβ no codão 118 (Figura 1A). O fragmento Hindlll-Hindlll do gene de hFSF^ foi ligado em estrutura ao fragmento BamHI-Hindlll de CGβ. Esta quimera (hFSh^ (CTP)) continha uma alteração de Ser118 para Ala118 no ponto de ligação, que foi corrigida por mutagénese dirigida por oligonucleótidos. A quimera contendo duas repetições em série de CTP (hFSh^ (CTP)2 foi construída criando um novo local Hindlll no codão de paragem da quimera ΙπΡεΗβ (CTP) (Figura 1B). O fragmento Hindlll-Hindlll foi ligado ao fragmento BamHI-Hindlll de Ι^ΰβ. O codão de Ala gerado pode ser reconvertido num codão de serina como descrito anteriormente.

Para inserir genes de ΙιΡεΗβ^ΤΡ) ou ΙηΡ5Ηβ^ΤΡ)2 no vector de expressão eucariota pM2, converteram-se os locais Hindlll nas extremidades 5' em locais BamHI utilizando o ligante oligonucleotídico BamHI e Klenow (Figura 1C), e inseriram-se os fragmentos BamHI-BamHI contendo os genes de ΙιΡεΗβ^Ρ ou ΙιΡ5Ηβ^ΤΡ)2 no local BamHI em pM2. A orientação correcta foi confirmada por análise com enzimas de restrição e a sequência completa do exão III foi sequenciada para confirmar a especificidade da mutagénese.

Exemplo 2

Efeito de prolongamentos em série de CTP A FSH humana contendo a sub-unidade β prolongada com duas unidades de CTP preparada como estabelecido no Exemplo 1 anterior foi injectada em ratos. Utilizaram-se 24 ratos fêmea Sprague-Dawley no estudo. Injectaram-se 21 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 12 ratos com 10 UI de FSH não modificada formulada em meio MEM; injectaram-se 12 ratos com 10 UI de FSH compreendendo hFSHp(CTP)2 formulada em meio MEM. Recolheu-se soro imediatamente e várias vezes durante a primeira hora, e depois após 2, 4 e 8 horas. Ensaiou-se o soro utilizando técnicas Standard de radioimunoensaio para a hormona FSH. Os resultados mostraram que enquanto a quantidade de FSH não modificada no soro diminuiu de cerca de 0,5 Ul/ml para menos de 0,05 Ul/ml durante um período de 8 horas, a FSH modificada da invenção contendo duas unidades de CTP permanece substancialmente inalterada ao longo deste período de tempo diminuindo de cerca de 0,8 Ul/ml para cerca de 0,5 Ul/ml.

Exemplo 3

Construção de unidades de CTP que representam unidades "parciais"

Insere-se o gene que codifica a sub-unidade β da gonadotropina coriónica humana no plasmídeo pM2 (supra) no local BamHI a jusante da repetição terminal longa (LTR). Um fragmento BamHI/BglII é sub-clonado em M13 para mutagénese dirigida ao local. São assim proporcionados codões de paragem em vez do resíduo arginina na posição 133 ou em vez do resíduo leucina na posição 128. O fragmento mutado é então reinserido no vector do hospedeiro pM2.

Os vectores que codificam formas truncadas de CGp humana foram então transfectados para células de CHO e as células transfectadas foram cultivadas e marcadas durante 7 horas com S-cisteína. Preparam-se lisados e meios e imunoprecipitaram-se com anti-soro de CGp. Os precipitados foram então submetidos a electroforese em gel de poliacrilamida SDS cujos resultados estão apresentados na Figura 2. Na Figura 2, as pistas do lisado e dos meios estão marcadas de acordo com o terminal carboxi. Ficou bem estabelecido que a maioria da glicosilação ligada a O em serina é ligada imediatamente antes da secreção. Portanto, existe um desvio de mobilidade que reflecte o aumento de peso molecular da sub-unidade quando é segregada. Como é aqui observado, existe uma diminuição progressiva do desvio de peso molecular do lisado para o meio nas formas mais curtas de hCGp. Os dados mostram pesos moleculares mais baixos para as formas segregadas das sub-unidades truncadas, indicando assim a ausência de locais de glicosilação de serina.

83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 22

Exemplo 4

Construção de FSHB modificada e outros péptidos A unidade de CTP que representa a forma "completa" ou a forma "porção" é então ligada a FSHp através de clivagem tanto do gene de FSHp como de hCGp mutado e não mutado, com Hindi11, e ligação da porção a montante resultante de FSH com a unidade de CTP, como apresentado na Figura 1 A. A nova ligação resulta numa substituição de Ser para Ala na posição 118 da unidade de CTP. Se desejado, este pode ser reconvertido num codão para serina, como apresentado na Figura 3.

