BRPI0906851B1 - Formulação em aerossol com sais de aminoácidos básicos de ácido acetilsalicílico e uso de sais de aminoácidos básicos de ácido acetilsalicílico no tratamento de infecções virais - Google Patents

Abstract

uso de um sal do ácido acetilsalicílico para tratamento de infecções virais a presente invenção refere-se ao uso de uma composição compreendendo um sal do ácido o-acetilsalicílico com um aminoácido básico para produzir uma composição farmacêutica para a profilaxia ou tratamento de infecções virais de seres humanos ou de animais, em particular mamíferos e pássaros.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se ao novo uso de uma composição compreendendo um sal do ácido O-acetilsalicílico com um aminoácido básico para a produção de uma composição farmacêutica.

Técnica Anterior e Antecedentes da Invenção

[0002] A influenza ainda pertence às grandes pragas da humanidade com um potencial pandêmico. Existem apenas poucos fármacos contra os patogênios indutores, os vírus da influenza A, os quais são todos imediatamente direcionados contra o vírus. O problema é que resistências podem ser desenvolver relativamente de forma rápida. Além disso, existe um risco da influenza aviária epidemicamente crescente em aves domésticas, induzida por infecções com o vírus H5 da influenza, ser também transmissível para seres humanos. Em particular, pessoas que entram em contato com aves domésticas infectadas estão, portanto, em alto risco. Particularmente, deve ser notado que são relatadas insensibilidades crescentes dos vírus H5N1 contra os poucos fármacos aprovados, tal como oseltamivir. Existe, portanto, uma necessidade urgente de novos e eficientes fármacos anti-influenza para a profilaxia, assim como para o tratamento de infecções virais, e os fármacos não devem despertar quaisquer resistências, se possível.

[0003] A partir do documento WO 2004/060360, é conhecido que o ácido acetilsalicílico é capaz de inibir o fator de transcrição NF-kB em células hospedeiras no curso de sua inibição do caminho do sinal NF- kB, componentes virais essenciais irão permanecer no núcleo da célula e não podem mais ser integrados em partículas virais. A partir desse documento, é também conhecida a administração aerogênica do ácido acetilsalicílico para a profilaxia ou tratamento de infecções virais.

[0004] Por exemplo, a partir do documento DE 102 02 019 A1, sais do ácido acetilsalicílico com aminoácidos básicos são conhecidos na técnica, as preparações obtidas com os mesmos sendo proporcionadas exclusivamente para a administração oral. A partir desse documento, também, é conhecido o uso de tais sais para o tratamento de doenças do tipo reumáticas, artrites, neuralgias, mialgias, enxaqueca, doenças cardíacas isquêmicas, infarto, angina pectoris, infarto do miocárdio, grampeamento do estômago, PTCA, implantes de stent, para o estímulo do sistema autoimune de pacientes com HIV, para a profilaxia de tumores, para o retardo do declínio cognitivo devido à síndrome de demência, para a inibição da formação de pedra nos rins e/ou o tratamento de doenças diabéticas. Os sais conhecidos até o momento são usados também sob o nome comercial Aspisol® como fármacos para o tratamento de asma, febre do feno, inchaços da mucosa nasal ou infecções crônicas do trato respiratório e, além disso à administração oral, também para injeção. Todas essas doenças não têm uma correlação direta com infecções virais por vírus da influenza.

[0005] O uso do ácido acetilsalicílico puro como um agente antiviral, que é administrado por inalação como um aerossol ao trato respiratório ou aos pulmões, provou-se em princípio muito bem no modelo animal. Para seres humanos, a inalação de ácido acetilslicílico puro pode, entretanto, causar fortes irritações do trato respiratório. Além disso, em casos individuais, foi demonstrado que uma inalação de ácido acetilsalicílico pode levar a ataques de asma para alguns pacientes sensíveis. Em qualquer caso, uma aplicação aerogênica de ácido acetilsalicílico como um fármaco anti-influenza seria, portanto, contraindicado para pacientes com asma ou pessoas com um risco de asma.

Objetivo Técnico da Invenção

[0006] É, portanto, o objetivo da invenção proporcionar uma formulação com ácido acetilsalicílico para tratar infecções virais, que é particularmente bem tolerada e em particular evita com segurança o risco da indução de ataques de asma.

Básicos da Invenção e Modalidades Preferidas

[0007] Para alcançar esse objetivo técnico, a invenção ensina o uso de uma composição compreendendo uma dose fisiologicamente eficaz de um sal do ácido O-acetilsalicílico com um aminoácido básico natural ou não natural para produzir uma composição farmacêutica para a profilaxia ou tratamento de infecções virais de seres humanos ou de animais, em particular de mamíferos e pássaros. Para as finalidades da invenção, em particular infecções com vírus do tipo selvagem de ocorrência natural, não, portanto, infecções com vírus geneticamente modificados, são designadas infecções virais.

[0008] Entre os pássaros, em particular aves domésticas, tais como galinhas, gansos, patos, galos, perus, codornas ou pombas, mas também pássaros canoros estão envolvidos para a profilaxia ou tratamento.

