PT2142193E - 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)fenil]piperazina como um composto com actividade combinada de recaptação de serotonina e 5-ht3 e 5-ht1a para o tratamento da dor ou sintomas residuais na depressão relacionada com o sono e cognição - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "1-[2—(2,4-DIMETILFENILSULFANIL)FENIL]PIPERAZINA COMO UM COMPOSTO COM ACTIVIDADE COMBINADA DE RECAPTAÇÃO DE SEROTONINA E 5-HT3 E 5-HT1A PARA O TRATAMENTO DA DOR OU SINTOMAS RESIDUAIS NA DEPRESSÃO RELACIONADA COM O SONO E COGNIÇÃO"

Antecedentes O composto 1-[2-(2,4-dimetilfenil-sulfanil)fenil]piperazina é divulgado no pedido de patente internacional WO 03/029232. O composto é referido como sendo um inibidor do transportador da serotonina e como tendo afinidade para o receptor da serotonina 2C(5-HT2c) e, como tal, sendo útil no tratamento de distúrbios de humor, tais como depressão e ansiedade.

No entanto, como apresentado nos exemplos, o composto tem um perfil farmacológico mais amplo o que torna o composto útil no tratamento também de outras doenças. Este perfil farmacológico foi também divulgado no pedido de patente internacional WO 2007/144005, em conjunto com a utilização do referido composto para o tratamento de doenças adicionais. A percepção de dor é mais complicada do que uma transmissão directa de sinais de uma parte lesionada do corpo para os receptores específicos no cérebro e em que a dor sentida é proporcional à lesão. Em vez disso, a lesão nos tecidos periféricos e lesão nos nervos pode provocar alterações nas estruturas neurais centrais envolvidas na percepção da dor, 1 afectando a sensibilidade subsequente à dor. Esta neuroplasticidade pode provocar uma sensibilização central na resposta a estímulo nocivo mais duradouro, que se pode manifestar, ela própria como, e. g., dor crónica, i. e., que a percepção da dor permanece mesmo após o estimulo nocivo ter terminado ou como hiperalgesia, í. e., uma resposta aumentada a um estímulo que é normalmente doloroso. Um dos exemplos mais misteriosos e dramáticos desta situação é o "síndrome do membro fantasma", í. e., a persistência da dor que existia num membro antes da sua amputação. Para uma revisão recente da neuroplasticidade central e dor ver Melzack et al., em Ann. N. Y. Acad. Sei, 933, 157-174, 2001. A dor crónica, tal como a dor neuropática manifesta-se, ela própria, de um modo diferente dos outros tipos de dor, e. g., dor somática ou visceral. A dor é, muitas vezes descrita como penetrante, ardor, alfinetes e agulhas, dormência ou lancinante. As causas comuns da dor neuropática incluem alcoolismo, amputação, problemas de costas, pernas e ancas, quimioterapia, diabetes, VIH, esclerose múltipla, cirurgia à medula e infecção por vírus herpes zoster. O componente central da dor crónica pode explicar porque a dor crónica, tal como, e. g., dor neuropática, muitas vezes responde de um modo fraco a analgésicos clássicos, tais como fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAID) e analgésicos opióides. Os antidepressivos tricíclicos (TCA), tipificados pela amitrilina, tornaram-se convencionais para o tratamento da dor neuropática e acredita-se que o efeito seja mediado pelo efeito inibidor combinado no transportador da serotonina e no transportador da norepinefrina [Clin Ther., 26, 951-979, 2004]. Mais recentemente, os denominados antidepressivos de acção 2 dupla, com um efeito inibidor na captura de serotonina e norepinefrina, foram utilizados clinicamente para o tratamento da dor neuropática [Human Psychopharm., 19, S21-S25, 2004]. Exemplos de antidepressivos de acção dupla são a venlafaxina e duloxetina e esta classe de antidepressivos é, muitas vezes, referida como SNRI.

Os dados sobre a utilização de inibidores da recaptura da serotonina selectivos (SSRI) para a dor neuropática, são raros mas, geralmente, sugerem um efeito limitado [Bas. Clin. Pharmacol, 96, 399-409, 2005] . De facto, tem sido colocada a hipótese de que os SSRI são apenas antinociceptivos fracos em e deles próprios, mas essa inibição do transporte de serotonina aumenta o efeito antinociceptivo da inibição da recaptura de norepinefrina. Esta noção é suportada por uma revisão de um estudo com 22 animais e cinco humanos que mostra que os SNRI têm um efeito antinociceptivo superior comparativamente aos inibidores da recaptura de norepinefrina, que são também superiores aos SSRI [Pain Med. 4, 310-316, 2000].