De modo semelhante, a forma prolongada no terminal C da proinsulina humana, da hormona do crescimento, e da sub-unidade a, são preparados a partir da unidade de CTP em formas completas ou porções. A unidade de CTP pode ser inserida no terminal amino ou carboxi da sub-unidade a, como apresentado na Figura 4. Como aí ilustrado, são inseridas as posições 118-145 de hCGp.

Com maior detalhe, a construção de quimeras contendo a unidade de CTP "completa" ou na forma de uma "porção" no terminal carboxi da sub-unidade α (aC), os fragmentos BamHI-BglII e Hindlll-BamHI contendo a sub-unidade alfa e os genes de hCGp, respectivamente, são submetidos a reacção em cadeia com polimerase (PCR) (Horton, R.M. et a!., Gene (1989) 77:51-59). Isto está representado em diagrama na Figura 5. O fragmento GH apresentado, que foi transcrito a partir do minigene α (autor) (J Cell Biol (1988) 106:1049-1059) contém a sequência traduzida completa da sub-unidade a, e o fragmento IJ contendo a sequência de CTP a partir das sub-unidades de CGp, foram amplificados em reacções PCR separadas. A extremidade 3' do iniciador H utilizado para amplificar o fragmento GH é complementar à extremidade 5' da sequência de CTP. De modo semelhante, a extremidade 5' do iniciador I era complementar à extremidade 3' da sequência a. Assim, utilizando dois iniciadores internos que se sobrepõem os fragmentos GH e IJ partilham "extremidades coesivas". Estes fragmentos foram

83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 23 purificados e misturados em conjunto e utilizados como molde para PCR. As extremidades sobrepostas permitem que uma cadeia de cada fragmento actue como iniciador na outra e a adição de iniciadores G e I permite a amplificação do gene da quimera α-CTP. O gene de a-CTP foi inserido no local BamHI de pM2.

As sequências dos iniciadores utilizados na construção de aC são como se segue: (5'-»3')

H = GCCTTTGAGGAAGAGGAAGATTTGTGATAATAAC I = GTTATTATCACAAATCTTCCTCTTCCTCAAAGGC G = GTAAAACGACGGCCAGT J = AACAGCTATGACCATG

Os oligonucleótidos G e J são para iniciar M13 mp 19 (New England Biolabs 1992, catálogo #1201 e 1211). Os oligonucleótidos G e J iniciam a jusante e a montante, respectivamente, da região poliligante. O CTP foi também inserido na extremidade do terminal N da sub-unidade α na junção dos aminoácidos 3/4 (Ca; Fig. 5) de um modo semelhante ao que foi utilizado para construir o aC. O CTP foi inserido numa região interna da sub-unidade entre o aminoácido 3 e o 4 (Fig. 6).

As sequências dos oligonucleótidos iniciadores utilizados na construção de Ca são: (A) 5'- AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3' (E) 5'- CAT TCC GCT CCT GAT TCC TCT TCC TCA AAG-3' (B) 3'- GTA AGG CGA GGA CTA AGG AGA AGG AGT TTC-5' (C) 5'- CCG ATC CTC CCA CAA GTG CAG GAT TGC CCA-3' (F) 3'- GGC TAG GAG GGT GTT CAC GTC CTA ACG GGT-5' (D) 3'-ATT CTT GGA GTT CTA GGG GTC TTC GAAA-5'

Os oligonucleótidos A e D são utilizados para iniciar M1 3. A extremidade 3 do iniciador B utilizado para amplificar o fragmento AB proporciona uma sequência complementar à extremidade 5' da região CTP. De

83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 24 modo semelhante, a extremidade 5' do iniciador C, utilizado para amplificar o fragmento cd, é complementar à extremidade 3' do exão 2 no gene da sub-unidade a. Os fragmentos foram purificados em gel e misturados para utilização como molde de PCR. As extremidades sobrepostas permitem que uma cadeia de cada fragmento actue como iniciador de outra; a adição de iniciadores a e d permite a amplificação de toda a quimera. A orientação correcta foi confirmada por análise com enzimas de restrição, e o gene modificado resultante foi sequenciado para verificar se as substituições estavam correctas.

Exemplo 5

Produção de hormonas modificadas O gene que codifica a sub-unidade α modificada (aC) foi inserido no local BamHI de pM2 e foi transfectado sozinho ou em conjunto com o gene de CGp em células de ovário de hamster chinês. A marcação contínua de clones estáveis com 35S-cisteína mostra que a forma segregada do péptido modificado migra mais lentamente do que a correspondente forma não modificada. Na Figura 7, as pistas 1 e 3 representam os lisados de células que produzem a sub-unidade α não modificada e aC, respectivamente; as pistas 2 e 4 são os sobrenadantes correspondentes. Uma vez que a forma segregada de aC modificado tem uma alteração de mobilidade muito maior em relação à forma do lisado quando comparado com o tipo selvagem a, pode-se concluir que o aC segregado contém oligossacáridos ligados a 0 que foram uma contribuição do prolongamento de CTP. A co-transfecção da sub-unidade FSHp com aC ou com Ca em células de CHO resultou em dímeros que foram segregados com uma eficiência comparável à da FSH nativa.