[0009] Através do uso de tal sal, em particular com administração aerogênica, uma irritação do tecido, por exemplo, da mucosa do trato respiratório, é evitada pelo que a substância ativa na formulação administrada não é ácida. Desse modo, em particular ataques de asma em pacientes afetados com asma ou pessoas em risco são evitados com confiança, e praticamente não existem obstáculos para uma ampla aplicação como um agente terapêutico, assim como um agente profilático por causa da liberdade de riscos de efeito colateral, mais uma vez visto que a formulação é mesmo já utilizada com um agente contra asma. Além disso, como foi verificado pela invenção, a inibição da replicação viral não é praticamente afetada pela derivatização do ácido acetilsalicílico, o que poderia ser esperado; surpreendentemente é até em parte ligeiramente aumentado.

[00010] É preferido, se o aminoácido básico é selecionado a partir do grupo que consiste em "lisina, arginina, ornitina, ácido diaminobutírico e misturas de tais ácidos", que seja um monoacetilsalicilato. Um aminoácido é um ácido alfa-aminocarboxílico, e no alfa-átomo, um hidrogênio ou um radical arbitrário pode ser ligado como uma cadeia lateral. Um aminoácido básico compreende na cadeia lateral um grupo básico ou diversos grupos básicos, em particular um grupo amino. O aminoácido básico pode em particular ser D-lisina, L-lisna ou uma mistura de D-lisina e L-lisina.

[00011] A preparação pode, além disso, compreender um sal de ácido O-acetilsalicílico com um aminoácido natural ou não natural com uma cadeia lateral não básica, em particular com glicina. A razão em peso de lisina para glicina na composição pode estar na faixa de 100:1 a 1:1, em particular de 100:1 a 10:1. Preferida é uma mistura de sais dos aminoácidos lisina e glicina. Particularmente preferido é um sal ou uma mistura de sais, tal como a composição comercialmente disponível sob o nome comercial Aspisol®, por exemplo, em uma solução aquosa.

[00012] Para as finalidades da invenção, composições farmacêuticas também podem ser usadas, que contêm profármacos, que são naturalmente metabolizadas em substâncias ativas usadas de acordo com a invenção pelo organismo após serem tomadas ou administradas.

[00013] De acordo com a invenção, a composição usada pode ser usada para a profilaxia ou tratamento de uma variedade de infecções virais. Particularmente adequada é a composição para a profilaxia ou tratamento de infecções com vírus RNA com filamento negativo, tais como vírus da influenza, de preferência vírus da influenza A, em particular vírus do tipo H5 ou H7.

[00014] Também foi verificado que a substância usada de acordo com a invenção suprime a superexpressão de citocinas induzida por vírus ("tempestade de citocinas"), que são reguladas de uma maneira dependente do NF-kB. Por meio da substância de acordo com a invenção, portanto, a patogenidade de muitos vírus pode geralmente ser reduzida, o potencial patogênico dos quais está correlacionado, entre outros, com uma excessiva expressão de citocinas. Portanto, a composição usada de acordo com a invenção também é adequada para o tratamento e profilaxia de infecções virais com coronavírus (SARS), vírus sincicial respiratório, filovírus, tal como vírus Marburg ou vírus Ebola, vírus arena, tal como vírus Lassa, vírus da febre hemorrágica Argentina, boliviana ou venezuelana, hantavírus, flavivírus, tal como o vírus da Dengue ou vírus da febre amarela, vírus da febre hemorrágica Crimeia-Congo, vírus da febre do vale do Rift, vírus da parainfluenza (tipo 1, 2 ou 3), rinovírus, metapneumovírus humano (hMPV) e vírus Epstein Barr.

[00015] A preparação galênica de uma composição farmacêutica usada de acordo com a invenção pode ser feita de um modo sendo usual nessa tecnologia e pode em princípio ocorrer em um tipo arbitrário de administração, por exemplo, oralmente, para injeção ou aerogenicamente para inalação. Formas de preparação galênica sólidas ou líquidas adequadas são, por exemplo, granulados, pós, drágeas, comprimidos (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, sucos, suspensões, emulsões, gotas ou soluções injetáveis (i.v., i.p.,i.m., s.c.) ou dispersões finas (aerossóis), sistemas transdérmicos e preparações com liberação prolongada de substância ativa, para produção das quais são usados meios convencionais, tais como substâncias transportadoras, explosivos, agentes de ligação, revestimento, intumescimento, de deslizamento ou de lubrificação, agentes saborizantes, adoçantes e mediadores de solução. Como substâncias auxiliares são denominados aqui carbonato de magnésio, dióxido de titânio, lactose, manitol e outros sacarídeos, talco, proteína do leite, gelatina, amido, celulose e seus derivados, óleos animais e vegetais tal como óleo de fígado de bacalhau, óleo de girassol, óleo de amendoim ou óleo de gergelim, polietileno glicóis e solventes, tal como água estéril e álcoois mono ou multivalentes, por exemplo, glicerina ou misturas de tais solventes. Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser produzida por aquele pelo menos um sal usado de acordo com a invenção é misturado em uma dose definida com um carreador farmaceuticamente adequado e fisiologicamente bem tolerado e possivelmente outras substâncias ativas, adicionais ou auxiliares adequadas, e é preparada na forma desejada de administração. Exemplos de preparações para a administração são, por exemplo, encontrados no documento DE 102 02 019 A1 e nos documentos citados aqui.

