PT2814981T - Dispositivo de colheita de sangue para estabilizar adn plasmático livre de célula - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "DISPOSITIVO DE COLHEITA DE SANGUE PARA ESTABILIZAR ADN PLASMÁTICO LIVRE DE CÉLULA"

CAMPO DA INVENÇÃO

Os ensinamentos no presente documento referem-se a dispositivos e métodos para estabilizar e preservar o ADN livre de célula sem danificar a integridade de ADN para proteção melhorada e regulação de materiais de ácido nucleico durante colheita, armazenamento e envio. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO. 0 ADN livre de célula (cfDNA)) ocorre naturalmente no sangue e foi amplamente atribuído aos processos apoptóticos e necróticos. Enquanto a presença de cfDNA no sangue foi constatada em 1948, as suas implicações na medicina clinica não foram realizadas durante mais de duas décadas. Especificamente, foi demonstrado que o cfDNA esteve presente no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistémico e que níveis de cfDNA foram elevados no soro de pacientes com cancro. Essas constatações despertaram um interesse na potencial utilização de cfDNA em diagnóstico e prognóstico de doença. Todas as investigações executadas em pacientes com artrite reumatoide, cancros colorretal, da mama, pancreático, de cabeça e pescoço mostraram um aumento assinalável em concentrações de cfDNA. 0 cfDNA extraído do plasma ou soro de pacientes com cancro mostrou características típicas de ADN de tumor e pode servir como biomarcadores não invasivos para deteção e gestão de cancro.

Também há um interesse crescente na utilização potencial de ácidos nucleicos fetais livres de célula em diagnóstico pré-natal não invasivo. Lo et al. Lancet 350 (1997) 485 a 487 foram os primeiros a mostrar que amostras sanguíneas de doador gestante têm concentrações de cfDNA materno elevadas e também demonstraram a presença de cfDNA fetal no plasma materno. As aplicações clinicas que envolvem análise de cfDNA fetal incluem determinação de sexo, distúrbios de gene único, distúrbios relacionados com a gestação e deteção de aneuploidia.

Desde esse tempo, um corpo cumulativo de pesquisa identificou cfDNA tanto como um indicador de prognóstico e diagnóstico para múltiplas afeções patogénicas; isto é, alterações genéticas e epigenéticas associadas ao cancro, mutação de ADN fetal e diagnóstico pré-natal e infeção virai através de deteção de ADN virai em sangue humano. Como tal, a deteção precisa de cfDNA em espécies biológicas humanas torna-se um meio não invasivo convencional que permite a avaliação, triagem e classificação, bem como monitorização de doença durante análise clinica de rotina.

cfDNA refere-se aos fragmentos de ADN detetáveis em múltiplos fluidos corporais. O plasma ou soro são utilizados com mais frequência com esse propósito, no entanto, a presença de cfDNA foi detetada na urina, saliva, fezes, fluido sinovial, fluido cérebroespinal, e fluido peritoneal. A concentração de circulação média de cfDNA para um indivíduo saudável é de 30 ng/mL, o cfDNA geralmente tem fita dupla, e tem aproximadamente 0,18 a 21 quilobases em tamanho (Wagner, J. "Free DNAnew potential analyte in clinicai laboratory diagnostics?" Biochem Med (Zagreb) 22(1): 24 a 38). A deteção de cfDNA, no entanto, é particularmente desafiadora pelas seguintes razões: (1) durante o diagnóstico pré-natal, os materiais celulares maternais pré-dominantes podem interferir com a deteção fetal de cfDNA, (2) processamento de amostra após a colheita poder induzir à lise de célula, levar a aumentos aberrantes na quantidade de cfDNA circulante, e (3) o nível relativamente baixo de cfDNA destaca os riscos potenciais de geração de resultados falsos negativos devido à perda de sequências de cfDNA de alvo escassas - devido à instabilidade de amostra ou processamento de amostra inapropriado. Para esse fim, as estratégias para minimizar a contaminação de ADN celular e preservar o cfDNA incluíram vários fatores pré-clínicos como o tipo de tubos de colheita sanguínea, condições de armazenamento de amostra e protocolos de centrifugação. Por exemplo, o anticoagulante como EDTA, heparina e citrato impedem a coagulação de células sanguíneas totais, o que se pensa que reduz a libertação de ADN da população de célula de leucócito. Adicionalmente, a otimização de condições de centrifugação é exigida para impedir a lise, mas separar adequadamente as células adequadas de plasma livre de célula.

Devido à abundância dos biomarcadores de cfDNA, é recomendado que os níveis de fundo de ADN genómico (gDNA) sejam minimizados para fornecer níveis de cfDNA de medições precisas. É adicionalmente benéfico que a integridade estrutural do cfDNA seja mantida devido às quantidades mínimas disponíveis para análise. É necessário, portanto, abordar diversos problemas pré-analíticos que surgem durante o tempo entre a extração de sangue e o isolamento de ADN subsequente. Esses problemas incluem atrasos no processamento de sangue, temperatura de armazenamento de sangue e uma agitação da amostra durante o transporte e envio de sangue. Tais condições podem alterar os níveis de ADN de plasma (pDNA) ao provocar a libertação de gDNA a partir das células sanguíneas nucleadas lisadas e ofuscar o cfDNA verdadeiro. Como resultado, é importante considerar o tipo de dispositivo de colheita de sangue e afeções pós-flebotomia durante o trabalho com amostras de cfDNA.

Os esforços anteriores focaram-se em métodos químicos, como a utilização de fixação à base de formaldeído para enriquecer a concentração de fração de cfDNA e estender o tempo após a flebotomia que uma amostra pode ser analisada de modo eficaz. No entanto, os estudos que examinam a eficácia de preservação de formaldeído de sangue total para a análise de prazo estendido de concentrações de cfDNA em amostras biológicas forneceram inconsistências estatísticas. Por exemplo, foi demonstrado que tratar uma amostra sanguínea com formaldeído imediatamente após a extração de sangue não teve efeitos benéficos na preservação da proporção de cfDNA fetal em plasma maternal. (Chinnapapagari SKR, Holzgreve W, Lapaire 0, et al. 2004. 0 tratamento de amostras sanguíneas maternais com formaldeído não altera a proporção de ácidos nucleicos fetais circulatórios (ADN e ARN) em plasma maternal. Clin Chem 51:652 a 655 e Chiu RWK, Chan KCA, Lau TK, et al. 2004.

Lack of dramatic enrichment of fetal DNA in maternal plasma by formaldehyde treatment. Clin Chem 51:655 a 658). Também foi relatado que formaldeído tem efeitos prejudiciais em ácidos nucleicos plasmáticos (Chung GTY, Chiu RWK, Chan KCA, Lau TK, Leung TN, Chan LW e LO YMD. 2005. Detrimental effect of formaldehyde on plasma RNA detection. Clin Chem 51:1074 a 1076). Isso sugeriu que, embora a fixação de formaldeido possa impedir a contaminação de concentrações de cfDNA por ADN celular, formaldeido e estabilizadores químicos à base de formaldeído sozinhos podem ser inadequados tanto para a análise exata quanto precisa de concentração de cfDNA por períodos de tempo estendidos antes da análise de amostra. O documento n- U.S. 2010/184069 AI refere-se ao diagnóstico pré-natal e revela um método para preservar ácidos nucleicos fetais localizados dentro do plasma maternal, em que o ácido nucleico fetal é tratado para reduzir tanto a lise celular de células sanguíneas maternais quanto a atividade de desoxirribonuclease e ribonuclease dentro dos ácidos nucleicos fetais. Schatz et al. ("Preservation of Cell-free DNA in Stored Blood Samples for the Analysis of the mSEPT9 Colorectal Câncer Screening Marker Enables Sample Shipment by Mail", Maio de 2011 - publicado como um póster na conferência na federação internacional de química clínica e medicina laboratorial Worldlab e EU, Berlim, Alemanha) revela a utilização de tubos de colheita de sangue livre de célula de ADN (BCT). O documento η- EP 2 674 502 Al refere-se a um método para armazenar amostras sanguíneas e preservar ácidos nucleicos, em que uma amostra faz contacto, num recipiente de colheita, com uma solução de preservação que inclui citrato de sódio, EDTA e tris(hidroximetil) aminometano (Tris) como um tampão.

Aqui, há uma necessidade, desse modo, de métodos para estabilizar e proteger o cfDNA pelos quais a integridade estrutural é mantida e o ADN de fundo genómico é minimizado, para que o envio e o armazenamento sejam possíveis com efeito minimo no cfDNA. Há uma necessidade adicional para tais métodos em que os efeitos prejudiciais de fixação de aldeido são evitados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os ensinamentos no presente documento empregam um protocolo que utiliza uma composição de agente protetor única que preserva de modo bem-sucedido as amostras ao mesmo tempo que estabiliza a integridade de ADN durante um periodo prolongado (por exemplo, que pode ser pelo menos 14 dias e que pode estar à temperatura ambiente) com a utilização de diversas técnicas analíticas. Os presentes ensinamentos fornecem um método consistente e eficaz para preservar ácidos nucleicos em amostradores biológicos, e particularmente para preservar ADN em plasma. Os dados demonstrados no presente documento descrevem um método que reduz a lise de célula sanguínea, atividade de nuclease e permite a análise analítica exata e precisa em função da preservação da concentração final de cfDNA recuperável ao longo do tempo. Ao fazer isso, os ensinamentos fornecem uma abordagem inovadora que melhora a análise clínica a jusante de cfDNA em plasma. A presente invenção impede a contaminação de cfDNA plasmático com ADN celular (por exemplo, ADN ou gDNA genómico) que é libertado de células danificadas ao estabilizar células sanguíneas dentro de uma amostra. Os presentes ensinamentos descrevem a proteção do cfDNA ao inibir a atividade de desoxirribonuclease no plasma. Como resultados de estabilização de célula sanguinea nucleada, deixa de ser necessário separar o plasma imediatamente após a flebotomia. Adicionalmente, as amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante até 14 dias sem efeitos deletérios à integridade de amostra, as quais eliminam a necessidade de armazenamento frio da amostra plasmática.

Os presentes ensinamentos fornecem adicionalmente os dispositivos de colheita de sangue que reduzem os niveis de fundo de ADN genómico (gDNA) em plasma em comparação com tubos de K3EDTA, quando submetidos a condições que podem ocorrer durante o armazenamento e o envio de amostra. Em um aspeto, os presentes ensinamentos contemplam um método para tratamento de amostra sanguinea que compreende localizar um agente protetor nos dispositivos de colheita de sangue descritos no presente documento. 0 agente protetor pode incluir um conservante. A amostra sanguinea pode ser extraída para o dispositivo de colheita de sangue, sendo que a amostra sanguínea tem uma primeira concentração de pDNA. 0 dispositivo de colheita de sangue que contém uma amostra sanguínea pode ser transportado a partir de uma primeira localização para uma segunda localização, em que pelo menos uma porção do transporte ocorre a uma temperatura maior que cerca de 0 °C. 0 cfDNA da amostra pode ser isolado pelo menos 24 horas após a extração de sangue, em que a amostra tem uma segunda concentração de pDNA, em que a segunda concentração de pDNA não é mais alta que a primeira concentração de pDNA por qualquer valor estatisticamente significativo.

Os ensinamentos no presente documento incluem adicionalmente o facto de que o conservante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em diazolidinil ureia e imidazolidinil ureia. A concentração do conservante antes da etapa de contacto pode estar entre cerca de 0,1 g/mL e cerca de 3 g/mL. O ADN livre de célula pode ser isolado da amostra pelo menos 3 dias após a extração de sangue. O ADN livre de célula pode ser isolado da amostra pelo menos 7 dias após a extração de sangue. O ADN livre de célula pode ser isolado da amostra pelo menos 14 dias após a extração de sangue. A amostra pode ter uma primeira concentração de gDNA na extração de sangue e uma segunda concentração de gDNA após o transporte e a segunda concentração de gDNA não é mais alta que a primeira concentração de gDNA em qualquer valor estatisticamente significativo. A etapa de transporte também pode ocorrer sem congelar a amostra sanguínea a uma temperatura mais fria que cerca de -30 °C. O agente protetor pode fazer contacto com o ADN livre de célula para que, após um período de pelo menos 7 dias a partir do mesmo momento em que a amostra sanguínea é extraída, a quantidade de ADN livre de célula seja pelo menos cerca de 90% da quantidade de ADN livre de célula no momento em que a amostra sanguínea é extraída. O agente protetor pode fazer contacto com o ADN livre de célula para que, após um período de pelo menos 7 dias a partir do momento em que a amostra sanguínea é extraída, a quantidade de ADN livre de célula presente na amostra seja cerca de 100% da quantidade de ADN livre de célula presente na amostra no momento em que a amostra sanguínea é extraída.

Os ensinamentos no presente documento contemplam composições de agente protetor melhoradas e métodos para estabilizar uma amostra biológica para análise. As composições de agente protetor geralmente incluirão um agente conservante conforme descrito no presente documento, e um agente de arrefecimento brusco para abater substancialmente qualquer aldeído livre (por exemplo, formaldeído) da reação com ADN dentro de uma amostra. Os métodos de acordo com a invenção compreendem uma etapa de obter num dispositivo recipiente de colheita de amostra uma amostra biológica que inclui pelo menos um primeiro ácido nucleico livre de célula de circulação, que é ADN, a partir de um indivíduo que contém um ácido nucleico próprio do indivíduo. Os métodos incluem uma etapa de colocar a amostra biológica em contacto, enquanto dentro do dispositivo de colheita de sangue, com uma composição de agente protetor que inclui um agente conservante, um anticoagulante e um agente de arrefecimento brusco para formar uma mistura que inclui a composição de agente protetor e uma amostra. Os métodos incluem uma etapa de arrefecer bruscamente qualquer formaldeído livre que pode estar presente com o agente de arrefecimento brusco a partir da composição de agente protetor para que o formaldeído livre reaja para formar um produto de reação que é inerte ao cfDNA da amostra biológica. A mistura resultante é desprovida de qualquer aldeído, e cfDNA ou outros ácidos nucleicos dentro da amostra são adequados para reação em cadeia da polimerase, sequenciação de ADN e outras aplicações a jusante sem congelar a amostra durante pelo menos 7 dias. A mistura resultante é substancialmente desprovida (i) de reticulação de ácido nucleico (ADN) para proteina, (ii) reticulações de ácido nucleico (ADN) para ácido nucleico (ADN) intramolecular e/ou intermolecular induzidas por aldeído; ou tanto (i) quanto (ii), para formar, assim, uma amostra que seja amplificável por reação em cadeia da polimerase (PCR), adequada para sequenciação de ADN e analisável por análise de número variável de repetições em tandem (VNTR), ou ambos.

Para amostras derivadas do sangue, pode haver uma etapa de extração de sangue para extrair sangue de um paciente para um dispositivo de colheita de sangue que tem a composição de agente protetor carregada no mesmo antes da etapa de extração de sangue. 0 método pode incluir uma etapa de transportar a amostra enquanto a mesma faz contacto com a composição de agente protetor a partir de um local de extração de sangue para um laboratório clínico (por exemplo, um localizado a pelo menos 100 metros, 1.000 metros, 10.000 metros de distância do local de extração de sangue) no qual a análise de amostra ocorrerá. O arrefecimento brusco ocorre antes e/ou substancial e simultaneamente com a etapa de contacto. Os métodos podem incluir uma etapa de isolar o ADN livre de célula da amostra. Os métodos podem ser livres de qualquer etapa de centrifugação da amostra. Os métodos podem ser livres de qualquer etapa de isolar o ADN fetal livre de célula do sangue materno. Os métodos podem ser livres de qualquer etapa de refrigerar a amostra (por exemplo, a uma temperatura abaixo da temperatura ambiente, como cerca de 10 °C ou mais fria) após ter feito contacto com a composição de agente protetor.