No entanto, a utilização de antidepressivos triciclicos está associada com efeitos secundários anticolinérgicos conhecidos, tais como, e. g., sonolência, ansiedade, inquietação e dificuldades cognitivas e de memória. Deste modo, existe uma necessidade na técnica para encontrar meios alternativos de tratar a dor.

Os doentes deprimidos a receber antidepressivos, tais como e. g., os SSRI, respondem, muitas vezes apenas parcialmente, ao tratamento, no sentido em que os sintomas, em particular relacionados com o sono e cognição, permanecem [J.Psychopharmacol., 20(3), 29-34, 2006]. Estes sintomas 3 residuais aumentam o risco de recaída e perturbam o doente no geral.

Sumário da invenção

Numa forma de realização, a invenção refere-se a 1-[2-(2,4-dimetilfenil-sulfanil)fenil]piperazina e seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis para utilização no tratamento da dor.

Figuras

Figura 1 : XRPD de base cristalina do composto I

Figura 2: XRPD da forma alfa do sal de bromidrato do composto I Figura 3: XRPD da forma beta do sal de bromidrato do composto I Figura 4: XRPD da forma gama do sal de bromidrato do composto I Figura 5: XRPD do hemi-hidrato do sal de bromidrato do

composto I

Figura 6: XRPD da mistura do solvato de acetato de etilo e da forma alfa do sal de bromidrato do composto I

Figura 7: XRPD do sal de cloridrato do composto I 4

Figura 8: XRPD do mono-hidrato do sal de cloridrato do composto I

Figura 9: XRPD do sal de mesilato do composto I

Figura 10: XRPD do sal de fumarato do composto I

Figura 11: XRPD do sal de maleato do composto I

Figura 12: xrpd do sal de meso-tartarato do composto I

Figura 13: XRPD do sal de L-(+)-tartarato do composto I

Figura 14: XRPD do sal de D-(-)-tartarato do composto I

Figura 15: XRPD do sal de sulfato do composto I

Figura 16: XRPD do sal de fosfato do composto I

Figura 17: XRPD do sal de nitrato do composto I

Figura 18: Efeito do composto I nos testes de formalina intradérmica. O eixo dos X mostra a quantidade de composto administrado; o eixo dos Y mostra a quantidade de tempo (s) dispendido a lamber a pata. Figura 18a: Resposta no período de 0-5 minutos; Figura 18b: Resposta no período de 20-30 minutos

Figura 19a: Níveis de acetilcolina extracelular no córtex pré-frontal em ratos que se movem livremente após administração do sal de HBr de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)feniljpiperazina. 5

Figura 19b: Niveis de acetilcolina extracelular no hipocampo ventral em ratos que se movem livremente após administração do sal de HBr de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)fenil]-piperazina.

Figura 20: Efeito do sal de HBr de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)fenil]piperazina no condicionamento do medo contextuai em ratos Sprague-Dawley, quando este lhes é administrado 60 minutos antes da aquisição. O comportamento de condicionamento foi registado durante um periodo de habituação de 58 s antes do choque na pata US (aquisição do pré-choque) (barras a branco). Foi medido o comportamento de bloqueio 24 h após o treino (teste de retenção) (barras a preto).

Figura 21: Efeito do sal de HBr de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)fenil]piperazina no condicionamento do medo contextuai em ratos Sprague-Dawley quando este lhes foi administrado 1 h antes do teste de retenção. O comportamento de bloqueio foi registado durante 58 s antes do choque na pata US (aquisição) (barras a branco). O comportamento de bloqueio foi medido 24 h após o treino (teste de retenção) (barras a preto).

Figura 22: Efeito do sal de HBr de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)fenil]piperazina no condicionamento do medo contextuai em ratos Sprague-Dawley quando este lhes foi administrado imediatamente após a aquisição. O comportamento de bloqueio foi registado durante 58 s antes do choque na pata US (aquisição do pré-choque) (barras a branco). O comportamento de bloqueio foi 6 medido 24 h após o treino (teste de retenção) (barras a preto).

Figura 23: Alteração no item 4 de avaliação HAM-D (Insónia

Precoce) para o placebo, 5 mg e 10 mg de composto I (sal de HBr) ao longo de 6 semanas. Existiam aproximadamente 100 doentes em cada grupo

Figura 24: Alteração no item 5 de avaliação HAM-D (Insónia Média) para placebo, 5 mg e 10 mg de composto I (sal de HBr) ao longo de 6 semanas. Existiam aproximadamente 100 doentes em cada grupo.

Figura 25: Alteração no item 6 de avaliação HAM-D (Insónia Tardia) para placebo, 5 mg e 10 mg de composto I (sal de HBr) ao longo de 6 semanas. Existiam aproximadamente 100 doentes por cada grupo.

