PT617965E

PT617965E - Preparacao farmaceutica a base de proteina cc10 de celulas clara e sua utilizacao como medicamento e em diagnostico

Info

Publication number: PT617965E
Application number: PT94200650T
Authority: PT
Inventors: Marc Jozef Philemon De Ley
Original assignee: Marc Jozef Philemon De Ley
Priority date: 1993-03-15
Filing date: 1994-03-14
Publication date: 2001-03-30
Also published as: ATE197548T1; DE69426275D1; GR3035386T3; EP0617965A1; ES2152285T3; BE1006919A3; EP0617965B1; DE69426275T2; DK0617965T3

Description

85 267 ΕΡ Ο 617 965/ΡΤ DESCRICÃO "Preparação farmacêutica à base de proteína CC10 de células Clara e sua utilização como medicamento e em diagnóstico" A presente invenção refere-se a uma preparação farmacêutica à base de proteína CC10 de células Clara e à utilização de proteína CC10 de células Clara como um medicamento e em diagnóstico. A proteína CC10 de células Clara, também denominada a proteína urinária 1, ou simplesmente CC10 ou CC16, é conhecida da literatura (Singh G. et a!., Biochimica Biophysica Acta, 950 [1988] 329-337). A proteína CC10 de células Clara é um polipéptido homodimérico ligado por dissulfureto (Mr 2 x 7900) que ocorre em vários fluidos biológicos, tais como saliva, urina, sémen e nas membranas mucosas das vias respiratórias.

Na saliva, a concentração de proteína CC10 de células Clara monta a uma média de 15 mg/l. A concentração na urina é superior nos machos (30 pg/l) do que nas fêmeas (0,5 pg/l), tornando-se estas diferenças máximas na puberdade. Em adição, a concentração de proteína CC10 de células Clara na urina aumenta durante a gravidez.

Pouco se conhece neste momento sobre a função biológica da proteína CC10 de células Clara. CA 147437h, vol. 113, página 293 (1990), refere-se à exacerbação de inchaço da almofada da pata induzida por carragenano. A presente invenção baseia-se na verificação de que a proteína CC10 de células Clara inibe a produção de gama-interferão (= IFN-g) de células mononucleares activadas. Esta inibição é máxima quando se utiliza interleucina 2 (IL-2) para a estimulação. A proteína CC10 de células Clara inibe, por um lado, a produção de IL-2 mas, em particular, bloqueia a interacção da IL-2 com células alvo ou uma combinação de ambos.

Verificou-se assim que a proteína CC10 de células Clara actua como um agente imunossupressor como resultado da sua acção anti-citóquinas.

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Uma preparação farmacêutica contém proteína CC10 de células Clara ou um seu derivado reactivo como constituinte activo, e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Esta preparação farmacêutica pode ser utilizada no tratamento de organismos, em particular humanos e animais, como um medicamento ou em diagnóstico. A preparação farmacêutica pode conter a proteína CC10 de células Clara em combinação com qualquer transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

As formas de dosagem podem consistir em comprimidos, grânulos, pós inaláveis, aerossóis, fluidos administráveis por via parentérica, intramuscular ou intravenosa, e semelhantes. Dá-se particular preferência a fluidos injectáveis que sejam isotónicos e opcionalmente tamponados da maneira usual. A preparação farmacêutica pode ser administrada numa forma de dosagem adequada numa quantidade dependente da concentração do constituinte activo de proteína CC10 de células Clara. Esta quantidade é geralmente inferior a 10 mg/kg de peso corporal, geralmente inferior a 5 mg/kg, por exemplo dentro da gama de um máximo de 0,05 a 5 mg/kg de peso corporal. Esta dosagem pode ser administrada toda de uma vez ou em múltiplas doses distribuídas ao longo do dia, dependendo do tipo de doença, da natureza da doença, da idade e do género do paciente.