[00016] É preferida, entretanto, a preparação galênica para a administração aerogênica, nasal como uma composição líquida, aquosa (solução), ou como um pó, se aplicável em uma suspensão em um propulsor, por exemplo, um propulsor para ser liquefeito à temperatura ambiente, tal como CFCs, hidrofluoroalcanos, tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano ou 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano, propano, butano, isobutano ou outros propulsores sendo úteis no campo das formulações médicas em aerossol. Além dos propulsores mencionados ou em seu lugar, ar oxigênio, nitrogênio, dióxido de carbono ou óxido nitroso também podem ser usados. A composição pode compreender as substâncias adicionais e auxiliares usuais das formulações médicas em aerossol, tal como, por exemplo, substâncias tensoativas fisiologicamente bem toleradas e/ou agentes de dispersão convencionais.

[00017] A composição aquosa também preferivelmente é uma solução aquosa a 0,01 mM a 3,0 M, preferivelmente 0,5 a 3,0 M ou 0,01 a 100 mM, em particular 0,1 a 10 mM, do sal ou da mistura de sais.

[00018] É preferido que o tamanho de partícula dos aerossóis, seja a solução, seja o sal como um material sólido ou uma suspensão, tenha um valor MMAD (diâmetro aerodinâmico médio de massa) menor do que 10 μm, preferivelmente menor do que 5 μm. Para a medição da distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica FPD (dose de partícula fina) ou FPF (fração de partícula fina), impactores são adequados, tal como, por exemplo, o Multi-stage Liquid Impinger de 5 estágios (MSLI) ou o Andersen Cascade Impactor de 8 estágios (ACI), que são descritos na capítulo 601 da Farmacopeia norte- americana (USP) ou o Inhalanda Monograph da Farmacopeia Europeia (Ph. Eur.). Com base na distribuição de partícula aerodinâmica, o valor MMAD de uma preparação em aerossol pode ser calculado por meio de um "gráfico log-probabilidade". Através dos valores MMAD preferidos, é alcançado que as partículas em aerossol são respiráveis e que descem para a parte mais profunda dos pulmões, de modo que uma concentração suficiente no pulmão todo é obtida para as durações usuais da administração. A fim de impedir que pequenas partículas sejam novamente exaladas, um limite inferior para o valor MMAD de 0,1 μm, preferivelmente 0,5 μm, mais preferivelmente 1 μm, pode ser proporcionado.

[00019] O sal usado de acordo com a invenção pode ser reduzido a pequenos pedaços ou micronizado de uma maneira convencional para obtenção dos valores desejados de MMAD, por exemplo, por meio de moinhos de disco fixo, de esfera ou de separação de ar.

[00020] A administração de um aerossol de acordo com a invenção pode ser feita com todos os dispositivos de inalação com geradores de aerossol, tal como vaporizadores ou nebulizadores, visto que eles são usuais no campo médico. Exemplos são vaporizadores de pó-aerossol ou DPI (inaladores de pó seco), bocal, ultrassom ou nebulizadores de membrana oscilante. Também podem ser usados geradores de aerossol, que utilizam o princípio da eletro-hidrodinâmica, ou aerossóis de condensação de uma formulação líquida. Exemplos para dispositivos de inalação adequados estão descritos nos documentos EP 1741460 A, EP 1700614 A, EP 1258264 A e EP 1163921 A.

[00021] A concentração do sal na composição em conexão com a taxa de rendimento de um gerador de aerossol empregado é selecionada de modo que pelo menos 10 mg, preferivelmente pelo menos 50 mg, mais preferivelmente pelo menos 100 mg, dos sais são transformados no aerossol e administrados a um paciente dentro de um tempo de menos do que 5 min, preferivelmente 2 min, mais preferivelmente 1 min.

[00022] Além disso, é útil para uma deposição ótima no pulmão se o fluxo inspiratório ou o volume inspiratório é verificado e ajustado. Com um fluxo de inalação muito rápido, as partículas de aerossol irão bater no fundo da faringe ou são separadas na glote. Se a respiração é muito fraca, as partículas de aerossol irão apenas alcançar a parte superior do trato respiratório e não as partes mais profundas do pulmão. Um sistema de inalação deve, portanto, garantir uma inalação lenta, profunda por um paciente. Para crianças, o volume de inalação deve ser pelo menos 200 ml, preferivelmente pelo menos 500 ml. Para adultos, o volume de inalação deve ser pelo menos 300 ml, preferivelmente pelo menos 500 ml. De maneira adequada, uma inalação de tal volume de aerossol ocorre por um período de pelo menos 1 s, melhor pelo menos 3 s, preferivelmente pelo menos 5 s. O fluxo de inalação é vantajosamente ajustado a menos do que 1.000 ml/s, em particular menos do que 500 ml/s, em particular menos do que 300 ml/s, e o volume de respiração a pelo menos 20%, em particular pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 50%, até 95%, com referência à capacidade de inspiração de um paciente. O último garante, por um lado, uma inalação lenta, porém, por outro lado, também uma inalação profunda por um paciente.

