PT2249866E - Uso de um sal de ácido acetilsalicílico para o tratamento de infecções virais - Google Patents

Description

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Descrição " Uso de um sal do ácido acetilsalicilico para o tratamento de infecções virais"

Campo da Invenção A invenção diz respeito a uma nova composição contendo um sal de ácido o-acetilsalicilico com um aminoácido básico para ser utilizada na profilaxia ou tratamento de infecções virais dos seres humanos ou dos animais.

Antecedentes da Invenção

Tanto antigamente como hoje em dia, a gripe pertence às grandes pestes da humanidade com potencial pandémico. Existem apenas poucos medicamentos contra os patogéneos que a originam, os virus da gripe A e são todos directamente dirigidos contra o virus. Neste caso, o problema consiste em que se podem desenvolver resistências relativamente rapidamente. Além disso, existe o perigo de que a gripe das aves que se propaga de forma epidémica entre as aves possa também atacar os seres humanos, induzida através de infecções com o virus H5 da gripe A. Em particular, na medida em que as pessoas entram em contacto com as aves infectadas estão numa situação de elevado grau de perigo. É especialmente de considerar que têm sido reportadas insensibilidades crescentes dos virus H5N1 contra os poucos medicamentos autorizados como o Oseltamivir. Existe por isso uma forte necessidade de medicamentos antigripais novos e de largo espectro de eficácia, tanto para a profilaxia, como para o tratamento de infecções virais, em que os medicamentos não deverão se possível provocar resistências. 2 A partir da referência bibliográfica W02004/060360 AI é conhecido que o ácido acetilsalicilico pode inibir o factor de transcrição NF-kB em células hospedeiras e que nessa inibição da via de sinalização do NF-kB permanecem nos núcleos das células componentes essenciais virais que já não podem ser incorporados em particulas virais. A partir desta referência bibliográfica é também conhecida a administração aerogénica do ácido acetilsalicilico para a profilaxia ou tratamento de infecções virais.

Por exemplo, a partir da referência bibliográfica DE 10202019A1 são conhecidos sais do ácido acetilsalicilico com aminoácidos básicos, em que as preparações que os contêm se destinam exclusivamente à administração oral. A partir desta referência bibliográfica é além disso conhecida a utilização de tais sais para o tratamento de doenças do foro reumático, artrites, neuralgias, mialgias, enxaquecas, isquémias cardíacas, acidente vascular cerebral, angina do peito, infarto do miocárdio, operações de by-pass, PTCA, implantes de stent, para a estimulação do sistema imunitário em doentes de HIV, para a profilaxia dos tumores, para retardar a decadência cognitiva do síndroma da demência, para a inibição da formação de pedras da vesícula e/ou do tratamento de doenças diabéticas. Os sais conhecidos são além disso já utilizados sob o nome comercial Aspisol® como medicamentos para o tratamento da asma, febre dos fenos, inchaços da mucosa nasal ou infecções crónicas das vias respiratórias, e para além da administração oral também para injecção. Todas estas doenças não se tratam de doenças que se relacionam directamente com infecções virais, através de vírus da gripe.

Uma utilização de ácido acetilsalicilico puro como agente anti-viral que é administrado como um aerossol nas vias respiratórias ou nos pulmões provou funcionar muito 3 bem no modelo animal. Nos seres humanos a inalação do ácido acetil salicilico puro pode provocar fortes irritações das vias respiratórias. Além disso, verificou-se em alguns casos individuais que uma inalação de ácido acetilsalicilico pode conduzir a ataques de asma em alguns doentes sensíveis. Em todo o caso, para doentes de asma ou pessoas com um risco de asma uma aplicação aerogénica de ácido acetil salicilico como medicamento antigripal é por isso contraindicada.

Problema Técnico da Invenção A invenção tem como base o problema técnico de disponibilizar uma formulação com ácido acetilsalicilico para utilização no tratamento de infecções virais que seja especialmente bem tolerada e que evite especialmente de forma fiável o risco de indução de ataques de asma. A invenção divulga como caracteristicas distintivas da invenção e das concretizações preferidas para resolver este problema técnico uma composição contendo uma dose fisiologicamente eficaz de um sal do ácido o- acetilsalicílico com um aminoácido básico natural, ou não natural para ser utilizada na profilaxia ou tratamento de infecções virais dos seres humanos ou animais, em particular de mamíferos e aves. No âmbito da invenção são designadas infecções virais sobretudo infecções com vírus do tipo selvagem que ocorrem de forma natural e não infecções com vírus modificados geneticamente.

Entre as aves são consideradas para profilaxia ou para tratamento sobretudo as aves domésticas, como galinhas, gansos, patos, frangos de engorda, peruas, perus machos, codornízes ou pombos e também aves canoras.

