PT2470214E - Método para tratamento de fragilidade - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA TRATAMENTO DE FRAGILIDADE" Área da invenção A invenção relaciona-se com a prevenção e tratamento de fragilidade num paciente idoso. A invenção também se relaciona com uma composição farmacêutica para utilização em tal método. A invenção relaciona-se, em particular, com uma composição farmacêutica com uma terapia de reforço de recuparação para pessoas idosas fragilizadas.

Antecedentes da invenção A fragilidade é um síndroma clínico com sintomas como baixo peso corporal devido a perda de peso não intencional, exaustão, fraqueza, andamento com lentidão e pouca actividade física. A fragilidade é caracterizada por uma diminuição das reservas e da resistência aos agentes de tensão, resultado, por sua vez, do declínio cumulativo ao longo de múltiplos sistemas fisiológicos, causando uma vulnerabilidade com consequências adversas. Entre estas, estão o aumento da resistência à insulina, síndroma metabólico e a esteoporose. et al.,

Uma definição muito divulgada deste síndroma geriátrico complexo, como proposto por Fried 2 ΡΕ2470214 (2001), J. Gereontol. A. Biol. Sei. Med. Sei., 56:M146-M156, baseia-se na avaliação de cinco caracteristicas distintas. Um indivíduo é considerado como sendo frágil quando possui pelo menos três das caracteristicas seguintes: perda não intencional de peso no ano transacto; fraqueza do poder de agarrar; pouca resistência/exaustão; lentidão; e nível baixo de actividade física. A fragilidade tem sido associada com alterações de biomarcadores como IL-6, CRP, 25-OH-vitamina-D, IGF-1, D-dímeros e é particularmente proeminente em pessoas idosas. No contexto desta invenção, os idosos têm, particularmente, uma idade de 60 anos ou superior, e mais particularmente, 65 anos ou superior. A fragilidade está associada com uma perda gradual de eficiência do metabolismo das proteínas. Por outro lado, isto afecta os graus de metabolismo, o que conduz a síndromas como os mencionados acima.

Um dos aspectos principais da fragilidade é o de afectar a massa muscular e resistência, levando a um aumento da incidência de quedas e lesões associadas, como fracturas e diminuição da mobilidade, Conjuntamente com uma diminuição da imunidade relacionada com a masssa muscular, velocidades de cicatrização reduzidas e deterioração mental, isto conduz a uma perda de independência.

Actualmente, não existe nenhum tratamento 3 ΡΕ2470214 registado especificamente para o tratamento da fragilidade. Foram realizadas algumas investigações clinicas sobre o efeito de diversos tratamentos sobre sintomas individuais de fragilidade. Isto inclui, e.g., o efeito de esteróides anabolizantes sobre a massa muscular, o que é bem conhecido pelos técnicos da matéria.

Uma referência sobre o efeito do esteroide anabolizante oxandrolona na massa muscular em homens idosos, é Schroeder et al., 2005, J. Gerontol. A. Biol. Sei. Med. Sei., 60:1586-1592.

Concentrações baixas de 25-OH-vitamina-D no soro, que é um marcador para insuficiência de calcitriol, são vulgarmente encontradas nos idosos e verificou-se que acompanham o desenvolvimento de sintomas de fragilidade

Uma referência que advoga a terapia com vitamina D é a de Campbell e Szoeke, Journal of Pharmacy Practice and Research , vol. 39, n° . 2, Junho de 2009, 147-151 que proporciona uma panorâmica sobre tratamentos farmacológicos alternativos para a fragilidade em idosos. Um desses tratamentos é com vitamina D, que é referida em relação aos seus efeitos sobre o osso, músculo e equilíbrio. Outro destes tratamentos é com hormonas anabolizantes, mas este tratamento é referido como não possuindo benefício claro em idosos fragilizados (Hedstrõm et al., 2002; Lyritis et al., 1994). 4 ΡΕ2470214