[00023] Para as finalidades da invenção, sistemas de inalação podem ser usados, que medem os parâmetros acima por meio de sensores e proporcionam informação a respeito da inalação apropriada, não apropriada por meio de sinais elétricos, acústicos e/ou óticos. Com relação a dispositivos de inalação que trabalham nesse sentido, referência é feita aos documentos cima. No caso de sistemas de inalação simples, também pode ser proporcionado que uma folha de informação ao paciente com as medidas mencionadas seja adicionada à composição farmacêutica.

[00024] Portanto, a invenção também se refere a uma formulação em aerossol compreendendo um sal do ácido O-acetilsalicílico com um aminoácido básico natural ou não natural, um propulsor e opcionalmente substâncias auxiliares e/ou carreadoras. Sal pode estar compreendido em uma quantidade de 0,001 a 50% em peso, 0,001 a 10% em peso, em particular 0,1 a 10% em peso ou 10 a 50% em peso, em particular 30 a 50% em peso, com referência à formulação completa. Se o sal existe em forma de partícula, ele pode estar compreendido com um valor de MMAD de menos do que 10 μm, em particular menos do que 5 μm.

[00025] É surpreendente, em particular quando usando as altas concentrações acima, que partículas de aerossol, as quais são geradas a partir de tais soluções, podem ser produzidas com o tamanho de partícula pequeno acima mencionado.

[00026] Além disso, a invenção também se refere ao uso de uma formulação em aerossol de acordo com a invenção para a profilaxia ou tratamento de infecções virais de seres humanos ou de animais, em que um ser humano, que está em risco de adquirir uma infecção viral ou está afetado com a mesma, ou tal animal é administrado aerogenicamente para a inalação através do nariz ou da boca com uma quantidade fisiologicamente eficaz da formulação em aerossol.

[00027] Finalmente, a invenção se refere a um dispositivo de inalação com um tanque de fornecimento e um gerador de aerossol conectado ao tanque de fornecimento, em que o tanque de fornecimento compreende uma formulação em aerossol de acordo com a invenção. Um bocal é usualmente conectado para a produção do gerador de aerossol. Adicionalmente, uma bomba de ar pode ser proporcionada, por meio da qual, sob controle através de um dispositivo de controle, o fluxo de inalação e/ou o volume de inalação são controlados. Meios de controle e/ou regulação, para o controle e/ou regulação do fluxo de inalação e do volume de respiração, podem ser proporcionados, e os meios de controle e/ou regulação são preferivelmente ajustados aos valores acima.

[00028] As explicações acima para a composição farmacêutica de acordo com a invenção se aplicam de uma maneira análoga também à formulação em aerossol de acordo com a invenção, ao uso da mesma e ao dispositivo de inalação.

[00029] A seguir, a invenção é explicada em mais detalhes com referência aos exemplos.

Exemplo 1: Investigação do fenômeno da resistência

[00030] Visto que particularmente os problemas de resistência com o ácido acetilsalicílico como um inibidor de atuação antiviral de fatores celular devem ser visados, a tendência à formação de variantes resistentes foi comparada aos fármacos amantadina e oseltamivir que atuam diretamente sobre o vírus. Células epiteliais do pulmão A549 foram infectadas com o isolado do vírus da influenza A aviária altamente patogênico A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (FPV, vírus da praga de aves domésticas) com um MOI = 0,01 (multiplicidade de infecção) e incubadas por mais 24 h na presença ou ausência de ácido acetilsalicílico (5 mM), amantadine (5 mM) e oseltamivir (2 mM). Em uma batelada separada, Células epiteliais do pulmão A549 foram infectadas com A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) com um MOI = 0,001 e incubadas por mais 24 h na presença ou ausência de lisina-glicina- acetilsalicilato (5 mM) e oseltamivir (2 mM). Para ambas bateladas, então o sobrenadante celular de cada amostra foi coletado, e o título viral no ensaio de placa em células MDCK foi determinado. Os sobrenadantes foram então normalizados e novamente usados para infectar, com números respectivamente idênticos de vírus, uma segunda passagem de célula tratada ou não tratada sob as mesmas condições. Esse procedimento foi repetido no total até a quinta ou oitava passagem.

[00031] Na Figura 1A, os títulos virais de células tratadas com ácido acetilsalicílico ou amantadina ou oseltamivir foram comparados aos títulos dos sobrenadantes de células não tratadas. Pode ser visto já na terceira passagem que os títulos virais de células tratadas com amantadina estão novamente significantemente aumentados por causa da formação de variantes resistentes. Surpreendentemente, isso também é verificado em uma extensão comparável sob as condições experimentais escolhidas aqui para oseltamivir. Em um contraste claro, verifica-se que o ácido acetilsalicílico tem até na quinta passagem ainda a mesma atividade antiviral inalterada como na primeira passagem. Na Figura 1B, os títulos virais de células tratadas com lisina-glicina-acetilsalicilato ou oseltamivir foram comparados aos títulos dos sobrenadantes de células não tratadas. O resultado descrito na Figura 1Atambém é obtido para lisina-glicina-acetilsalicilato, e mesmo após oito passagens ainda não há formação de resistência viral detectável após tratamento com lisina-glicina-acetilsalicilato. Os resultados obtidos são completamente adequados para todo o estado em que o ácido acetilsalicílico, bem como lisina-glicina-acetilsalicilato, não têm nenhuma tendência à formação de variantes resistentes em cultura celular.