Através da utilização de um tal sal é evitada sobretudo numa administração aerogénica uma irritação de 4 tecidos, como das mucosas das vias respiratórias, uma vez que o principio activo na formulação administrada não se encontra na forma ácida. Deste modo são evitados de uma forma fiável principalmente ataques de asma em doentes de asma ou pessoas em perigo e não existe praticamente nada contra uma aplicação alargada com base na ausência de efeitos secundários, uma vez que a formulação pode ser utilizada até como um meio contra a asma. Além disso, foi constatado no âmbito da invenção que através da derivatização do ácido acetilsalicílico a inibição da replicação virai não é praticamente enfraquecida, o que não era esperado; ela é até surpreendentemente levemente aumentada.

De acordo com a invenção o aminoácido básico é escolhido no grupo constituído por "lisina, arginina, ornitina, ácido diaminobutírico, e misturas de tais aminoácidos" em que se trata preferencialmente de um monoacetilsalicilato. Um aminoácido é um ácido aminocarboxí lico alfa, em que ao átomo alfa pode estar ligado um hidrogénio ou um resíduo desejado como cadeia lateral. Um aminoácido básico contém na cadeia lateral um grupo básico ou vários grupos básicos, em particular um grupo amina. 0 aminoácido básico pode ser em particular D-lisina, L-lisina ou uma mistura constituída por D-lisina e i-lisina. A composição contém adicionalmente um sal do ácido o-acetilsalicílico com glicina. A proporção em peso de lisina em relação à glicina na composição pode situar-se na gama de 100:1 até 1:1, em particular de 100:1 até 10:1. É preferida uma mistura de sais dos aminoácidos lisina e glicina. É especialmente preferido um sal ou uma mistura de sais, como a que contém a composição comercial sob o nome comercial Aspisol®, por exemplo em solução aquosa. 5

No âmbito da invenção podem também ser utilizadas composições farmacêuticas que contêm pró-fármacos que são metabolizados naturalmente pelo organismo após a toma ou administração nos princípios activos de acordo da invenção. A composição de acordo com a invenção é possível de utilizar para a profilaxia ou tratamento de numerosas infecções virais. É especialmente adequada a composição para a profilaxia ou tratamento de infecções com vírus com cadeias negativas de ARN, como vírus da gripe, preferencialmente vírus da gripe A, em particular vírus do tipo H5 ou H7.

Foi porém também constatado que a substância utilizada de acordo com a invenção suprime a sobre-expressão de citocinas induzidas pelos vírus ("ataque de citocinas") cuja regulação depende de NF-κΒ. Com a substância de acordo com a invenção a patogenicidade de muitos vírus cujo potencial patogénico se encontra relacionado entre outros factores com a sobre-expressão de citocinas pode consequentemente em geral ser reduzida. Por isso a composição utilizada de acordo com a invenção é também adequada para o tratamento e profilaxia de infecções virais com vírus Corona (SARS), vírus sincicial respiratório (RSV), Filovírus, tais como vírus de Marburgo ou vírus de Ébola, Arenavírus, como o vírus de Lassa, Argentino, Boliviano ou Venuzuelano, vírus da febre hemorrágica, Hantavírus, Flavivírus, como o vírus de Dengue ou vírus da febre amarela, vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, vírus do vale do Rift, vírus da Paragripe (tipo 1, 2 e 3), rinovírus, Metapneumovírus humanos (hMPV) e vírus de Epstein Barr. A preparação galénica de uma composição farmacêutica utilizada de acordo com a invenção pode ser efectuada da forma habitual empregue no estado da técnica e basicamente na forma de administração desejada, por exemplo, oral, 6 injectável ou aerogénica para inalação. Preparações galénicas sólidas ou liquidas adequadas são por exemplo granulados, pós, drageias, comprimidos (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, sumos, suspensões, emulsões, gotas, ou soluções para injecções (i.v., i.p., i.m.,s.c.) ou nebulização (aerossóis), sistemas transdérmicos, assim como preparados de libertação prolongada de principio activo prolongada, em cuja preparação são utilizados excipientes usuais, tais como suportes, desintegrantes, ligantes, revestimentos, agentes de inchamento, agentes de escoamento ou lubrificantes, agentes que conferem sabor, edulcorantes, e solventes. Como excipientes são de mencionar o carbonato de magnésio, dióxido de titânio, lactose, manitose e outros sacarideos, talco, albumina, gelatina, amido, celulose e seus derivados, óleos animais e vegetais como óleo de figado de bacalhau, girassol, amendoim, óleo de sésamo, polietilenoglicois e solventes como água esterilizada e álcoois monovalentes ou polivalentes, por exemplo glicerina, ou misturas de tais solventes. Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção é por isso possivel de preparar misturando pelo menos um sal utilizado de acordo com a invenção numa dose definida com um suporte farmaceuticamente adequado e fisiologicamente tolerado e eventualmente outros princípios activos adequados ou excipientes com doses definidas e pré-determinadas e é transformada nas formas de administração desejadas. Exemplos de preparações adequadas para administração oral podem-se por exemplo retirar da referência bibliográfica DE10202019A1 e das referências bibliográficas ai mencionadas. São contudo preferidas as preparações galénicas para uma administração aerogénica, por via nasal como composições liquidas aquosas (solução), ou na forma de pó, eventualmente em suspensão num agente propulsor, por 7 exemplo um agente propulsor que se pode liquefazer à temperatura ambiente, como CFC, hidrofluoroalcanos, como 1,1,1,2-tetrafluoroetano ou 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano, propano, butano, isobutano, ou outros agentes propulsores usuais no campo das formulações de aerossóis medicinais. Para além dos agentes propulsores referidos podem ser também utilizados em alternativa, ar, oxigénio, azoto, dióxido de carbono ou gás hilariante. Neste caso a composição pode conter os aditivos e excipientes do estado da técnica das formulações de aerossóis medicinais, como por exemplo substâncias tensioactivas fisiologicamente toleradas, e/ou agentes de suspensão do estado da técnica. A composição aquosa é ainda preferencialmente uma solução aquosa do sal, ou da mistura de sais de 0,01 mM a 3,0 M, preferencialmente 0,5 a 3,0 M, ou de 0,01 a 100 mM, em particular de 0,1 a 10 mM. É preferido quando o tamanho das particulas do aerossol em solução, ou do sal na forma sólida, i.e. em suspensão, apresenta uma valor de MMAD (Mass Median Aerodynamic Diameter) inferior a 10 ym, preferencialmente inferior a 5 ym. Para a medição da distribuição do tamanho de particulas aerodinâmico FPD (Fine Particle Dose) ou FPF (Fine Particle Fraction) são adequados impactores, como por exemplo o liquid impinger multifásico de 5 passos (MSLI) ou impactor de cascata de Anderson de 8 fases (ACI) que são descritos no capitulo 601 da farmacopeia dos Estados Unidos (USP) ou na monografia dos inaláveis da farmacopeia europeia (Ph. Eur) . Com base na distribuição aerodinâmica das particulas o valor MMAD de uma preparação de aerossóis pode ser calculado, através de um "Log-probability plots". Com os valores MMAD preferidos é conseguido que as particulas dos aerossóis acedam aos pulmões e na realidade até às zonas mais profundas dos pulmões de modo que uma concentração suficiente em todo o pulmão seja atingida nas durações habituais da administração. Para evitar que as pequenas partículas sejam novamente expiradas pode ser pré-determinado como limite inferior para o valor de MMAD 0,1 ym, preferencialmente 0,5 ym, mais preferencialmente 1 ym. O sal utilizado de acordo com a invenção para atingir o valor desejado de MMAD pode ser moido da forma habitual do estado da técnica, ou micronizado por exemplo através de moinhos de pinos, esferas, ou de jacto de ar.