Uma referência sobre terapias emergentes para tratamento do síndroma de fragilidade em idosos é a de Cherniack et ai., Alternative Medicine Reviews, Volume 12, Número 3, 2007, páginas 246-258. Aqui, o foco é colocado sobre os suplementos nutricionais com, e.g., vitaminas, carotenóides, creatinina, DHEA ou beta-hidroxi-beta-metilbutirato e sobre modalidades de exercício (tai chi e aminhada sobre pedras roladas). O suplemento com vitamina D é referido como um meio prometedor para alívio de componentes do síndroma de fragilidade. Também em referência às deficiências em vitamina D, que ocorrem com frequência nos idosos, é colocada a hipótese de um suplemento de vitamina D poder prevenir a fragilidade. O tratamento combinado com decanoato de nandrolona, colecalciferol (vitamina D3) oral e um suplemento de cálcio em mulheres recuperando de fractura da anca, mostrou melhorar os índices de BMD, massa muscular e o passo (Hedstrõm et al., J. Bone Joint Surg. Br., 2002; 84: 497-503). O documento não se dirige à fragilidade. Adicionalmente, os sujeitos viviam independentemente e possuíam um estatuto BMI médio de 23, indicando que os sujeitos neste estudo não eram frágeis. Apesar de o estudo proporcionar vitamina D em conjunção com um esteróide anabolizante, a revelação, além da referência de Cambell et al., acima, reflete o conhecimento convencional enfatizando o papel da vitamina D em relação ao osso e o papel do esteróide anabolizante em relação ao osso e músculo. 5 ΡΕ2470214 0 tratamento eficiente da fragilidade é uma necessidade médica não solucionada devido à forma como se desenvolve a patofisiologia e ao aumento dos custos associados com os cuidados de saúde.

No alivio e prevenção dos sintomas de fragilidade é desejado que sejam tratados ou aliviados vários sintomas ao mesmo tempo. No tratamento de fragilidade é desejável proporcionar uma única terapia que na realidade trate a condição e seja particularmente dirigida à melhoria da capacidade funcional e independência, que são objectivos clínicos preferidos para os pacientes idosos. Uma consequência típica da fragilidade consiste em os pacientes ficarem sujeitos a uma espiral descendente de declínio, que quase inevitavelmente conduzirá a admissão para cuidados de longo tremo. É desejável prevenir e reverter o de outro modo, declínio adicional e permitir aos pacientes viverem independentemente durante um período mais longo de tempo. Isto é particularmente crítico em pacientes em recuperação após hospitalização, dado que este é, frequentemente, um ponto de viragem dos idosos fragilizados, que conduz a estadias prolongadas em estabelecimentos de saúde (e declínio adicional), em vez de retomarem independência (e retomarem actividade física e mental, levando a uma melhoria de saúde). Assim, é necessária intervenção médica.

Sumário da invenção

De modo a melhor cumprir um ou mais dos desejos 6 ΡΕ2470214 acima, a invenção, num aspecto, é o tratamento ou prevenção de fragilidade num paciente idoso, particularmente, possuindo uma idade de 60 anos ou superior, compreendendo a administração parenteral concomitante de uma dose eficaz de uma combinação de um esteroide anabolizante e de um composto de vitamina D.

Noutro aspecto, a invenção apresenta uma combinação de um esteroide anabolizante e de um composto de vitamina D, para utilização no tratamento de fragilidade num paciente idoso, particularmente, possuindo uma idade de 60 anos ou superior, compreendendo a administração parenteral concomitante de uma dose eficaz de uma combinação de um esteroide anabolizante e de um composto de vitamina D.

Ainda noutro aspecto, a invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um esteroide anabolizante e um composto de vitamina D num veiculo liquido adequado para administração parenteral.

Ainda noutro aspecto, a invenção inclui um dispositivo de injecção para administração intramuscular de um liquido, em que o líquido contém um esteroide anabolizante e um composto de vitamina D num veículo líquido adequado para administração parenteral. 7 ΡΕ2470214

Breve descrição dos desenhos A Fig. 1 é um diagrama de barras mostrando o efeito de nandrolona e de la, 25-dihidroxivitamina D3 (DHVD3) sobre a alteração na percentagem de células com expressão positiva do receptor andrógeno (AR) em células do músculo esquelético humano (células satélite), lote hSkMC2, após 5 dias de tratamento com nandrolona e/ou DHDV3. Foi utilizada testosterona como referência. A Fig. 2 é análoga à Fig. 1, mostrando os efeitos sobre a expressão positiva do receptor de vitamina D (VD3R). A Fig. 3 são diagramas de barras mostrando os efeitos de duas concentrações de nandrolona e de la,25- dihidroxivitamina D3 (DHVD3) isoladamente e o das suas combinações sobre a proliferação de células de músculo esquelético humano (lotes hSkMCl e 2), que é utilizado como medida da massa muscular.