Conforme pode ser notado a partir do supracitado, os ensinamentos no presente documento fornecem o tratamento vantajoso de amostras que contêm ADN e fornecem amostras estabilizadas que são essencialmente livres de modificações covalentes detetáveis que inibem a amplificação de PCR, como ao inibir a ligação e o alongamento de polimerase, iniciador anelamento, e/ou intercalação de corante de ADN (como com verde SYBR ou brometo de etidio). Quaisquer modificações aos ácidos nucleicos (ADN) que podem inibir a análise de PCR exata e a sequenciação de ADN como resultado de tratamento com as composições de agente protetor dos presentes ensinamentos é atrasada durante pelo menos 24, 48 ou 9 6 horas, 1 semana ou até mesmo duas semanas. Há uma ausência substancial de qualquer indicação de interação de composição de agente protetor com o ADN que é aleatório em natureza, aumenta ao longo do tempo ou ambos. Desse modo, a utilização dos ensinamentos no presente documento possibilita a previsibilidade maior no auxilio de garantir que qualquer sequência de ADN de interesse que deve ser amplificada ou sequenciada não será danificada. Isso fornece uma vantagem sob o tratamento de ADN apenas com formaldeido. Isto é, acredita-se que a modificação de formaldeido impedirá imediatamente a amplificação de alguns genes e o número de genes que não são amplificados aumentará com o tempo. Não há previsão de quais os genes que serão modificados primeiro. Como resultado, um clinico pode ser incapaz de detetar certos biomarcadores, e/ou outras caracteristicas de gene (como mutações de gene criticas ou deleções que efetuam o desenvolvimento fetal, no contexto de análise de ADN fetal livre de célula).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura la mostra um gráfico que exibe o efeito de uma composição de agente protetor exemplificativa na deteção de pDNA por qPCR a 3 e 6 horas após a extração de sangue. A Figura lb mostra uma representação gráfica do efeito de uma composição de agente protetor exemplificativa de acordo com os ensinamentos no presente documento sobre deteção de pDNA por qPCR em 7 e 14 dias após a extração de sangue. A Figura 2a mostra uma representação gráfica do efeito de gDNA de fundo elevado em plasma na deteção de sequências de ADN raras. A Figura 2b mostra uma representação gráfica do efeito de gDNA de fundo elevado em plasma na deteção de sequências de ADN raras e o efeito de uma composição de agente protetor exemplificativa de acordo com os ensinamentos no presente documento.

As Figuras 3a e 3b mostram representações gráficas do efeito de agitação e envio em concentração de pDNA em amostras sanguíneas, incluindo as amostras sanguíneas tratadas com uma composição de agente protetor exemplificativa num dispositivo de colheita de sangue de acordo com os presentes ensinamentos e amostras sanguíneas em tubos de K3EDTA padrão.

As Figuras 4a e 4b mostram representações gráficas da temperatura de armazenamento na concentração de pDNA em amostras sanguíneas, incluindo as amostras sanguíneas tratadas com uma composição de agente protetor exemplificativa num dispositivo de colheita de sangue de acordo com os presentes ensinamentos e amostras sanguíneas em tubos de K3EDTA padrão. A Figura 5 é uma representação esquemática para ilustrar as interações potenciais entre um aldeído (por exemplo, formaldeído) e uma amostra de ADN genómico.

As Figuras 6a e 6b representam os diagramas esquemáticos de um dos diversos modos de ADN-ADN e um dos diversos modos de reações de reticulação de ADN-proteína. A Figura 7a é uma leitura de ressonância magnética nuclear (RMN) de 13C para uma amostra tratada com uma composição de agente protetor exemplificativa de acordo com os presentes ensinamentos que ilustra a ausência substancial de qualquer pico em 82 ppm, o que sustenta que a amostra tratada seja essencialmente livre de qualquer formaldeído livre. A Figura 7b é uma leitura de RMN de 13C comparativa para uma amostra de formaldeído de acordo com os presentes ensinamentos que ilustra a presença característica de um pico em 82 ppm. A Figura 8a é uma série de plotagens de intensidade de espectrometria de fluorescência (flr) para comparar uma amostra de controlo que contém ADN ("(controlo) de ADN") e amostras que contêm ADN tratadas com uma de entre uma composição de agente protetor ("ADN+CF ADN-1") de acordo com os presentes ensinamentos, formaldeído ("ADN+0,1% de Form") ou glutaraldeído ("ADN+0,1% de Glut"); com a série que mostra as amostras após sete dias à temperatura ambiente (Plotagem superior: "RT em 7 Dias"), amostras após sete dias à temperatura ambiente seguidos por aquecimento durante uma hora a 60 °C (Plotagem intermediária: "RT em 7 Dias + 60°C - 1 h"), e amostras após sete dias à temperatura ambiente seguidos por aquecimento durante dois minutos a 90°C (Plotagem intermediária "RT em 7 Dias + 90°C - 2 min"). A Figura 8b é uma série de plotagens de intensidade de espectrometria de fluorescência (flr) para comparar uma amostra de controlo que contém ADN ("(controlo) de ADN") e amostras que contêm ADN tratadas com um de entre uma composição de agente protetor ("ADN+CF ADN-1") de acordo com os presentes ensinamentos, formaldeído ("ADN+0,1% de Form") ou glutaraldeído ("ADN+0,1% de Glut"); com a série que mostra amostras após catorze dias à temperatura ambiente (Plotagem superior; "RT a 14 Dias"), amostras após catorze dias à temperatura ambiente seguidos por aquecimento durante uma hora a 60 °C (Plotagem intermediária: "RT-14 Dias + 60°C - 1 h"), e amostras após catorze dias à temperatura ambiente seguidos por aquecimento durante dois minutos a 90 °C (Plotagem intermediária: "RT-14 Dias + 90°C - 2 min")

As Figuras 9a a 9c são imagens de eletroforese em gel que ilustram e comparam a amplificação de PCR de ADN não tratado (ADN de controlo); amostras de ADN tratadas com uma composição de acordo com o presente ensinamento (denotadas por ADN+CF-ADN-BCT), amostras de ADN tratadas com formaldeido (denotadas por ADN+Form) e amostras de ADN tratadas com glutaraldeido (denotadas por ADN+Glut).

As Figuras 10a a lOd são plotagens gue indicam os resultados de análise quantitativa em tempo real para a amplificação de reação em cadeia da polimerase (PCR) de amostras de ADN tratadas com um de entre uma composição de agente protetor ("ADN+cfDNA-BCT") de acordo com os presentes ensinamentos na qual uma amostra é extraida para um dispositivo de colheita de sangue que contém uma composição de agente protetor dos presentes ensinamentos, formaldeido ("ADN+0,1% de form") ou glutaraldeido ("ADN+0,1% de glut) e em comparação com uma amostra de controlo de ADN não tratada ("Controlo de ADN"). A Figura 11 mostra uma representação gráfica que indica a análise quantitativa em tempo real para amplificação de reação em cadeia da polimerase (PCR) de amostras que contêm ADN tratadas com um de entre uma composição de agente protetor ("ADN+cfDNA-BCT") de acordo com os presentes ensinamentos na qual uma amostra é extraida para um dispositivo de colheita de sangue que contém uma composição de agente protetor dos presentes ensinamentos, formaldeido ("ADN+0,1% de formaldeido") ou glutaraldeido ("ADN+0,1% de glutaraldeido) e em comparação com uma amostra de controlo de ADN não tratada ("Controlo de ADN").

As Figuras 12a e 12b são plotagens de espectros de dicroísmo circulares que ilustram plotagens de controlo de ADN nativo (a curva denotada "ADN-RT" que começa mais ao fundo na intersecção com o eixo geométrico y); a amostra de ADN tratada de acordo com os presentes ensinamentos (a curva denotada "ADN+CF ADN BCT-RT" que começa na localização mais alta na sua intersecção com o eixo geométrico y) ; e a amostra de ADN tratada com formaldeido (a curva denotada "ADN=0,1% de form à RT").

As Figuras 13a a 13d são imagens de eletroforese em gel de agarose que ilustram várias faixas paralelas e comparam amostras de controlo não tratadas (denotadas por "ADN Nativo"; faixas 1, 2, 8 e 9); amostras de ADN tratadas com uma composição de agente protetor de acordo com os presentes ensinamentos (denotados por "ADN+cfDNA"; faixas 3, 4, 10 e 11); amostras de ADN tratadas apenas com imidazolidinil ureia (denotadas por "ADN+IDU"; faixas 5 e 12); amostras tratadas com formaldeido (denotadas por "ADN+0,1% de form"; faixas 6 e 13); e amostras tratadas com glutaraldeido (denotadas por "ADN+0,1% de glut"; faixas 7 e 14) . A Figura 14 mostra uma representação gráfica do efeito de tratamento de DNase de plasma em concentração de cfDNA. A Figura 15 mostra uma representação gráfica do efeito de armazenamento em concentração de cfDNA em amostras sanguíneas em tubos de K3EDTA. A Figura 16 mostra uma representação gráfica do efeito de armazenamento na concentração de cfDNA em amostras sanguíneas em dispositivos de colheita de sangue de acordo com os presentes ensinamentos. A Figura 17 mostra a equação química para uma etapa de arrefecimento brusco exemplificativa de acordo com os presentes ensinamentos. A Figura 18 mostra a equação química para uma etapa de arrefecimento brusco exemplificativa adicional de acordo com os presentes ensinamentos. A Figura 19 mostra uma representação gráfica de libertação de formaldeído e arrefecimento brusco com vários agentes. A Figura 20 mostra a presença de formaldeído hidratado com vários agentes de arrefecimento brusco. A Figura 21 mostra as concentrações de formaldeído na presença de vários agentes de arrefecimento brusco. A Figura 22 mostra equações químicas possíveis para a libertação de formaldeído hidratado. A Figura 23 mostra a presença química na mistura de glicina/formaldeído. A Figura 24 mostra a equação química para a reação de glicina e formaldeído à temperatura ambiente. A Figura 25 mostra a equação química para a reação de glicina e formaldeído a 50°C durante 4 dias. A Figura 26 mostra as equações químicas possíveis para a libertação de formaldeído e reação de formaldeído/glicina subsequente. A Figura 27 mostra a equação química para a reação de agente de arrefecimento brusco/formaldeído.

DESCRIÇÃO DETALHADA A menos que declarado de outro modo, a percentagem conforme estabelecido no presente documento se referem à percentagem em peso. Adicionalmente, a menos que o contexto da discussão torne claro o contrário, as referências a ácido nucleico podem incluir ácido ribonucleico (ARN), ácido desoxirribonucleico (ADN) ou fragmentos de qualquer um dos mesmos. Desse modo, por exemplo, a discussão de ADN livre de célula (cfDNA) refere-se não apenas ao ADN livre de célula, como também aos fragmentos de ADN.

Os presentes ensinamentos contemplam um método de triagem genética não invasiva para a identificação de características de sequência de ADN que são potencialmente indicativas de várias afeções patológicas, incluindo, mas sem limitação: cancro, um distúrbio neurogenerativo, um distúrbio psiquiátrico, infeção virai, diagnóstico pré-natal, doenças autoimunes, microquimerismo, enfarte agudo do miocárdio, derrame, isquemia mesentérica e pancreatite. Os ensinamentos no presente documento perspetivam não apenas preservar o estado de quaisquer células numa amostra (por exemplo, ao estabilizar as membranas celulares para que os ácidos nucleicos sejam impedidos de serem libertados de dentro das células), mas também perspetivam proteger o ADN livre de célula de efeitos adversos de atividade de desoxirribonuclease. Os métodos dos ensinamentos no presente documento envolvem geralmente etapas de contacto de uma amostra biológica (cuja amostra pode ser opcionalmente livre de qualquer ADN fetal (por exemplo, pode ser livre de qualquer ADN fetal livre de célula)), e que pode incluir múltiplas células sanguíneas e biomoléculas livres de célula) , com uma composição de agente protetor livre de aldeído (por exemplo, livre de formaldeído) numa quantidade e num tempo que é suficiente para impedir (1) a libertação de ADN genómico na amostra sanguínea e (2) a atividade de desoxirribonuclease que degrada os ácidos nucleicos livres de célula (por exemplo, cfDNA) na amostra. 0 tratamento é de modo que impeça substancialmente qualquer aldeído livre de reagir de modo adverso com os ácidos nucleicos livres de célula da amostra (por exemplo, cfDNA) , tal como ao empregar um agente de arrefecimento brusco. Dessa maneira, as quantidades substanciais de cfDNA podem ser isoladas da amostra com pouca preocupação de que o cfDNA isolado contém ADN libertado por uma célula da amostra após a amostra ter sido obtida. A integridade de ácido nucleico (por exemplo, a integridade de cfDNA) é substancialmente preservada no seu estado fornecido (por exemplo, o estado no momento de extração de sangue) ao evitar os efeitos de danificação de qualquer aldeído (por exemplo, formaldeído). Desse modo, a análise analítica exata e precisa do ácido nucleico (por exemplo, cfDNA em plasma) da amostra pode ser alcançada. 0 método pode incluir adicionalmente as etapas para analisar o ácido nucleico (por exemplo, cfDNA) de uma amostra que foi tratada de acordo com o supracitado, ou que esteve em contacto de outro modo com a composição de aqente protetor e o agente de arrefecimento brusco na mesma. Conforme notado, os ensinamentos no presente documento permitem a identificação de caracteristicas de cfDNA para utilização de prognóstico e diagnóstico de várias afeções patológicas na clinica.

Os produtos químicos à base de aldeído, como formaldeído e glutaraldeído, reagem com uma variedade de constituintes celulares nucleofílicos que formam, por exemplo, derivados de metilol do grupo mercaptano de glutationa e os grupos amino de ARN, ADN e proteína. Além disso, esses aldeídos atuam como agentes de reticulação que produzem reticulações intramoleculares e intermoleculares de ADN-proteína e ADN-ADN. A combinação das modificações de ADN induzidas por formaldeído listadas acima podem afetar a dissociação de ADN, a capacidade para amplificação de ADN durante a análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciação de ADN. Para estudos genéticos projetados em torno da PCR, isso pode provocar uma diminuição nas concentrações de cfDNA e prejudicar a deteção de alvos de ADN raros após fixação prolongada com formaldeído. Além dos efeitos prejudiciais que os fixadores à base de aldeído têm em análise com base em PCR de ADN, Ganguly et al. mostraram as heterogeneidades em espectros de emissão de fluorescência em amostras de ADN fixadas por formaldeído, as quais se manifestaram em dados de sinal e espúrios fluorescentes gerais inferiores (Ganguly S, Clayton AHA, e

Chattopadhyay A, 2011 Bioche. Biophy. Res. Comm. 405: 234 a 237) . A fixação altera a vida útil de fluorescência e anisotropia de células que expressam o recetor de serotoninaiA etiquetado por EYFP. De modo geral, o corpo de trabalho nesse campo sugere que o formaldeido pode funcionar de modo bem-sucedido como um conservante celular, ser prejudicial para análises analíticas a jusante para medir as concentrações de cfDNA exatas, detetar alvos de ADN raros e sequenciação de ADN propensos a serem resultantes das modificações quimicas adversas coerentes com a fixação prolongada de biomoléculas (isto é, ADN, ARN e proteina) . Portanto, para melhorar a análise analítica qualitativa e quantitativa de concentrações de cfDNA em fluido biológico humano, há uma exigência clara por um método eficaz em tempo e custo que seja livre de formaldeido e preserve a amostra biológica enquanto mantém a integridade, quantidade e especificidade de amostra do cfDNA a ser analisado.