Uma apresentação de um aerossol de acordo com a invenção pode ser realizada com os dispositivos para inaláveis usuais no campo da tecnologia médica com produtores de aerossóis como pulverizadores ou nebulizadores. Exemplos são pulverizadores de pós de aerossóis ou DPI (Dry Powder Inhalators), nebulizadores de bocais, de ultrassons, ou de membrana vibratória. São igualmente possíveis de utilizar produtores de aerossóis que funcionam com base no princípio de electrohidrodinâmico ou aerossóis de condensação a partir de formulações líquidas. Exemplos de dispositivos adequados para inaláveis são descritos nas referências bibliográficas EP1741460A, EP1700614A, EP1258264A e EP1163921A. A concentração do sal na composição associada ao fluxo de um produtor de aerossóis utilizado é escolhida com a condição de que pelo menos 10 mg, preferencialmente pelo menos 50 mg, mais preferencialmente pelo menos 100 mg do sal num período de menos do que 5 min., preferencialmente 2 min. mais preferencialmente 1 min é transformado em aerossol e é administrado a um doente.

Além disso, é apropriado para uma deposição nos pulmões óptima, quando o fluxo da inspiração ou o volume da inspiração é controlado e regulado. Uma vez que para um fluxo de inalação demasiado rápido as partículas de aerossol fazem ricochete na parede posterior da faringe ou 9 são separados na glote. Numa respiração demasiado fraca as partículas de aerossóis atingem apenas as vias respiratórias superiores e não as zonas mais profundas dos pulmões. Um sistema de inalação utilizado deverá por isso garantir uma inalação profunda, lenta num doente. Para as crianças os volumes de inalação deverão ser de pelo menos 200 ml, preferencialmente pelo menos 500 ml. Para os adultos os volumes de inalação deverão ser de pelo menos 300 ml, preferencialmente pelo menos 500 ml. Convenientemente a inalação de um tal volume de aerossol é efectuada ao longo de pelo menos 1 s, mais preferencialmente pelo menos 3 s, preferencialmente pelo menos 5 s. O fluxo de inalação é regulado preferencialmente para um valor inferior a 1000 ml/s, especialmente inferior a 500 ml/s, em particular inferior a 300 ml/s, e o volume da respiração para pelo menos 20%, especialmente pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 50%, até 95%, relativamente à capacidade de inspiração de um doente. Por último garante por um lado uma inalação lenta e por outro, também uma inalação mais profunda por um doente.

Assim, a presente invenção diz respeito a composições para utilização de acordo com as reivindicações 1 a 9.