Descrição detalhada das realizações A invenção relaciona-se com o tratamento da fragilidade. 0 termo "fragilidade" é aqui definido particularmente com referência à definição acima mencionada (Fried et al. , 2001) . Os pacientes a serem tratados serão geralmente seres humanos idosos, tanto homens como mulheres, possuindo geralmente uma idade de 60 anos ou ΡΕ2470214 superior. Mais particularmente, os pacientes tratados possuem uma idade de 65 anos ou superior.

Num sentido lato, a invenção baseia-se no reconhecimento que os estudos actuais, parciais e orientados para os sintomas individuais da fragilidade não são suficientes para conduzir a um verdadeiro tratamento. A invenção pretende proporcionar tal tratamento por uma via de administração especifica de uma combinação judiciosa de substâncias activas. Sem se desejarem ligar a qualquer teoria, os inventores acreditam que a eficácia da adfministração parenteral combinada de um esteróide anabolizante, preferencialmente decanoato de nandrolona, e de um composto de vitamina D, preferencialmente vitamina D3 (colecalciferol) , se baseia num efeito sinergistico entre os dois compostos, particularmente sobre a massa muscular e a função muscular. Esta crensa baseia-se na acção molecular dos receptores para os dois compostos e as vias que os dois compostos podem activar nas células mioblásticas/satélite. Tanto o receptor de androgénio como o receptor de vitamina D pertencem à família dos factores de transcrição nucleares, o respectivo modo de acção é muito diferente. Sabe-se que o receptor de vitamina D está envolvido na proliferação e diferenciação celular. 0 receptor androgénio está envolvido no crescimento celular. Contudo, em combinação, julga-se que levem a uma estimulação óptima do crescimento de células musculares. Adicionalmente, julga-se que a administração de um esteróide anabolizante, concomitantemente com um composto de vitamina D, afecta 9 ΡΕ2470214 positivamente a actividade do receptor de vitamina D. E a vitamina D afecta positivamente o sistema neuromuscular. A invenção envolve a administração parenteral concomitante de doses eficazes de um esteroine anabolizante e de um composto de vitamina D. 0 termo "administração concomitante" é bem conhecido na arte e geralmente refere-se à administração de duas substâncias activas ao mesmo tempo ou quase ao mesmo tempo. Na presente invenção isto significa que ambos os compostos são administrados no mesmo intervalo de tempo. Assim, se um dos compostos for administrado diáriamente, o outro composto também é administrado diáriamente, no mesmo dia. Se um dos compostos for administrado semanalmente, o outro composto também será administrado semanalmente, na mesma semana. Se um dos compostos for administrado mensalmente, o outro composto também será administrado mensalmente, na mesmo mês. Deve ser tomado em consideração que os termos "dia", "semana" e "mês" não se referem necessáriamente a um dia, semana ou mês de calendário, mas a intervalos de tempo possuindo essa duração. Preferencialmente, ambos os compostos serão administrados directamente, um após o outro e mais preferencialmente são administrados simultâneamente. Ainda mais preferencialmente, a administração simultânea é efectuada através de uma única composição compreendendo ambos os compostos. 0 termo "administração parenteral" é bem entendido na arte é geralmente refere-se a todas as vias de 10 ΡΕ2470214 administração além das através do trato gastro-intestinal, incluindo, mas não se limitando a administração intramuscular, intravenosa, subcutânea, transdérmica, transmucosa ou por inalação. Na invenção, administração parenteral é preferencialmente injecção intramuscular ou subcutânea.

