PT2806886T - Composições de proteínas estabilizadas baseadas em alcanos semifluorados - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÕES DE PROTEÍNAS ESTABILIZADAS BASEADAS EM ALCANOS

SEMIFLUORADOS

CAMPO

A presente invenção inclui-se no campo das composições de proteínas e péptidos, em particular composições que são úteis como formulações farmacêuticas de polipéptidos ou proteínas para utilização de diagnóstico ou terapêutica. ANTECEDENTES

Novas classes de biofarmacêuticos terapêuticos com base em péptidos e proteínas tendo como alvo doenças anteriormente incuráveis ou não tratáveis emergiram nos últimos anos, em consequência dos muitos avanços e desenvolvimentos novos que surgiram no campo biotecnológico.

Contudo, devido à sua má biodi sponibi1idade oral e semividas curtas em geral in vivo, o método de fornecimento de muitas das terapêuticas de proteínas e polipéptidos desenvolvidas até agora tem sido maioritariamente restrito à via parentérica. Os anticorpos monoclonais humanos (uma classe em crescimento rápido de terapêuticas direcionadas) que são atualmente aprovados exigem todos administração por inj eção. Por exemplo, adalimumab (Humira™, comercializado por Abbott), um anticorpo monoclonal humano primeiramente indicado para tratar artrite reumatoide, é apresentado numa seringa cheia previamente. Somente algumas composições terapêuticas orais, de mucosa ou por inalação estão atualmente comercialmente disponíveis, muitas das quais incorporam somente agentes polipeptídicos com massa molecular relativamente mais baixa. Um exemplo de uma terapêutica de proteína com massa molecular mais elevada fornecida por via de inalação é dornase alfa (Pulmozyme™, distribuído por Roche) , uma solução de desoxirribonuclease I humana recombinante, indicada para o tratamento de fibrose cística. 0 puro tamanho molecular e complexidade de proteínas e polipéptidos bem como a facilidade relativa de perda da sua atividade através de dano à sua integridade estrutural apresenta um desafio de processamento, formulação e fornecimento destes tipos de terapêuticas. A atividade biológica de uma proteína é determinada pela sua estrutura tridimensional única; pelas suas estruturas secundária e terciária. Uma combinação específica e equilibrada de interações internas como ligação de hidrogénio, interações eletrostáticas, forças van der Waals, interações hidrofóbicas e ligação covalente entre os componentes da cadeia peptídica abrangendo a proteína é o que contribui para a estrutura final de uma proteína dobrada no seu estado nativo. Alterações marginais para essas interações podem ter potencialmente um grande impacto sobre a integridade estrutural de uma proteína. A função biológica precisa de uma proteína baseia-se nas suas interações específicas com outras macromoléculas relevantes e/ou moléculas pequenas. Consequentemente, a especificidade e, consequentemente, a eficácia terapêutica de uma proteína serão perdidas, se as características tridimensionais essenciais forem rompidas de algum modo. A perda da estrutura de proteína nativa pode ocorrer através de diversos caminhos de degradação. A agregação pode ocorrer através de eventos de ligação não covalentes como a auto-associação de monômeros proteicos nativos, ou a associação de proteínas parcialmente desdobradas em oligómeros não nativos. A deterioração e a agregação de proteínas também podem ocorrer através de eventos químicos irreversíveis, covalentes como a formação de e/ou permuta de ligações de dissulfureto de reticulação, hidrólise de ligações peptídicas, desamidação ou oxidação. A prevalência destes fenómenos não depende apenas das características inerentes da proteína, mas também de diversas condições ambientais físico-químicas como temperatura incluindo condições de stress relacionadas como ciclos de congelação-descongelação, pH, concentração proteica, força iónica, a presença de aditivos químicos de desestabilização, secura e fatores de stress mecânico como cavitação ou cisalhamento, todos os quais podem causar um impacto negativo na estrutura dobrada nativa da proteína. A associação de proteína em tais formas oligoméricas frequentemente com massa molecular elevada apresenta um grande problema na formulação, fornecimento e armazenamento a longo prazo das terapêuticas de polipéptidos ou proteínas. A agregação pode levar à perda de fármaco de proteína ativa, levando a dosagens falíveis e ineficazes. Nas formulações líquidas, agregados que podem ser insolúveis podem precipitar e formar grandes particulados que podem impedir o fluxo, o que seria extremamente desvantajoso para aplicações parentéricas. Além disso, os agregados proteicos podem apresentar toxicidade e podem desencadear respostas imunogénicas indesejáveis (Rosenberg, A.S., AAPS J, 2006, 8, E501) . As características do meio escolhido para uma formulação líquida de polipéptido ou proteína podem, consequentemente, ter um grande impacto na praticidade e longevidade de uma formulação.

Sabe-se que um ambiente aquoso é importante na maioria dos casos para a manutenção da estrutura e bioatividade das proteínas, isto é, moléculas de água podem ser essenciais ou mesmo a força de acionamento para dobrar e/ou podem desempenhar um papel direto na atividade enzimática. Por outro lado, um meio aquoso também pode ter um efeito adverso, dependendo da natureza da composição, da fase aquosa e de vários parâmetros como pH e força iónica. A água pode atuar como um plastificante ou servir como o meio de reação bem como diretamente como um componente de reação, como na clivagem hidrolítica de ligações de amida.

Deste modo, um método que tem sido substancialmente utilizado no campo da formulação de terapêuticas de proteínas é a liofilização (secagem por congelação) ou secagem por pulverização da proteína até uma forma de pó de estado sólido. Neste caso, a remoção de água limita a flexibilidade conformacional e mobilidade difusiva da macromolécula de proteína para interagir com outras, diminuindo assim as possibilidades de agregação. Consequentemente, com proteínas no estado seco, é exequível um armazenamento com uma duração substancialmente mais longa, em comparação com muitas formulações de base aquosa.

Contudo, deve ser observado que a degradação e agregação proteica podem ocorrer com bastante facilidade durante o próprio processo de liofilização e, portanto, para diminuir a incidência destes eventos, o investimento de tempo e custos para desenvolver o processo de liofilização são necessariamente muito elevados. Estabilizadores adicionais como sacarídeos, polióis e semelhantes, que servem para compensar a perda de efeitos de ligação de hidrogénio água são também frequentemente adicionados na composição pré-liofilização. Tais excipientes, embora úteis durante o processo de liofilização podem ser prejudiciais para a estabilidade das proteínas no estado seco com o passar do tempo, por exemplo, por separação de fase através de cristalização. Outros excipientes de estabilização pós-liofilização também podem ter de ser incluídos para suportar o tempo de armazenamento mais longo da proteína, incrementando o número de componentes que têm de estar presentes na formulação final.