Os ensinamentos no presente documento perspetivam que uma composição de agente protetor única possa ser empregue, a qual inclui uma composição conservante e agentes de arrefecimento brusco. Tal composição de agente protetor pode ser pré-carregada num dispositivo de colheita de amostra, como um tubo de colheita de sangue (o qual pode ser evacuado para uma pressão abaixo da pressão atmosférica após o carregamento). Desse modo, é possível que uma amostra possa ser retirada de um indivíduo diretamente para o dispositivo de colheita de amostra (por exemplo, um tubo de colheita de sangue), no momento em que entrará em contacto com a composição de agente protetor. Também é possível que uma amostra possa ser tomada a partir de um indivíduo para um primeiro recipiente e a amostra ser subsequentemente transferida a um ou mais segundos recipientes nos quais a composição de agente protetor está presente. A composição de agente protetor livre de aldeído (por exemplo, livre de formaldeído) de acordo com a invenção inclui uma composição conservante tal como uma selecionada a partir do grupo que consiste em: diazolidinil ureia, imidazolidinil ureia, dimetoilol-5,5-dimetil-hidantoína, dietil ureia, 2-bromo-2-nitropropano-l,3-diol, oxazolidinas, hidroximetil glicinato de sódio, 5-hidroximetoximetil-l-laza-3,7-dioxabiciclo [3.3.0]octano, 5-hidroximetil-l-laza-3,7-dioxabiciclo [3.3.0] octano, 5-hidroxipoli[metilenooxi]metil-l-laza-3,7-dioxabiciclo [3.3.0] octano, adamantina quaternária e qualquer combinação dos mesmos. Embora a composição de agente protetor livre de aldeído (por exemplo, livre de formaldeído) possa libertar um aldeído (por exemplo, formaldeído) , os ensinamentos no presente documento perspetivam uma etapa específica de arrefecer bruscamente o aldeído para tornar o mesmo inerte ao cfDNA. A composição conservante é desejavelmente utilizada em combinação com um agente de arrefecimento brusco para auxiliar na garantia de que o ácido nucleico (por exemplo, ADN) na amostra evita ser submetido a aldeído livre (por exemplo, formaldeído livre) que pode provocar um ou mais efeitos deletérios mediante o ácido nucleico). Consequentemente, os ensinamentos no presente documento contemplam uma utilização de pelo menos um agente de arrefecimento brusco de aldeído, o qual é empregue numa quantidade e de uma maneira suficiente para que qualquer aldeído livre (por exemplo, formaldeído) libertado da composição de agente protetor reaja para formar um produto de reação que é inerte ao ácido nucleico da amostra biológica, a mistura resultante seja desprovida de qualquer aldeído, e ácidos nucleicos dentro da amostra sejam adequados para reação em cadeia da polimerase e sequenciação de ADN, e exibam integridade estrutural comparável com os ácidos nucleicos nativos (por exemplo, ADN exibirá elipticidade que é substancialmente similar àquela de ADN nativo não tratado, conforme medido por espectroscopia de dicroísmo circular ou exibirá fluorescência de corante de ADN que é substancialmente similar àquela de ADN nativo não tratado, conforme medido por espectroscopia de fluorescência). A concentração da composição conservante antes do contacto de amostra pode estar a uma concentração na qual a reticulação de ADN para ADN e ADN para proteínas não é observada, conforme indicado por eletroforese em gel de agarose. A concentração da composição conservante após o contacto de amostra pode ser maior que cerca de 20 mg/mL, 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2 mg/mL ou ainda menor que cerca de 0,8 g/mL da mistura de composição de agente protetor e amostra biológica (por exemplo, sangue) . A concentração da composição conservante após o contacto de amostra pode ser maior que cerca de 0,1 g/mL da mistura de composição de agente protetor e amostra biológica (por exemplo, sangue). A título de exemplo, a concentração da composição conservante após o contacto de amostra pode estar entre aproximadamente 0,1 g/mL a aproximadamente 0,8 g/mL da mistura de composição de agente protetor e amostra biológica (por exemplo, sangue) . A concentração da composição conservante após o contacto de amostra pode estar entre aproximadamente 0,3 g/mL a aproximadamente 0,6 g/mL da mistura de composição de agente protetor e amostra biológica (por exemplo, sangue). A concentração da composição conservante tanto antes guanto após o contacto com uma amostra sanguínea pode ser modificada dependendo de a quais procedimentos de diagnóstico uma amostra pode ser submetida. Como exemplo, a concentração pode ser modificada no caso de uma amostra ser submetida à análise de citometria de fluxo. Mais especificamente, a concentração pode ser aumentada no caso de uma amostra ser submetida à análise de citometria de fluxo. Desse modo, a concentração da composição conservante após o contacto de amostra pode ser maior que cerca de 15 mg/mL, maior que cerca de 25 mg/mL, ou ainda maior que cerca de 30 mg/mL após o contacto de amostra. A formulação da composição de agente protetor (e da composição conservante contida na mesma) também pode ser modificada de modo que uma amostra que seja submetida à análise de citometria de fluxo possa conter diazolidinil ureia. A composição de agente protetor também pode incluir um agente de arrefecimento brusco. A composição de agente protetor também pode incluir EDTA. O agente de arrefecimento brusco pode ser um ou mais compostos que incluem pelo menos um grupo funcional com capacidade para reagir com um grupo funcional deficiente de eletrões de um aldeído (por exemplo, um composto de amina que reage com formaldeído para formar a base de Schiff de metilol e/ou imina ou um composto cis-diol que reage com formaldeído para formar um acetal cíclico). 0 agente de arrefecimento brusco pode ser selecionado de entre aminoácidos, alquilaminas, poliaminas, aminas primárias, aminas secundárias, sais de amónio, nucleobases ou qualquer combinação dos mesmos. 0 agente de arrefecimento brusco pode ser selecionado de entre glicina, lisina, etileno diamina, arginina, ureia, adinina, guanina, citosina, timina, espermidina ou qualquer combinação dos mesmos. A concentração do agente de arrefecimento brusco é uma quantidade que é suficientemente grande em que, após o contacto da amostra com a composição de agente protetor, há uma ausência de aldeído livre (por exemplo, uma ausência de formaldeído livre). No entanto, a concentração é suficientemente pequena de modo que a diluição da amostra não impacte materialmente qualquer característica analisada da amostra. A concentração do reagente de arrefecimento brusco de formaldeído após a etapa de contacto de amostra pode estar acima de cerca de 0,001 g/mL, 0,002 g/mL ou até mesmo cerca de 0,004 g/mL da mistura de composição de agente protetor e amostra biológica (por exemplo, sangue). A concentração do reagente de arrefecimento brusco de formaldeído após a etapa de contacto de amostra pode estar abaixo de cerca de 0,03 g/mL, 0,01 g/mL ou até mesmo cerca de 0,008 g/mL da mistura de composição de agente protetor e amostra biológica (por exemplo, sangue). A título de exemplo, a concentração do reagente de arrefecimento brusco de formaldeído após a etapa de contacto de amostra pode estar entre cerca de 0,004 g/mL a cerca de 0,008 g/mL.

Os ensinamentos no presente documento também perspetivam a utilização de um agente de arrefecimento brusco que é uma combinação de glicina com um ou mais agentes de arrefecimento brusco adicionais, ou um agente de arrefecimento brusco de um tipo e numa quantidade, conforme descrito no presente documento, que é diferente de glicina. Por exemplo, tal agente de arrefecimento brusco pode ser empregue (conforme ensinado no presente documento) em combinação com qualquer anticoagulante e com a composição conservante conforme descrito para tratar qualquer amostra que possa conter ADN livre de célula (por exemplo, ADN fetal livre de célula).

Mediante o contacto com uma amostra para formar uma mistura da amostra e composição de agente protetor (por exemplo, no momento de uma extração de sangue num dispositivo de colheita de sangue que contém uma composição de agente protetor dos ensinamentos no presente documento) , a composição de agente protetor pode estar presente numa fração pequena geral do volume de mistura. Por exemplo, a mesma pode estar presente numa quantidade que é menor que cerca de 5%, 2%, 0,5% ou ainda menor que cerca de 0,3% do volume de mistura geral. Por exemplo, a composição de agente protetor pode estar presente numa quantidade de cerca de 1:20 partes em volume a cerca de 1:300 partes em volume da mistura. A quantidade da composição de agente protetor pode estar presente de cerca de 1:50 partes em volume a cerca de 1:200 partes em volume da mistura.

Durante pelo menos a etapa de contacto, a quantidade da composição de agente protetor está presente de cerca de 1:20 (1 parte de composição de agente protetor para 20 partes de mistura total) partes em volume a cerca de 1:300 partes em volume da mistura total (que inclui tanto a composição de agente protetor quanto a amostra biológica). Por exemplo, durante pelo menos a etapa de contacto, a quantidade da composição de agente protetor está presente de cerca de 1:100 partes em volume a cerca de 1:200 partes em volume da mistura. A composição de agente protetor pode incluir pelo menos uma composição de agente protetor selecionada de entre diazolidinil ureia, imidazolidinil ureia, dimetoilol-5,5-dimetil-hidantoína, dimetilol ureia, 2-bromo-2,-nitropropano-1,3-diol, oxazolidinas, hidroximetil glicinato de sódio, 5-hidroximetoximetil-l-laza-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octano, 5-hidroximetil-l-laza-3,7dioxabiciclo[3.3.0]octano, 5-hidroxipoli[metilenooxi]metil-l-laza- 3,7dioxabiciclo[3.3.0]octano, adamantina quaternária, ácido 2-aminoacético ou qualquer combinação das mesmas. A titulo de ilustração, a etapa de contacto pode incluir empregar como a composição de agente protetor uma composição que inclui imidazolidinil ureia numa quantidade de cerca de 0,1 a cerca de 2,0% em peso da mistura total da composição de agente protetor mais uma amostra biológica; opcionalmente, ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) numa quantidade de cerca de 0,05 a cerca de 0,75% em peso da mistura total da composição de agente protetor mais uma amostra biológica; e um agente de arrefecimento brusco numa quantidade suficiente para reagir com qualquer aldeido livre (por exemplo, formaldeído) que pode surgir a partir da imidazolidinil ureia para formar um produto de reação que não reagirá para desnaturar qualquer proteina da amostra biológica. A composição de agente protetor (antes do contacto com qualquer amostra biológica) pode incluir de cerca de 20% a cerca de 60% em peso de imidazolidinil ureia. A composição de agente protetor pode incluir pelo menos cerca de 30% em peso de imidazolidinil ureia. A composição de agente protetor pode incluir pelo menos cerca de 40% em peso de imidazolidinil ureia e menos que cerca de 55% em peso de imidazolidinil ureia. A composição de agente protetor pode incluir de cerca de 1% a cerca de 10% em peso do agente de arrefecimento brusco. A composição de agente protetor pode incluir pelo menos cerca de 2% em peso do agente de arrefecimento brusco. A composição de agente protetor pode incluir pelo menos cerca de 4% em peso do agente de arrefecimento brusco e menos que cerca de 8% em peso do agente de arrefecimento brusco. A composição de agente protetor pode incluir de cerca de 1% a cerca de 20% em peso de EDTA. A composição de agente protetor pode incluir pelo menos cerca de 5% em peso de EDTA. A composição de agente protetor pode incluir pelo menos cerca de 7% em peso de EDTA e menos que cerca de 10% em peso de EDTA. A composição de agente protetor pode ser pré-carregada num tubo e pode ser pré-carregada na quantidade de cerca de 50 a cerca de 400 pL de composição de agente protetor. A quantidade pré-carregada pode ser pelo menos de cerca de 100 pL e menos que cerca de 300 pL. A quantidade pré-carregada pode ser de pelo menos cerca de 150 pL e menos que cerca de 250yL. Dentro da composição de agente protetor pré-carregada, a composição de agente protetor pode compreender pelo menos cerca de 80 mg e menos que cerca de 100 mg da composição de agente protetor. O agente de arrefecimento brusco pode compreender pelo menos cerca de 1 mg e menos que cerca de 15 mg da composição de agente protetor. EDTA pode compreender pelo menos cerca de 10 mg e menos que cerca de 25 mg da composição de agente protetor. Para a composição de agente protetor, o mesmo pode incluir uma quantidade de cerca de 10 partes em peso da composição de agente protetor por cerca de 1 parte em peso do agente de arrefecimento brusco. O agente de arrefecimento brusco pode incluir um composto que inclui pelo menos um grupo funcional com capacidade para reagir com um grupo funcional deficiente de eletrões de formaldeido (por exemplo, um composto de amina que reage com formaldeido para formar a base de Schiff de metilol ou imina ou um composto cis-diol que reage com formaldeido para formar um acetal ciclico). O agente de arrefecimento brusco pode ser um ingrediente selecionado de entre aminoácidos, alquilaminas, poliaminas, aminas primárias, aminas secundárias, sais de amónio ou uma combinação dos mesmos. 0 mesmo pode ser um ingrediente selecionado de entre glicina, lisina, etileno, diamina, arginina, ureia, adinina, guanina, citosina, timina, espermidina ou qualquer combinação dos mesmos. O mesmo pode ser um ingrediente selecionado de entre glicina, lisina, etileno diamina, ureia ou qualquer combinação dos mesmos. A etapa de arrefecimento brusco pode incluir reagir qualquer aldeido livre (por exemplo, formaldeido) para formar um metilol, base de Schiff de imina, um produto de reação de reticulação de arrefecimento brusco-base de Schiff, um dímero de base de Schiff ou qualquer combinação dos mesmos. 0 isolamento de cfDNA de plasma pode incluir isolar cfDNA na ausência de qualquer célula. Uma ou ambas as etapas de isolamento ou análise pode ocorrer em pelo menos 2 horas, 7 dias ou 14 dias após a flebotomia. Uma ou ambas as etapas de isolamento ou análise podem ocorrer sem e/ou antes de qualquer congelamento da amostra ou qualquer um de seus constituintes (isto é, a uma temperatura mais fria que cerca de -30 °C, mais preferencialmente, mais fria que cerca de -70 °C)). A composição de agente protetor pode incluir opcionalmente um inibidor de nuclease selecionado a partir do grupo que consiste em: pirocarbonato de dietilo, etanol, ácido aurintricarboxilico (ATA), formamida, complexos de vanadil-ribonucleósido, macaloide, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), proteinase K, heparina, ião hidroxilamina-oxigénio-cúprico, bentonite, sulfato de amónio, ditiotreitol (DTT), beta-mercaptoetanol (BME), cisterna, ditioeritritol, cloridrato de tris(2-carboxietil) fosfeno, um catião divalente, como Mg2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+, Ca2+, Cu2+ e qualquer combinação dos mesmos. A composição de agente protetor pode incluir uma composição conservante, um agente de arrefecimento brusco de aldeído e um anticoagulante. Em uma modalidade preferida, a composição de agente protetor pode incluir imidazolidinil ureia, glicina e ácido etilenodiamina tetra-acético.