Figura 26: Efeito do composto I no limiar da retirada no modelo de lesão por contracção crónica em rato.

Descrição detalhada da invenção A invenção refere-se à utilização de 1-[2-(2, 4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina e seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis (composto I) . A estrutura da 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina é 7

Numa forma de realização, os referidos sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis são sais de adição de ácido de ácidos que são não tóxicos. Os referidos sais incluem sais preparados a partir de ácidos orgânicos, tais como ácido maleico, fumárico, benzóico, ascórbico, succinico, oxálico, bis-metilenossalicilico, metanossulfónico, etanodissulfónico, acético, propiónico, tartárico, salicilico, cítrico, glucónico, láctico, málico, mandélico, cinâmico, citracónico, aspártico, esteárico, palmítico, itacónico, glicólico, p-aminobenzóico, glutâmico, benzenossulfónico, teofilina acético, bem como as 8-haloteofilinas, por exemplo 8-bromoteofilina. Os referidos sais podem também ser preparados a partir de sais inorgânicos, tais como ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico e nítrico. É feita referência particular aos sais preparados a partir de ácido metanossulfónico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido meso-tartárico, ácido (+)-tartárico, ácido (-)-tartárico, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosforoso e ácido nítrico. É feita menção distinta ao sal de bromidrato. consequentemente, melhor

As formas de dosagem oral e, em particular, comprimidos, são muitas vezes preferidas pelos doentes e pelo médico devido à facilidade de administração e, 8 cumprimento. Para os comprimidos, é preferido que os ingredientes activos sejam cristalinos. Numa forma de realização, o composto I é cristalino.

Numa forma de realização, os cristais utilizados na presente invenção são solvatos, i. e., os cristais em que as moléculas de solvente faz parte da estrutura de cristal. 0 solvato pode ser formado a partir de água, em cujo caso os solvatos são muitas vezes referidos como hidratos. Alternativamente, os solvatos podem ser formados de outros solventes, tais como, e. g., etanol, acetona ou acetato de etilo. A quantidade exacta do solvato depende, muitas vezes, das condições. Por exemplo, os hidratos irão, tipicamente, perder água à medida que a temperatura é aumentada ou à medida que a humidade relativa é diminuida.

Numa forma de realização, o composto I é um cristal não solvatado.

Alguns compostos são higroscópicos, í. e., absorvem água quando expostos à humidade. A higroscopicidade é, geralmente, considerada como uma propriedade não desejada para os compostos que são para serem apresentados numa formulação farmacêutica, em particular, numa formulação seca, tal como comprimidos. Numa forma de realização, a invenção proporciona a utilização de cristais com higroscopicidade reduzida. Para formas de dosagem oral utilizando ingredientes activos cristalinos, é também benéfico se os referidos cristais forem bem definidos. No presente contexto, o termo "bem definido", em particular, significa que a estequiometria é bem definida, i. e., que a proporção entre os iões que formam o sal é a proporção entre pequenos números inteiros, tais como 1:1, 1:2, 2:1, 1:1:1, etc. 9

Numa forma de realização, o composto I forma cristais bem definidos. 0 composto I cristalino pode existir em mais do que uma forma, i. e., pode existir em formas polimórficas. As formas polimórficas existem se um composto conseguir cristalizar em mais do que uma forma. A presente invenção pretende englobar todas estas formas polimórficas, como compostos puros ou como suas misturas.

Numa forma de realização, os compostos da presente invenção estão numa forma purificada. 0 termo "forma purificada" entende-se como indicando que o composto é essencialmente livre de outros compostos ou outras formas do mesmo composto, consoante o caso.

Numa forma de realização, a invenção proporciona a utilização de sais cristalinos do composto I com XRDP como mostrado nas Figuras 1-17 e, em particular, figuras 2, 3, 4 e 5. A tabela abaixo mostra as principais reflexões XRDP para o composto I.

Posições seleccionadas de picos de raio X (°2Θ), Todos os valores +-0,1°

Base Cristalina 11, 10 16,88 17, 42 22,23 -bromidrato (a) 5, 85 9,30 17, 49 18,58 -bromidrato (β) 6,89 9, 73 13, 78 14,62 -bromidrato (Y) 11, 82 16,01 17, 22 18,84 10 (continuação) -bromidrato (hidrato) 10, 69 11,66 15, 40 17,86 -bromidrato (solvato de 8,29 13,01 13,39 16,62 acetato de etilo) -cloridrato 9, 41 12,37 19, 66 22,55 -cloridrato (mono-hidrato) 7, 72 13,45 15, 39 17,10 -mesilato 8,93 13,39 15, 22 17,09 -hidrogenofumarato 5, 08 11,32 17,12 18,04 -hidrogenomaleato 9, 72 13,19 14, 72 17,88 -meso-hidrogenotartarato 9, 51 10,17 16,10 25,58 -L-(+)-hidrogenotartarato 13,32 13,65 14, 41 15,80 -D-(-)-hidrogenotartarato 13,32 13,65 14, 41 15,80 -sulfato de hidrogénio 11, 82 17,22 17, 72 20,13 -di-hidrogenofosfato 7,91 11, 83 15, 69 17,24 -nitrato 12, 50 7, 41 18,12 18,47