Além disso, apesar da remoção de água, composições de proteína de estado seco não são imunes aos efeitos de fatores ambientais externos como temperatura, e reações de degradação química onde água não é um reagente principal, como desamidação ou oxidação. Temperaturas elevadas resultam em mobilidade aumentada e consequentemente numa maior probabilidade de reações inter-proteínas, deste modo muitas proteínas liofilizadas ainda têm de ser constantemente armazenadas em condições de refrigeração. Além disso, os excipientes adicionados para tornar o pH e a tonicidade da formulação mais favoráveis para o processo de liofilização podem não ser tão estabilizantes para a proteína no estado seco final. A introdução de humidade pode ser uma preocupação e atenção específica deve ser também dada ao meio (bem como ao material) de armazenamento para proteínas no estado sólido seco.

Além disso, a reconstituição da proteína liofilizada em meios aquosos como uma etapa extra antes da administração efetiva é necessária, e acarreta o risco de manipulação/dosagem inadequada e contaminação. A própria etapa de reconstituição pode desencadear a agregação proteica, se o pH, ou temperatura do meio aquoso não for ótima ou o tempo para a reidratação adequada for demasiadamente curto. Assim, a formulação de um meio de reconstituição apropriado também pode ter de ser considerado e adequadamente desenvolvido. No geral, desde um ponto de vista económico, está envolvida uma quantidade significativamente grande de tempo, esforço e custo para o processo e desenvolvimento da formulação da proteína liofilizada em comparação com formulações líquidas (Wang, W. , Int. J. Pharm., 2000, 203,1). A utilização de solventes orgânicos como meios portadores é outra opção para formular terapêuticas de proteínas. Deve ser observado, no entanto, que tais solventes nem sempre podem ter um efeito de estabilização sobre a estrutura proteica, em alguns casos, passa-se exatamente o oposto. Por exemplo, a concentrações mais elevadas, solventes fortemente polares como DMSO ou DMF e álcoois como metanol ou etanol podem atuar como desnaturantes, frequentemente por competição com ligações de hidrogénio amida internas que pode levar à perda de estruturas terciárias; inclusivamente a razão de estruturas secundárias pode ser alterada, possivelmente levando a estruturas não nativas (Stevenson, C.L. Curr. Pharm. Biotech., 2000, 1, 165). Consequentemente, tais solventes podem não ser ideais para o armazenamento a longo prazo de terapêuticas proteicas. De forma semelhante, a tolerabilidade fisiológica destes tipos de solventes pode ser baixa, e considerações adicionais em relação à libertação e adsorção da proteína (também dependendo do estado da sua solubilidade em tais sistemas de solvente) podem ter de ser tidas em consideração.

Formulações terapêuticas de proteínas em meios aquosos estão, frequentemente, apenas disponíveis sob a forma de uma solução. Formulações que utilizam solventes orgânicos, por outro lado, exigem uma consideração adicional devido à não solubilidade ou solubilidade parcial geral da proteína em tais meios, dependendo da polaridade do solvente e propriedades físicas da proteína. A combinação de solventes orgânicos hidrofóbicos e proteína isenta de água (liofilizada) produz normalmente dispersões ou suspensões. Em tais casos, a estabilidade física a longo prazo da suspensão também é uma consideração importante durante o desenvolvimento da formulação, juntamente com a estabilidade a longo prazo da própria proteína. A utilização de solventes não polares como óleos e lípidos como veículos de suspensão para proteínas ou polipéptidos para utilização parentérica foi relatado, no entanto, a estabilidade destes veículos a temperaturas fisiológicas durante períodos de tempo prolongados foi questionado (Knepp, V.M. et al., Pharm. Res. 1998, 15, 1090). Além disso, estes compostos podem causar efeitos secundários como dor no local da injeção. Além disso, óleos e lípidos tendem a atrasar fortemente a liberação do agente terapêutico. Esta pode ser uma caracterí stica útil para produzir formulações injetáveis do tipo depósito ou de libertação sustentada de duração mais longa, porém não se for desejada uma biodisponibilidade mais rápida e imediata.

Composições baseadas em polímero também foram descritas, por exemplo, foram relatadas formulações de suspensão não aquosas, viscosas de agentes peptídicos ou proteicos, apropriadas para utilização em combinação com um dispositivo implantável, compreendendo polivinilpirrolidona como um componente polimérico e lactato de laurilo (ou álcool laurílico) como um solvente (US7258869 e EP1152749). Tais composições são sugeridas como sendo apropriadas para a libertação controlada de tais agentes terapêuticos.

Compostos perfluorados também foram utilizados como veículos líquidos não aquosos de proteína, polipéptidos e outros agentes biologicamente ativos. Por exemplo, o documento US6458376 descreve composições propostas para aplicações oftálmicas (como gotas para os olhos aplicadas topicamente) nas quais compostos de diagnóstico/terapêuticos incluindo oligopéptidos e fatores de crescimento proteicos são suspensos em perfluorocarbonos e na presença de, pelo menos, um tensioativo. No entanto, é omisso no que se refere ao assunto da escolha de tensioativos específicos que possam ser apropriados para utilização em composições contendo compostos terapêuticos proteicos ou peptídicos, e não realiza qualquer discussão a respeito da estabilidade química e física a longo prazo de tais compostos específicos nestas formulações ao longo do tempo. 0 documento EP0939655 (e US6730328) divulga formulações termicamente estáveis nas quais veículos não aquosos, hidrofóbicos e não reativos como óleo mineral, perfluorodecalina, metoxi fluorano, perfluorotributilamina ou tetradecano são utilizados para composições de suspensão compreendendo proteínas, compostos proteicos e ácidos nucleicos. As formulações são propostas para métodos de administração parentérica, transdérmica, de mucosa, oral e entérica, bem como a sua utilização para administração contínua a longo prazo e fornecimento através de um dispositivo implantável. Contudo, a capacidade destas composições de suspensão para permanecer fisicamente estáveis, isto é, uniformemente dispersas ou redispersáveis após um período de tempo não foi divulgada. A compatibilidade efetiva com o tecido destes tipos de composições também não foi demonstrada. 0 documento US2010/0008996 menciona a utilização por inalação ou instilação de SFAs como veículos para transportar uma substância ativa até à membrana alveolar/regiões dos pulmões de um paciente. Em maior detalhe, o documento ensina soluções coloidais micelares de substâncias ativas que apresentam solubilidade suficiente em SFAs e cujas moléculas têm um tamanho no intervalo de 1 a 0,1 nm para facilitar o transporte através da membrana do pulmão até â corrente sanguínea. Divulga composições baseadas em SFA dos fármacos moleculares pequenos, ibuprofeno, alfa-tocoferol, palmitato de retinol, 5-fluorouracilo, bromexina, oseltamivir e ambroxol, que são descritos como sendo úteis para inalação ou instilação. Em contraste, não divulga qualquer composição específica de uma substância ativa que é uma molécula maior, como uma proteína, ou de uma substância ativa que não seja solúvel em SFAs. 0 documento WO 2011/073134 divulga de forma semelhante soluções compreendendo ciclosporina, um polipéptido cíclico com massa molecular de 1202,61 num alcano semifluorado, opcionalmente na presença de um cossolvente como etanol. Embora suspensões e emulsões sejam também mencionadas como alternativas opcionais, não existe uma divulgação específica de tal tipo de composição.