As composições e os métodos no presente documento tornam possível a evitação de essencialmente qualquer formaldeído livre (ou outro aldeído) na amostra e auxilia a evitar, desse modo, qualquer um de entre os efeitos potencialmente deletérios que tal formaldeído livre (ou outro aldeído) pode ter mediante ácidos nucleicos (por exemplo, desnaturação de proteínas, ligação covalente indesejada (como entre fitas de ADN) ou ambos, ou alguma outra alteração química do cfDNA. As composições e métodos no presente documento tornam possível a habilidade para amplificar as amostras de ácido nucleico (por exemplo, ADN) que foram tratadas de acordo com os presentes ensinamentos.

Uma determinação no presente documento de que uma composição é substancialmente desprovida de aldeído livre (e particularmente desprovida de qualquer formaldeído livre (que pode ser formaldeído hidratado)) e/ou metileno glicol pode ser realizada com a utilização de técnicas conhecidas, como por ressonância magnética nuclear (RMN) de 13C. Por exemplo, a mesma pode ser realizada por ressonância magnética nuclear de 13C (i) num solvente de óxido de deutério, (ii) auxiliado por um agente de relaxamento (por exemplo, ácido gadopentélico (Gd-DTPA)) ou tanto (i) quanto (ii) . Uma composição que é substancialmente desprovida de aldeído livre (e particularmente desprovida de qualquer formaldeído livre) e/ou metileno glicol não exibirá tipicamente um pico num espectro de RMN de 13C na faixa de cerca de 82 a 85 ppm. Várias concentrações de composição conservante e agente de arrefecimento brusco que podem ser contidas dentro da composição de agente protetor também podem ser analisadas com a utilização de RMN de 13C para determinar quais concentrações resultam em quantidades reduzidas de aldeído livre, conforme desejado. Mais especificamente, várias composições conservantes (incluindo imidazolidinil ureia (IDU), diazolidinil ureia (DU), nuosept 145 (metanol, formaldeído) e oxaban-A (4,4-Dimetil-l,3-oxazolidina) em várias concentrações foram combinadas com concentrações variáveis de um agente de arrefecimento brusco (incluindo glicina). Para a preparação de amostra, 16,7 mg de Gd-DTPA foram transferidos para um frasco vazio e 3,5 mL de D2O foram adicionados ao frasco. Cada amostra foi preparada ao pesar um tubo vazio no qual 15 a 17 pL de THF foram transferidos e o peso do tubo com THF foi registado. 300 pL de solução de amostra em H2O foram transferidos após a adição de 200 pL de solução de GD-DTPA/D20. Os espectros de RMN de 13C foram, então, adquiridos. A Tabela 1 abaixo representa os resultados.

Qualquer determinação de que uma alteração química da formação de dupla hélice de ADN tenha ocorrido pode ser realizada, de modo semelhante, com a utilização de técnicas como espectrometria (por exemplo, uma técnica de espectrometria mediada por mancha de ácido nucleico, como espectrometria de fluorescência mediada por corante verde SYBR), que podem ser empregues para detetar fenómenos óticos, como fluorescência. Com tal abordagem, o ADN de uma amostra de controlo (por exemplo, ADN nativo) pode ser medido e comparado com um ADN de uma amostra tratada para garantir qualquer efeito na conformação de hélice, com a utilização de espectros de dicroismo circular (CD). Espera-se que as amostras tratadas de acordo com os presentes ensinamentos exibam espectros de CD que estão geralmente em conformidade com aquele do ADN nativo, com uma ausência de indicação de alteração de estruturas secundárias.

Uma mistura resultante que foi tratada de acordo com os presentes ensinamentos pode incluir um ou mais produtos de reação que incluem um metilol, base de Schiff, uma estrutura reticulada de arrefecimento brusco de base de Schiff, ou um dimero de base de Schiff. Por exemplo, para uma composição ilustrativa, os ensinamentos no presente documento contemplam a presença (com ou sem uma amostra biológica) de uma combinação de dois ou mais de entre IDU, um produto de reação de glicina de IDU, glicina, glicina metilol, uma base de Schiff de glicina, uma base de Schiff reticulada de glicina ou um dimero de base de Schiff.

Uma mistura resultante que foi tratada de acordo com os presentes ensinamentos pode incluir células sanguíneas que são livres de desnaturação de proteínas celulares. As membranas celulares resultantes podem ser de modo que o conteúdo das células possa ser mantido dentro da membrana durante o processamento e o envio sem vazamento detetável. Consequentemente, a amostra pode ser de integridade suficientemente alta de que os fluidos livres de célula representam verdadeira e precisamente o fluido extracelular. Adicionalmente, embora possa ser possível que alguma combinação com proteínas (não ácidos nucleicos) possa ocorrer, a combinação não é irreversível, mas pode ser removida por aquecimento (por exemplo, a uma temperatura de cerca de 60 °C a cerca de 90 °C) . Consequentemente, os ensinamentos no presente documento também contemplam uma etapa opcional de aquecer amostras tratadas durante um tempo e a uma temperatura suficiente para separar proteínas (por exemplo, a uma temperatura de cerca de 60 °C a cerca de 90 °C) . Uma etapa de aquecimento pode ser utilizada conforme descrito no presente documento para purificar uma amostra de ácido nucleico e remover qualquer contaminação de uma amostra de ácido nucleico. Tal etapa de aquecimento pode ser combinada com a utilização de uma protease que pode ser uma serina protease, como proteinase K.

Em um aspeto, acredita-se que os ensinamentos no presente documento são inesperada e particularmente úteis para análise de número variável de repetições em tandem ("VNTR"). Isso torna os ensinamentos aplicáveis para a análise de cena de crime, teste de paternidade ou outra análise de ADN forense. Em tais casos, é possível que um método possa empregar a extração de uma amostra sanguínea de um indivíduo para um tubo de colheita de sangue evacuado que contém uma composição de agente protetor de acordo com os presentes ensinamentos. As células sanguíneas podem ser consequentemente estabilizadas para impedir a libertação de seu ácido nucleico e qualquer aldeido livre (por exemplo, formaldeido) arrefecido bruscamente. 0 ADN livre de célula pode ser isolado e opcionalmente exposto a uma ou mais enzimas adequadas para regiões de corte de ADN que circundam as VNTR. Tais VNTR podem ser analisadas e comparadas com o ADN colhido a partir de uma cena de crime. No caso de teste de paternidade, métodos de extração de sangue conforme acima podem ser empregues tanto para a descendência quanto para o potencial pai de interesse. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) pode ser utilizada para amplificar uma amostra. As amostras amplificadas resultantes podem ser analisadas, como por técnicas óticas adequadas para resolver a amostra de modo espetral. Por exemplo, os loci de repetições curtas em tandem (STR) podem ser multiplexados. Acredita-se que uma quantidade surpreendentemente grande da amostra é não afetada pelas composições de agente protetor no presente documento, conforme demonstrado por uma ausência de desnaturação dos loci de STR e uma ausência de reticulação nos loci. Como tal, um grau relativamente alto de confiança em torno da amostra é alcançado. Além disso, devido aos efeitos de estabilização relativamente a longo prazo das composições (por exemplo, pelo menos 1 semana, 2 semanas, 4 semanas ou mais longo), é possível utilizar a amostra durante um período prolongado de tempo e evitar a necessidade de múltiplas extrações de sangue.

Acredita-se que os ensinamentos no presente documento são úteis para análise de um, dois, três, cinco, oito, dez ou treze ou mais de entre os loci de STR a seguir: ACTBP2 (SE33); Amelogenina (X ou Y); CD4; D2S1338; D3S1358; D3S1359; D7S809; D7S820; D8S347; D8S1179; D11S554; D12S391; D13S308; D13S317; D16S639; D18S51; D19S433; D21S11; F13A1; F13B; FABP; FES/FPS; FGA (FIBRA); F0LP23 (DHFRP2); HPRTB; LPL (LIPOL); THO1; TPOX; CSF1PO; D5S818; ou VWA (vWF).

Os dados obtidos em torno do ADN de um indivíduo podem ser armazenados para recuperação subsequente, como num banco de dados de ADN (por exemplo, o Sistema de índice de ADN Combinado (CODIS)). A comparação cruzada subsequente de perfis de ADN pode ser feita com tais informações. As informações de ADN podem ser empregues para resolver casos não resolvidos ou "arquivados" (por exemplo, casos não resolvidos) para resolver crimes de propriedade, para identificar pessoas ou vitimas, ou para algum outro propósito. Um ou mais recipientes de amostra que têm uma composição de agente protetor dos presentes ensinamentos pré-carregada (por exemplo, num dispositivo de colheita de sangue evacuado com uma composição de agente protetor dos presentes ensinamentos) pode ser fornecida como parte de um kit de análise forense. Qualquer um de entre os kits no presente documento pode incluir um ou mais componentes adicionais adaptados para amplificação e tipagem. 0 mesmo pode incluir um ou mais conjuntos de iniciadores adequados (por exemplo, iniciadores identificados de modo fluorescente), o qual pode ser adequadamente adaptado para análise de repetições curtas em tandem (STR) . 0 mesmo pode incluir recipientes de amostra (por exemplo, conforme descrito no Pedido de n£ de série PCT/US2012/34506) para realizar um ponto de análise de PCR de colheita (por exemplo, com um instrumento termociclador portátil como o

Instrumento Philisa® comercializado por Streck, Inc., ou um instrumento descrito de outro modo no Pedido de n- de série PCT/US2012/040201, Pedido n£ U.S. 13/484.963, e Pedido de Publicação n£ U.S. 2009/034446. A reação em cadeia da polimerase de multiplexação pode ser empregue, a qual pode envolver adicionar um ou mais conjuntos de iniciadores de PCR (por exemplo, iniciadores identificados de modo fluorescente) a uma amostra em análise a fim de direcionar seletivamente uma pluralidade de localizações ao longo do genoma.

Os ensinamentos no presente documento contemplam outras aplicações, incluindo, mas sem limitação, extrair ADN livre de célula para utilização na deteção de cancro (incluindo, mas sem limitação, carcinomas, leucemia e/ou linfoma). Por exemplo, os ensinamentos no presente documento podem ser empregues para detetar a metilação anormal para o cancro da mama, cancro da próstata, cancro gástrico, cancro do ovário, cancro colorretal, cancro da bexiga, cancro do testículo, cancro do esófago, melanoma ou outros cancros.

De acordo com os ensinamentos, uma amostra sanguínea pode fazer contacto com uma composição de agente protetor no presente documento, qualquer aldeido pode ser arrefecido bruscamente e o ADN resultante extraído para análise. A análise pode incluir a análise de padrões de metilação do ADN. A análise pode ser empregue para identificar biomarcadores com base em metilação (por exemplo, em um ou mais fragmentos ricos em GC) associados a um ou mais de entre cancro, um distúrbio neurogenerativo (por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, epilepsia, esclerose múltipla ou outros), e/ou um distúrbio psiquiátrico (por exemplo, esquizofrenia, depressão ou outros) . Por exemplo, a análise pode ser empregue para identificar a ocorrência de citosina metilada. A análise pode ser empregue para detetar e/ou monitorizar a infeção virai, doenças autoimunes, microquimerismo, enfarte agudo do miocárdio, derrame, isquemia mesentérica e pancreatite. Obviamente, a análise também pode ser empregue para diagnóstico pré-natal (por exemplo, para uma ou mais afeções como uma trissomia anormal 13, trissomia 18, ou patologia de trissomia 21, sindrome de Klinefelter, sindrome de Turner ou determinação de sexo pré-natal). A análise pode empregar a amplificação e a deteção por PCR, espectroscopia de massa, sequenciação de ADN paralelo ou alguma outra técnica analítica adequada pela qual um estado de doença ou afeção é detetado, diagnosticado, tratado e/ou monitorizado.

Os ensinamentos no presente documento também contemplam o emprego possível de etapas de terapias de monitorização de um paciente em resposta a algum tratamento (por exemplo, radiação e/ou terapia de fármaco). As amostras sanguíneas podem ser tomadas num primeiro tempo, tratadas de acordo com os ensinamentos e analisadas por ADN. As amostras sanguíneas podem ser retiradas uma ou mais vezes após a primeira vez, tratadas de acordo com os ensinamentos e analisadas por ADN. Os resultados das respetivas análises podem ser comparados e a terapia pode ser alterada em resposta à comparação de resultados.

Os ensinamentos no presente documento podem ser adicionalmente utilizados para proteger as amostras biológicas durante o envio e o armazenamento. 0 transporte de amostras sanguíneas do local de flebotomia para outra instalação é comummente exigido para teste de diagnóstico molecular. Conforme discutido no presente documento, diversas variáveis pré-analiticas podem comprometer as medições de cfDNA precisas, incluindo a seleção de dispositivos de colheita de sangue e armazenamento de amostra e condições de envio. Cada um desses parâmetros afeta a quantidade de lise de célula sanguínea nucleada que ocorre após a flebotomia. A lise de célula nucleada leva à libertação de gDNA, elevar os fundos de pDNA e suprimir a medição de cfDNA verdadeira. É desejável, portanto, minimizar os aumentos de gDNA de fundo que ocorrem geralmente durante o envio e o armazenamento com base no movimento de amostra e mudanças de temperatura,

Durante o transporte, a agitação pode romper a integridade de célula sanguínea nucleada e comprometer a precisão, conforme descrito acima. Em condições de envio simulado (com a utilização de um agitador orbital) durante um período de 24 horas, as amostras sanguíneas foram localizadas em K3EDTA e nos dispositivos de colheita de sangue de composição de agente protetor para comparação. Um aumento na concentração de pDNA foi observado a 6 e 24 horas em amostras sanguíneas K3EDTA. A composição de agente protetor estabilizou células sanguíneas e não mostrou aumento considerável em pDNA sob condições de agitação.

Quando as amostras foram enviadas, as tendências similares foram observadas como quando as amostras foram agitadas. As amostras foram enviadas em qualquer um de entre K3EDTA ou dispositivos de colheita de sangue de composição de agente protetor e a concentração de pDNA resultante entre os dois tubos foi comparada. As amostras de composição de agente protetor mostraram concentrações de pDNA estáveis antes e após o envio, enquanto K3EDTA mostrou aumentos em pDNA sob condições de envio. Isso sugere que o rompimento de célula nucleada ocorreu em amostras sanguíneas que foram enviadas em K3EDTA que leva à libertação de gDNA, mas isso não ocorreu nas amostras de composição de agente protetor.

Na prática atual, as amostras sanguíneas são geralmente centrifugadas para isolar plasma e congelar o mesmo para impedir a contaminação por gDNA de cfDNA durante processamento, transporte e armazenamento de amostra. Os produtos químicos estabilizadores dentro da composição de agente protetor impedem a libertação de gDNA em plasma após a flebotomia até 14 dias, ao evitar essas exigências intensivas de trabalho. Com a utilização do dispositivo de colheita de sangue revelado no presente documento, o armazenamento ex vivo à temperatura ambiente torna-se possível, permitindo a flexibilidade para extrações sanguíneas não locais a serem enviadas para laboratórios centrais para análise a jusante do cfDNA sem centrifugações preliminares ou criopreservação.

As amostras podem ser provenientes ou estar na forma inicial de uma ou mais matérias biológicas (por exemplo, sangue, urina, saliva, fezes, fluido sinovial, fluido cérebroespinal, fluido peritoneal ou outro fluido). As amostras podem incluir células, ou podem ser livres de células. Em geral, espera-se que as amostras tenham alguma quantidade inicial de ADN livre de célula, à qual o desejo é preservar substancialmente a quantidade de tal ADN livre de célula e proteger o ADN livre de célula da atividade de desoxirribonuclease, para que o mesmo possa ser analisado de modo eficaz.