Tendo em vista o grupo de pacientes tratados, os idosos, a via de administração mais preferida é por injecção subcutânea. Os idosos são frequentemente caracterizados por possuírem pouco músculo (particularmente se sofrerem de fragilidade). Por outro lado, tendem a possuir uma área de pele relativamente grande, com muitas rugas. Por isso, especialmente no tratamento da fragilidade, a injecção subcutânea tem a vantagem particular de ser muito mais fácil e menos dolorosa para o paciente, do que a injecção intramuscular

Os compostos são administrados em doses eficazes. O termo "dose eficaz" é bem conhecido na arte. Em farmacologia, a dose eficaz é a dose média de um fármaco que produz o efeito desejado. A dose eficaz é frequentemente determinada com base na análise da relação dose-resposta específica do fármaco. A dosagem que produz um efeito desejado em metade da população testada é referida como ED-50 e esta é geralmente reconhecida como uma dose eficaz. No contexto da invenção, a dose é considerada como sendo eficaz se servir para aliviar uma pluralidade (i.e., dois ou mais) de sintomas de 11 ΡΕ2470214 fragilidade. As doses eficazes preferidas servem para tratar a condição de fragilidade, como pode ser avaliado através de biomarcadores adequados e/ou objectidos clínicos adequados. No contexto da invenção, o termo "dose eficaz" relaciona-se com a dose combinada das duas substâncias activas. A dose eficaz e o intervalo de dosagem podem, por vezes, ser escolhidos de forma diferente entre pacientes masculinos e femininos. E.g., as doses de esteroides androgénicos anabolizantes podem ser mais elevadas em pacientes masculinos. Adicionalmente, as mulheres tendem a sofrer de fragilidade a uma idade inferior à dos homens e podem necessitar de uma terapia prolongada de doses regulares, enquanto que um homem, tornando-se frágil a uma idade mais elevada pode necessitar de terapia de reforço da recuperação de duração mais curta e dosagem mais elevada. A combinação de substâncias activas de invenção compreende um esteroide anabolizante. 0 termo "esteroide anabolizante" é bem conhecido na arte, como sendo uma classe de hormonas esteroidais relacionadas com a hormona testosterona. Para uma revisão dos esteroides anabolizantes, é feita referência a A.T. Kicman, British Journal of Pharmacology (2008) 154, 502-521. Os esteroides anabolizantes geralmente possuem efeitos anabólicos e androgénicos sobrepostos e são, por consequência, por vezes denominados esteroides anabólico-androgénicos (AAS). A relação androgénico:anabólico de um AAS é um factor importante para a determinação da aplicação clínica destes compostos. Deve ser tomado em consideração que, na presente 12 ΡΕ2470214 invenção, é desejado que o efeito anabólico (miotrófico), que promove o crescimento de células musculares, tenha precedência sobre o efeito androgénico. Com este propósito, o esteroide anabolizante é preferencialmente selecionado do grupo que consiste em norboletona, oximetolona, oxandrolona, oximetolona, nandrolona e esteres seus derivados. 0 esteroide anabolizante preferido para utilização na presente invenção é a nandrolona ou um ester seu derivado, mais preferencialmente o decanoato de nandrolona.

De acordo com a invenção, o decanoato de nandrolona é administrado preferencialmente (preferencialmente por injecção intramuscular e mais preferencialmente por injecção subcutânea) , uma vez por mês, mais preferencialmente, uma vez de três em três semanas e, ainda mais preferencialmente, todas as semanas. A quantidade de dosagem total administrada por intervalo de tempo, pode, em geral, variar entre 15 mg, preferencialmente, 25 mg por mês e 600 mg, preferencialmente 400 mg por mês. No tratamento de fragilidade de acordo com a invenção, é preferido que a dose não seja demasiado baixa. Tendo em vista os efeitos androgénicos inevitáveis, também é preferido que a dosagem não seja muito elevada. As dosagens preferidas são o mais baixas possível, mas tão elevadas quanto necessário, variando, por semana, entre 5 mg, preferencialmente, 10 mg e 150 mg, preferencialmente 50 mg ou, mensalmente, desde 20 mg, preferencialmente 40 mg até 600 mg, preferencialmente, 13 ΡΕ2470214 2 0 0 mg.