Kociok et al. (Graef e' s Arch Clin Exp Ophthamol 2005, 243, 345-358) investigaram se a ativação de macrófagos através da ligação à membrana celular poderia ser suportada por gotículas tamponadas emulsifiçadas de determinado tamanho de vesícula. Para estas finalidades, prepararam gotículas emulsifiçadas (mencionadas como vesículas unilamelares) de F6H8 numa fase contínua aquosa pela extrusão do alcano semifluorado através de membranas de filtro de policarbonato numa solução de PBS. Para determinar se a albumina sérica humana (HSA) tem influência sobre a ativação de neutrófilos sanguíneos, algumas das gotículas foram revestidas com HSA incluindo HSA na solução de PBS aquosa. É um obj etivo da presente invenção introduzir composições novas de proteína ou polipéptido que superam as limitações e desvantagens associadas a formulações atualmente conhecidas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Num primeiro aspeto, a invenção proporciona composições novas de polipéptidos ou proteínas bioativas em um veículo líquido que compreende um alcano semifluorado da fórmula RFRH, em que RF é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo alquilo linear com 4 a 8 átomos de carbono. A proteína ou polipéptido bioativo tem preferivelmente uma massa molecular de pelo menos aproximadamente 1.500 Da, em particular pelo menos aproximadamente 2.000 Da e é incorporado na composição de modo a formar uma suspensão. 0 polipéptido ou proteína é preferivelmente uma vacina ou agente de diagnóstico ou terapêutico. O composto bioativo é preferivelmente um polipéptido ou proteína que é sensível à degradação e/ou agregação. Foi descoberto pelos inventores que a utilização de alcanos semi fluorados proporciona dispersões ou suspensões mais estáveis de proteínas como insulina em comparação com outros solventes orgânicos. Em combinação, foi estabelecido também que alcanos semi fluorados têm um efeito de estabilização notável em tais compostos, e que proteínas sensíveis como insulina podem até mesmo ser submetidas a temperaturas substancialmente elevadas sem perda de bioatividade através de agregação e/ou degradação.

Alcanos semifluorados particularmente úteis são selecionados a partir do grupo que consiste em F4H5, F4H8, F6H4, F6H6, F6H8 e F6H10 de acordo com a terminologia como definida abaixo. Estes alcanos semifluorados são bem tolerados pelos tecidos, são capazes de dissolver uma grande gama de excipientes adicionais que podem ser necessários em composições farmacêuticas, e formam provavelmente devido a sua anf ifilicidade inerente dispersões ou suspensões farmaceuticamente vantajosas com polipéptidos e proteínas.

Num aspeto, as composições de polipéptido ou proteína da presente invenção são química e fisicamente estáveis à temperatura ambiente e mesmo a temperaturas elevadas (por exemplo, em torno a 37 °C, ou temperatura fisiológica), pelo que a bioatividade do agente proteico ou peptídico é retida e existe uma agregação insignificante do agente terapêutico. Num aspeto adicional, as composições de suspensão de polipéptido ou proteína na presente invenção também permanecem monodispersas e/ou podem ser prontamente redispersas após armazenamento a temperaturas elevadas (por exemplo, em torno a 37 °C, ou a temperatura fisiológica).

Além disso, a invenção proporciona utilizações médicas de tais composições bem como métodos para estabilizar polipéptidos ou proteínas que são sensíveis à degradação e/ou agregação, cujos métodos incluem a incorporação do polipéptido ou proteína num veículo líquido compreendendo um alcano semifluorado como definido acima.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Num primeiro aspeto, a invenção proporciona uma composição que compreende um composto bioativo e um veículo líquido. 0 composto bioativo é selecionado a partir de agentes terapêuticos ou de diagnóstico ou vacinas que são polipéptidos e proteínas. 0 polipéptido ou proteína tem uma massa molecular de pelo menos aproximadamente 1.500 Da, em particular pelo menos aproximadamente 2.000 Da. 0 veículo líquido compreende um alcano semifluorado da fórmula RFRH, em que RF é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo alquilo linear com 4 a 8 átomos de carbono. Além disso, o composto bioativo é incorporado na composição de modo a formar uma suspensão; isto é, o composto bioativo é suspenso no veículo líquido.

Alcanos semifluorados são veículos muito vantajosos desde a perspetiva farmacêutica: em primeiro lugar, são substancialmente não tóxicos, isto é, bem tolerados por vários tipos de tecido humano e animal após administração tópica ou injeção. Em segundo lugar, são quimicamente inertes e mostram pouca interação prejudicial com ingredientes ativos ou inativos das formulações farmacêuticas. Em terceiro lugar, são - provavelmente devido a seu grau de anfifilicidade inerente - capazes de dissolver uma grande gama de compostos, como ingredientes ativos moleculares pequenos ou muitos excipientes comuns que são úteis em formulações farmacêuticas. Em quarto lugar, ao incorporar compostos que não são solúveis ou somente muito pouco solúveis em alcanos semifluorados (como muitos polipéptidos e proteínas), formam dispersões ou suspensões com propriedades físicas ou farmacêuticas muito úteis, isto é, com pouca ou nenhuma tendência de formar sedimentos não dispersáveis, sólidos.

Os inventores verificaram que as suspensões e dispersões de proteína em alcanos semifluorados são surpreendentemente estáveis. Permanecem finamente dispersas e homogéneas e se ocorrer a flutuação ou sedimentação, geralmente ocorre lentamente, deixando tempo suficiente para o paciente ou cuidador retirar uma dose após agitar o recipiente (por exemplo, frasco) que contém a formulação. A formação de agregados pouco redispersãveis grandes não é observada, e após flutuação ou sedimentação, as partículas de proteína são facilmente redispersas por agitação suave sem perda significativa e parecem reter amplamente a sua distribuição de tamanho de partícula original.

Isto está em contraste acentuado com outros veículos líquidos quimicamente inertes, como perfluorocarbonos, que foram propostos como veículos para medicamentos, por exemplo, nos documentos US 5.518.731 e US 6.458.376. Foi verificado pelos inventores que quando um composto perfluorado como perfluoroctano ou perfluorodecalina ou outros solventes orgânicos como octano são utilizados como veículos líquidos, as suspensões tendem a ser significativamente mais instáveis, isto é, separam-se muito rapidamente por flutuação da fase dispersa, ou pela sua sedimentação, dependendo das densidades relativas da fase dispersa e da fase contínua. Isto é acompanhado por uma formação rápida de agregados de partícula que podem ser densos e são pouco redispersáveis. A flutuação rápida ou sedimentação torna a dosagem precisa e reproduzível um grande desafio, se não impossível. Por exemplo, se uma suspensão oftálmica ou injetável assenta muito rapidamente após agitação, a primeira dosagem a partir de um recipiente cheio (por exemplo, um frasco) se não for retirada imediatamente após agitação, conterá um número inferior ao pretendido de partículas de fármaco, a menos que o recipiente seja mantido de cabeça para baixo, em cujo caso uma quantidade maior do que a pretendida de partículas de fármaco será dispensada. Quando o mesmo recipiente está quase vazio e as últimas doses são dispensadas, a dose de fármaco retirada por volume será demasiadamente elevada se era baixa no início e vice-versa.