No âmbito da invenção podem ser utilizados sistemas de inalação que compreendem os parâmetros técnicos de medida anteriores com sensores e através de sinais eléctricos, acústicos, e/ou ópticos informam sobre a inalação devida, ou indevida. No que diz respeito aos dispositivos de inalação em funcionamento remete-se a título de complemento para as anteriormente referidas referências bibliográficas. No caso de sistemas de inalação mais simples pode também ser previsto juntar à composição farmacêutica um documento com informação para o doente com as instruções mencionadas. 10

Consequentemente a invenção diz respeito a uma formulação de aerossóis contendo uma composição de acordo com a reivindicação 1 a 5, um agente propulsor assim como excipientes e/ou suportes opcionais. O sal pode encontrar-se presente na solução numa quantidade de 0,001 a 50% p., 0,001 a 10% p., especialmente de 0,1 até 10% p. ou de 10 até 50% p. especialmente de 30 a 50% p. relativamente à formulação total. Quando o sal se encontra na forma de partículas pode-se encontrar presente com um valor de MMAD inferior a 10 μιη, especialmente menos do que 5 μιη.

Por isso é surpreendente, em particular na utilização das elevadas concentrações anteriormente referidas que partículas de aerossóis que são formadas a partir de tais soluções possam ser preparadas com os pequenos tamanhos de partícula anteriormente indicados.

Além disso, a invenção também divulga a utilização de formulações de aerossóis de acordo com a invenção para a profilaxia ou tratamento de infecções virais do ser humano ou dos animais, em que é administrado uma quantidade fisiologicamente eficaz da formulação de aerossol a uma pessoa que ameaça ficar doente com uma infecção virai, ou se encontra doente, ou um tal animal por via aerogénica por inalação através do nariz ou da boca.

Finalmente, a invenção divulga um dispositivo para inalação com um reservatório e um gerador de aerossóis ligado ao reservatório, em que o reservatório contém uma formulação de aerossóis de acordo com a invenção. Ao gerador de aerossóis encontra-se ligado habitualmente do lado da saída uma embocadura. Além disso pode ser incluída uma bomba de ar que através de um controlo por meio de um dispositivo de controlo, o fluxo de inalação e/ou do volume de inalação podem ser controlados. Podem ser incluídos instrumentos de controlo e/ou de regulação para o controlo e/ou regulação do fluxo de inalação e do volume 11 respiratório, em que o instrumento de controlo e/ou de regulação é regulado preferencialmente para os valores anteriormente mencionados.

As explicações anteriores para a composição farmacêutica de acordo com a invenção dizem também respeito analogamente à formulação de aerossóis de acordo com a invenção, à sua utilização, assim como ao seu dispositivo para inalação.

Seguidamente a invenção é ilustrada detalhadamente através de exemplos.

Exemplo 1: Investigação dos fenómenos de resistência

Uma vez que a problemática da resistência ao ácido acetilsalicilico como antagonista com acção antiviral em factores celulares deveria ser abordada, foi investigada a tendência para a formação de variantes resistentes em comparação com os medicamentos que se dirigem directamente para o vírus Amantadina e Oseltamivir. Células epiteliais dos pulmões A549 foram infectadas com o isolado do virus A da gripe das aves altamente patogénico A/FPV/Bratislava/79(H7N7)(FPV, fowl plague virus, virus da peste aviária) com uma MOI=0,01 (multiplicidade da infecção) e foram incubadas durante mais 24 h na presença ou ausência de ácido acetilsalicilico (5 mM) , Amantadina (5 μΜ) e Oseltamivir (2 μΜ) e Oseltamivir (2 μΜ). Numa experiência separada, células epiteliais dos pulmões A549 foram infectadas com A/FPV/Brastilava/79 (H7N7) com uma M01 = 0,001 e incubadas durante mais 24 h na presença e na ausência de lisina-glicina-acetilsalicilato (5 mM) e Oseltamivir (2 μΜ) . Em ambas as experiências foi recolhido o sobrenadante celular de cada amostra e foi determinado o titulo virai no ensaio em placa em MDCK. Os sobrenadantes foram normalizados e novamente utilizados para que uma 12 segunda subcultura tratada, ou não tratada fosse infectada com o mesmo número de vírus nas mesmas condições. Este processo foi repetido até a uma quinta ou oitava subcultura.

Na Figura IA foi representado graficamente o título de vírus de células tratadas com ácido acetilsalicílico ou com Amantadina, ou Oseltamivir em comparação com os títulos dos sobrenadantes de células não tratadas. Já se verifica na terceira subcultura que o título de vírus de células tratadas com Amantadina devido à formação de variantes resistentes aumenta significativamente. Surpreendentemente constata-se isto também de forma equivalente nas condições experimentais selecionadas para o Oseltamivir. Pelo contrário, verifica-se que o ácido acetilsalicílico ainda na quinta subcultura apresenta a mesma actividade antiviral inalterada como na primeira cultura.