Se for utilizado outro esteróide anabolizante, os intervalos preferidos de dosagem são equivalentes aos mencionados para o decanoato de nandrolona. O técnico da matéria saberá como calcular as conversões de dosagem entre diversos esteróides anabolizantes. A combinação de substâncias activas da invenção inclui um composto de vitamina D. No contexto da invenção, o termo "composto de vitamina D" refere-se à vitamina D e às diversas formas suas derivadas, assim como a precursores e análogos de vitamina D. Esta classe de compostos é bem conhecida dos técnicos da matéria. O composto de vitamina D é, preferencialmente, uma das formas correntes de vitamina D e é seleccionado do gupo que consiste em ergocalciferol, colecalciferol, calcidiol, calcitriol, doxercalciferol e calcipotrieno. A forma de vitamina D mais preferida para utilização na invenção é o colecalciferol (vitamina D3) .

Na invenção, é preferido administrar a vitamina D com uma força de dosagem que conduza a níveis no plasma superiores aos associados com a deficiência em vitamina D. A deficiência em vitamina D é geralmente definida como uma concentração de 25-hidroxivitamina D no plasma, inferior a 20 ng/mL (50 nmol/L) . As concentrações, no plasma, > 140 nmol/L, têm sido associadas a efeitos adversos. Consequentemente, a dosagem preferida de composto de vitamina D é seleccionada de modo a proporcionar um nivel 14 ΡΕ2470214 entre 50 a 70 nmol/L e 140 nmol/L.

De acordo com a invenção, o composto preferido de vitamina D, colecalciferol, é preferencialmente administrado (mais preferencialmente, por injecção intramuscular), uma vez por mês, mais preferencialmente, uma vez de três em três semanas e ainda mais preferencialmente, semanalmente. A dosagem para o colecalciferol situa-se entre o equivalente parenteral de uma dose oral de 100-4000 Ul/dia ou as doses correspondentes por semana ou mês. Contudo, são possíveis dosagens parenterais tão elevadas como 600000 UI (15 mg) de calciferol intramuscular.

Os compostos anteriormente mencionados estão, preferencialmente, incluídos numa única composição farmacêutica, adequada para administração parenteral. Isto refere-se, mais preferencialmente, a uma composição farmacêutica compreendendo um esteróide anabolizante e um composto de vitamina D, preferencialmente, a combinação de decanoato de nandrolona e de colecalciferol num veículo líquido adequado para administração parenteral. O veículo líquido é, preferencialmente, um óleo, mais preferencialmente seleccionado do grupo que consiste em óleo de aráquis, óleo de semente de algodão e óleo de sésamo.

Sem se desejarem ligar à teoria, os inventores acreditam que o facto de tanto o esteróide anabolizante 15 ΡΕ2470214 como o composto de vitamina D (e, particularmente, o decanoato de nandrolona e o colecalciferol) serem solúveis em óleo, pode contribuir para um beneficio mútuo na estabilidade de uma preparação para injecção baseada em óleo. Adicionalmente, a combinação, numa única preparação para injecção, dos dois compostos, facilita a administração concomitante, é menos invasiva para o paciente e dirige-se a uma melhor cumplicidade com o regime de administração de ambos os fármacos.

Deve ter-se em consideração que as composições farmacêuticas da invenção podem conter outros excipientes, como vulgarmente utilizado em tais preparações. Excipientes, aditivos, adjuvantes e outros do mesmo tipo para utilização em formas de dosagem parenteral são conhecidos pelos técnicos da matéria, não necessitando de elucidação aqui.

No tratamento da fragilidade, a composição da invenção será geralmente administrada durante um período de pelo menos 3 meses a 12 meses, preferencialmente, de 4 a 8 meses, e mais preferencialmente, durante 6 meses. A invenção proporciona uma intervenção médica inovadora no tratamento de fragilidade em pacientes idosos.

Apesar de este tratamento da fragilidade não ter antecedentes, os inventores acreditam (sem se pretenderem ligar a qualquer teoria) que a intervenção médica da invenção possui benefícios adicionais. 16 ΡΕ2470214

Isto refere-se ao ponto de viagem mencionado anteriormente, em que um paciente idoso, sofrendo de fragilidade, após hospitalização pode não conseguir reter a sua independência. Estadias prolongadas em estabelecimentos de saúde, também com terapias físicas e mentais próprias, inerentemente depriva estes pacientes de uma importante ferramenta para a prevenção de uma espiral descendente, em oposição à independência de viver as suas próprias vidas com actividade física e mental regular e diária.