As amostras podem ser colhidas de várias maneiras. As mesmas podem ser colhidas como parte de uma extração de flebotomia, por seringa, por um esfregaço, por colheita de descarga ou de outro modo. Os mesmos podem ser colhidos num recipiente (por exemplo, um frasco, um copo de colheita de espécime, um tubo de colheita, um tubo capilar ou de outro modo) . 0 recipiente pode ter uma composição de agente protetor dos presentes ensinamentos contidos no presente documento. As amostras podem ser amostras sanguineas e os métodos podem incluir obter uma amostra sanguínea recém-extraída para um tubo de colheita de sangue evacuado que inclui a composição de agente protetor pré-carregado no mesmo.

Os métodos podem incluir uma ou mais etapas analíticas para analisar os ácidos nucleicos. Por exemplo, os métodos podem incluir uma etapa de submeter a amostra à amplificação de reação em cadeia da polimerase qualitativa, amplificação de reação em cadeia da polimerase quantitativa ou ambas após a etapa de arrefecimento brusco. Os métodos podem incluir uma etapa de submeter a amostra à amplificação de reação em cadeia da polimerase qualitativa, amplificação de reação em cadeia da polimerase quantitativa ou ambas após a etapa de arrefecimento brusco que ocorre pelo menos quatro dias, uma semana ou duas semanas após a etapa de arrefecimento brusco. 0 método pode incluir uma etapa de submeter a amostra à espectrometria de massa. 0 método pode incluir uma etapa de submeter a amostra à espectrometria de massa que ocorre pelo menos quatro dias, uma semana ou duas semanas após a etapa de arrefecimento brusco. 0 método pode incluir uma etapa de submeter a amostra à sequenciação de ADN. 0 método pode incluir uma etapa de submeter a amostra à sequenciação de ADN que ocorre pelo menos quatro dias, uma semana ou duas semanas após a etapa de arrefecimento brusco. 0 método pode incluir alternativamente uma etapa de realizar análise de citometria de fluxo na amostra.

Os ensinamentos também perspetivam em seu escopo as composições de agente protetor no presente documento, sozinhas e/ou em combinação com o recipiente de colheita de amostra (por exemplo, um dispositivo de colheita de sangue evacuado), kits que incluem a composição de agente protetor (por exemplo, num recipiente de colheita de amostra, como um tubo de colheita de sangue) , dispositivos e artigos de análise forense, outros reagentes, recipientes de amostra de reação em cadeia da polimerase (por exemplo, tubos) ou semelhantes. Também são perspetivados de modo vantajoso nos ensinamentos os métodos para realizar amplificação de reação em cadeia da polimerase de uma amostra que compreendem amplificar um ácido nucleico (por exemplo, ácido desoxirribonucleico (ADN)) a partir de uma amostra biológica que foi tratada de acordo com os métodos acima. Adicionalmente, é vantajosamente perspetivado que um método para identificar repetições em tandem de número variável (VNTR) numa amostra de ADN que compreendem tratar uma amostra de acordo com os ensinamentos no presente documento; determinar um padrão de VNTR de amostra para a amostra; comparar um primeiro padrão de VNTR a partir de uma fonte de ADN conhecida com o padrão de VNTR a partir da amostra; e determinar se o padrão de VNTR de amostra corresponde ao primeiro padrão de VNTR.

Os ensinamentos no presente documento podem ser para qualquer uma de entre várias aplicações, e podem ser empregues para aprimorar os ensinamentos de Pedido Publicado n- U.S. 2010/0184069 que inclui as triagens amplas de genoma de ADN fetal. Por exemplo, os ensinamentos no presente documento podem ter aplicação adequada para PCR em tempo real quantitativa para identificação genética de Trissomia 21 (sindrome de Down) , de acordo com pelo menos uma etapa de detetar um aumento no número de cópia de ADN (isto é, um evento de duplicação cromossómica dentro do genoma fetal). Como com a análise de amostras de acordo com os ensinamentos no presente documento, em geral, isso pode ser conduzido numa clinica não local (por exemplo, uma localização que é distante da localização de extração de sangue materna (por exemplo, a pelo menos 100 metros, 1.000 metros, 10.000 metros ou mais de distância)). Devido à natureza remota, haverá tipicamente uma etapa de transporte da amostra do local de extração para um local de análise clinica. Tal transporte (novamente, como com a análise de amostras de acordo com os ensinamentos no presente documento, em geral) pode ser sem refrigeração.

Além disso, conforme indicado, os ensinamentos fornecerão a aplicação útil em análise de ADN forense. A título de ilustração, para análise forense, ADN de VNTR pode empregar a utilização de iniciadores que flanqueiam as mesmas regiões de VNTR no curso da amplificação de uma amostra de ADN. As VNTRs amplificadas podem ser coletivamente executadas numa faixa individual de um gel de agarose, o que resolve os segmentos de ADN de VNTR com base em seu tamanho e são específicos a um padrão de VNTR conhecido de paciente (por exemplo, um suspeito do crime). As comparações qualitativas dos padrões de tamanho de ADN no gel de agarose podem ser comparadas a uma amostra de ADN colhida numa cena de crime para correspondência. Os ensinamentos no presente documento podem ser empregues para obter e preservar uma amostra sanguínea do suspeito, para obter e preservar uma amostra de cena de crime, ou ambos.

Exemplos

As amostras foram extraídas a partir de doadores saudáveis em K3EDTA e tubos de colheita sanguínea que contêm uma composição de agente protetor. Para estimular condições de envio, as amostras foram agitadas ou não agitadas. Num estudo de envio, as amostras foram enviadas ou não enviadas. Para avaliar a temperatura, várias amostras foram incubadas a 6 °C, 22 °C e 37°C. Em todos os casos, o plasma foi colhido por centrifugação e o ADN de plasma total (pDNA) foi avaliado por PCR em tempo real quantitativa (qPCR), o sangue agitado em tubos de K3EDTA mostrou aumentos significantes em pDNA enquanto nenhuma mudança foi vista nas amostras de composição de agente protetor. 0 sangue enviado em tubos de K3EDTA mostrou aumentos significantes em ADN versus aqueles enviados na composição de agente protetor. 0 sangue em tubos de K3EDTA incubado a 6 °C, 22 °C e 37 °C mostrou aumentos significantes em pDNA enquanto o pDNA das amostras de composição de agente protetor permaneceu estável. A composição de agente protetor impede os aumentos de niveis de gDNA de fundo que pode ocorrer durante o armazenamento e o envio de amostra. Desse modo, a composição de agente protetor fornece uma maneira inovadora para obter amostras estabilizadas de qualidade alta para deteção de alvo de ADN de abundância baixa e concentrações de cfDNA exatas. A deteção de PCR de alvos de livre de célula de ADN dentro de um fundo de gDNA alto é desafiadora, exigindo protocolos especializados e/ou volumes grandes de material inicial. Como resultado, minimizar a libertação de gDNA de células nucleadas é essencial para cfDNA verdadeiro de análise exata. Com a utilização da composição de agente protetor, é possivel preservar a proporção original de cfDNA fetal ao minimizar o fundo de gDNA materno. 0 gDNA de fundo aumentado afeta de modo adverso a deteção de alvos de cfDNA de abundância baixa (Figura 2C) . Visto que a concentração de pDNA aumentou nos dias 7 e 14 em amostras de K3EDTA devido à libertação de gDNA, a deteção dos fragmentos de SRY introduzidos diminuiu (Figura 2a) . Em contraste, não houve mudança significativa na concentração de pDNA devido à libertação de gDNA nas amostras de composição de agente protetor no dia 7 e libertação de gDNA minima no dia 14, mas a deteção de fragmentos de SRY permaneceu estável ao longo de todo o periodo de tempo inteiro (Figura 2b). A variação na temperatura de armazenamento de amostra é outra condição pós-flebotomia que pode provocar mudanças na concentração de gDNA. 0 efeito de três temperaturas de armazenamento na concentração de pDNA de amostras sanguineas extraidas no K3EDTA e a composição de agente protetor foi monitorizada. Após a extração de sangue, as amostras foram incubadas a 6 °C, 22 °C ou 37 °C durante 14 dias. Os aumentos significantes em concentrações de pDNA de amostra sanguínea de K3EDTA foram vistas a 6 °C e a 37 °C no dia 7 e a todas as temperaturas pelo dia 14 (Figura 4A). 0 sangue extraído para os tubos de composição de agente protetor não mostrou aumento na concentração de pDNA a qualquer temperatura no dia 7 e mostrou mudanças estatísticas em concentração de pDNA no dia 14 quando incubadas a 6 °C e 22 °C (Figura 4B) . No entanto, os cálculos de vezes de mudança de comparação entre os níveis de pDNA de K3EDTA e amostras de composição de agente protetor no dia 0 versus o dia 7 e o dia 14 (consultar Figuras 4A e 4B). Isso demonstra a habilidade da composição de agente protetor para estabilizar os níveis de pDNA e impedir a libertação de gDNA através de uma faixa de temperatura ampla durante um período estendido de tempo.

Os doadores de sangue foram recrutados com consenso informado a partir de Streck. Inc. em Omaha, NE. Os

doadores foram tanto masculinos quanto femininos e assumidos como saudáveis. Todas as extrações foram realizadas com a utilização de flebotomia. Para cada experiência, as amostras doadoras foram extraídas em dois tubos de colheita de sangue diferentes. As amostras de controlo foram extraídas para tubos de K3EDTA (BD

Vacutainer<®>, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) e comparadas a amostras extraídas para a composição de agente protetor descritas no presente documento. 0 sangue foi misturado imediatamente após a extração ao inverter 10 vezes.

Processamento de amostra

Após a flebotomia, as amostras de sangue foram armazenadas à temperatura ambiente (22°C), exceto quando notado de outro modo, e o plasma foi separado em pontos no tempo notados. Para a separação de plasma, as amostras sanguíneas foram centrifugadas a 22 °C a 300 xg durante 20 minutos. A camada plasmática foi cuidadosamente removida sem perturbar o revestimento com tampão, transferido a um frasco novo com a utilização de uma pipeta e, então, centrifugada a 22°C a 5.000 xg durante 10 minutos para remover as células residuais.

Isolamento de ADN livre de célula de plasma O Kit de Ácido Nucleico de Circulação QIAamp® (Qiagen, Santa Clarita, CA) foi utilizado para a extração de pDNA. O protocolo recomendado pelo fabricante foi modificado levemente aumentando-se a duração do tratamento de Proteinase K de 30 minutos a 1 hora a 60 °C. As amostras foram eluídas em 50 pL de água livre de nuclease estéril e armazenadas a -80 °C até a análise por qPCR em tempo real. PCR em Tempo Real Quantitativa (qPCR)

Os iniciadores de ação β humanos e sonda e iniciadores para a região de determinação de sexo Y cromossómica humana (SRY) foram preparadas conforme anteriormente descrito por Chan et al. (Chan KC, Ding C, Gerovassili A, et al. (2006)

Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma: A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis. Clin. Chem 52:2211 a 2218) e por Lee et al. (Lee TH, Paglieroni T, Ohto H, et al. (1999) Survival of donor leukocyte subpopulations in immunocompetent transfusion recipients: frequent long-term microchimerism in severe trauma patients. Blood 93:3127 a 3139.) A sonda a seguir foi projetada para a quantificação de sequência de SRY: 6FAM-ATG GCT CTA GAG AAT CCC AGA ATG CGA AAC TCA GAG A-TAMRA. Para cada ensaio, diluições de 10 vezes (300.000-30 cópias) de construtos de ADN de plasmideo foram utilizadas para estabelecer as curvas padrões de qPCR. Os construtos foram preparados ao clonar uma cópia única de β-actina ou sequência de ADN de SRY, os quais produziram amplicões de 136 bp ou 148 bp, respetivamente. Os equivalentes genómicos de β-actina foram calculados a partir do número de cópia de qPCR e, então, convertidos para nanogramas de cfDNA por mililitro de plasma (ng/mL) . A concentração de ADN de SRY final foi expressa como cópias de ADN recuperadas por mililitro (cópias/mL) de plasma. Todos os iniciadores foram adquiridos a Integrated ADN Technologies (Coralville, IA) . As sondas de qPCR e TaqMan<®>Universal PCR Master Mix II foram adquiridos a partir de Applied Biosystems (Foster City, CA).

Efeito de temperatura de armazenamento na concentração de pDNA em amostras sanguíneas 0 sangue foi colhido a partir de oito doadores para tubos de K3EDTA e tubos de composição de agente protetor. 0 sangue foi dividido em partes iguais e, então, dividido em três conjuntos compreendidos, cada um, de três aliquotas de K3EDTA e três de composição de agente protetor. Um conjunto de aliquotas foi armazenado a 6°C, outro conjunto a 22°C e o último conjunto a 37 °C. 0 plasma foi colhido em cada temperatura no dia 0, 7 e 14 e armazenado A -80 °C até o pDNA ter sido extraído e analisado por qPCR com a utilização do ensaio de β-actina.

Efeito de agitação e envio na concentração de pDNA em amostras sanguíneas

Para simular o envio, o sangue de oito doadores foi extraído para tubos de K3EDTA e tubos de composição de agente protetor. Os tubos foram presos à plataforma de um agitador orbital e agitadas a 150 rpm a 22 °C. Nos pontos no tempo de 0, 3, 6 e 24 horas, o plasma de um tubo de K3EDTA e um tubo de composição de agente protetor foi colhido e congelado a -80°C até à extração e à análise. Uma experiência de controlo foi feita quando o sangue não foi agitado enquanto todos os outros parâmetros experimentais permaneceram o mesmo. Num estudo de envio separado, o sangue de dez doadores foi extraído para tubos de K3EDTA e os tubos de composição de agente protetor. Os tubos foram enviados em viagem de ida e volta por meio de via aérea a um laboratório em Springfield, MA (o tempo decorrido foi de 4 dias) e o plasma foi colhido mediante regresso armazenado a -80 °C até a extração e a análise. Um conjunto de controlo de tubos não foi enviado e o plasma foi colhido nos dias 0 e 4. Tanto para as amostras agitadas quanto enviadas, o pDNA foi medido por qPCR com a utilização do ensaio de β-actina.

Análise estatística A análise estatística foi executada com a utilização do sitio da web Tools for Science de College of Saint Benedict Physics Department, Saint John's University, St. Joseph, MN, EUA (http://www.physics.csbsju.edu/). A análise foi realizada com a utilização do teste t de Student não emparelhado e p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Efeito de produtos químicos presentes na composição de agente protetor em amplificação de pDNA

Foi investigado o efeito da composição de agente protetor em amplificação de pDNA por qPCR (Figura 1) . O sangue foi extraído em tubos de K3EDTA e o plasma foi separado por centrifugação. O sobrenadante plasmático foi divido em partes iguais e dividido em dois grupos de tratamento. A um grupo de amostras de plasma (barras cinzas), a composição de agente protetor foi adicionada a uma concentração final igual à quantidade presente numa extração de sangue de 10 mL padrão. O outro grupo de amostras de plasma (barras pretas) não foi tratado e foi servido como um controlo. As amostras de cada grupo foram processadas a 3 e 6 horas (painel a) e a 7 e 14 dias (painel b) . A concentração de pDNA foi determinada com a utilização do ensaio de qPCR de β-actina. Quando em comparação com amostras não tratadas, as amostras tratadas com os produtos químicos não mostraram diminuição em extração de ADN de plasma ou em sua amplificação por qPCR. As barras de erro indicam SD, n = 5 para ambos os painéis. Na Figura 1, a comparação de concentrações de pDNA em amostras plasmáticas quimicamente tratadas e não tratadas não mostraram diminuição na amplificação após 3 e 6 horas de incubação a 22 °C (Figura IA, p = 0,44 e p = 0,52, respetivamente); amostras incubadas durante 7 e 14 dias mostraram resultados similares (Figura 1B, p = 0,0036 e p = 0,23, respetivamente). Essas constatações indicam que os produtos químicos presentes na composição de agente protetor não tiveram efeitos adversos em qualquer um de entre extração de ADN de plasma ou sua amplificação por qPCR.