Exemplo 2: Investigação da formulação lisina-glicina-acetilsalicilato quanto à atividade antiviral contra vírus A altamente patogênicos

[00032] A composição investigada é lis-gli-acetilsalicilato (a seguir também chamada LG-acetilsalicilato), que corresponde à composição molecular do produto Aspisol®, disponível pela Bayer AG.

[00033] Essa formulação foi submetida a investigações quanto à atividade antiviral contra vírus da influenza. Células epiteliais dos pulmões A549 foram infectadas com A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (MOI = 0,01) e incubadas por 8 horas, 24 horas e 36 horas na presença ou ausência de ácido acetilsalicílico (5 mM) ou LG-acetilsalicilato (5 mM). O sobrenadante celular de cada amostra foi então coletado e o título viral no ensaio de placa em células MDCK foi determinado a partir das mesmas. A Figura 2 mostra um gráfico dos títulos virais versus tempo. O resultado é que LG-acetilsalicilato inibe de modo igualmente eficiente a multiplicação viral do isolado do H7N7 aviário altamente patogênico assim como ácido acetilsalicílico.

[00034] Esse é, conforme mostrado na Figura 3, também o caso após infecção com isolados altamente patogênicos do subtipo H5N1. Células epiteliais dos pulmões A549 foram infectadas com isolado do H5N1 humano A/Tailândia/KAN-1/2004 (MOI = 0,001) e incubadas na presença ou ausência de ácido acetilsalicílico ou LG ácido acetilsalicílico nas concentrações mencionadas. O sobrenadante celular foi investigado para a determinação dos títulos virais no ensaio de placa em células MDCK. A Figura 3A mostra um valor de tempo de 20 horas, na Figura 3B, os títulos virais estão mostrados em um diagrama cinético de crescimento. Em ambos casos, pode ser vista uma inibição eficiente dos títulos virais da cepa de H5N1 por diversas potências decimais.

[00035] Devido ao alto potencial viral in vitro, pode ser assumido que a formulação LG-acetilsalicilato é adequada como uma substância ativa anti-influenza para uma administração inalativa.

Exemplo 3: Influência de LG-acetilsalicilato em vírus da influenza aviária altamente patogênicos no sistema de cultura celular

[00036] Células MDCKII foram cultivadas em meio MEM (MEM; Gibco (Invitrogen) Alemanha 21430-079, lote 32034) com a adição de soro bovino fetal desativado por calor a 10% (FCS, LAA Laboratories/A04305-0346), penicilina (Grünenthal/616G03) e estreptomicina (Sanavita/03056440111). Para a infecção, as células foram semeadas em placas de 24 poços (8 x 104 células/poço; Greiner, Alemanha, No. 662160, lote 05210151) e incubadas durante a noite a 37 °C. Antes da infecção, as células foram lavadas com PBS, o vírus correspondente (FPV, SN1, MB1) foi diluído em PBS/BA (PBS suplementado com BA a 0,6% (MP Biomedicals), MgCl2 a 1 mM, CaCl2 a 0,9 mM, penicilina (Grünenthal/616G03) e estreptomicina e pipetadas com um MOI de 0,001 no tecido celular. Após um tempo de incubação de 30 min a 37 °C, o inóculo do vírus foi removido, às células foi adicionado ou 1 ml de meio MEM ou meio MEM, que continha LG-acetilsalicilato a 5 mM. Após 8, 24, 32 e 48 horas após a infecção, o respectivo sobrenadante foi extraído. A presença de partículas de vírus infeccioso foi verificada em um "ensaio de placa".

[00037] Para o ensaio "de placa", células MDCKII foram semeadas em placas de 96 poços, de modo que o tecido celular estava aderente no dia seguinte. As células foram lavadas com PBS e infectadas com diluições dos sobrenadantes, que foram estabelecidas em PBS/BA, por 60 min a 37 °C. Após a incubação, as células foram revestidas com uma mistura de meio Avicel (Avicel RC-581 (FMC/B624C)). Para essa finalidade, uma solução Avicel a 2,5% foi misturada com a mesma quantidade de meio MEM 2x. Após um tempo de incubação de 20 horas, a mistura de meio Avicel foi removida, as células foram fixas com uma solução Roti®-Histofix a 4% (Roth/32789170) em PBS por 30 min a 4 °C e então lavadas com PBS. As etapas de trabalho a seguir sendo necessárias para o tingimento foram realizadas à temperatura ambiente. Através da incubação com Triton-X-100 a 0,3% (Serva/30043) em PBS, as células foram permeabilizadas. Células infectadas com vírus foram tingidas por um método imuno-histológico. Para essa finalidade, as células foram incubadas por 1 hora com um anticorpo monoclonal (Serotec/250107), que é específico para a nucleoproteína do Vírus A da influenza. A detecção das células infectadas ocorreu através de outra incubação (30 min) com um anticorpo anticamundongo conjugado à peroxidase (DIANOVA/75790) e a adição do substrato de peroxidase True Blue® (KPL/070490). As diluições do anticorpo foram realizadas em PBS com FCS a 10% e Tween-20 a 0,1% (Serva/16211). Após a incubação com o anticorpo primário e secundário, as células foram lavadas três vezes por 5 min por PBS/Tween-20 a 0,1%. Para interromper a reação, as placas foram lavadas com água de torneira e secas. As placas secas foram examinadas e avaliadas por meio do software Corel DRAW 9.0. A fim de determinar o título viral dos sobrenadantes, os acúmulos de células infectadas (focos) em cada poço da placa de 96 poços foram contados. O número de focos contados foi multiplicado com o respectivo fator de diluição. A partir dos valores calculados, o valor médio foi determinado para cada amostra. O Título viral foi registrado como log10 dos valores médios.