Na Figura 1B foi representado graficamente os títulos virais de células tratadas com lisina-glicina-acetilsalicilato ou Oseltamivir em comparação com os títulos de sobrenadantes de células não tratadas. Verifica-se também para o lisina-glicina-acetilsalicilato o resultado descrito na Figura IA, em que mesmo após a oitava passagem não é detectada a formação de resistência virai após o tratamento com lisina-glicina-acetilsalicilato.

Os resultados obtidos são perfeitamente adequados para se concluir que tanto o ácido acetilsalicílico como lisina-glicina-acetilsalicilato não apresentam tendência para a formação de variantes resistentes em cultura celular.

Exemplo 2: Investigação da actividade antiviral contra os vírus altamente patogénicos da gripe A da formulação lisina-glicina-acetilsalicilato 13 A composição investigada é Lys-Gly-acetilsalicilato (seguidamente também designada como LG-Acetilsalicilato) que corresponde à composição molecular do produto Aspisol® possivel de obter na Bayer AG.

Esta formulação foi adoptada na série de investigações sobre a actividade antiviral contra os virus da gripe. Célula epiteliais dos pulmões A549 foram infectadas com A/FPV/Bratislava/79 (H7N7)(MOI=0,01) e incubadas durante 8 h, 24 h e 36 h na presença ou ausência de ácido acetilsalicilico (5 mM) , ou LG-Acetilsalicilato (5 mM) . 0 sobrenadante celular de cada amostra foi então recolhido e o titulo virai foi determinado no ensaio em placa com células MDCK. A Figura 2 representa o titulo dos virus ao longo do tempo. Os resultados mostram que o LG-acetilsalicilato inibe tão eficientemente a multiplicação virai do isolado altamente patogénico do isolado aviário H7N7 como o ácido acetilsalicilico.

Isto é também o caso, como indicado na Figura 3 após a infecção com o isolado altamente patogénico do subtipo H5N1. Células epiteliais dos pulmões A549 foram infectadas com o isolado humano H5N1 A/Thailand/KAN-1/2004 (MOI=0,001) e incubadas na presença ou ausência de ácido acetilsalicilico ou ácido LG-acetilsalicilico nas concentrações indicadas. 0 sobrenadante celular foi pesquisado para determinar o titulo virai no ensaio em placa com células MDCK. A Figura 3A apresenta um tempo de 20 h, na Figura 3B os títulos do vírus são representados numa cinética de crescimento. Em ambos os casos observa-se uma inibição eficiente do título dos vírus da estirpe de H5N1 de várias dezenas percentuais.

Devido ao elevado potencial antiviral in vitro é de prever que a formulação LG-acetilsalicilato seja adequada como um princípio activo antigripal para uma administração por inalação. 14

Exemplo 3: Influência de LG-acetilsalicilato em vírus da gripe aviária altamente patogénicos em sistemas de cultura de células Células MDCKII foram cultivadas em meio MEM (MEM; Gibco (Invitrogen) Alemanha 21430-079, Lote 32034) com adição de soro fetal de vitela a 10% activado por calor (FCS, PAA Laboratories/ A04305-0346), Penicilina (Grunenthal/616G03) e estreptomicina (Sanavita/03056440111). Para a infecção as células foram inoculadas em placas de 24 poços (8xl04 células/poço; Greiner, Alemanha, N°662160, Lote05210151) e incubadas de um dia para o outro a 37°C. Antes da infecção as células foram lavadas com PBS, o virus correspondente (FPV, SNI, MB1) foi diluído em PBS/BA (suplementado com PBS com 0,6% BA (MP Biomedicals) , MgCl2 1 mM, CaCl2 0,9 mM, penicilina (Grunenthal/616G03) e estreptomicina e pipetadas com um MOI de 0,001 sobre as camadas celulares. Após um tempo de incubação de 30 min a 37°C o inoculo virai foi retirado e às células foi adicionado ou 1 ml de meio MEM ou meio MEM que continha 5 mM de LG-acetilsalicilato. Depois de um tempo de incubação de 8, 24, 32 e 48 horas após a infecção foi retirado o respectivo sobrenadante. A existência de partículas virais infecciosas foi demonstrada num "plaque assay".