Além disso, a formação de agregados de proteínas grande e pouco redispersáveis em veículos perfluorados ou outros solventes orgânicos como octano leva potencialmente à obstrução de agulhas de injeção finas como aquelas utilizadas para injeção subcutânea. Partículas grandes estão em risco de induzir reações adversas no corpo, em particular processos de inflamação.

Foi também observado que as partículas suspensas em compostos perfluorados ou octano tendem a aderir às paredes do recipiente de frasco de vidro e/ou seringa-agulha utilizada para a remoção de uma dose. Isso também levaria à interferência com uma dosagem precisa.

As propriedades vantajosas de suspensões à base de SFA resultam em características de desempenho e qualidade farmacêutica superiores. 0 nível de conveniência para o paciente e/ou prestador de cuidados de saúde é muito aumentado. De forma mais importante, a precisão de dosagem, isto é, precisão e reprodutibi1idade de dosagem, é muito aperfeiçoada em relação a outros tipos de suspensões farmacêuticas. Isto ocasionará um efeito terapêutico mais fiável e um risco reduzido de efeitos adversos que resultam da sobredosagem.

Ao mesmo tempo, os alcanos semifluorados têm um efeito de estabilização notável sobre polipéptidos e proteínas. Os mesmos evitam ou inibem substancialmente a agregação proteica e reduzem significativamente a degradação química. Na realidade, verificou-se que algumas proteínas sensíveis são estabilizadas até tal grau que, quando incorporadas num alcano semifluorado, podem ser expostas a temperaturas elevadas como 50 °C sem perda de bioatividade. Vantagens principais da presente invenção são ocasionadas pela presença de um alcano semifluorado na composição, funcionando como um veículo líquido. Alcanos semifluorados são alcanos lineares ou ramificados alguns de cujos átomos de hidrogénio foram substituídos por flúor. Nos alcanos semifluorados (SFA's) utilizados na presente invenção, um segmento de hidrocarboneto não fluorado linear e um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear estão presentes. Estes compostos seguem deste modo a fórmula geral F(CF2)n(CH2)mH. De acordo com a presente invenção, n é selecionado do intervalo de 4 a 12, e m é selecionado do intervalo de 4 a 8.

Uma nomenclatura que é frequentemente utilizada para SFA' s designa um segmento de hidrocarboneto perfluorado como RF e um segmento não fluorado como RH. Alternativamente, os compostos podem ser mencionados como FnHm e FnHm, respetivamente, em que F significa um segmento de hidrocarboneto perfluorado, H significa um segmento não fluorado. Novamente m define o número de átomos de carbono do segmento respetivo. Por exemplo, F3H3 é utilizado para perfluorpropilpropano. Além disso, esse tipo de nomenclatura é normalmente utilizado para compostos tendo segmentos lineares. Portanto, a menos que indicado de outro modo, deve ser assumido que F3H3 significa 1-perfluoropropilpropano, em vez de 2-perfluoropropilpropano, 1-perfluoroisopropilpropano ou 2-perfluoroisopropilpropano. SFA' s que são úteis no contexto da presente invenção são também descritos nos documentos EP-A 965 334, EP-A 965329 e EP-A 2110126, a divulgação de cujos documentos é referida no presente documento. SFA' s preferidos incluem em particular os compostos F4H4, F4H6, F4H8, F6H4, F6H6, F6H8 e F6H10. São particularmente preferidos para realizar a invenção F4H5, F4H6, F6H6 e F6H8. Noutra forma de realização particularmente preferida, a composição da invenção compreende F6H8.

Opcionalmente, a composição pode compreender mais de um SFA. Pode ser útil combinar SFA's, por exemplo, para obter uma propriedade alvo específica como certa densidade ou viscosidade. Se uma mistura de SFA'S for utilizada, é adicionalmente preferido que a mistura compreenda pelo menos um de F4H5, F4H6, F6H4, F6H6, F6H8 e F6H10, e em particular um de F4H5, F4H6, F6H6 e F6H8. Noutra forma de realização, a mistura compreende pelo menos dois elementos selecionados a partir de F4H5, F4H6, F6H4, F6H6, F6H8 e F5H10, e em particular pelo menos dois elementos selecionados a partir de F4H5, F6H6 e F6H8. SFA's líquidos são química e fisiologicamente inertes, incolores e estáveis. As suas densidades típicas variam de 1,1 a 1,7 g/cmJ, e a sua tensão superficial pode ser tão baixa quanto 19 mN/m. SFA's do tipo RFRH são insolúveis em água, porém também de certo modo anfifílicos com lipofilicidade crescente correlacionando-se com um tamanho crescente do segmento não fluorado. SFA's líquidos do tipo RFRH têm sido utilizados comercialmente para desdobrar e reaplicar uma retina, para tamponamento a longo prazo como substituto do humor vítreo (H. Meinert et al., European Journal of Ophthalmology, vol. 10(3), pãg. 189-197, 2000), e como soluções de lavagem para óleo de silício residual após cirurgia vítreo-retinal. Experimentalmente, foram também utilizados como substitutos do sangue (H. Meinert et al., Biomaterials, Artificial Cells, and Immobilization Biotechnology, vol. 21(5), pãg. 583-95, 1993). Estas aplicações estabeleceram SFA's como compostos fisiologicamente bem tolerados. Por outro lado, SFA's não foram utilizados como excipientes em produtos farmacológicos aprovados até hoje. A composição da invenção compreende um composto bioativo selecionado a partir do grupo de polipéptidos ou proteínas. Polipéptidos e proteínas representam polímeros de unidades de aminoácidos que se ligam entre si por ligações peptídicas. Uma vez que os limites de tamanho que são frequentemente utilizados para diferenciar entre polipéptidos e proteínas são de certo modo arbitrários, as duas expressões para essas moléculas não devem ser - no contexto da presente invenção - entendidas como mutuamente exclusivas: um polipéptido pode também ser mencionado como uma proteína e vice-versa. Tipicamente, o termo "polipéptido" somente se refere a uma cadeia de polímero única, ao passo que a expressão "proteína" também se pode referir a duas ou mais cadeias polipeptí dicas que são ligadas entre si por ligações não covalentes. 0 composto bioativo de acordo com a invenção deve ter uma massa molecular de pelo menos 1.500 Da, em particular pelo menos aproximadamente 2.000 Da.

Como descrito em maior detalhe acima, a bioatividade de polipéptidos e proteínas não somente se baseia na sua estrutura química primária, isto é, na sua sequência de aminoácidos, como também na sua estrutura secundária e terciária, frequentemente também na sua estrutura quaternária. Frequentemente, a sensibilidade de um polipéptido ou proteína à degradação também se refere à sua estrutura secundária, terciária ou mesmo quaternária. Polipéptidos e proteínas que se beneficiarão das presentes invenções incluem tanto compostos quimicamente instáveis, por exemplo, compostos que são propensos a hidrólise, como compostos que têm tendência a perder rapidamente a sua estrutura secundária ou mais elevada, e/ou a desnaturar. Em particular, a composição compreende um polipéptido ou proteína que é sensível à degradação e/ou agregação.