Efeito de gDNA de fundo elevado em plasma na deteção de sequências de cfDNA raras

Foi estimulado o efeito em concentração de gDNA aumentada, medido pelo ensaio de β-actina na deteção de alvos de cfDNA de abundância baixa pela introdução de um ADN específico masculino (SRY) em sangue feminino não gestante (Figura 2). 0 sangue foi extraído a partir de doadores femininos não gestantes para tubos de K3EDTA e tubos de composição de agente protetor e armazenado a 22 °C durante 0, 7 ou 14 dias. Em cada ponto no tempo, o plasma foi separado por centrifugação. Um construto de ADN de plasmídeo que contém um fragmento de sequência de SRY (3.000 cópias) foi, então, introduzido em todas as amostras plasmáticas e o pDNA foi extraído. A concentração de ADN plasmático total foi determinada com a utilização de ensaio de qPCR de β-actina (·) e números de cópia de sequência cromossómica Y foram determinados pelo ensaio de qPCR de SRY () . Para as amostras de K3EDTA (Figura 2A), visto que as concentrações de pDNA de β-actina aumentaram em amostras de K3EDTA (*p < 0,05, **p < 0,001), houve diminuições significativas em deteção de número de cópia de sequência de SRY (**p < 0,001) . Para as amostras de composição de agente protetor (Figura 2B), as concentrações de pDNA permaneceram próximas ao valor de dia 0 inicial (**p < 0,001) e a sequência de SRY foi detetável ao longo do curso do tempo do dia 14. As inserções de tabela em cada figura mostram as vezes de mudança quando em comparação entre os níveis de β-actina e de SRY de dia 0 e aqueles nos dias 7 e 14. As barras de erro indicam SD, n = 5 para ambos os painéis. A Figura 2a mostra a concentração de ADN de ambos os alvos de gene no plasma colhido de amostras de K3EDTA armazenadas a 22 °C durante 0, 7 e 14 dias. Um gDNA foi libertado no plasma ao longo do tempo, aumentos significativos em níveis de gDNA (β-actina) foram observados nos dias 7 e 14, em comparação à concentração inicial no dia 0 (p = 0,0087 e p = 0,0002) . À medida que os níveis de gDNA (β-actina) aumentam, a deteção do alvo de cfDNA (SRY fragmento) diminuiu de modo significativo (dia 7, p = 0,0068 e dia 14, p = <0,0001). A Figura 2b mostra a concentração de pDNA das amostras plasmáticas de composição de agente protetor armazenadas sob as mesmas condições de armazenamento, conforme supracitado. 0 plasma colhido a partir das amostras de composição de agente protetor não mostraram mudança significativa na concentração de β-actina em 7 dias (p = 0,55), mas mostraram uma mudança estatistica no ponto no tempo de dia 14 (p = 0, 0002) . Com a composição de agente protetor, os niveis de gDNA (β-actina) permanecem próximos ao valor de dia 0, os niveis de cfDNA (fragmento de SRY) não mudaram e permaneceram detetáveis ao longo do curso do tempo inteiro (dia 7, p = 0,45 e dia 14, p = 0,20) . A fim de demonstrar mais claramente como as mudanças nos niveis de gDNA efetuam a deteção de alvo de cfDNA, os cálculos de vezes de mudança foram realizados (Figura 2C). À medida que os niveis de gDNA de K3EDTA aumentaram (β-actina, dia 7 = mudança de 51 vezes, dia 14 = mudança de 92 vezes), a deteção de cfDNA diminuiu (SRY, dia 7 = mudança de -3 vezes, dia 14 = mudança de -95 vezes) . Os niveis de ADN de composição de agente protetor permaneceram relativamente estáveis (β-actina, dia 7 = mudança de 1 vez, dia 14 = mudança de 8 vezes) , assim como a deteção de alvo de cfDNA (SRY, dia 7 = mudança de -1 vez, dia 14 = mudança de -1 vez).

Efeito de agitação e envio na concentração de pDNA em amostras sanguíneas

As condições de agitação presentes durante o transporte de amostra foram simuladas com um agitador orbital. Uma experiência de controlo também foi realizada com a utilização de tipos de tubos sem a agitação (Figura 3) . 0 sangue foi extraído para tubos de K3EDTA e os tubos de composição de agente protetor e, então, agitados a 22 °C num agitador orbital. Conforme mostrado no painel A, nos tempos 0, 3, 6 e 24 horas, um tubo de K3EDTA (o) e um tubo de composição de agente protetor (□) foram removidos e o pDNA foi isolado. Uma experiência de controlo também foi realizada com sangue extraído a partir dos mesmos doadores para o tubo de K3EDTA (·) e tubo de composição de agente protetor () durante o mesmo período de tempo sem agitação. A concentração de pDNA foi determinada com a utilização do ensaio de qPCR de β-actina. Os tubos de K3EDTA que foram submetidos à agitação mostraram aumentos estatisticamente significantes na concentração de pDNA em 3, 6 e 24 horas

comparados ao tempo 0 (*p < 0,05, **p < 0,001). A concentração de ADN plasmático total permaneceu estável em ambas as amostras de composição de agente protetor agitadas e amostras não agitadas. As barras de erro indicam SD,n = 8 no painel A. Num estudo de envio, conforme mostrado no painel B, o sangue foi extraído para tubos de K3EDTA (barras pretas) e tubos de composição de agente protetor (barras cinzas) e foram enviados em viagem de ida e volta para um laboratório em Springfield, MA ou não enviados. Mediante o regresso, o plasma de amostras enviadas e não enviadas foi isolado e a concentração de pDNA foi determinada com a utilização de ensaio de qPCR de β-actina, tubos de K3EDTA que foram enviados mostraram um aumento significativo em pDNA quando em comparação com tubos de composição de agente protetor enviado s (*p< 0.05), tubos de K3EDTA que não foram enviados mostraram significância similar quando em comparação com tubos de composição de agente protetor que não foram enviados. A concentração de pDNA em amostras de composição de agente protetor enviadas e não enviadas não mostraram mudança estatística em comparação com o tempo zero. As barras de erro indicam SD,n = 10 no painel B. A Figura 3a mostra que a agitação do sangue extraido para tubos de K3EDTA provocou aumento significativo na concentração de pDNA em 3, 6 e 24 horas após a extração de sangue (p = 0,031, 0,0003 e 0,001), enquanto a agitação do sangue extraido para os tubos de composição de agente protetor não mostrou mudanças (p = 0,14, 0,34 e 0,31). As amostras de controlo não agitadas extraídas para tubos de K3EDTA e os tubos de composição de agente protetor não mostraram mudança na concentração de pDNA após 3 (p = 0,14 e 0,22), 6 (p = 0,33 e 0,52) ou 24 horas de incubação (p = 0,29 e 0,72).

Após mimetizar o envio, as amostras novas foram extraídas para os tubos de K3EDTA ou os tubos de composição de agente protetor. Os tubos foram enviados para um laboratório em Springfield, MA e de volta para o curso de quatro dias ou não enviados a 22 °C. A Figura 3b ilustra um aumento significativo na concentração de pDNA entre amostras de K3EDTA enviadas e amostras de composição de agente protetor (p = 0,01) enviadas após terem regressado. Também houve um aumento significativo em pDNA entre K3EDTA inicial e enviado (p= 0,015) e entre K3EDTA inicial e não enviado (p = 0,013). No entanto, não houve mudança em concentração de pDNA entre os tubos de composição de agente protetor inicial e não enviada ou não enviada e enviada (p = 0,399 e 0,340).

Efeito de temperatura de armazenamento na concentração de pDNA em amostras sanguíneas

Para demonstrar o efeito de temperatura em níveis de pDNA no sangue extraído para tubos de K3EDTA e tubos de composição de agente protetor, as amostras foram armazenadas a 6 °C, 22 °C ou 37 °C durante até 14 dias (Figura 4) . 0 sangue foi extraído para K3EDTA e a composição de agente protetor. 0 sangue foi, então, dividido em partes iguais e, então, dividido em três conjuntos, em que cada um é compreendido de 3 alíquotas de K3EDTA e 3 alíquotas de composição de agente protetor. Um conjunto de alíquotas foi incubado a 6 °C (A), um conjunto a 22 °C (·) e um conjunto a 37 °C () . 0 plasma foi separado por centrifugação de alíquotas a cada temperatura nos dias 0, 7 e 14. A concentração de pDNA foi determinada com a utilização do ensaio de qPCR de β-actina. As amostras extraídas para K3EDTA (Figura 4A) e armazenadas a todas as temperaturas mostraram aumentos estatisticamente significativos em concentração de pDNA em comparação com o valor de dia 0, enquanto o pDNA isolado de amostras de composição de agente protetor (Figura 4B) mostrou mudança mínima durante o período de 14 dias (*p < 0,05, **p < 0,001). As inserções de tabela em cada figura mostram as vezes de mudança quando em comparação entre os níveis de pDNA de dia 0 e aqueles nos dias 7 e 14. As barras de erro indicam SD,n = 8 para ambos os painéis. A Figura 4a mostra aumentos significativos na concentração de pDNA em amostras de K3EDTA nos dias 7 e 14 quando em comparação com valores iniciais a 6 °C (dia 7, p = 0,039, dia 14, p = 0,041) e no dia 14 quando armazenadas a 22 °C (dia 7, p= 0,056, dia 14, p = 0,0002) . As amostras de K3EDTA incubadas a 37 °C mostraram um grau alto de hemólise ao longo curso do tempo e a concentração de pDNA no dia 14 (dia 7, p = 0,003, dia 14, p = < 0,0001) foi mais baixa de algum modo em comparação às amostras incubadas a 6°C e 22°C. Nenhuma hemólise foi visível em amostras de composição de agente protetor quando armazenadas a 37 °C. As amostras sanguíneas extraídas para os tubos de composição de agente protetor e armazenadas a 6 °C, 22 °C e 37 °C não mostram mudança significativa na concentração de pDNA no dia 7 em comparação com o valor de dia 0 (Figura 4B, p = 0,15, p = 0,32 e p= 0,61, respetivamente). As mudanças estatísticas foram vistas no dia 14 nas amostras de composição de agente protetor armazenadas a 6 °C (p = 0,048) e 22 °C (p = 0,039), mas não a 37 °C, (p = 0,070).

Os cálculos de mudanças de vezes (Figuras 4a e 4b, inserção de tabela) ilustram o aumento em níveis de pDNA de K3EDTA no dia 7 e 14 (6°C = aumento de 10 e 78 vezes, 22°C = aumento de 75 e 233 vezes, 37°C = aumento de 30 e 53 vezes, respetivamente), enquanto as mudanças nos níveis de pDNA das amostras de composição de agente protetor permaneceram mínimas (6 °C = aumento de 2 e 3 vezes, 22 °C = aumento de 2 e 7 vezes, 37 °C = aumento de 1 e 5 vezes, respetivamente).

Com referência à Figura 5, o formaldeído é utilizado como um fixador celular devido à sua habilidade para reticular grupos amino, amido, guanidino, tiol, fenólico, imidazolil e indolil em ácidos nucleicos e proteína para formar derivados de hemiacetal, reticulações de ADN-proteína ou ADN-ADN são um tipo especializado, mas importante, de dano que bloqueia a investigação genética de um número grande de amostras armazenadas. A reticulação induzida por formalina preserva de modo eficaz a morfologia estrutural de ADN, mas é extremamente prejudicial à análise de ADN subsequente devido ao facto de as bases reticuladas impedirem as polimerases e reticulações de ADN-ADN poderem inibir a desnaturação. Devido ao genoma humano ser muito grande (3 mil milhões de pares de desoxirribonucleótidos), é impossível determinar quais nucleótidos serão reticulados quando expostos a uma solução de formalina (isto é; adição de hemi-acetal a DNTPs por formal ocorre por chance aleatória). Portanto, a deteção de dano de ADN induzido por formalina com a utilização de uma análise de gene único não é suficiente. Por exemplo, a Figura 5 ilustra três reações diferentes que contêm a mesma preparação de ADN genómico e formaldeido. No entanto, o sitio de reticulação de formaldeido é diferente em cada tubo.

As Figuras 6a e 6b ilustram diagramas esquemáticos das modificações quimicas de formação de ponte de metileno entre duas nucleobases de adenina (um exemplo de reticulação ADN-ADN), e entre nucleobases de adenina e lisina (um exemplo de reticulação de ADN-proteína) que ocorre em reticulação de ADN-ADN e ADN-proteína.

As Figuras 7a e 7b ilustram como os ensinamentos no presente documento evitam formaldeido livre detetável. Na plotagem superior, um espectro de RMN de 13C de cfDNA em contacto com a composição de agente protetor não mostra pico de formaldeído (metileno glicol) em torno de 82 a 85 ppm (região sombreada). Na plotagem inferior, foi mostrado um exemplo comparativo de pico de RMN de 13C de formaldeido em solução de formaldeido (metileno glicol) em várias concentrações. A titulo de ilustração, uma abordagem para determinar a presença ou ausência de um aldeído, como formaldeído, pode empregar as análises de RMN de 13C quantitativa, executada na presença de complexo de gadolínio-dietilenotriaminapentaacetato (Gd-DTPA). Os dados de RMN podem ser adquiridos por um instrumento que tem capacidades relevantes coerentes com àquelas do espectrómetro de RMN de série 500 MHz Avance DRX com TXI Cryoprobe, Bruker Biospin Corp (Billerica, MA). Os dados de RMN podem ser processados pelo software que tem capacidades relevantes coerentes com àquelas do software Bruker Topspin. Para obter os dados de RMN, tubos de RMN de borossilicato de 5 mm de diâmetro externo (por exemplo, a partir de New Era Enterprise, Inc, Vineland, NJ) podem ser utilizados. Um espectrómetro adequado, como o espectrómetro de Bruker que opera a 125 MHz de frequência de observação de 13C numa temperatura de sonda de 24,85 °C (298 K) pode ser empregue. Uma sequência de desacoplamento de protão (zgig30) pode ser aplicada para a aquisição. Os parâmetros ilustrativos para RMN de 13C{1H} tiveram largura espetral --30030 Hz; produtos de domínio de tempo -- 32.768; tempo de aquisição -- 0,5 segundos; atraso de pulso -- 1 segundo, ao qual um número adequado de varrimentos (por exemplo, 2.048 varrimentos) pode ser adquirido. Antes de cada experiência de RMN, Gd-DTPA pode ser dissolvido em D2O para obter a solução com a concentração desejada. Para a aquisição de RMN, 250 yL de solução de amostra podem ser diluídos com 250 pL de Gd-DTPA/D20. THF pode ser adicionado em peso diretamente na solução de amostra de RMN.