Para o "plaque assay" foram inoculadas células MDCKII em placas de 96 poços de tal maneira que as camadas celulares no dia seguinte estavam em confluência. As células foram lavadas com PBS e com diluição dos sobrenadantes colocadas em PBS/BA foram infectadas durante 60 min a 37°C. Após a incubação as células foram misturadas com uma mistura de meio Avicel (Avicel RC-581(FMC/B624C)). Para isso foi misturada uma solução de Avicel a 2,5% com 15 uma quantidade igual de meio 2x MEM. Após um tempo de incubação de 20 h a mistura de meio Avicel foi retirada, as células foram fixadas com uma solução de Roti®-Histofix (Roth/327 8917 0) a 4% em PBS durante 30 min a 4°C e depois lavadas com PBS. Os passos seguintes necessários para a coloração foram efectuados à temperatura ambiente. Através da incubação com 0,3% de Triton-X-100 0,3% (Serva/30043) em PBS as células foram permeabilizadas. Células infectadas com virus foram coradas, através de um processo imunohistológico. Para isso as células foram incubadas durante 1 h com um anticorpo moclonal (Serotec/250107) que é especifico para a nucleoproteína do virus da gripe. A detecção das células infectadas foi efectuada, através de mais uma incubação (30 min) com um anticorpo anti-ratinho acoplado a uma peroxidase (DIANOVA/75790) e adição de substracto True Blue ™ peroxidase (KPL/07 0490) . As diluições dos anticorpos foram realizadas em PBS com 10% FCS e 0,1% de Tween-20 (Serva/16211). Após incubação com o anticorpo primário e secundário as células foram lavadas três vezes durante 5 minutos com PBS/0,1% Tween 20. Para parar a reacção, as placas secas foram lavadas com água canalizada e secas. Foi efectuado um scan das placas e estas foram avaliadas com o auxilio do software Corel Draw 9,0. Para determinar o titulo virai dos sobrenadantes foram contadas as colónias de células infectadas (Foci) em cada poço das placas de 96 poços. O número de colónias contadas foi multiplicado com o factor de diluição correspondente. A partir dos valores calculados foi determinado o valor médio para cada amostra. O titulo virai foi indicado como loglO do valor médio.

Os resultados são apresentados na Figura 4. Reconhece-se que tanto a replicação de um virus H7N1 (FPV) como também de um virus H5N1 (MB1) é reduzida parcialmente 16 através do tratamento com LG-acetilsalicilato em mais do que 99% num sistema de cultura de células.

Exemplo 4: Investigação do mecanismo de acção molecular que se encontra na base da actividade antiviral do LG-acetilsalicilato

Seguidamente o objectivo é investigar se o perfil de actividade do LG-acetilsalicilato era comparável com o da substância pura ácido acetilsalicilico. 0 acetilsalicilato deveria ter uma acção inibidora do NF-kB e não apresentar correspondentemente nenhuns efeitos secundários sobre outras vias de sinalização induzidas por virus. Um grupo importante de mediadores de sinais que são activados também após infecção com o virus da gripe são as designadas cinases de proteinas activadas por mitogénios (MAPK). A este grupo pertencem as cinases JNK, p38 e ERK. Para a substância pura ácido acetilsalicilico foi já demonstrado que a activação destas cinases induzida por virus não é inibida pelo ácido acetilsalicilico. Como é indicado na Figura 5, isto é também o caso para o LG-acetilsalicilato: a actividade induzida por virus de JNK, p38 e ERK (Figura 5, banda 5) que pode ser demonstrada com o auxilio de anticorpos fotoespecificos contra a forma activa destas cinases por transferência de Western não é bloqueada, através da adição de 5 mM (banda 7) ou 7 mM de ácido acetilsalicilico (banda 9). 0 ácido acetilsalicilico possui uma acção antiviral sobre a inibição da expressão de factores proapóptóticos o que conduz finalmente a uma activação reduzida da caspase na célula. A Figura 6 mostra isto também para o LG-acetilsalicilato com base numa transferência de Western da activação da caspase em relação à cisão dos substractos da caspase poli-ADP-ribose-polimerase (PARP). A banda claramente visivel da PARP 17 cindida após 30 h (banda 6) é reduzida eficientemente nas amostras tratadas com LG-acetilsalicilato (banda 7). O passo dependente da NF-kB na replicação virai é a exportação de complexos de ribonucleoproteínas virais (RNP) para o citoplasma dependente da caspase que podem ser então incorporados em novas partículas de vírus na membrana celular. O ácido acetilsalicílico bloqueia este passo especificamente sem actuar sobre a acumulação das proteínas virais nas fases precoces do ciclo de multiplicação. Para o LG-acetilsalicilato é válido o mecanismo idêntico: a Figura 7 mostra numa transferência de Western que a acumulação de proteínas virais Ml, NP, NS1 e PB1 não é inibida pelo LG-acetilsalicilato. Porém verifica-se como anteriormente descrito para a substância pura ácido acetilsalicílico um complexo RNP virai eficiente restringido como é claramente visível nas análises de imunofluorescência apresentadas na Fig. 8.

Pode-se por isso concluir que o ácido LG- acetilsalicílico possui o mesmo potencial anti-viral que o ácido acetilsalicílico e que actua através de mecanismos moleculares idênticos de forma inibidora em relação à multiplicação virai.

Exemplo 5: Redução do nível de expressão de m-ARN por IP10 e interferão gama após tratamento com LG-acetilsalicilato É conhecido que uma sobre-expressão de citocinas, o chamado ataque por citocinas é um importante factor de patogenicidade em infecções pelo vírus da gripe H5N1. Uma vez que a maior parte destas citocinas são reguladas de uma forma dependente de NF-kB pretendia-se demonstrar se o LG-ASA pode inibir a expressão das citocinas induzidas por vírus e que deste modo pode influenciar adicionalmente indirectamente a patogenicidade destes vírus. A partir de 18 trabalhos próprios prévios era conhecido que IP10 e IFN-gama após infecção com H5N1 (MB1) são altamente regulados em pulmões de ratinhos. A expressão desta quimiocina ou citocina é induzida através do factor de transcrição NF-kB. Com base em conhecimentos anteriores pôde ser demonstrado que a aspirina actua como um inibidor de NF-kB.