[00038] Os resultados estão mostrados na Figura 4. Pode ser visto que a replicação de um vírus H7N1 (FPV), assim como de um vírus H5N1 (MB1) através de tratamento com LG-acetilsalicilato é reduzida no sistema de cultura celular em parte por mais do que 99%.

Exemplo 4: Investigação dos mecanismos moleculares de ação sobre os quais se baseia a atividade antiviral de LG-acetilsalicilato

[00039] Além disso, investigou-se se o perfil molecular de ação de LG-acetilsalicilato é comparável àquele da substância pura ácido acetilsalicílico. LG-acetilsalicilato deve agir como um inibidor do NF-kB e correspondentemente não ter quaisquer efeitos colaterais sobre outros caminhos de sinal induzidos por vírus. Um importante grupo de mediadores de sinal, que também são ativados após infecção do vírus da influenza, são as assim chamadas proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK). A essas pertencem as quinases JNK, p38 e ERK. Para a substância pura ácido acetilsalicílico, já foi mostrado que a ativação induzida por vírus dessas quinases não é inibida por ácido acetilsalicílico. Conforme mostra a Figura 5, esse também é o caso para LG-acetilsalicilato: a ativação induzida por vírus das JNK, p38 e ERK (Figura 5, sinal 5), que pode ser detectada por meio de anticorpos fósforo-específicos contra a forma ativa dessas quinases no Western blot, não é bloqueada pela adição de ácido acetilsalicílico a 5 mM (sinal 7) ou a 7 mM (sinal 9). Ácido acetilsalicílico atua de uma maneira antiviral através da inibição da expressão de fatores pró- apoptóticos, que finalmente levam a uma reduzida ativação da caspase na célula. A Figura 6 mostra isso também para LG- acetilsalicilato com base em um Western blot, a ativação da caspase pela clivagem do substrato de caspase poli-EDO-ribose polimerase (PARP). A faixa da PARP clivada (sinal 6) estando claramente visível após 30 h é eficientemente reduzida em amostras tratadas com LG- acetilsalicilato (sinal 7).

[00040] A etapa dependente do NF-kB na replicação viral é a exportação dependente da caspase de complexos de ribonucleoproteína viral (RNP) para dentro do citoplasma, que podem então se acumular na membrana celular em novas partículas virais. O ácido acetilsalicílico especificamente bloqueia essa etapa, sem atuar sobre o acúmulo de proteínas virais em uma etapa anterior do ciclo de multiplicação. Para LG-acetilsalicilato, se aplica o mecanismo idêntico de ação: a Figura 7 mostra em um Western blot que o acúmulo das proteína virais M1, NP, NS1 e PB1 não é inibido por LG-acetilsalicilato. Verifica-se, portanto, o mesmo conforme descrito antes para a substância pura ácido acetilsalicílico, uma retenção eficiente de complexos de RNP virais, como se tornará aparente a partir da análise de imunofluorescência mostrada na Figura 8.

[00041] A partir da mesma, pode ser tirada a conclusão de que LG- acetilsalicilato tem o mesmo potencial antiviral que o ácido acetilsalicílico e atua por mecanismos moleculares idênticos em um modo de inibição na multiplicação viral.

Exemplo 5: Redução do nível de expressão de mRNA para IP10 e interferon-gama após tratamento com LG-acetilsalicilato

[00042] É conhecido que uma produção excessiva de citocina, a assim chamada tempestade de citocina, é um importante fator de patogenidade para infecções por vírus da influenza H5N1. Visto que a maioria dessas citocinas são reguladas de uma maneira dependente do NF-kB, foi verificado que LG-ASA pode inibir a expressão de citocinas induzidas por vírus e pode, então, também indiretamente influenciar a patogenidade desses vírus. A partir do próprio tabalho preparatório, foi conhecido que IP10 e IFN-gama são regulados para cima após infecção com H5N1 (MB1) em pulmões de camundongo. A expressão dessa quimiocina ou citocina é induzida pelo fator de transcrição NF-kB. Com base em descobertas anteriores, pode ser demonstrado que a Aspirina atua como um inibidor do NF-kB.

[00043] O objetivo desse experimento foi verificar se LG- acetilsalicilato atua como um inibidor do NF-kB no pulmão do camundongo após infecção com H5N1. Para essa finalidade, foi investigado se um tratamento dos camundongos antes e durante a infecção de MB1 com LG-acetilsalicilato tem um efeito sobre a taxa de expressão das duas quimiocinas ou citocinas. Para o experimento, cinco camundongos Balb/C foram, cada um, tratados uma hora antes da infecção (dose de infecção: 1 x 103 pfu/50 μl) i.v. (100 μl) e i.p. (200 μl) com LG-acetilsalicilato a 50 mM. Os tratamentos adicionais foram feitos 17, 24 e 42 horas após infecção. Após 48 horas p.i., os pulmões foram extraídos e o RNA foi isolado. A expressão de IP10 e IFN-gama nos pulmões de camundongo dos camundongos tratados com LG- acetilsalicilato comparada aos animais de controle foi verificada por meio de RT-PCR quantitativa. Os dados estão mostrados na Figura 9.