Tal sensibilidade significa tipicamente que o respetivo composto não pode ser formulado como uma formulação líquida (por exemplo, pronta para utilização por injeção) em meios aquosos comuns, mesmo ao incorporar excipientes de estabilização (como tampões, etc.), e armazenados sob condições normais. Deste modo, para ter uma vida de armazenamento aceitável (tipicamente de pelo menos 2 anos), as formulações farmacêuticas de compostos sensíveis devem ser refrigeradas durante o armazenamento, ou devem ser fornecidas sob uma forma seca a partir da qual são reconstituídas antes da utilização. Em particular, "sensível" significa que o respetivo composto perde pelo menos aproximadamente 5 % da sua bioatividade em menos de 1 ano de armazenamento sob condições normais quando formulado num veículo aquoso otimizado. 0 polipéptido ou proteína é um composto de diagnóstico ou terapêutico ou uma vacina. Como utilizado no presente documento, um composto terapêutico é um composto que é útil para evitar uma doença ou condição, aliviar quaisquer sintomas de uma doença ou condição, melhorar qualquer doença ou condição, atrasar o progresso de uma doença ou condição ou semelhante. Um composto de diagnóstico é útil para determinar o estado de um organismo, ou para diagnosticar uma doença, condição, sintoma ou fenótipo de paciente. 0 composto terapêutico deve ser administrado ao paciente, ao passo que o agente de diagnóstico pode ser utilizado in vivo ou in vitro, dependendo do caso específico. Para evitar quaisquer dúvidas, o composto terapêutico ou de diagnóstico é incorporado na composição da invenção numa quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico ou de diagnóstico.

Os inventores também verificaram que o efeito de estabilização dos alcanos semifluorados sobre a atividade química ou biológica é muito acentuado se o composto bioativo for um polipéptido ou proteína no intervalo baixo a médio de tamanho molecular para agentes terapêuticos e de diagnóstico desta classe. Numa forma de realização específica, a massa molecular do agente bioativo está no intervalo de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 100.000 Da. Numa forma de realização adicional, a massa molecular está no intervalo de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 60.000 Da. Em formas de realização adicionais, está compreendida no intervalo de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 60.000 Da, ou de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 50.000 Da, respetivamente. Por outro lado, o benefício da estabilidade física e/ou capacidade de redispersão fácil da dispersão ou suspensão também é prontamente obtido com polipéptidos e proteínas de tamanho molecular relativamente grande, como albumina sérica (aprox. 67 kDa) ou mesmo com proteínas de mais de 100.000 Da. Numa forma de realização específica adicional, o agente bioativo é uma proteína de domínio único ou uma proteína de dois domínios. Isto baseia-se na descoberta dos inventores de que o efeito de estabilização dos alcanos semifluorados também é muito acentuado em combinação com tais proteínas tendo somente um ou dois domínios. Como utilizado no presente documento, um domínio de proteína é uma parte da sequência de aminoãcidos da proteína que forma uma estrutura tridimensional compacta que pode evoluir, funcionar e existir de certo modo independentemente do resto da cadeia proteica. Os domínios podem variar substancialmente em comprimento; na maioria dos casos, no entanto, compreendem monómeros de aproximadamente 25 a aproximadamente 500 aminoãcidos.

Opcionalmente, o agente bioativo pode ser uma enzima, hormona, ou fator de crescimento ou uma proteína estrutural. A composição pode compreender uma hormona terapêutica que serve para substituir ou suplementar uma hormona natural deficiente num paciente. A composição pode compreender ainda opcionalmente mais de um polipéptido ou proteína bioativa.

Numa forma de realização opcional adicional, o agente bioativo pode ser uma proteína que é recombinante ou uma proteína que pode ser originária a partir de uma fonte naturalmente derivada ou um péptido sintetizado. A proteína também pode ser um conjugado proteico ou um análogo de uma proteína natural e/ou endógena.

De acordo com uma forma de realização adicional, a composição compreende uma insulina como agente bioativo, em particular uma insulina humana recombinante. Verificou-se surpreendentemente que insulina dispersa num alcano semifluorado é extremamente estável e não se agrega mesmo quando armazenada a temperaturas substancialmente elevadas, como aproximadamente 50 °C.

Como mencionado, o polipéptido ou proteína é incorporada na composição de modo a formar uma suspensão. Por outras palavras, o polipéptido ou proteína é suspensa no veículo líquido. 0 facto de se uma suspensão é formada após dispersão da proteína no veículo líquido depende, por exemplo, da natureza da proteína, da sua concentração no veículo e do(s) SFA(s) selecionado(s).

Como utilizado no presente documento, uma suspensão pode ser definida como um tipo de uma dispersão, isto é, um sistema tendo pelo menos uma fase contínua (ou coerente) e pelo menos uma fase descontínua (ou interna) que é dispersa na fase contínua. Numa suspensão, a fase dispersa está no estado sólido. As suspensões úteis para pôr em prática a invenção são líquidos, pelo menos à temperatura fisiológica, o que significa que a fase contínua é um líquido. Tipicamente, as suspensões são também líquidas à temperatura ambiente. Além das suspensões, o termo dispersões é entendido como incluindo sistemas coloidais nos quais uma proteína e polipéptido são finamente dispersos na fase líquida. Em algumas formas de realização, o polipéptido ou proteína também é pelo menos parcialmente solvatado.

Numa forma de realização específica, a composição compreende somente o polipéptido ou proteína bioativa e um ou mais SFAs, isto é, a composição consiste no polipéptido ou proteína bioativa e um ou mais SFAs como definido acima.

Em contraste com algumas outras suspensões conhecidas na técnica anterior, as formulações da invenção não exigem qualquer tensioativo, ou somente pequenas quantidades de tensioativo, para a sua estabilização física. Isto é uma vantagem significativa pois tensioativos têm um potencial substancial de irritação e toxicidade local, especialmente quando administrados por injeção subcutânea ou intramuscular ou por instilação no olho. De acordo com uma das formas de realização preferidas, as composições da invenção são substancialmente isentas de tensioativos. Numa forma de realização adicional a quantidade total de tensioativo ou tensioativos, se mais de um tensioativo for incorporado, não é superior a aproximadamente 10 % em peso, em particular não superior a aproximadamente 5 % em peso, ou preferivelmente não superior a aproximadamente 2 % em peso, respetivamente. Em formas de realização preferidas adicionais, a quantidade não é superior a aproximadamente 1 % em peso ou não superior a aproximadamente 0,5 % em peso respetivamente. Neste contexto, os SFA's como descrito no presente documento, embora possuam algumas propriedades anfifílicas devido à sua estrutura química que inclui grupos de alquilo (ou alquileno) fluorado e não fluorado caracterizados por graus diferentes de lipofilicidade, não são entendidos como estando compreendidos no âmbito dos tensioativos.