Como evidenciado, e. g., pelas figuras 2-5, os compostos da presente invenção, in casu o sal de bromidrato, podem existir em várias formas, i. e., serem polimórficos. As formas polimórficas têm diferentes propriedades, como mostrado nos exemplos. A forma beta do sal de bromidrato é a mais estável, como demonstrado pelo ponto de fusão de DSC superior e a baixa solubilidade. Além disso, a forma beta tem uma combinação atractiva de baixa higroscopicidade e solubilidade, o que torna este composto particularmente adequado para preparar comprimidos. Assim, numa forma de realização, a invenção proporciona o sal de bromidrato de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina com reflexões de XRDP a aproximadamente 6,89, 9,73, 13,78 e 14,62 (°2Θ) e, em particular, com um XRPD como apresentado na figura 3. 11 A solubilidade de um ingrediente activo é também significativo para a escolha da forma de dosagem, uma vez que pode ter impacto directo na biodisponibilidade. Para as formas de dosagem oral, acredita-se, no geral, que uma solubilidade mais elevada do ingrediente activo é benéfica, uma vez que aumenta a biodisponibilidade. 0 perfil farmacológico do composto I é proporcionado nos exemplos, mas pode ser sumariado como se segue. 0 composto I é um inibidor do transportador da serotonina, antagoniza o receptor 3 (5-HT3) da serotonina e é um agonista parcial do receptor IA (5-HTiA) da serotonina.

Os dados apresentados nos exemplos 14 e 17 mostram que o composto I é útil no tratamento da dor e que pode, até mesmo, ter um efeito analgésico.

Numa forma de realização, a referida dor é a dor crónica, incluindo a dor do membro fantasma, dor neuropática, neuropatia diabética, neuralgia pós-herpética (PHN), sindrome do túnel cárpico (CTS), neuropatia do VIH, sindrome da dor regional complexa (CPRS), neuralgia trigeminal, tique doloroso, intervenção cirúrgica (e. g., analgésicos pós-operação), vasculopatia diabética, resistência capilar, sintomas diabéticos associados com insulite, dor associada à menstruação, dor associada ao cancro, dor de dentes, dor de cabeça, enxaqueca, dor de cabeça do tipo tensão, neuralgia trigeminal, sindrome da articulação temporomandibular, dor miofascial, lesão muscular, sindrome da fibromialgia, dor da articulação e osso (osteoartrite), artrite reumatóide, artrite reumatóide e edema resultantes de trauma associado com queimaduras, entorses ou 12 fracturas do osso devido a osteoartrite, osteoporose, metástases do osso ou razões desconhecidas, gota, fibrosito, dor miofascial, sindromes de saida torácica, dor torácica ou lombalgia (em que a dor de costas resulta de doença medular sistémica, regional ou primária (radiculopatia), dor pélvica, dor de peito cardíaca, dor de peito não cardíaca, dor associada com lesão da espinal medula (SCI), dor de pós-acidente vascular cerebral central, neuropatia cancerosa, dor relacionada com SIDA, dor de células falciformes ou dor geriátrica. Numa forma de realização, a dor é a síndrome do intestino irritável (IBS). 0 composto I tem sido testado em ensaios clínicos em doentes utilizando HAM-D (Escala de Classificação de Hamilton para Depressão) como ponto terminal clínico. A escala de HAM-D pode ser utilizada para avaliar a gravidade da depressão em doentes, através de um questionário com 24 itens. 0 Item 4, 5 e 6 da escala relacionada com o modo como o doente dorme, i. e., é fácil adormecer (Insónia precoce), se o doente acorda durante a noite (Insónia Moderada) e se o doente acorda muito cedo de manhã (Insónia Tardia) . 0 composto foi testado a 5 e 10 mg diárias contra placebo, em aproximadamente 100 doentes por braço. Os dados nas Figuras 23-25 mostram claramente que o composto I proporciona um aumento grande e dependente da dose do padrão de sono que é superior ao proporcionado pelo placebo. É bem sabido que os distúrbios de sono são um efeito secundário geral da maioria dos antidepressivos. Em particular, os SSRI e compostos que inibem o transportador da noradrenalina são referidos como dando origem a problemas com o início do sono e manutenção e problemas com insónia são também muitas vezes referidos [Int. Chn. Psychpharm., 21 (supl 1), S25-S29, 2006]. Outros referem que tais compostos proporcionam um sono REM suprimido, latência do sono aumentada, sono menos eficiente, 13 aumento nas vezes que acorda durante a noite e fragmentação do sono [Hum. Psychopharm. Clin. Exp., 20, 533-559, 2005]. É deste modo, um resultado surpreendente que a administração do composto I não esteja associada com efeitos secundários do sono adversos, mas de facto, proporciona uma melhoria do padrão do sono. E bem sabido que o tratamento com anti-depressivos no geral, e com SSRI em particular, pode estar associado com a disfunção sexual, que frequentemente conduz a descontinuação do tratamento. Cerca de 30-70% dos doentes com SSRI reportam défice na função sexual [J. Clin. Psych., 66, 844-848, 2005], cujo défice inclui libido diminuído, orgasmos retardados, reduzidos ou ausentes, estímulo diminuído e disfunção eréctil.