Foi objectivo desta experiência verificar se o LG-acetilsalicilato actua como inibidor de NF-kB no pulmão de ratinhos após infecção por H5N1. Para isso foi investigado se um tratamento dos ratinhos com LG-acetilsalicilato após ou durante a infecção com MB1 actua sobre a taxa de expressão de ambas as quimiocinas ou citocinas. Para a experiência cada cinco ratinhos Balb/c foram tratados uma hora antes da infecção (dose da infecção: lxlO3 50 pfu/μΐ) i.v. (100 μΐ) i.p. (200 μΐ) com 50 mM de LG-acetilsalicilato. Os outros tratamentos foram efectuados 17, 24 e 42 horas após infecção. Após 48 h p. i. os pulmões foram retirados e o ARN foi isolado. A expressão de IP10 e de IFN-gama nos pulmões de ratinhos em ratinhos tratados com LG-acetilsalicilato em comparação com a dos animais de controlo foi demonstrada através de RT-PCR quantitativa. Os dados são representados na Figura 9. A expressão de IP10 e IFN-gama em ratinhos não tratados foi estabelecida como sendo de 100% para se obter uma possibilidade de comparação clara. Após 4 tratamentos com LG-acetilsalicilato foi possível reconhecer uma redução da expressão de ARNm de ambas as quimiocinas ou citocinas tanto através da via intravenosa, como também através da via intraperitoneal. A via de tratamento intravenosa mostrou um efeito mais forte com uma redução de 62% para IP10 e de 68% para IFN-gama do que a via de tratamento intraperitoneal com 26% para IP10 e 50% para IFN-gama.

Os resultados mostram que a expressão induzida pelo vírus H5N1 do gene dependente de NF-kB nos pulmões dos 19 ratinhos infectados tratados com LG-acetilsalicilato é fortemente reduzida. Isto é significativo na medida em que a produção em excesso de citocinas ("ataque das citocinas") observada após infecção com o virus H5N1, em que a regulação é em grande parte dependente de NF-kB contribui fortemente para a patogenicidade destes virus. Deste modo, o LG-acetilsalicilato pode não só influenciar directamente a replicação virai, mas também influenciar indirectamente positivamente o andamento da doença, através da redução da produção em excesso das citocinas.

Exemplo 6: Estudos de tolerabilidade

Na experiência seguinte a tolerabilidade do LG-acetilsalicilato deveria ser testada após tratamento de ratinhos com aerossóis. Para observar o melhor possivel a influência do tratamento, a experiência foi realizada com o auxilio de um sistema de monitorização do ratinho. Isto permite a medição da temperatura em tempo real. Todos os 5 minutos é calculado um valor de temperatura e representado graficamente (Figura 10A-F). Além disso, os animais foram pesados todos os dias. No final do tratamento os ratinhos foram mortos e o peso dos órgãos figado e baço determinado. Já aos primeiros sinais de toxicidade do figado ocorre o aumento do figado. Pelo contrário um aumento do baço é um sinal de processos de inflamação.

Para os estudos de tolerabilidade foram implantados no total em 12 ratinhos Balb/c fêmeas 3 dias antes do inicio de tratamento um emissor de monitorização de ratinhos. A intervenção de sucesso foi observada durante 3 dias. Seguidamente foram tratados 6 ratinhos três vezes ao dia com respectivamente 2 ml de uma solução de LG-acetilsalicilato de 50 mM com o auxilio de um nebulizador de Pari. Como controlos serviram 6 ratinhos que foram tratados com 2 ml de PBS. As soluções foram nebulizadas com 20 uma pressão de 1,5 bar de modo que o tratamento durasse cerca de 10 minutos. Os tratamentos foram efectuados diariamente durante 5 dias às 9:00; 12:00 e 15:00 horas.

Foi pesquisado a influência do LG-acetilsalicilato na variação do peso. Todos os ratinhos foram pesados diariamente no inicio do dia do tratamento e na verdade antes do primeiro tratamento (9:00 horas). O peso determinado no primeiro dia de tratamento foi estabelecido como sendo de 100% e o peso corporal determinado nos dias seguintes foi determinado como percentagem relativa desse peso. Da comparação de ambos os grupos de tratamento resultou o gráfico apresentado na Figura 11. Resulta disto que entre o grupo tratado com LG-acetilsalicilato e o grupo tratado com PBS não houve diferenças significativas em relação a alterações do peso corporal.

Seguidamente foi investigada a influência de LG-acetilsalicilato na temperatura do corpo. Como já mencionado o sistema de monitorização do ratinho possibilita a determinação da temperatura do corpo de ratinhos em tempo real. Uma vez que os ratinhos possuem um elevado metabolismo, pequenas variações do bem estar já conduzem a uma alteração da temperatura do corpo. Na Figura 10 é representada a variação da temperatura do corpo começando no dia 1 antes do tratamento (Figura 10A) até ao final do tratamento (dia +4) (Figura 10F). Não se reconhece nenhuma diferença entre a temperatura do corpo nos ratinhos tratados com LG-salicilato quando comparados com os animais de controlo.