Os tensioativos que estão ausentes ou somente presentes em pequenas quantidades incluem tensioativos não iónicos, catiónicos, aniónicos e zwiteriónicos como comumente utilizados como excipientes em vários tipos de composições farmacêuticas, por exemplo, como agentes humectantes, emulsionantes, agentes de dispersão, agentes de solubilização e semelhantes. Exemplos de tensioativos que são considerados potencialmente úteis incluem tiloxapol, poloxâmeros como Pluronic F68LF ou Lutrol F68, Pluronic L-G2LF e Pluronic L62D, polissorbatos como polissorbato 20 e polissorbato 80, derivados de óleo de rícino de polioxietileno, ésteres de sorbitano, estearatos de polioxil, lecitinas, fosfolipídios purificados ou sintéticos e misturas de dois ou mais dos mesmos.

As composições da invenção podem compreender opcionalmente um líquido orgânico não fluorado, por exemplo, para modificar as propriedades do veículo líquido, como a viscosidade. Tal outro líquido pode ser um óleo selecionado de óleos de glicérido, ceras líquidas e parafina líquida, ou um solvente orgânico que apresenta um alto grau de biocompatibilidade, ou uma mistura de mais de um excipiente líquido.

Os exemplos de excipientes oleosos potencialmente úteis que podem ser utilizados em combinação com um ou mais SFA's incluem óleos de triglicérido (isto é, óleo de soja, azeite, óleo de gergelim, óleo de semente de algodão, óleo de rícino, óleo de amêndoa doce), óleo mineral (isto é, parafina líquida e petrolato), triglicéridos de cadeia média (MCT), ácidos gordos oleosos, miristato de isopropilo, álcoois gordos oleosos, ésteres de sorbitol e ácidos gordos, ésteres de sacarose oleosos, ou qualquer outra substância oleosa que seja fisiologicamente tolerada pelo olho.

Exemplos de solventes orgânicos potencialmente úteis incluem glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e etanol. A concentração do cossolvente deve ser preferivelmente baixa em relação à do SFA ou mistura de SFA. Se um solvente orgânico como etanol for utilizado, é recomendável manter o mesmo abaixo de um nível de aproximadamente 5 % em peso. Mais preferivelmente, o teor de etanol é de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2 % em peso e mais preferivelmente não superior a aproximadamente 1 % em peso. A composição pode compreender, evidentemente, excipientes farmacêuticos adicionais como exigido ou útil. Excipientes potencialmente úteis incluem ácidos, bases, antioxidantes, meios de estabilização, sinergistas, agentes de coloração, agentes espessantes e - se exigido num caso específico - um conservante. Genericamente, no entanto, a invenção proporciona um meio para formular composições não aquosas que são microbiologicamente estáveis. Isto deve-se ao facto de que SFA's não são normalmente propensos a contaminação microbiana. Consequentemente, é possível formular composições isentas de conservante para serem preenchidas em recipientes multiuso. As composições isentas de conservante são melhor toleradas por muitos pacientes e permitem custos mais baixos dos artigos finais.

As suspensões líquidas da invenção podem ser preparadas por métodos convencionais. Em princípio, as partículas sólidas compreendendo o ingrediente ativo podem ser dispersas no veículo líquido compreendendo o SFA. Alternativamente, as partículas podem ser precipitadas ín situ através da adição de uma solução - tipicamente orgânica - do ingrediente ativo (e, opcionalmente, um ou mais excipientes sólidos) sob condições controladas ao veículo à base de SFA. 0 tamanho de partícula da fase dispersa pode ser ajustado antes ou após as partículas serem combinadas com o veículo líquido. Numa das formas de realização preferidas, são fornecidas partículas do ingrediente ativo que já têm o tamanho de partícula apropriadamente selecionado. Pós tendo tal tamanho de partícula selecionado podem ser obtidos diretamente a partir da síntese do composto respetivo por engenharia de cristal ou após síntese por métodos de trituração ou moagem convencionais utilizando equipamento padrão como um moinho de bolas, moinho de martelo, moinho de rolo, moinho coloidal, moinho de jato ou semelhantes. Se o tamanho de partícula tiver de ser reduzido após preparação de uma suspensão, a ultrasonicação bem com vários tipos de homogeneizadores podem ser utilizados, como moinhos coloidais ou homogeneizadores de pressão elevada.

As propriedades físicas superiores das suspensões de acordo com a invenção tornam estas composições particularmente úteis para a administração tópica ao olho de um paciente, ao ouvido, nariz ou pulmão ou por via parentérica por injeção. Modos de injeção preferidos incluem injeção dérmica, subcutânea, intramuscular e loco- regional. As vias de administração subcutânea e intramuscular são as mais preferidas.

As formas de realização adicionais tornar-se-ão óbvias a partir dos seguintes exemplos que ilustram a invenção em alguns dos seus principais aspetos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: estabilização de α-quimotripsinogénio A 30 frascos com alíquotas de α -quimotripsinogénio A (CHY) foram preparados a partir de uma solução-mãe da proteína. A cada de 10 alíquotas, foram adicionados 2,5 ml de tampão de fosfato de potássio (PPB, 50 mM, pH 8,0), a cada de outras 10 alíquotas, foram adicionados 2,5 ml de F6H8. Os 10 frascos restantes serviram como controlos. Os frascos foram purgados com azoto, suavemente agitados e armazenados a 50 °C. Em intervalos predeterminados, os frascos foram removidos, o seu conteúdo extraído e analisado por dicroísmo circular e um ensaio enzimãtico.

Como resultado, verificou-se que a atividade enzimática das amostras armazenadas em tampão foi drasticamente reduzida já após um tempo de armazenagem de 1 dia. A aglomeração era visível. Em contraste, a amostra de SFA reteve uma atividade enzimática substancial durante um período de semanas. Na realidade, a bioatividade de CHY armazenado em F6H8 era muito semelhante à dos frascos de controlo. 0 Quadro 1 mostra a atividade enzimática em unidades/ml verificadas para cada amostra testada.

Em relação aos resultados de dicroísmo circular, as amostras de CHY armazenadas em F6H8 eram muito semelhantes aos controlos em todos os momentos, enquanto as amostras de CHY armazenadas em PPS mostraram alterações significativas indicando uma desnaturação substancial.

A alíquotas de 2,5 mg de insulina bovina, 2,5 ml de F6H8 ou 2,5 ml de ácido clorídrico aquoso altamente diluído (0,04 M) foram adicionados e suavemente agitados. As amostras foram purgadas com azoto ou oxigénio e depois armazenadas a 37 °C ou 50 °C, respetivamente. Em intervalos predeterminados, os frascos foram removidos, o seu teor extraído e analisado por dicroísmo circular e um ensaio de HPLC.