Exemplo 6 Actividade biológica FSH nativa e dímeros de FHS com aC ou com Ca foram quantificados em meio condicionado com um ensaio imunorradiométrico da FSH e um RIA de 25 83 914

ΕΡ 0 695 307/ PT anticorpos duplos (Diagnostic Products, Los Angeles). A bioactividade in vitro destas hormonas foi determinada pelo bioensaio de aromatase em células da granulosa como descrito (autor, J Biol Chem (1989) 264:4764-4774; autor, Endocrinology (1986) 119:1570-1577). A estimulação da produção de estrogénio por FSH nativa e por FSH aC e Ca foi comparada após um período de cultura de 3 dias. A Figura 8 compara a resposta esteroidogénica de FSH nativa (círculos a cheio), aC-FSHp (quadrados a branco) e FSH, sub-unidade β-CTP/a (triângulos a branco). Observa-se que a presença de CTP na extremidade carboxi da sub-unidade α resulta numa resposta biológica inferior (redução de 25-50 vezes).

Em contraste, a presença do CTP na extremidade amino da sub-unidade α (Ca) não afectou a ligação a receptores ou a esteroidogénese (Fig. 9) de dímeros de FSH. A FSH nativa (círculos a branco), a FSHp prolongada no terminal carboxi com uma unidade de CTP dimerizada com α nativa (triângulos a branco), a sub-unidade FSHp dimerizada com Ca (círculos a cheio), e a FSHp prolongada com CTP dimerizada com Ca (triângulos a cheio), mostraram todas actividades semelhantes. As formas modificadas, em concentração óptima, mostram actividades um pouco superiores à da forma nativa. Resultados preliminares mostram que dímeros de Ca proporcionam agonistas de actuação longa com actividade biológica comparável à da hormona nativa.

Resultados adicionais mostraram que as proteínas modificadas que incluem sequências de CTP parciais particularmente aquelas a que faltam locais ligados a O induzem uma resposta biológica comparável a dímeros que incluem CTP de comprimento completo e espera-se que sejam menos antigénicos.

Lisboa, 21. fEV. 2000

Por WASHINGTON UNIVERSITY

DA CUNHA FERREIRA Âg. Of. Pr. Ind.

Raa das Flores, 74 - 4.’

1ΕΘΟ LISBOA

Claims (9)

1. 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 1/2 Reivindicações 1. Fármaco de uma proteína ou péptido modificados em que a modificação compreende a inserção de uma unidade de péptido do terminal carboxi (CTP) "completa" ou "parcial" ou sua variante, numa região não crítica da proteína ou do péptido, em que a referida unidade de CTP contém pelo menos um local de glicosilação, com a condição de que se a região não crítica for o terminal C, a inserção seja uma unidade de CTP parcial.
2. 2. Péptido ou proteína modificados de acordo com a reivindicação 1 em que a unidade de CTP é uma unidade de CTP parcial e em que os locais de glicosilação na unidade de CTP consistem nos locais 1, 2 e 3; ou nos locais 1, 3 e 4; ou nos locais 1, 2 e 4; ou nos locais 2, 3 e 4; ou em que os locais de glicosilação na unidade de CTP consistem nos locais 1 e 2; ou nos locais 1 e 3; ou nos locais 1 e 4; ou nos locais 2 e 3; ou nos locais 2 e 4; ou nos locais 3 e 4; ou em que os locais de glicosilação na unidade de CTP consistem no local 1, ou no local 2, ou no local 3 ou no local 4.
3. 3. Péptido ou proteína modificados de acordo com a reivindicação 1 em que a unidade de CTP parcial consiste nas posições 112-132; 115-132; 116-132; 118-132; 112-127; 115-127; 116-1 27; ou 118-127 da sub-unidade β da gonadotropina coriónica humana.
4. 4. Péptido ou proteína modificados de acordo com quaisquer das reivindicações anteriores em que a região não crítica é próxima do terminal C ou próxima do terminal N.
5. 5. Péptido ou proteína modificados de acordo com qualquer reivindicação anterior que é uma sub-unidade oc de uma hormona reprodutora humana e em que a região não crítica é próxima do terminal N.
6. 6. Péptido ou proteína modificados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em que o péptido ou a proteína é uma citóquina. 83 914 ΕΡ Ο 695 307/ ΡΤ 2/2
7. 7. Péptido ou proteína modificados de acordo com a reivindicação 6, em que a citóquina é IL-3.
8. 8. Péptido ou proteína modificados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em que o péptido ou a proteína é proinsulina, FSHp humana, ΤβΗβ humana, ou Ι_Ηβ humana.
9. 9. Composição farmacêutica compreendendo uma proteína ou um péptido modificados de acordo com qualquer reivindicação anterior em mistura com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 21 2000 Por WASHINGTON UNIVERSITY