Sobre este aspecto, a invenção baseia-se na compreensão que uma intervenção médica num paciente, em tal ponto de viragem, pode não apenas tratar a condição de fragilidade per se, mas serve para suportar o paciente na retenção da sua independência e retoma de actividade física e mental. De modo a assim suportar estes pacientes para uma saúde melhorada, a invenção também proporciona uma terapia de suporte de recuperação para pessoas idosas fragilizadas, particularmente após hospitalização ou cirurgia. Neste aspecto da invenção, é administrada uma dosagem relativamente elevada das duas substâncias activas, preferencialmente decanoato de nandrolona e colecalciferol, com uma frequência relativamente elevada, de preferência semanal, durante um período de tempo que seja suficientemente longo para proporcionar a acção farmacológica requerida, mas suficientemente curta para ser sentida como uma terapia de reforço de curto prazo (para retomar a independência), em vez de medicação permanente (que reflectirá uma doença crónica). Uma duração preferida 17 ΡΕ2470214 para o tratamento de reforço é de 4 a 8 meses, preferencialmente, 6 meses. A invenção também se relaciona com a prevenção de fragilidade em pacientes com propensão a tornarem-se frágeis após hospitalização. Geralmente, estes pacientes estarão para lá do estado de sarcopenia e sofrem de uma função imune reduzida. É preferido que a terapia de reforço anteriormente mencionada seja conduzida utilizando, em cada administração, uma única composição farmacêutica compreendendo ambos os compostos.

Os dispositivos para administração parenteral dos compostos na invenção são conhecidos pelos técnicos da matéria. Com base nos equipamentos conhecidos, a invenção também se relaciona com um dispositivo para injecção para administração intramuscular de um líquido, em que o líquido é uma composição de acordo com a invenção, como descrito acima. A invenção será adicionalmente ilustrada, seguidamente, com referência aos exemplos não limiants que se seguem e às figuras que os acompanham.

Os exemplos são estudos in vitro que demonstram que a nandrolona e a ICC, 25-dihidroxivitamina D3 possuem um efito sinergístico sobre a proliferação de células 18 ΡΕ2470214 satélite do músculo e, consequentemente, sobre a massa muscular. Assim, a invenção pretende utilizar doses mais baixas de decanoato de nandrolona utilizadas em seres humanos, de modo a atingir com a combinação o mesmo efeito sobre a massa muscular e/ou função que se conseguiria apenas com o decanoato de nandrolona.

Exemplo 1

Materiais e Métodos

Obtiveram-se dois lotes diferentes de células de músculo esquelético humano ou células satélite (hSkMCl -obtidas a partir de uma mulher saudavel com 33 anos de idade - e hSkMC2 - obtidas a partir de uma mulher com 64 anos de idade)à PromoCell (Heidelberg, Alemanha) e cultivaram em frascos de acordo com as instruções do fornecedor. Recolheram-se as células e armazenaram-se em azoto liquido até serem utilizadas nas experiências. As céllas não foram utilizadas em passagens com número superior a 15. Para as experiências, as células foram cultivadas a 37°C e 5% de C02, a uma densidade de 3 500-7 000 células/cm2, em meio basal (PromoCell) com a adição de 5% de carvão (Sigma-Aldrich), soro bovino fetal tratado (FBS) (PAA, Alemanha), utilizando placas de 24 poços (Costar) até uma confluência de aproximadamente 80%. A nandrolona, testosterona e la,25-dihidroxivitamina D3 foram adquiridas à Sigma-Aldrich. 19 ΡΕ2470214