Finalmente foi investigada a influência do LG-acetisalicilato no peso do figado e do baço. Quinze minutos após o último tratamento todos os animais foram mortos e foi efectuada uma necropsia. Os órgãos internos após sangramento completo, através da veia cava foram avaliados. Os pulmões foram primeiro avaliados através do diafragma 21 num estado não colapsado. Fígado e baço foram pesados. Os resultados são apresentados na Figura 13. Uma vez que o peso corporal dos ratinhos durante o tratamento não se altera significativamente, não foi necessário ser efectuada uma normalisação do peso dos órgãos. Não pôde ser verificada uma diferença significativa nos pesos dos órgãos tanto no baço (Figura 12A) como no fígado (Figura 12B) de animais tratados com LG-acetilsalicilato em relação aos animais de controlo. Consequentemente após o tratamento de ratinhos por inalação não se observa nenhum sinal de toxicidade do fígado frequentemente associado com o inchaço do órgão. Além disso, não se observaram reacções de inflamação sistémica que estão associadas a um aumento do baço.

Resumindo, a partir dos estudos acima descritos uma aplicação por inalação de 2 ml de LG-acetilsalicilato com uma concentração de 50 mM num período de 5 dias é bem tolerado por ratinhos.

Exemplo 7: Testes com doentes

Numa experiência de tratamento foi administrado a 4 doentes com infecção brônquica uma solução contendo até 2 M de LG-ASA (50:50) e pulverizado até um tamanho de partícula inferior a 5 pm. As quantidades totais de LG-ASA foram até 350 mg. O fluxo de inalação foi regulado para um valor inferior a 500 ml/s, na maior parte das vezes inferior a 300 ml/s. O volume respiratório foi de pelo menos 30%, na maior parte das vezes pelo menos 50% da capacidade de inspiração dos doentes.

Em três dos doentes foi verificada uma clara melhoria dos sintomas já no dia seguinte ao da administração. Em todos os doentes observou-se uma melhoria dos sintomas no 3o dia após a administração. Neste caso, a tolerabilidade 22 destas concentrações elevadas experimentada subjectivamente foi excelente. Nenhum doente relatou irritações devido ao sabor. Também não foi verificada uma irritação acrescida da garganta.

Lisboa, 26 de Outubro de 2012.

Claims (12)

1 Reivindicações 1. Composição contendo um sal de ácido o-acetilsalicilico com um aminoácido seleccionado a partir do grupo que consiste em "lisina, arginina, ornitina, ácido diaminobutirico e misturas de tais aminoácidos" para ser utilizada na profilaxia ou tratamento de infecções virais em seres humanos ou animais.

2. Composição para ser utilizada de acordo com a reivindicação 1 contendo adicionalmente um sal de ácido o-acetilsalicilico com glicina.

3. Composição para ser utilizada de acordo com a reivindicação 2, em que o aminoácido básico é D-lisina, L-lisina, ou uma mistura de D-lisina e L-lisina.

4. Composição para ser utilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para a profilaxia ou tratamento de infecções com virus da gripe A ou rinovirus.

5. Composição para ser utilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em preparações galénicas na forma de um liquido, composição aquosa, em particular para uma aplicação aerogénica.

6. Composição para ser utilizada de acordo com a reivindicação 5, em que a composição aquosa é uma solução aquosa de 0,1 a 5 M, em particular de 0,1 a 3M, preferencialmente de 1 a 3 M do sal.

7. Composição para ser utilizada de acordo com a reivindicação 5, em que a composição aquosa é uma solução 2 aquosa de 0,01 a 100 mM, em particular de 0,1 a 10 mM do sal.

8. Composição para ser utilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a composição é disponibilizada num reservatório farmaceuticamente aceitável com um pulverizador ou um nebulizador.

9. Composição para ser utilizada de acordo com a reivindicação 8, em que o reservatório é desenhado para se regular um fluxo de inalação inferior a 1000 ml/s, preferencialmente inferior a 500 ml/s, em particular inferior a 300 ml/s, assim como um volume respiratório de pelo menos 10%, em particular de pelo menos 30%, preferencialmente de pelo menos 50% até 95% em relação à capacidade de inspiração de um doente.

10. Formulação de aerossóis contendo uma composição de acordo com as reivindicações 1 a 5, um agente propulsor e, eventualmente adjuvantes e/ou excipientes.

11. Formulação de aerossóis de acordo com a reivindicação 10, em que o sal se encontra presente numa quantidade que vai de 0,001 a 50% em peso, 0,001 a 10% em peso, em particular de 0,1 a 10% em peso ou em particular de 10 a 50% em peso, em relação à formulação total.

12. Formulação de aerossóis de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o sal se encontra presente na forma de partículas ou na forma de solução com um valor de MMAD inferior a 10 μΜ, em particular inferior a 5 μΜ. Lisboa, 26 de Outubro de 2012.