Uma unidade de deslocamento de RMN quimico convencional em ppm (partes por milhão) pode ser utilizada para interpretações espetrais, com picos calibrados com base no -CH2-CH2-0- de picos de tetraidrofurano (THF, uma referência interna inerte) □ = 24,9 ppm. A unidade de deslocamento quimico de RMN em ppm é a razão da diferença entre a ressonância química do analito e as substâncias de referência para a frequência do instrumento. A mesma pode ser expressa por quantidade adimensional e definida como: m= [ (EWostra- □Referência) x 106] /frequência de operação.

Para detetar o limite de deteção inferior das condições de RMN, espectros de RMN de 13C de soluções de formaldeído com concentrações de formaldeído gradualmente decrescentes podem ser adquiridos. Na Figura 7b, por exemplo, o espectro de RMN de 13C, com 2.048 varrimentos de repetição e 1 segundo de atraso de relaxamento de 0,01% de solução de formaldeído, indica que o sinal de metileno glicol CH2 a -81,9 ppm tem uma relação sinal-ruído de aproximadamente 2. Um espectro similar com 0,005% de formaldeído não mostrou presença de qualquer pico na região de 80 a 85 ppm. Portanto, o limite de deteção inferior da técnica de RMN aplicada para detetar o formaldeído está entre 0,01% e 0,005%. A Figura 7A mostra o espectro de RMN de 13C representativo de reagentes de BCT de ADN centrais (uma composição de agente protetor exemplificativa nos presentes ensinamentos) (250 pL) em D20 (250 pL) na presença de Gd-DTPA (~0,6 mg). Os espectros de RMN de 13C de múltiplos lotes de tais composições não mostram sinal na região de 80 a 85 ppm. Acredita-se que os resultados similares são alcançáveis com amostras tratadas de acordo com os presentes ensinamentos. Isto é, não apenas a composição de agente protetor é livre de formaldeido detetável por análise de RMN de 13C, como também as amostras tratadas com a composição são livres de modo semelhante de formaldeido detetável por análise de RMN de 13C. A Figura 8a ilustra como o dano conformacional ao ADN pode ser evitado com a utilização dos ensinamentos no presente documento. São representados os espectros de fluorescência de ADN nativo (controlo) , ADN preservado por CF-ADN-BCT (uma composição de agente protetor exemplificativa dentro dos presentes ensinamentos), ADN preservado por formaldeido e ADN preservado por glutaraldeido. A plotagem superior é para uma amostra mantida à temperatura ambiente durante 7 dias. A plotagem intermediária é para uma amostra mantida à temperatura ambiente durante 7 dias e, então, aquecida a 60 °C durante 1 h. A plotagem inferior é para uma amostra mantida à temperatura ambiente durante 7 dias e aquecida a 90 °C durante 2 min. A Figura 8b ilustra adicionalmente como o dano conformacional ao ADN pode ser evitado com a utilização dos ensinamentos no presente documento. São representados os espectros de fluorescência de ADN nativo (controlo), ADN preservado por CF-ADN-BCT (uma composição de agente protetor exemplificativa dentro dos presentes ensinamentos), ADN preservado por formaldeido e ADN preservado por glutaraldeido. A plotagem superior é para uma amostra mantida à temperatura ambiente durante 14 dias. A plotagem intermediária é para uma amostra mantida à temperatura ambiente durante 14 dias e, então, aquecida a 60 °C durante 1 h. A plotagem inferior é para uma amostra mantida à temperatura ambiente durante 14 dias e aquecida a 90 °C ou 2 min. A Figura 9 ilustra como a amplificação de amostras de ADN pode se beneficiar dos ensinamentos no presente documento. As amostras de ADN são incubadas com vários agentes à temperatura ambiente. Um controlo de ADN é empregue. As amostras tratadas são empregues para comparação, incluindo uma amostra tratada por BCT de CF-ADN (uma composição de agente protetor exemplificativa dentro dos presentes ensinamentos), uma amostra tratada por formaldeído (0,1%) e uma amostra tratada por glutaraldeido (0,1%) para comparação. As aliquotas são retiradas de cada amostra de ADN por várias vezes e amplificadas por PCR.

Imediatamente após a adição dos agentes para tratar as amostras, por a Figura 9a, as amplificações de PCR são similares a todas as amostras de ADN misturadas com agentes diferentes. A amplificação de PCR não parece ser afetada pela presença dos fixadores imediatamente mediante contacto com cada amostra. No entanto, cerca de 18 horas após a adição de agentes, por a Figura 9b, as amplificações de PCR de ADN de controlo e ADN tratado por BCT de CF-ADN são similares. No entanto, a amplificação de PCR de ADN fixado por formaldeido é prejudicada e o ADN fixado por glutaraldeido é adicionalmente prejudicado. Acredita-se, desse modo, que a utilização de BCT de CF-ADN (uma composição de agente protetor exemplificativa conforme descrito no presente documento) de acordo com os presentes ensinamentos não danifica ADN, enquanto formaldeido e glutaraldeido danificam ADN.

Após cerca de 72 horas, por a Figura 9c, a amplificação de PCR de ADN de controlo e ADN tratado por BCT de CF-ADN são similares; a amplificação de PCR de ADN fixado por formaldeido é notavelmente prejudicada; e ADN fixado por glutaraldeido não amplificou. Consequentemente, acredita-se novamente que por períodos estendidos (maior que 24, 48 ou 72 horas), BCT de CF-ADN não danifica ADN, enquanto formaldeido e glutaraldeido danificam ADN.

As Figuras 10a a lOd ilustram análise de PCR em tempo real quantitativa de um fragmento de gene de 800 pares de base de ADN de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase humano (GAPDH) tratado com ou sem formaldeido, glutaraldeido ou reagente de BCT de CF-ADN (uma composição de agente protetor exemplificativa dentro dos presentes ensinamentos) nas concentrações indicadas. As amostras são mantidas à temperatura ambiente (RT; a e b) ou um tratamento a quente adicional é feito durante 1 hora a 60 °C antes da amplificação de PCR (c e d) . A quantificação da concentração de ADN inicial de fragmentos de ADN de GAPDH, após a amplificação, é realizada num Termociclador Bio-Rad iQ5™ com a utilização de TaqMan Universal Master Mix II com UNG. Os dados apresentados representam os pontos no tempo dos dias 0 (a e c) e 7 (b e d). Os resultados indicam que tratamento de ADN de GAPDH com BCT de CF-ADN (uma composição de agente protetor exemplificativa dentro dos presentes ensinamentos) não impede a amplificação de PCR do ADN de GAPDH e concentrações de ADN quantificadas são comparáveis ao controlo de ADN não tratado no tempo 0, o que indica que o reagente de BCT de CF-ADN não restringe a PCR análise das amostras nos 7 dias após a extração de amostra. No entanto, tratamentos com formaldeido ou glutaraldeido restringem parcial ou completamente a amplificação do ADN de GAPDH. Em suma, esses dados demonstram que o reagente de BCT de CF-ADN, mas não formaldeido ou glutaraldeido, podem ser utilizados para estabilizar e manter a integridade de ADN para análise quantitativa a jusante por metodologias com base em PCR quantitativas. A Figura 11 ilustra os efeitos de reagentes de estabilização em amplificação de cfDNA plasmático. Um modelo in vitro que contém amplicão de ADN de 800 pares de base de ADN genómico humano é introduzido no plasma de sangue humano saudável, amostras plasmáticas introduzidas de ADN foram incubadas com ou sem agentes estabilização diferentes à temperatura ambiente. As amostras tratadas foram empregues para comparação, incluindo uma amostra tratada por BCT de CF-ADN (uma composição de agente protetor exemplificativa dentro dos presentes ensinamentos), uma amostra tratada por formaldeido (0,1%) e um glutaraldeido (0,1%) amostra tratada para comparação. As aliquotas são retiradas de cada amostra de ADN nos tempos indicados; o ADN foi extraido com a utilização do kit de extração Qiaqen e amplificado por PCR em tempo real quantitativa. A quantificação de ADN tratado e não tratado foi realizada num Termociclador Bio-Rad iQ5™ com a utilização de protocolo de produto químico de verde SYBR. A Figura 11 demonstra que o ADN não tratado (controlo) e o ADN tratado por BCT de CF-ADN continuam a amplificar até um ponto substancialmente similar; enquanto o ADN tratado tanto por formaldeído quanto por glutaraldeído tem amplificação continuamente decrescente ao longo do tempo. A Figura 12 ilustra dano de conformação de dupla hélice de ADN por formaldeído após o aquecimento a 60 °C durante 1 hora (isso foi feito para estimular a etapa de digestão de proteinase K que é feita a 60 °C durante 1 hora durante a extração de cfDNA de plasma) , mas não com reagente de CF-ADN-BCT de acordo com os presentes ensinamentos. Os espectros de dicroísmo circular de ADN nativo (controlo), ADN preservado por CF-ADN-BCT (uma composição de agente protetor exemplificativa dentro dos presentes ensinamentos) e ADN preservado por formaldeído são mostrados.

As Figuras 13a a 13d ilustram como uma carga formal de ADN é afetada por formaldeído, mas não com o reagente de CF-ADN-BCT, uma composição de agente protetor exemplificativa dentro dos presentes ensinamentos. São mostrados os resultados esperados a partir da eletroforese em gel de ADN nativo (controlo) , ADN preservado por CF-ADN-BCT (uma composição de agente protetor exemplificativa dentro dos presentes ensinamentos) e ADN preservado por formaldeído, e mantidos à temperatura ambiente durante 7 dias (Figura 13a); à temperatura ambiente durante 7 dias mais aquecida a 60 °C durante 1 hora (Figura 13b); temperatura ambiente após 14 dias (Figura 13c); e à temperatura ambiente durante 14 dias mais aquecida a 60°C durante 1 hora (Figura 13d). A eletroforese em gel de agarose de ADN genómico ou ADN tratado por fixador determina as mudanças em padrões de migração de ADN-gel induzidas por um painel de fixadores diferentes. 0 ADN fixado ou não tratado foi incubado à temperatura ambiente durante 9 (a) e 14 dias (b) antes da eletroforese em gel de agarose. Para os experimentos c e d, as incubações de dias 7 e 14 são submetidas a um tratamento a quente adicional durante 1 h a 60°C. O reagente de CF-ADN nativo não fixado (uma composição de agente protetor exemplificativa dentro dos presentes ensinamentos) , e ADN tratado por IDU (Figura 9a a 9d, faixas 1 a 2; 8 a 9, faixas 3 a 4; 10 a 11, e 5; 12, respetivamente) não são afetadas por diferenças em condições experimentais. Esses dados sustentam que o reagente de BCT de CF-ADN e o IDU do não mudam a carga formal de ADN e não afetam, assim, a migração eletroforética da banda de ADN primária (seta inferior, marcada como "Banda de ADN Primária") em comparação com o ADN não fixado de controlo. Ao contrário, o tratamento com 0,1% de formaldeido e 0,1% de glutaraldeido reduz a concentração aparente de ADN no poço de carregamento (seta superior, marcada como "Poço de Carregamento"; a e c; faixa 6), que foi mais drástica com um tratamento de glutaraldeido. Quando as amostras são expostas ao tratamento a quente, as concentrações de ADN aparentes para o poço de carregamento (seta superior) e a banda de ADN primário são drasticamente reduzidas dentro do gel (b e d; faixa 13 formaldeido, faixa 14 glutaraldeido). De facto, formaldeido e glutaraldeido induzem a maior parte ou todo o ADN que está visível no poço de carregamento, respetivamente. Adicionalmente, o ADN se demonstrou em peso molecular mais baixo, o que sugere que a carga formal do ADN é alterada por formaldeído ou glutaraldeído aumentando a taxa de migração através do gel do ADN modificado por fixador mais eletronegativo, ou fragmentação de ADN induzida por formaldeído e glutaraldeído ter ocorrido. Alternativamente, formaldeído e glutaraldeído podem induzir a degradação ou o dano ao ADN que afetam a sua resolução no gel.

Na Figura 14, o sangue foi extraído a partir de 6 doadores pra os tubos de extração de K3EDTA padrão. Duas amostras plasmáticas de cada doador foram separadas. Uma amostra foi tratada com Proteinase K (30mAU) a 37 °C durante 10 minutos e, então, aquecida a 75 °C durante 15 minutos para desativar a proteinase. DNase I (136 U) e 6 mM de MgCl2 foram, então, adicionadas à amostra desproteinizado. Após a incubação de um dia para o outro, a concentração de cfDNA foi medida com a utilização de kit de ensaio de Qubit dsDNA HS (Life Technologies, Grand Island, NY) e foi constatado que a fluorescência do plasma tratado foi reduzida por 93% em comparação com o plasma de controlo. Desse modo, um sistema de ensaio de ADN com base em fluorescência utilizado para quantificar cfDNA em plasma é conveniente, exata e compatível com sangue extraído para dispositivos de colheita de sangue que contêm a composição de agente protetor descrita no presente documento, a qual estabiliza o cfDNA durante 14 dias de armazenamento à temperatura ambiente.

Conforme mostrado nas Figuras 15 e 16, amostras sanguíneas a partir de 20 doadores foram extraídas em ambos os tubos de K3EDTA (Figura 15) e dispositivos de colheita de sangue de acordo com os presentes ensinamentos (Figura 16) e armazenadas à temperatura ambiente. Nos pontos no tempo indicados, uma aliquota foi tomada a partir de cada tubo e o plasma separado, conforme anteriormente descrito. Após a separação de plasma, a concentração de cfDNA de plasma foi determinada com a utilização de ensaio de Qubit dsDNA HS. Para o quadro de tempo de armazenamento de dia 14, um aumento estatisticamente significativo na concentração de cfDNA foi visto apenas em tubos de K3EDTA e não nos dispositivos de colheita de sangue incluindo a composição de agente protetor dos presentes ensinamentos. Para as plotagens em caixa, a linha dentro da caixa indica 0 valor mediano e os limites da caixa representam o 75£ e o 25-percentis. As barras de erro superiores e inferiores indicam o 10- e 90- percentis, respetivamente, enquanto a maioria dos pontos indicam os quaisquer valores fora dos bigodes. *p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001 por teste t de Student.