Para os estudos dos receptores, cultivaram-se as células durante 5 dias com a adição de 1 μΜ e 10 μΜ de nandrolona (o metabolito activo do decanoato de nandrolona) ou 1, 10 e 100 nM de la,25-dihidroxivitamina D3. Os protocolos de coloração dos receptores de androgéneo e da vitamina D, com a subsequente visualização por métodos de citometria de fluxo, derivaram dos publicados por Krishan et al. (2000) e Folgueira et al. (2000) . O método que proporcionou melhores padrões de coloração incluíam a fixação com formalina seguida de permeabilização com Tween 20 e coloração dupla com anticorpos primários não marcados (receptor anti-androgénio (Epitomics) e receptor anti-vitamina D (GeneTex) e anticorpos secundários marcados com fuoroforo (IgG cabra anti-rato, PE conjugado para coloração do receptor de vitamina D e cabra anti-coelho, FITC-conjugado para coloração do receptor androgéneo, ambos de Rockland). A marcação com os dois anticorpos secundários apenas foi utilizada como fundo. Os receptores Fc foram bloqueados por incubação com tampão contendo soro. Todas as soluções continham também Tween 20 como detergente para manter as células no estado permeabilizado ao longo de toda a experiência de coloração. Compararam-se as colorações em células não estimuladas e estimuladas, determinando a intensidade da coloração nas células, assim colo a coloração na % de cálulasAs medições foram realizadas com um citómetro com duplo fluxo de cor (Beckman Coulter, Type FC500 Cytomics) . A % de aumento de células coradas, para além da base do marcador (a 1% para a coloração de fundo) foi determinada com e sem tratamento hormonal. 20 ΡΕ2470214

Para os estudos de proliferação, cultivaram-se as células durante 8 dias apenas com 100 e 1000 nM de nandrolona ou 10 e 100 nM de la, 25-dihidroxivitamina D3 e com as combinações de nandrolona e la, 25-dihidroxivitamina D3. O meio e as hormonas foram substituídos dos dias 1, 4 e 7. A proliferação foi medida utilizando o ensaio de resazurina (Stern-Straeter et ai., 2008). A análise estatística dos dador de proliferação foi realizada com o teste t de Student.

Exemplo 2

Estudos dos receptores A acção tanto da nandrolona como da la,25-dihidroxivitamina D3 sobre as células depende da presença dos seus receptores cognatos. Consequentemente, investigou-se a presença de ambos os receptores, tanto do androgénio como da vitamina, nas células utilizadas de músculo esquelético humano. As figuras 1 e 2 mostram o efeito da nandrolona e da la,25-dihidroxivitamina D3 sobre a percentagem de células em que se altera a expressão do receptor de androgénio e de vitamina D, em comparação com a coloração apenas com anticorpo secundário.Nas células hSkMC2 são observados aumentos do número de células com receptores positivos ao androgénio e à vitamina D, após exposição à nandrolona, assim como à la,25-dihidroxivitamina D3. Os histogramas também mostram um aumento na intensidade da coloração das células, o que 21 ΡΕ2470214 indica um aumento do número de receptores por célula, quando já continham o receptor, antes do tratamento hormonal. Estes resultados indicam que mais células se tornam positivas ao receptor androqénio e também que o número de receptores por célula aumenta, quando já eram positivas ao receptor, antes do tratamento. Os efeitos nas células hSkMCl foram menos pronunciados (dados não mostrados).

Estes estudos dos receptores mostram que tanto o receptor do androgéneo como o da vitamina D estão presentes nas células do músculo esquelético humano e que a nandrolona e a la,25-dihidroxivitamina D3 estimulam a expressão dos receptores do outro.

Exemplo 3

Estudos de proliferação 0 aumento da percentagem de células com receptores androgénio e de vitamina D positivos pelos dois compostos, como mostrado no Exemplo 1, indica que mais células podem potencialmente responder ao tratamento.

Utilizou-se a proliferação de células do músculo esquelético humano como parâmetro de resposta, de modo a testar se a combinação de nandrolona e de la,25-dihidroxivitamina D3 possui um efeito sinergístico sobre a massa muscular. 22 ΡΕ2470214 A Figura 3 mostra (a) que para as células hSkMCl não houve efeito sobre a proliferação das células com os compostos individuais, mas quando se combinou a la, 25-dihidroxivitamina D3 com a nandrolona, observou-se um efeito significativo em todas as 4 combinações testadas (P<0,001, excepto para 100 nM de nandrolona mais 100 nM de la,25-dihidroxivitamina D3, que é significativo a P<0,05). Para (b) as células hSkMC2, as concentrações mais elevadas de la,25-dihidroxivitamina D3 mostram um aumento na proliferação e novamente as 4 combinações mostram um efeito significativo em comparação com o controlo (P<0,05, excepto para 100 nM de nandrolona mais 10 nM de la, 25-dihidroxivitamina D3, que é significativo a P<0,0001). A percentagem de aumento sobre o controlo, para os diversos tratamentos, são apresentadas na Tabela 1, abaixo. Para as células hSkMCl os aumentos para todas as combinações, excedem a soma dos aumentos para os compostos individuais na combinação. Isto prova o efeito sinergístico da combinação de nandrolona mais de la,25-dihidroxivitamina D3 sobre as células do músculo esquelético humano. Para as células hSkMC2 os efeitos sinergisticos são observados em três das quatro combinações testadas.