Exemplo 2: estabilização de insulina bovina

Como resultado, verificou-se que a insulina era altamente instável quando armazenada em ácido clorídrico aquoso, porém substancialmente estável em ambos os níveis de temperaturas quando armazenada em F6H8, independente de se as amostras tinham sido purgadas com azoto ou oxigénio. Isto foi confirmado pelos dois métodos analíticos. Os resultados do ensaio de HPLC (em % de insulina recuperada) são fornecidos no quadro 2 (armazenamento a 37 °C) e quadro 3 (armazenamento a 50 °C).

Quadro 3

Exemplo 3: Estabilidade física e capacidade de redispersão de suspensões de insulina humana

Nesta série de experiências, a estabilidade física e capacidade de redispersão de suspensões de insulina humana (Hl) num SFA e outros líquidos não aquosos foram avaliadas. Como mencionado, o grau de estabilidade física e em particular a capacidade de dispersão são critérios importantes que determinam a adequação de um meio de suspensão, por exemplo, para uma composição farmacêutica injetãvel ou tópica. A retenção de turbidez, de suspensões de insulina humana (Hl) em F6H8, perfluorodecalina (PFD), perfluoroctano (PFO) e octano (OCT) foi determinada fotometricamente através da medição da transmitância a 350 nm em vários intervalos de tempo durante um período total de 24 horas (figura 1) .

Insulina humana (Sigma, 12643) foi suspensa em cada dos líquidos a uma concentração de 0,91 mg/ml. As suspensões foram misturadas por vórtice durante 3 segundos, a seguir sonicadas em banho de gelo durante 5 minutos. Imediatamente após a sonicação, as suspensões foram transferidas através de pipeta em células de quartzo de 3 ml tapadas com rolha. A transmitância a 350 nm foi medida utilizando um espectrofotómetro UV para cada das suspensões em intervalos de tempo durante um período de 16 horas. As suspensões foram então dispersas novamente durante 15 minutos utilizando um rotador de tubos de ensaio (Labinco) ajustado a 10 rpm e ângulo de 45 graus. Após a redispersão, a transmitância foi medida durante um período adicional de 8 horas. Os dados de transmitância medidos a 350 nm foram normalizados contra uma solução de 0,91 mg/ml de insulina humana em HC1 a 0,04 M, pH 1,6.

Como resultado, foi observado que a separação de fase ocorreu de forma significativamente mais lenta para a insulina humana suspensa em F6H8 (figura 1) . Uma maior estabilidade da suspensão de insulina humana em F6H8, comparada com as amostras nos solventes perfluorados e octano foi evidente nos níveis mais elevados de turbidez (como correlacionado com uma % mais baixa de valores de transmitância) retida durante um período de tempo mais longo. Em contraste, as suspensões nos solventes perfluorados e solvente de hidrocarboneto octano perderam rapidamente turbidez e mostraram separação de fase (por exemplo, por flutuação ou sedimentação) como demonstrado pelos aumentos rápidos acentuados da transmitância. A heterogeneidade poderia ser visivelmente observada nas células de amostra destes solventes, mesmo na suspensão inicialmente formada, com sedimentação e/ou flutuação adicional na interface de ar-líquido tornando-se rapidamente evidente com o passar do tempo.

Após 16 h de tempo de repouso, a suspensão redispersa de insulina humana em F6H8 também readquiriu aproximadamente o mesmo nível de turbidez como quando a suspensão foi inicialmente formada. Em contraste, o mesmo nível de turbidez das suspensões de perfluorodecalina, perfluoroctano e octano não pode ser recuperado após redispersão. Assim, somente a suspensão da proteína em SFA, porém não as suspensões em PFD, PFO e OCT, demonstraram propriedades físicas adequadas para utilização farmacêutica.

Exemplo 4: estabilidade física e capacidade de redispersão de suspensões de a-quimotripsina A retenção de turbidez, de suspensões de a-quimotripsina (CHY em F6H8, perfluorodecalina (PFD), perfluoroctano (PFO) e octano (OCT) foi determinada fotometricamente através da medição da transmitância a 350 nm em vários intervalos de tempo durante um período total de 24 horas. α-Quimotripsina (Sigma, C4129) foi suspensa em cada dos solventes a uma concentração de 2 mg/ml. As suspensões foram misturadas por vórtice durante 3 segundos, a seguir sonicadas em banho de gelo durante 5 minutos. Imediatamente após sonicação, as suspensões foram transferidas através de pipeta para células de quartzo de 3 ml tapadas com rolha. A transmitância a 350 nm foi medida utilizando um espectrofotómetro UV para cada das suspensões em intervalos de tempo ao longo de um período de 16 horas. As suspensões foram então dispersas novamente durante 15-20 minutos utilizando um rotador de tubos de ensaio (Labinco) ajustado a 10 rpm e ângulo de 4 5 graus. Após a redispersão, a transmitância foi medida durante um período de tempo adicional de 8 horas. Os dados de transmitância a 350 nm foram normalizados contra uma solução de a-quimotripsina (2 mg/ml) em tampão de fosfato de potássio, 50 mM, pH 8. A partir do início, valores substancialmente mais baixos de transmitância foram observados para a suspensão de α-quimotripsina em F6H8 em comparação com as respetivas suspensões em perfluorodecalina (figura 3), perfluoroctano (figura 4) e octano (figura 2), indicando uma homogeneidade prolongada desta suspensão e uma separação de fase mais lenta (por exemplo, por flutuação ou sedimentação) no caso da suspensão de SFA. Em particular, observou-se que a-quimotripsina suspensa em octano sedimentava rapidamente no fundo da célula de quartzo, indicando características de suspensão muito mãs a ausentes (quase 100 % de transmitância). Igualmente, após redispersão depois de repouso durante um período de 16 horas, a suspensão de a-quimotripsina em F6H8 foi claramente superior às outras suspensões no sentido em que a sua turbidez de suspensão original (em t=0) foi grandemente recuperada, em contraste com aquela das outras suspensões.

Exemplo 5: cinética de suspensão de suspensões de albumina sérica bovina

De um modo semelhante aos exemplos 3 e 4, a cinética de suspensão da albumina sérica bovina (BSA) em F6H8, perfluorodecalina (PFD), perfluoroctano (PFO) e octano (OCT) foi avaliada através de medição da transmitância a 350 nm em vários intervalos de tempo durante um período de 2 horas. BSA foi suspensa em cada dos solventes a uma concentração de 5 mg/ml. As suspensões foram misturadas por vórtice durante 3 segundos, a seguir sonicadas em banho de gelo durante 5 minutos. Imediatamente após sonicação, as suspensões foram transferidas através de pipeta para células de quartzo de 3 ml tapadas com rolha. A transmitância a 350 nm foi medida utilizando um espectrofotómetro de UV para cada das suspensões em intervalos de tempo durante um período de 2 horas. Os dados de transmitância em 350 nm foram normalizados contra uma solução de BSA (5 mg/ml) em tampão de fosfato de sódio, pH 7.