Um total de 114 indivíduos saudáveis, foram expostos ao composto I em ensaios clínicos; destes 114 indivíduos, apenas um indivíduo apresentou disfunção sexual. Estes dados sugerem que a intervenção clínica utilizando o composto I está associada com, de um modo surpreendente, um défice reduzido no funcionamento sexual.

Esta noção foi também suportada pelos ensaios clínicos conduzidos em doentes. Os ensaios clínicos mencionados acima em doentes, também capturaram efeitos secundários adversos sexuais reportados pelos doentes. A tabela abaixo mostra o número de doentes que reportaram os tipos especificados de efeitos secundários sexualmente relacionados. 14

Efeito secundário declarado Placebo 5 mg 10 mg Anorgasmia 0 0 0 Ejaculação retardada 0 0 0 Disfunção eréctil 0 0 0 Libido diminuída 0 1 1 Orgasmo anormal 2 0 0 Perda da Libido 0 1 0 Sensação de orgasmo diminuída 0 0 0

Os resultados anteriores que mostram que o efeito secundário sexual do composto I é semelhante ao placebo e, deste modo, muito melhor do que seria esperado normalmente de um antidepressivo, e, em particular, num SSRI. Assim, acredita-se que uma intervenção clinica compreendendo a administração do composto I seja particularmente benéfica para o doente uma vez que os eventos secundários sexualmente adversos relacionados são diminuídos (ou até mesmo ausentes) relativamente a uma intervenção clínica compreendendo a administração de um SSRI. 0 termo "tratamento" e "tratando", como aqui utilizado significa a gestão e cuidado de um doente para o objectivo de combater um estado, tais como uma doença ou um distúrbio. 0 termo é entendido como incluindo o espectro total de tratamentos para um determinado estado de que o doente está a sofrer, tal como a administração do composto activo para aliviar os sintomas ou complicações, para retardar a progressão da doença, distúrbio ou estado, para aliviar os sintomas e complicações e/ou para curar ou eliminar a doença, distúrbio ou estado, bem como prevenir o estado, em que a prevenção é para ser entendida como a gestão e cuidado de um doente para o objectivo de combater a 15 doença, estado ou distúrbio e inclui a administração dos compostos activos para prevenir o início dos sintomas ou complicações. No entanto, o tratamento profilático (preventivo) e terapêutico (curativo) são dois aspectos separados da invenção. 0 doente a ser tratado é, de um modo preferido, um mamífero, em particular um ser humano.

Tipicamente, o tratamento da presente invenção irá envolver a administração diária de composto I. Isto pode envolver uma administração diária ou duas administrações por dia ou até com mais frequência.

Numa forma de realização, a invenção refere-se à utilização de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)fenil]piperazina e seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis (composto I), para utilização num método para o tratamento da dor.

As formulações farmacêuticas contendo o Composto I podem ser preparadas por métodos convencionais na técnica. É feita menção particular aos comprimidos, que podem ser preparados por mistura do ingrediente activo com adjuvantes convencionais e/ou diluentes e, subsequentemente, comprimindo a mistura numa máquina de compressão convencional. Exemplos de adjuvantes ou diluentes compreendem: hidrogenofosfato de cálcio anidro, PVP, co-polímeros PVP-VA, celulose microcristalina, glicolato de amido de sódio, amido de milho, manitol, amido de batata, talco, estearato de magnésio, gelatina, lactose, gomas e semelhantes. Quaisquer outros adjuvantes ou aditivos normalmente utilizados para tais objectivos, tais como corantes, aromatizantes, conservantes etc. podem ser utilizados desde que sejam compatíveis com os ingredientes activos. 16

As soluções para injecções podem ser preparadas por dissolução do ingrediente activo e aditivos possíveis numa parte do solvente para injecção, de um modo preferido, água estéril, ajustando a solução para o volume desejado, esterilizando a solução e colocando-a em ampolas adequadas ou frasquinhos. Pode ser adicionado qualquer aditivo adequado, utilizado convencionalmente na técnica, tal como agentes de tonicidade, conservantes, antioxidantes, etc.