Tabela 1

Percentagem de aumento(%Δ) na proliferação de células de músculo esquelético humano (hSkMCl e hSkMC2) pela nandrolona e pela la,25-dihidroxivitamina D3 (dhvitD3), sós e em combinações dos dois compostos, em comparação com um controlo. Σ representa a soma da %Δ da nandrolona ΡΕ2470214 23 isoladamente mais a %Δ da dhvit D3 isoladamente, utilizado nas diversas combinações. como hSkMCl hSkMC2 100 nM de nandrolona 1000 nM de nandrolona 10 nM de dhvit D3 100 nM de dhvit D3 100 nM de nandrolona + 10 nM de dhvit D3 100 nM de nandrolona + 100 nM de dhvit D3 1000 nM de nandrolona + 10 nM de dhvit D3 1000 nM de nandrolona + 100 nM de dhvit D3 %Δ Σ 3 1 1 -5 12 4 11 -2 13 2 10 -4 %Δ 4 1 1 11 13 13 15 Σ 5 12 2 9

Lisboa,14 de Agosto de 2013

Claims (15)

1. ΡΕ2470214 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo um esteróide anabolizante e um composto de vitamina D, num veiculo liquido adequado para administração parenteral.
2. 2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o esteróide anabolizante é seleccionado do qrupo que consiste em oximetolona, oxandrolona, nandrolona e esteres seus derivados e é, preferencialmente, decanoato de nandrolona.
3. 3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o composto de vitamina D é seleccionado do grupo que consiste em ergocalciferol, colecalciferol, calcidiol, calcitriol, doxercalciferol e calcipotrieno.
4. 4. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, compreendendo de 5 a 600 mg de decanoato de nandrolona e de 17,5 μg a 15 mg de colecalciferol.
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o veiculo liquido é seleccionado do grupo que consiste em óleo de araquis, óleo de semente de algodão e óleo de sésamo. 2 ΡΕ2470214
6. 6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para utilização na prevenção de fragilidade, particularmente como terapia para reforço de recuperação de pessoas que se encontrem num estado para além da sarcopenia, sem estarem fragilizados.
7. 7. Dispositivo de injecção para administração intramuscular de um líquido, contendo um liquido que é uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
8. 8. Composição compreendendo um esteróide anabolizante e um composto de vitamina D para utilização no tratamento de fragilidade num paciente idoso, particularmente, possuindo uma idade de 60 anos ou superior, compreendendo a administração parenteral concomitante de uma dose eficaz de uma combinação de um esteróide anabolizante e um composto de vitamina D.
9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que a administração é efectuada pelo menos mensalmente e preferencialmente, semanalmente.
10. 10. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que a administração é efectuada durante um período de pelo menos 3 meses, preferencialmente, 6 meses.
11. 11. Composição para utilização de acordo com 3 ΡΕ2470214 qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que o esteróide anabolizante é seleccionado do grupo que consiste em oximetolona, oxandrolona, nandrolona e esteres seus derivados, sendo preferencialmente decanoato de nandrolona.
12. 12. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, em que o composto de vitamina D é seleccionado do grupo que consiste em ergocalciferol, colecalciferol, calcidiol, calcitriol, doxercalciferol e calcipotrieno.
13. 13. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, em que a administração é conduzida via injecção parenteral de uma única formulação compreendendo tanto o esteróide anabolizante, como o cmposto de vitamina D, preferencialmente a combinação de decanoato de nandrolona e colecalciferol.
14. 14. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 13, em que a formulação única compreende uma dosagem com entre 5 e 600 mg de decanoato de nandrolona e 17,5 μg a 15 mg de colecalciferol.
15. 15. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, como um reforço de 4 ΡΕ2470214 recuperação de pessoas idosas fragilizadas, particularmente após hospitalização ou cirurgia. Lisboa, 14 de Agosto de 2013