Como resultado da acção anti-citóquinas da proteína CC10 de células Clara, a proteína CC10 de células Clara encontra aplicação particular no tratamento de doenças auto-imunes, tais como tiroidite de Hashimoto, lúpus eritematoso, artrite reumatóide, esclerose múltipla, infecção crónica. A proteína CC10 de células Clara pode ainda ser aplicada para utilização na prevenção de rejeição de tecidos após transplantação; para tratamento de infertilidade, choque séptico, alergia, cirrose biliar, miastenia grave; ou para prevenir o nascimento prematuro, o aborto por septicemia Gram-negativa. A proteína CC10 de células Clara pode além disso ser utilizada em diagnóstico, porque a sua concentração em fluidos corporais tais como a urina, o sangue, o fluido amniótico, o fluido sinovial, a lavagem pulmonar, o fluido 3 85 267 ΕΡ Ο 617 965/ΡΤ cerebrospinal, ο fluido seminal e semelhantes, representa uma medida do estado imunitário e dá uma impressão da operação da chamada rede de citóquinas, pelo que a concentração da proteína CC10 de células Clara tem um valor preditivo em relação às doenças anteriormente mencionadas.

Será aparente aos peritos na arte que, em adição à proteína CC10 de células Clara, estruturas proteicas e polipeptídicas derivadas são também adequadas para utilização de acordo com a invenção, desde que estas estruturas apresentem substancialmente a mesma actividade biológica. A acção anti-citóquinas da proteína CC10 de células Clara será elucidada adiante com base em vários exemplos que mostram claramente a acção de mediação imunitária ao nível de um bloqueio da produção de gama-interferão, em particular quando induzida por IL-2. EXEMPLO 1 Célula mononucleares (CMN) originárias de um único dador, foram isoladas a partir de crostas leucocíticas frescas por centrifugação em lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Noruega) e cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco Ltd., Paisley, Escócia) suplementado com soro de vitelo fetal inactivado pelo calor a 10% (v/v) com gentamicina a 0,1% (v/v) e L-glutamina (2 mM). Quando necessário, removeram-se monócitos por adesão a plástico (1 hora, 37°C, C02 a 5% (v/v)), após o que se avaliou a pureza em linfócitos através de uma coloração com esterase não específica. Incubaram-se as células na presença de proteína CC10 de células Clara e estimularam-se após 3 horas por adição de um agente indutor. Recolheram-se amostras a partir do sobrenadante em cada 24 horas durante 4-7 dias. A Figura 1 apresenta a produção de gama-IFN por estas células mononucleares (2x10® células/ml) após estimulação com fito-hemaglutinina (PHA, Welcon, Beckingham, RU), IL-2 e uma cultura mista de leucócitos (CML). Como se pode observar da Figura 1, a produção de gama-IFN é claramente inibida. A produção de gama-IFN foi mínima na presença de 1,5μg/ml de proteína CC10 de células Clara quando se utilizaram IL-2 ou CML. A extensão da inibição máxima variou de 75% (PHA) a 95% (IL-2 e CML).

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Mediu-se a concentração de gama-IFN utilizando um teste ELISA Standard e corrigiram-se os valores obtidos em relação à preparação padrão internacional Gg 23-901-530-g (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH, Bethesda, EUA).

Ensaiou-se ainda a concentração de gama-IFN num teste antiviral utilizando células A459 humanas, que foram infectadas com vírus de encefalomiocardite (vírus EMC) após um período de 24 horas de incubação com diluições do sobrenadante. Uma vez mais, os valores são corrigidos contra um padrão internacional (National Biological Standards Board, National Institute of Standards and Control, Hertfordshire EN6 3QG UK, Padrão 86-504 de IL-2 humana). EXEMPLO 2