As composições farmacêuticas contendo o Composto I podem ser administradas através de qualquer via adequada, por exemplo, oralmente na forma de comprimidos, cápsulas, pós, xaropes, etc., ou parentericamente na forma de soluções para injecção. Para preparar tais composições, podem ser utilizados métodos bem conhecidos na técnica e podem ser utilizados quaisquer veículos, diluentes, excipientes ou outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis, utilizados normalmente na técnica.

De um modo conveniente, o composto I é para ser administrado numa forma de dosagem unitária contendo os referidos compostos numa quantidade de cerca de 1 a 50 mg. Acredita-se que seja estabelecido um limite superior pela dependência da concentração da actividade do 5-HT3. A dose diária total está, normalmente, na gama de cerca de 1-20 mg, tal como cerca de 1 a 10 mg, cerca de 5-10 mg, cerca de 10-20 mg ou cerca de 10-15 mg do composto da invenção. É feita referência particular às dosagens diárias de 1, 2,5, 5, 10, 15 ou 20 mg.

Os comprimidos compreendendo o composto I podem ser convenientemente preparados por granulação húmida. Utilizando este método, os sólidos secos (ingredientes activos, enchimentos, ligando, etc.) são misturados e humidificados com 17 água ou outro agente de humidificação (e. g., um álcool) e são construídos aglomerados ou grânulos a partir de sólidos humidificados. 0 aglomeramento húmido é continuado até ser alcançado um tamanho de partícula homogéneo desejado, após o qual o produto granulado é seco. 0 composto I é tipicamente misturado com mono-hidrato de lactose, amido de milho e copovidona, num misturador de elevado cisalhamento, em conjunto com água. Após a formação de grânulos, estes grânulos podem ser peneirados numa peneira com um tamanho de malha adequado e seco. Os grânulos resultantes secos são depois misturados com celulose microcristalina, croscarmelose de sódio e estearato de magnésio, após isto os comprimidos são prensados. Alternativamente, a granulação húmida do composto I pode ser alcançada utilizando manitol, amido de milho e copovidona, cujos granulados são misturados com celulose microcristalina, glicolato de amido se sódio e estearato de magnésio antes dos comprimidos serem prensados. Alternativamente, a granulação húmida dos compostos da presente invenção pode ser alcançada utilizando hidrogenofosfato de sódio anidro, amido de milho e copovidona, cujos granulados são misturados com celulose microcristalina, glicolato de amido de sódio (tipo A), talco e estearato de magnésio antes dos comprimidos serem prensados. A copovidona é um copolímero PVP-VA. A base livre do composto I pode se preparada como divulgado no documento WO 2003/029232. Os sais da presente invenção podem ser preparados por dissolução da base livre num solvente apropriado, adicionando o ácido relevante, seguido por precipitação. A precipitação pode ser efectuada por adição de um segundo solvente e/ou evaporação e/ou arrefecimento. Alternativamente, a base livre da presente invenção e, finalmente, os compostos da presente invenção podem ser 18 sintetizados numa reacção catalisada por paládio, como descrito no documento WO 2007/144005. A utilização dos termos "a" e "uma" e "o" e referências semelhantes no contexto da descrição da invenção são para ser construídos de modo a abranger o singular e o plural, a não ser que seja indicado o contrário aqui, ou claramente em contradição com o contexto. Por exemplo, a frase "o composto" é para ser entendida como se referindo a vários compostos da invenção ou aspectos descritos em particular, a não ser que seja indicado contrário. A não ser que seja indicado o contrário, todos os valores exactos aqui proporcionados são representativos dos valores aproximados correspondentes (e. g., todos os valores exactos dos exemplos proporcionados relativamente a um factor em particular ou medição podem ser considerados também para proporcionar a medição aproximada correspondente, modificada por "cerca de", quando apropriado). A descrição aqui de qualquer um dos aspectos ou aspecto da invenção, utilizando termos tais como "compreendendo", "com", "incluindo" ou "contendo", relativamente a um elemento ou elementos, entende-se como proporcionando suporte para um aspecto semelhante ou aspecto da invenção que "consiste de, "consiste essencialmente de, ou "compreende substancialmente" que o elemento ou elementos particulares, a não ser que seja afirmado ou claramente contradito pelo contexto (e. g., uma composição aqui descrita como compreendendo um elemento particular deverá ser entendida como descrevendo também uma composição consistindo desse elemento, a não ser que seja referido de outro modo ou claramente contradito pelo contexto). 19

Exemplos Métodos analíticos

Os espectros de RMN de ΧΗ são registados a 500,13 MHz num instrumento Bruker Avance DRX500. É utilizado dimetilsulfóxido (99,8%D) como solvente e o tetrametilsilano (TMS) é utilizado como padrão interno de referência.