[00044] A expressão de IP10 e IFN-gama para camundongos não tratados foi estabelecida a 100%, a fim de ter uma possibilidade mais clara para comparar. Após tratamento por quatro vezes com LG- acetilsalicilato por via intravenosa, assim como intraperitoneal, uma redução da expressão de mRNA pôde ser detectada para ambas quimiocinas e citocinas. A via de tratamento intravenosa mostrou, com uma redução de 62% para IP10 e uma redução de 68% para IFN- gama, um efeito mais forte do que para a via de tratamento intraperitoneal, com uma redução de 26% para IP10 e 50% para IFN- gama.

[00045] Os resultados mostram que a expressão induzida por vírus H5N1 de genes dependentes do NF-kB em pulmões de camundongo tratado com LG-acetilsalicilato é fortemente reduzida. Isso é importante visto que a produção excessiva de citocinas observada após infecção com vírus H5N1 ("tempestade de citocina"), cujas citocinas na maior parte são reguladas de uma maneira dependente de NF/kB, contribui fortemente para a patogenidade desses vírus. Assim, LG-ASA não pode apenas diretamente influenciar a replicação viral, mas também pode influenciar indiretamente de uma maneira positiva o curso da doença através de redução da produção excessiva de citocinas.

Exemplo 6: estudos de compatibilidade

[00046] No experimento a seguir, a compatibilidade de LG- acetilsalicilato após tratamento com aerossol de camundongos foi testada. A fim de monitorar a influência do tratamento tão precisamente quanto possível, o experimento foi realizado por meio do Sistema de Monitoramento de Camundongo. Isso permite a verificação da temperatura em tempo real. A cada 5 minutos, um valor de temperatura foi determinado e colocado em gráfico (Figura 10A-F). Além disso, os animais foram pesados todo dia. Ao final do tratamento, os camundongos foram mortos e o peso dos órgãos do fígado e baço foi determinado. Aos primeiros sinais de toxicidade do fígado, o tamanho do fígado aumentará. Por outro lado, um aumento do tamanho do baço é um sinal de processos de inflamação.

[00047] Para o estudo da compatibilidade, um transmissor de Monitoramento de Camundongo foi implantado no total em 12 camundongos fêmeas Balb/c 3 dias antes do tratamento. A intervenção bem sucedida foi monitorada por 3 dias. Então, 6 camundongos foram, cada um, tratados três vezes por dia com 2 ml de uma solução de LG-acetilsalicilato a 50 mM por meio de um nebulizador Pari. Como controles, serviram 6 camundongos que foram tratados com 2 ml de PBS. As soluções foram nebulizadas com uma pressão de 150 kPa (1,5 bar), de modo que o tratamento levou aproximadamente 10 minutos. O tratamento foi realizado diariamente por 5 dias às 9:00, 12:00 e 15:00 horas.

[00048] A influência de LG-acetilsalicilato sobre a alteração de peso foi investigada. Todos os camundongos foram pesados diariamente começando com o dia do tratamento e aquele antes do primeiro tratamento (9:00 horas). O peso do primeiro dia de tratamento foi estabelecido como 100% e o peso corporal determinado nos dias a seguir foi com referência ao mesmo. A comparação dos dois grupos de tratamentos resultou no gráfico mostrado na Figura 11. Pode ser verificado que não existe diferença significante das alterações do peso corporal entre o grupo de LG-acetilsalicilato e o grupo tratado com PBS.

[00049] Além disso, a influência de LG-acetilsalicilato sobre a temperatura do corpo foi investigada. Como já mencionado, o Sistema de Monitoramento de Camundongo permite a determinação da temperatura corporal do camundongo em tempo real. Visto que camundongos têm um alto metabolismo, menores alterações de bem- estar já irão levar a alterações da temperatura do corpo. Na Figura 10, o curso da temperatura começando 1 dia antes do tratamento (Figura 10A) ao final do tratamento (dia +4) (Figura 10F) está mostrado. Nenhuma diferença pode ser vista com relação à temperatura corporal para camundongos tratados com LG-acetilsalicilato comparados aos animais de controle.

[00050] Finalmente, a influência de LG-acetilsalicilato sobre o peso do fígado e baço foi investigada. Quinze minutos após o último tratamento, todos os animais foram mortos, e a necropsia foi realizada. Após completa retirada de sangue através da Veia Cava, os órgãos internos foram examinados. Os pulmões foram primeiro examinados através do diafragma na condição de não-colapso. O fígado e o baço foram pesados. Os resultados estão mostrados na Figura 13. Visto que o peso corporal dos camundongos não se alterou substancialmente durante o tratamento, a normalização dos pesos dos órgãos pôde ser deixada de fora. Para o baço (Figura 12A), assim como para o fígado (Figura 12B), nenhuma diferença significante nos pesos dos órgãos de animais tratados com LG-acetilsalicilato e nos animais de controle pôde ser verificada. Assim, após tratamento inalativo dos camundongos, nenhum sinal para uma toxicidade do fígado, frequentemente acompanhada com um inchaço do órgão, foi observado. Além disso, nenhuma reação de inflamação sistêmica, frequentemente acompanhada com um aumento de tamanho do baço, foi observada.