Estimularam-se com IL-2, CMN esgotadas de monócitos por adesão a plástico (pureza em linfócitos de 95%). Como mostrado na Figura 2, houve apenas um ligeiro aumento na produção total de gama-IFN. Ao contrário, a extensão da inibição induzida incluindo proteína CC10 de células Clara num meio de cultura, permaneceu constante. A inibição por proteína CC10 de células Clara não é portanto o resultado de inactivação da função dos monócitos. EXEMPLO 3 A proteína CC10 de células Clara é radioactivamente marcada com [125l] de acordo com o método da cloramina T. Incubou-se subsequentemente a [125I]-CC10 com 3x106 CMN ou células A549 no mesmo meio que no exemplo 1 durante 2 horas a 4°C. Repetiu-se a mesma experiência na presença de um excesso de CC10 não marcada radioactivamente. Após separação, verificou-se que a CC10 tinha aderido às CMN ou às células A549 em menos de 2%. EXEMPLO 4

Repetiu-se o exemplo 1 com monómero de CC10, i.e., após redução das pontes de dissulfureto com ditiotreitol e bloqueio dos grupos tiol por meio de etilação com piridilo. Verificou-se o efeito de monómero CC10 sobre a produção de gama-interferão por células CMN estimuladas com OK-432. Em contraste com o dímero de CC10, que inibiu a produção de gama-IFN em 33% numa concentração de 100 ng/ml, não se observou qualquer efeito do monómero de CC10 à mesma concentração. 5 85 267 ΕΡ Ο 617 965/ΡΤ EXEMPLO 5 A proteína CC10 de células Clara reduz a fagocitose de monócitos como resultado da estimulação com gama-interferão. A fagocitose por monócitos, que é gerada por adição de Zymosan A (marca registada), foi medida por meio de bioluminescência após pré-incubação durante a noite com 10 unidades/ml de gama-interferão, que resultou num aumento de 68%. Quando antes da incubação com gama-interferão as células foram tratadas durante 3 horas com proteína CC10 de células Clara (concentração de 100ng/ml), o efeito do gama-interferão foi inibido em mais de 70%. EXEMPLO 6

Estimularam-se leucócitos humanos para produção de gama-interferão, com e sem pré-tratamento com proteína CC10 de células Clara. Subsequentemente extraiu-se o ARN, e quantificou-se o ARNm que codifica para o gama-interferão. Por meio de PCR demonstrou-se que ocorreu uma diminuição significativa na quantidade de ARNm como resultado do tratamento com proteína CC10 de células Clara.

Lisboa, 19. CIZ. 2ΰυϋ

Por MARC JOZEF PHILEMON DE LEY - O AGENTE OFICIAL -

Claims

85 267 ΕΡ Ο 617 965/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína CC10 de células Clara ou um seu derivado activo para utilização como medicamento.
2. Proteína CC10 de células Clara ou um seu derivado activo, de acordo com a reivindicação 1, para utilização como inibidor da acção de citóquinas.
3. Proteína CC10 de células Clara ou um seu derivado activo, de acordo com a reivindicação 1, para utilização no tratamento de uma doença auto-imune.
4. Proteína CC10 de células Clara ou um seu derivado activo, de acordo com a reivindicação 1, para utilização no tratamento de tiroidite de Hashimoto, lúpus eritematoso, artrite reumatóide, esclerose múltipla, infecção crónica.
5. Proteína CC10 de células Clara ou um seu derivado activo, de acordo com a reivindicação 1, para utilização: i) na prevenção de rejeição de tecidos após transplantação; ii) para tratamento de infertilidade, choque séptico, alergia, cirrose biliar, miastenia grave; ou iii) para evitar o nascimento prematuro, o aborto por septicemia Gram-negativa.
6. Proteína CC10 de células Clara ou um seu derivado activo, de acordo com a reivindicação 1, para utilização em diagnóstico.
7. Proteína CC10 de células Clara ou um seu derivado activo, de acordo com a reivindicação 1, para utilização na determinação do estado imunitário do organismo. Lisboa, 1¾ UL 20CU Por MARC JOZEF PHILEMON DE LEY

Ag. Of. Pr. Ind. Ree das Flores, 74 - 4.· 12ΘΟ LISBOA DA CUHHA FERREIRA