Os pontos de fusão são medidos utilizando Calorimetria de Varrimento Diferencial (DSC). O equipamento é um TA-instruments DSC-QIOOO calibrado a 5°/min para proporcionar o ponto de fusão como o valor inicial. Cerca de 2 mg da amostra são aquecidos 5°/min num recipiente fechado, de modo solto, sob fluxo de azoto. A análise termo gravimetrica (TGA) utilizada para fazer uma estimativa do conteúdo de solvente/água do material seco é efectuada utilizando um TA-instruments TGA-Q500. Uma amostra de 1-10 mg é aquecida a 10°/min, num recipiente aberto sob fluxo de azoto.

Os difractogramas de Raio-X de pós foram medidos num Difractómetro de Raio X PANalytical X'Pert PRO utilizando radiação de CuKai. As amostras foram medidas de um modo reflexivo numa gama 2Θ de 5-40° utilizando um detector X'celerator.

Exemplo 1 Farmacologia do receptor In vitro

Transportador de serotonina em rato: IC50 a 5,3 nM (bloqueio da recaptura de 5-HT) 20

Transportador de serotonina humana: IC50 a 40 nM (bloqueio da recaptura de 5-HT)

Receptor Humano 5-HTIA: Ki a 40 nM com agonismo parcial (eficácia de 85%)

Receptor 5-HT3 de rato: ΙΟ50 a 0,2 nM (antagonismo em ensaio funcional)

Receptor 5-HT3A Humano: IC5o cerca de 20 nM (antagonismo em ensaio funcional). A concentração superior, o composto exibe actividade antagonista com um ED50 de 2,1 μΜ. O composto da invenção apresentou também uma elevada afinidade para o receptor 5HT3 humano num ensaio de ligação in vitro (Ki 4,5 nM) .

Exemplo 2a Preparação da base livre do composto I 10 gramas de bromidrato de 1-[2-(2, 4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina foram tratadas com uma mistura agitada de 100 mL de NaOH 3 M e 100 mL de acetato de etilo durante 10 minutos. A fase orgânica foi separada, lavada com 100 mL de NaCl (aq) 15% em peso, seco sob MgS04, filtrado e concentrado in vacuo produzindo 7,7 gramas (98%) do composto I base como um óleo incolor límpido. A RMN corresponde com a estrutura. 21

Exemplo 2b Preparação da base cristalina do composto I 3,0 gramas do óleo incolor de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina foram tratadas com 70 mL de acetonitrilo e foram aquecidas a refluxo. A solução quase limpida foi filtrada e o filtrado límpido foi arrefecido espontaneamente, após isto deu-se início à precipitação pouco tempo após a filtração. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente (22 °C), durante 2 horas, e o produto foi isolado por filtração e seco sob vácuo (40 °C), de um dia para o outro. Foram isoladas 2,7 gramas da base cristalina como um sólido branco (90%). A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 72,40% C, 9,28% N, 7,58% H (teoria: 72,26% C, 9,36% N, 7,42% H).

Exemplo 2c Caracterização da base cristalina do composto I A base, como preparada no exemplo 2b, é cristalina (XRPD) - ver Figura 1. Tem um ponto de fusão de -117 °C. Não é higroscópica e tem uma solubilidade de 0,1 mg/mL em água.

Exemplo 3a Preparação da forma alfa do sal de bromidrato do composto I

Foram dissolvidas 2,0 gramas de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em 30 mL de acetato de etilo quente e foram adicionados 0,73 mL de 48% HBr em peso (aq). Esta adição provocou formação de uma pasta espessa e foram adicionados mais 10 mL de acetato de etilo, de modo a proporcionar uma agitação mais adequada. A pasta foi agitada, à temperatura ambiente, durante mais uma hora. A filtração e 22 secagem a vácuo (20 °C) durante a noite, produziram 2,0 gramas do produto como um sólido branco (80%). A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 57,05% C, 7,18% N, 6,16% H (Teórica para o sal 1:1: 56,99% C, 7,39% N, 6,11% H)

Exemplo 3b Caracterização da forma alfa do bromidrato do composto I A forma alfa do bromidrato, como preparado no exemplo 3a, é cristalina (XRPD) - ver Figura 2. Tem um ponto de fusão de ~226 °C. Absorve cerca de 0,3% de água quando exposto à humidade relativa elevada e tem uma solubilidade de 2 mg/mL em água.