[00051] A partir dos estudos descritos acima, segue, como um resumo, que a aplicação inalativa de 2 ml de LG-acetilsalicilato com uma concentração de 50 mM por um período de 5 dias é bem compatível para camundongos.

Exemplo 7: testes em pacientes

[00052] Em uma tentativa de cura, 4 pacientes com infecções bronquiais foram administrados com uma solução compreendendo até 2M de LG-ASA (50:50) e vaporizada a tamanhos de partícula de menos do que 5 μm. As quantidades totais de LG-ASA foram até 350 mg. O fluxo de inalação foi ajustado para menos doq eu 50 ml/s, ma maioria dos casos menos do que 300 ml/s. O volume de respiração foi de pelo menos 30%, na maioria dos casos pelo menos 50%, da capacidade de inspiração dos pacientes.

[00053] Para três dos pacientes, uma melhora significante dos sintomas foi detectada já no primeiro dia após a administração. Para todos os outros pacientes, uma melhora dos sintomas ocorreu no 3° dia após a administração. A compatibilidade subjetivamente percebida dessas altas concentrações nas soluções foi excelente. Nenhum paciente relatou irritações de gosto. Além disso, nenhum estímulo extra para a tosse foi detectado.

Claims (16)

1. Uso de uma composição compreendendo um sal do ácido o-acetilsalicílico com D-lisina, L-lisina ou uma mistura de D-lisina e L-lisina, caracterizado pelo fato de ser para produzir uma composição farmacêutica para a profilaxia ou tratamento de infecções virais de seres humanos ou de animais.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que opcionalmente, além disso, um sal do ácido o- acetilsalicílico com uma cadeia lateral não básica, em particular com glicina, pode estar compreendido.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para a profilaxia ou tratamento de infecções com vírus RNA de fita negativa, preferivelmente com vírus da influenza A, em particular com vírus do tipo H5 ou H7.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser em uma preparação galênica como uma composição aquosa, líquida, em particular para a administração aerogênica, por exemplo, nasal.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a composição aquosa é uma solução aquosa a 0,1 até 5 M, em particular 0,1 até 3 M, preferivelmente 1 a 3 M do sal.

6. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a composição aquosa é uma solução aquosa a 0,01 a 100 mM, em particular 0,1 a 10 mM, do sal.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição está disposta em um tanque farmaceuticamente compatível com um vaporizador ou nebulizador.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o tanque é preparado para o ajuste de um fluxo de inalação de menos do que 1,000 mL/s, preferivelmente menos do que 500 mL/s, em particular menos do que 300 ml/s, e de um volume de respiração de pelo menos 10%, em particular pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 50%, até 95%, com referência à capacidade de inspiração de um paciente.

9. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a profilaxia ou tratamento de infecções virais de seres humanos ou de animais, em que um ser humano que está em risco de adquirir uma doença viral ou está afetado com a mesma, ou tal animal é administrado aerogenicamente para a inalação através do nariz ou da boca com uma quantidade fisiologicamente eficaz da composição farmacêutica na forma de uma formulação em aerossol.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10 mg, preferivelmente pelo menos 50 mg, mais preferivelmente pelo menos 100 mg, até mais do que 200 mg, da formulação em aerossol são administrados aerogenicamente e preferivelmente dentro de um período de menos do que 5 min, preferivelmente menos do que 2 min, mais preferivelmente menos do que 1 min.

11. Uso de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o fluxo de inalação é ajustado para menos do que 1,000 mL/s, em particular menos do que 500 mL/s, em particular menos do que 300 mL/s, e em que o volume de respiração é ajustado para pelo menos 20%, em particular pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 50%, até 95%, com referência à capacidade de inspiração de um paciente.

12. Formulação em aerossol, caracterizada pelo fato de que compreende um sal do ácido o-acetilsalicílico com D-lisina, L-lisina ou uma mistura de D-lisina e L-lisina, um propulsor e opcionalmente substâncias auxiliares e/ou veículo.

13. Formulação em aerossol de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o sal está compreendido em uma quantidade de 0,001 a 50% em peso, 0,001 a 10% em peso, em particular 0,1 a 10% em peso, ou em particular 10 a 50% em peso, com referência à formulação total.

14. Formulação em aerossol de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que o sal está compreendido em forma de partícula ou solução com um valor MMAD de menos do que 10 μm, em particular menos do que 5 μm.

15. Formulação em aerossol de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizada pelo fato de que a formulação em aerossol está compreendida em um tanque de fornecimento de um dispositivo de inalação com um gerador de aerossol sendo conectado ao tanque de fornecimento.

16. Formulação em aerossol de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o dispositivo de inalação apresenta meios de controle e/ou regulação para o controle e/ou regulação do fluxo de inalação e do volume de respiração, em que os meios de controle e/ou regulação são preferivelmente ajustados a valores como definidos na reivindicação 11.

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