Como referência à Figura 17, a fixação de formaldeido pode ser regulada ao utilizar compostos de arrefecimento brusco de formaldeido (conforme discutido no presente documento) como aminas (por exemplo, metilamina, CH3NH2) ou outros aminoderivados, como amida (por exemplo, ureia, H2NOONH2) , aminoácidos (por exemplo, glicina, HOOCCH2NH2) ou sais de amónio. Ao reagir o agente de arrefecimento brusco e formaldeido conforme mostrado, os produtos que incluem metilol e bases de Schiff são formados, conforme representado. Em teoria, qualquer composto com grupo funcional rico em eletrões que pode reagir com grupo funcional carbonilo deficiente em eletrões de formaldeido pode arrefecer bruscamente o formaldeído. Por exemplo, conforme mostrado na Figura 18, os compostos de cis -diol podem arrefecer bruscamente o formaldeído e render o acetal cíclico. A Figura 19 mostra que formaldeído libertado por 47,5 de imidazolidinil ureia é completamente arrefecido bruscamente por glicina, lisina e ureia. Os espectros de RMN de 13C de imidazolidinil ureia na presença de vários arrefecedores são mostrados. 0 sinal de 13C de formaldeído hidratado de imidazolidinil ureia é indicado na área sombreada à posição de deslocamento químico de 81,9 ppm. 0 pico não está presente quando glicina, lisina ou ureia estão presentes no meio. No entanto, as eficácias de arrefecimento brusco dos vários agentes de arrefecimento brusco discutidas no presente documento são diferentes. Diazolidinil ureia é utilizada na Figura 20 para determinar sua eficácia de arrefecimento brusco. A Figura 20 mostra eficácia relativa para arrefecer bruscamente o formaldeído libertado da 0,5% de solução de diazolidinil ureia, conforme pode ser incluído na composição de agente protetor revelada no presente documento, A Figura 21 mostra concentrações de formaldeído de diazolidinil ureia (0,5%) na presença de vários arrefecedores bruscos. As concentrações são calculadas com a utilização do método de RMN com base na integração de pico. A Figura 22 representa produtos de formaldeído livre hidratado presentes tanto em diazolidinil ureia quanto em imidazolidinil ureia. 0 estudo de espectroscopia de RMN mostrou que, quando a glicina (5%) e o formaldeído (5%) são misturados juntos, o metilol é formado conforme mostrado na Figura 23. Conforme mostrado na Figura 23, se a mistura de glicina e formaldeído é aquecida a 50°C durante 4 dias, os produtos de reação adicionais como base de Schiff, produto reticulado de base de Schiff-glicina e dímero de base de Schiff também são formados. Quando glicina é adicionada a uma solução de diazolidinil ureia ou imidazolidinil ureia, a mesma reage com o formaldeído libertado de diazolidinil ureia e imidazolidinil ureia, conforme mostrado, por exemplo, na Figura 24. Os estudos de RMN podem detetar a presença de glicina metilol e base de Schiff numa mistura de imidazolidinil ureia e soluções de glicina, conforme mostrado, por exemplo, na Figura 25.

Conforme discutido no presente documento, diazolidinil ureia, em solução aquosa, também é conhecida por libertar formaldeído (consultar Figura 26). Glicina é adicionada para arrefecer bruscamente o formaldeído libertado de diazolidinil ureia. Os estudos de RMN mostram que os produtos formados a partir de glicina e formaldeído são glicina-metilol, glicina-base de Schiff, dímero de glicina-base de Schiff, glicina-base de Schiff reticulados, conforme mostrado, por exemplo, na Figura 26. Numa mistura de diazolidinil ureia e glicina, todos os produtos químicos supracitados podem estar presentes em várias concentrações.

Além de glicina, diversos compostos podem ser utilizados como arrefecedor de formaldeído (consultar Figura 27) . Os exemplos de tal arrefecedor de formaldeído pode incluir, mas sem limitação, quaisquer compostos que contêm grupo amina reativo incluindo ureia, sais de amónio, aminas primárias e secundárias, lisina, arginina e/ou nucleobases (isto é, adenina, guanina, citosina e timina), e poliaminas (isto é, espermidina). Os produtos obtidos a partir do formaldeido de reação, libertados a partir de diazolidinil ureia, com os supracitados ou qualquer outro grupo amina que contém arrefecedores pode incluir metilol correspondente e base de Schiff. A natureza dos outros subprodutos pode variar dependendo do arrefecedor.

Conforme pode ser adicionalmente notado a partir do supracitado, os ensinamentos no presente documento perspetivam métodos para analisar ADN numa amostra biológica livre de aldeído. Os métodos podem incluir uma ou mais etapas de contacto com uma amostra que contém ADN com uma composição de agente protetor que inclui imidazolidinil ureia e um ou mais agentes de arrefecimento brusco, conforme descrito no presente documento. Após isso, a amostra pode ser tratada por uma ou mais etapas para analisar ADN.

Por exemplo, pode haver uma etapa de contacto da amostra com um corante fluorescente que se liga seletivamente a ADN de dupla hélice, e após isso, realizar um ensaio no ADN que inclui realizar espectroscopia de fluorescência, espectroscopia de dicroísmo circular, ou ambos para analisar o ADN da amostra. É esperado que, após um período de pelo menos cerca de 6, 12, 24, 48, 96 horas ou mais (por exemplo, 1 semana ou até mesmo duas semanas depois) a partir do momento em que a amostra fez contacto com a composição estabilizadora, a mesma exiba uma intensidade de fluorescência que está dentro de cerca de 20% da intensidade de ADN nativo (no momento de aquisição de amostra) que não foram submetidos à etapa de contacto acima. Espera-se que, após um período de pelo menos cerca de 6, 12, 24, 48, 96 horas ou mais (por exemplo, 1 semana ou até mesmo duas semanas depois) a partir do momento da amostra que fez contacto com a composição estabilizadora, a mesma exiba uma elipticidade substancialmente correspondente àquela de ADN nativo (no momento de aquisição de amostra) que não foi submetido a uma etapa de contacto.

Pode haver uma etapa de amplificar o ADN resultante da etapa de contacto por PCR em que, após um período de pelo menos cerca de 6, 12, 24, 48, 96 horas ou mais (por exemplo, 1 semana ou até duas semanas depois) a partir do momento em que a amostra entrou em contacto com o agente, a mesma exibe eficácia de amplificação que está dentro de cerca de 20% daquela de ADN nativo (no momento de aquisição de amostra) que não foi submetido a uma etapa de contacto.

As explicações e as ilustrações apresentadas no presente documento são destinadas a relacionar-se a outros peritos na especialidade com a invenção, os seus princípios e sua aplicação prática. Como para todos os ensinamentos gerais, conforme utilizado no presente documento, a menos que declarado de outro modo, os ensinamentos perspetivam que qualquer membro de um género (lista) possa ser excluído do género; e/ou qualquer membro de um agrupamento Markush possa ser excluído do agrupamento. A menos que declarado de outro modo, quaisquer valores numéricos declarados no presente documento incluem todos os valores a partir do valor inferior até ao valor superior em incrementos de uma unidade fornecida, visto que há uma separação de pelo menos 2 unidades entre qualquer valor inferior e qualquer valor superior. Como exemplo, se for declarado que a quantidade de um componente, uma propriedade ou um valor de uma variável de processo como, por exemplo, temperatura, pressão, tempo e semelhantes seja, por exemplo, de 1 a 90, preferencialmente de 20 a 80, mais preferencialmente de 30 a 70, é pretendido que os valores de faixa intermediária (por exemplo, 15 a 85, 22 a 68, 43 a 51, 30 a 32 etc.) estejam dentro dos ensinamentos do presente relatório descritivo. De modo semelhante, os valores intermediários individuais também estão dentro dos presentes ensinamentos. Para valores que são menores que um, uma unidade é considerada como 0,0001, 0,001, 0,01 ou 0,1, conforme apropriado. Esses são apenas exemplos do que é especificamente pretendido e todas as combinações possíveis de valores numéricos entre o valor mais baixo e o valor mais alto enumerados devem ser considerados como expressamente declarados nessa aplicação de maneira similar. Conforme pode ser visto, o ensinamento de quantidades expressas como "partes em peso" no presente documento também contempla as mesmas faixas expressas em termos de percentagem em peso e vice-versa. Desse modo, uma expressão da Descrição Detalhada da Invenção de uma faixa em termos de "x" partes em peso da composição de união polimérica resultante" também contempla um ensinamento de faixas de alquma quantidade recitada de "x" em percentaqem em peso da composição de união polimérica resultante". A menos que declarado de outro modo, todas as faixas incluem ambos os pontos finais e todos os números entre os pontos finais. A utilização de "cerca de" ou "aproximadamente" em ligação a uma faixa aplica-se a ambas as extremidades da faixa. Desse modo, "cerca de 20 a 30" é destinado a cobrir "cerca de 20 a cerca de 30", inclusivamente pelo menos os pontos finais especificados. As concentrações de ingredientes identificados nas Tabelas no presente documento podem variar ± 10%, ou até mesmo 20% ou mais e permanecer dentro dos ensinamentos. O termo "que consiste essencialmente em" para descrever uma combinação deve incluir os elementos, ingredientes, componentes ou etapas identificados, e tais outros ingredientes de elementos, componentes ou etapas que não afetam materialmente as caracteristicas básicas e inovadoras da combinação. A utilização dos termos "que compreende" ou "que inclui" para descrever combinações de elementos, ingredientes, componentes ou etapas no presente documento também contemplam as modalidades que consistem essencialmente em, ou até mesmo consistem nos elementos, ingredientes, componentes ou etapas. Os vários elementos, ingredientes, componentes ou etapas podem ser fornecidos por um elemento, ingrediente, componente ou etapa integrado único. Alternativamente, um elemento, ingrediente, componente ou etapa integrado único pode ser dividido em elementos, ingredientes, componentes ou etapas plurais separados. A revelação de "um" ou "um (1)" para descrever um elemento, ingrediente, componente ou etapa não é destinado a excluir elementos, ingredientes, componentes ou etapas adicionais. Todas as referências no presente documento a elementos ou metais que pertencem a um certo Grupo referem-se à Tabela Periódica dos Elementos publicada e protegida por direitos autorais por CRC Press, Inc., 1989. Qualquer referência ao Grupo ou Grupos deve ser ao Grupo ou Grupos, conforme refletido nessa Tabela Periódica dos Elementos com a utilização do sistema IUPAC para numerar grupos.

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método caracterizado por compreender as etapas de: a. obter num recipiente de colheita de amostra uma amostra biológica que inclui pelo menos um primeiro ácido nucleico livre de célula de circulação, que é ADN, de um indivíduo que contém um ácido nucleico próprio do indivíduo, em que o indivíduo é selecionado de entre uma vítima de um crime, um suspeito de um crime, um indivíduo submetido à deteção e/ou monitorização de uma afeção cancerígena, um indivíduo submetido à deteção e/ou monitorização de uma afeção neurodegenerativa, um indivíduo submetido à deteção e/ou monitorização de uma afeção psiquiátrica, ou um indivíduo que não é gestante; b. colocar em contacto a amostra biológica, enquanto dentro do recipiente de colheita de amostra, com uma composição de agente protetor que inclui um agente conservante, um anticoagulante e um agente de arrefecimento brusco para formar uma mistura que inclui a composição de agente protetor e a amostra; e formar um produto de reação que é: (i) inerte ao ácido nucleico da amostra biológica; e (ii) desprovido de qualquer aldeído; para que os ácidos nucleicos dentro da amostra sejam adequados para a reação em cadeia da polimerase e sequenciação de ADN sem congelar a amostra durante pelo menos 7 dias e o ADN é desprovido de (i) reticulação de ácido nucleico para proteína, (ii) reticulações de ácido nucleico para ácido nucleico intramolecular e/ou intermolecular induzidas por aldeído, ou tanto (i) quanto (ii) , ao arrefecer bruscamente qualquer formaldeído livre que possa estar presente com o agente de arrefecimento brusco da composição de agente protetor, em que a composição de agente protetor inclui pelo menos um agente conservante selecionado de entre diazolidinil ureia, imidazolidinil ureia, dimetoilol-5,5-dimetil-hidantoína, dimetilol ureia, 2-bromo-2-nitropropano-l,3-diol, oxazolidinas, hidroximetil glicinato de sódio, 5-hidroximetoximetil-l-aza-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octano, 5-hidroximetil-l-l-aza-3,7-dioxabiciclo[3.3.0]octano, 5-hidroxipoli[metilenooxi]metil-l-aza-3,7- dioxabiciclo[3.3.0]octano, adamantina quaternária ou qualquer combinação dos mesmos.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa (a) incluir obter uma amostra de sangue ou urina para contacto com a composição de agente protetor.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa de contacto incluir empregar como composição de agente protetor uma composição que inclui: a. imidazolidinil ureia como o agente conservante numa quantidade de cerca de 0,1 a cerca de 1,0% em peso da composição total; b. opcionalmente, ácido etilenodiaminatetra-acético como o anticoagulante numa quantidade de cerca de 0,05 a cerca de 0,75% em peso da composição total; e c. um agente de arrefecimento brusco numa quantidade suficiente para reagir com qualquer formaldeido livre que surge da imidazolidinil ureia para formar um produto de reação que não reagirá para desnaturar qualquer proteina da amostra biológica.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa de contacto incluir empregar como a composição de agente protetor uma composição que inclui uma quantidade de cerca de 10 partes em peso do agente conservante por cerca de 1 partes em peso do agente de arrefecimento brusco.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa de contacto incluir empregar como o agente de arrefecimento brusco um composto que inclui pelo menos um grupo funcional com capacidade para reagir com um grupo funcional deficiente de eletrões de formaldeido selecionado a partir do grupo que consiste num composto de amina que reage com formaldeido para formar base de Schiff de metilol e/ou imina, ou um composto cis-diol que reage com formaldeido para formar um acetal ciclico.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa de contacto incluir empregar como o agente de arrefecimento brusco um ingrediente selecionado de entre aminoácidos, alquilaminas, poliaminas, aminas primárias, aminas secundárias, sais de amónio ou uma combinação dos mesmos.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa de contacto incluir empregar como o agente de arrefecimento brusco um ingrediente selecionado de entre glicina, lisina, etileno diamina, arginina, ureia, adenina, guanina, citosina, timina, espermidina ou qualquer combinação dos mesmos.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa de contacto incluir reagir qualquer formaldeido livre para formar um metilol, base de Schiff de imina, um produto de reação de reticulação arrefecedor de base de Schiff, um dimero de base de Schiff, ou qualquer combinação dos mesmos.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o nivel de ADN de fundo genómico no recipiente que contém a amostra e o agente protetor ser menor que o nivel de ADN de fundo genómico que estará presente num recipiente que contém apenas a amostra e nenhum agente protetor.
10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por incluir o transporte do recipiente que contém a amostra de uma primeira localização a uma segunda localização em que pelo menos uma porção do transporte ocorre a uma temperatura maior que 0 °C.
11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o arrefecimento brusco ocorrer antes da etapa de contacto.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o arrefecimento brusco ocorrer em simultâneo com a etapa de contacto.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o método ser livre de qualquer centrifugação da amostra.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a mistura ser livre de quaisquer modificações covalentes detetáveis que inibem a amplificação de PCR ao inibir a ligação de polimerase e o alongamento, ao inibir anelamento de iniciador, e/ou inibindo intercalação de corante de ADN.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a concentração do agente de arrefecimento brusco após a etapa de contacto de amostra ser maior que 0,001 g/mL, maior que 0,002 g/mL ou ainda maior que 0,004 g/mL da mistura de agente protetor e amostra.
16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a concentração do agente de arrefecimento brusco após a etapa de contacto de amostra ser menor que 0,03 g/mL, menor que 0,01 g/mL ou ainda menor que 0, 008 g/mL da mistura de agente protetor e amostra.
17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o agente protetor incluir de cerca de 1% a cerca de 10% em peso do agente de arrefecimento brusco.
18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o agente protetor incluir desde cerca de 1% a cerca de 20% em peso EDTA.
19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o agente protetor incluir pelo menos cerca de 1 mg e menor que cerca de 15 mg do agente de arrefecimento brusco.
20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a mistura ser desprovida de aldeído livre conforme medido por RMN de 13C.
21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a mistura não exibir picos numa faixa de 82 a 85 ppm quando medida por RMN de 13C.
22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir uma etapa de realizar uma análise de número variável de repetições em tandem (VTNR) na mistura.
23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o agente protetor incluir diazolidinil ureia, imidazolidinil ureia e EDTA.
24. 24. Utilização de um kit ou recipiente caracterizado por realizar o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.