Como resultado, observou-se que a suspensão de BSA em F6H8 tinha o nível de transmitância inicial mais baixo (figura 5) . Além disso, o aumento em transmitância nos primeiros intervalos de teste (5 e 10 minutos) foi relativamente baixo para a suspensão à base de SFA em comparação com aquele das outras suspensões que já estavam mais próximas dos seus níveis de patamar nestes pontos de tempo. Em termos farmacêuticos, estas diferenças traduzem- se num tempo prolongado que esta disponível para administrar convenientemente uma dose de tal suspensão de BSA no SFA, por exemplo, por injeção subcutânea, que é tipicamente realizada em alguns minutos.

Exemplo 6: cinética de suspensão de suspensões de calcitonina de salmão A retenção de turbidez de suspensões de calcitonina de salmão (sCT) em F6H8, perfluorodecalina (PFD), perfluoroctano (PFO) e octano (OCT) foi determinada fotometricamente através da medição da transmitância a 350 nm em vários intervalos de tempo durante um período de 2 horas. A calcitonina de salmão foi suspensa em cada dos solventes a uma concentração de 5 mg/ml. As suspensões foram misturadas por vórtice durante 3 segundos, a seguir sonicadas em banho de gelo durante 5 minutos. Imediatamente após sonicação, as suspensões foram transferidas através de pipeta para células de quartzo de 3 ml tapadas com rolha. A transmitância a 350 nM foi medida utilizando um espectrofotómetro UV para cada das suspensões em intervalos de tempo durante um período de 2 horas. Os dados de transmitância a 350 nm foram normalizados contra uma solução de calcitonina de salmão (5 mg/ml) em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. A suspensão de sCT em F6H8 foi observada como tendo o nível de transmitância inicial mais baixo bem como durante um período de 2 h, indicando novamente propriedades de suspensão substancialmente superiores em comparação com as suspensões em PFD, PFO e OCT (figura 6).

Exemplo 7: distribuição de tamanho de insulina humana em F6H8

Medições de dispersão de luz dinâmica (DLS) de amostras de insulina humana (Sigma, Aldrich 10908) em F6H8 foram feitas utilizando um instrumento Nanostar™ Wyatt Technology DLS. As medições foram feitas utilizando cubetas descartáveis de 4 μΐ. As amostras foram preparadas em concentrações de 1 mg/ml e 10 mg/ml, e não foram filtradas antes de se realizarem as medições.

Os resultados a partir das amostras nas duas concentrações demonstram que há alguma solvatação de insulina humana em F6H8, com uma fração significativa com tamanho de partícula correlacionando-se com as formas monoméricas da proteína (figura 7 - distribuição de tamanho de insulina humana na amostra de 1 mg/ml (ciclo n.° 1) e figura 8 - distribuição de tamanho de insulina humana na amostra de 10 mg/ml). Os inventores acreditam que a capacidade do SFA solvatar a proteína contribui para as propriedades de suspensão e dispersão vantajosas e evita a formação de agregados grosseiros que não são redispersáveis.

Exemplo 8: distribuição de tamanho de calcitonina humana em F6H8

Medições de dispersão de luz dinâmica (DLS) de amostras de calcitonina humana (Bachem AG 4014409.00005) em F6H8 foram feitas utilizando um instrumento Nanostar™ Wyatt Technology DLS. As medições foram feitas utilizando cubetas descartáveis de 4 μL. uma amostra foi preparada a uma concentração de 1 mg/ml. A amostra não foi filtrada antes da realização das medições.

Os resultados a partir da amostra demonstram que há alguma solvatação da calcitonina humana em F6H8 com uma fração detetável com tamanhos de partícula correlacionando com as formas monoméricas da proteína (figura 9). Agregados pequenos foram também detetados. Novamente, acredita-se que a solvatação da proteína pelo SFA contribui para as propriedades de suspensão ou dispersão vantajosas e evita a formação de agregados grosseiros irreversíveis.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 7258869 B [0014] • EP 1152749 A [0014] • US 6458376 B [0015] [0030] • EP 0939655 A [0016] • US 6730328 B [0016] • US 20100008996 A [0017] • WO 2011073134 A [0018] • US 5518731 A [0030] • EP 965334 A [0036] • EP 965329 A [0036] • EP 2110126 A [0036]

Documentos de não patente citados na descrição • ROSENBERG, A. S. AAPS J, 2006, vol. 8, E501 [0007] • WANG, W. Int. J. Pharm., 2000, vol. 203, 1 [0011] • STEVENSON, C. L. Curr. Pharm. Biotech., 2000, vol. 1, 165 [0012] • ΚΝΕΡΡ, V. M. et al. Pharm. Res. , 1998, vol. 15, 1090 [0013] • KOCIOK et al. Graefe' s Arch Clin Exp Ophthalmol, 2005, vol. 243, 345-358 [0019] • H. MEINERT et al. European Journal of Ophthalmology, 2000, vol. 10 (3), 189-197 [0040] • H. MEINERT et al. Biomaterials, Artificial Cells, and

Immobilization Biotechnology, 1993, vol. 21 (5), 583-95 [0040]

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição compreendendo um composto bioativo e um veículo líquido, em que o veículo líquido compreende um alcano semifluorado da fórmula RFRH em que RF é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo alquilo linear com 4 a 8 átomos de carbono; e em que o composto bioativo é um agente de diagnóstico ou terapêutico ou vacina selecionado a partir de polipéptidos e proteínas tendo uma massa molecular de pelo menos 1.500 Da, em que o composto bioativo é suspenso no veículo líquido e em que a composição está sob a forma de uma suspensão.

2. A composição de acordo com a reivindicação 1, em que o composto bioativo é sensível à degradação e/ou agregação.

3. A composição de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o composto bioativo é uma proteína de domínio único ou uma proteína de dois domínios.

4. A composição de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o composto bioativo é uma insulina.

5. A composição de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o alcano semifluorado é selecionado a partir de F4H5, F4H6, F4H8, F6H4, F6H6, F6H8 e F6H10.

6. A composição de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, que é substancialmente isenta de água.

7. A composição de acordo com qualquer das reivindicações anteriores para utilização como um medicamento.

8. A composição para utilização como um medicamento de acordo com a reivindicação 7, em que o medicamento é para administração parentérica por injeção subcutânea, dérmica, intramuscular ou loco-regional.

9. A composição para utilização como um medicamento de acordo com a reivindicação 7, em que o medicamento é para administração tópica ao olho, ouvido, pulmão, pele ou nariz de um paciente.

10. Método de preparação de uma composição que compreende um agente de diagnóstico ou terapêutico bioativo ou vacina selecionado a partir de um polipéptido ou proteína, tendo uma massa molecular de pelo menos 1.500 Da, compreendendo a etapa de incorporar o polipéptido ou proteína bioativa num veículo líquido que compreende um alcano semifluorado da fórmula RFRH em que RF é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo alquilo linear com 4 a 8 átomos de carbono de modo a formar uma suspensão.

11. 0 método de acordo com a reivindicação 10, em que a proteína ou polipéptido bioativo é sensível à degradação e/ou agregação.

12. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 11, em que a composição é química e/ou fisicamente estabilizada.