Exemplo 3c Preparação da forma beta do sal de bromidrato do composto I 49,5 gramas do óleo incolor de 1-[2-(2, 4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina foram dissolvidas em 500 mL de acetato de etilo e foram adicionados 18,5 mL de HBr (aq)a 48% em peso. Esta adição provocou formação de uma pasta espessa que foi agitada de um dia para o outro, à temperatura ambiente. A filtração e secagem a vácuo (50 °C) de um dia para o outro, produziram 29,6 gramas de produto como um sólido branco (47%). A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 56,86% C, 7,35% N, 6,24% H (Teórica para o sal 1:1: 56,99% C, 7,39% N, 6,11% H) 23

Exemplo 3d Caracterização da forma beta do bromidrato do

composto I A forma beta do bromidrato, como preparado no exemplo 3c, é cristalina (XRPD) ver Figura 3. Tem um ponto de fusão de -231 °C. Absorve cerca de 0,6% de água quando exposto a humidade relativa elevada e tem uma solubilidade de 1,2 mg/mL em água.

Exemplo 3e Preparação da forma gama do sal de bromidrato do composto I A 1 g de bromidrato de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina, como preparado no exemplo 4a, foram adicionados 20 mL de água e foram aquecidos a 85 °C. A solução estava claramente limpida. A adição de 1 gota de HBr tornou-a límpida. Foi adicionado HBr até ser observado o ponto de névoa. A solução foi arrefecida para a temperatura ambiente e seco. A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 56,63% C, 7,18% N, 6,21% H (Teórica para o sal 1:1: 56,99% C, 7,39% N, 6,11% H)

Exemplo 3f Caracterização da forma gama do bromidrato do composto I O bromidrato, como preparado no exemplo 3e, é cristalino (XRPD) - ver Figura 4. A curva DSC apresenta alguns acontecimentos térmicos a cerca de 100 °C; provavelmente altera na forma de cristal. Depois funde-se a cerca de 220 °C. Absorve cerca de 4,5% de água quando exposto a humidade relativa elevada e a 30% HR, à temperatura ambiente, são absorvidos cerca de 2% de água. 24

Exemplo 3g Preparação do hidrato de bromidrato do composto I A 1,4 gramas do óleo de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina foram adicionados 20 mL de água e aquecido para 60 °C. O pH foi ajustado para 1 utilizando 48% HBr. A solução foi arrefecida para a temperatura ambiente e seca. A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 55,21% C, 7,16% N, 6,34% H (Teórica para o sal hemi-hidrato 1:1: 55,68% C, 7,21% N, 6,23% H)

Exemplo 3h Caracterização do hemi-hidrato do bromidrato do

composto I O hidrato, como preparado no exemplo 3g, é cristalino (XRPD) - ver figura 5. O teor de água depende muito da humidade relativa. À temperatura ambiente e 95% HR o teor de água é de cerca de 3,7%. A desidratação ocorre por aquecimento a cerca de 100 °C.

Exemplo 3i Preparação do solvato de acetato de etilo do sal de bromidrato do composto I

Foram dissolvidas 0,9 gramas do óleo de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em 35 mL de acetato de etilo e adicionados 0,5 mL de HBr (aq) a 48% em peso. Esta adição provocou a formação de uma pasta espessa que foi agitada de um dia para o outro, à temperatura ambiente. A filtração e lavagem com 30 mL de éter dietilico, seguidas por 25 secagem a vácuo (50 °C), de um dia para o outro, produziram

1,0 gramas do solvato de EtOAc de HBr de 1-[2-(2, 4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina (65%). A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 56,19% C, 6,60% N, 6,56% H (Teórica para o sal 1:1 quando corrigida para 8% de Acetato de etilo e 0,5% de água como determinado por tga e KF: 56,51% C, 6,76% N, 6,38% H)

Exemplo 3j Caracterização do solvato de acetato de etilo do bromidrato do composto I O solvato de acetato de etilo, como preparado no exemplo 3i, é cristalino (XRPD) - ver Figura 6. O lote contém uma mistura do solvato e da forma alfa do composto 1, provavelmente devido à secagem que provocou desolvação parcial. A desolvatação começa a ~75 °C quando aquecida 10°/min. Após desolvatação forma-se uma forma alfa. Se exposto a humidade relativa elevada, o acetato de etilo é substituído por água, que é libertado quando a humidade é subsequentemente diminuída. O sólido resultante é higroscópio e absorve 3,2% de água a humidade relativa elevada.

Exemplo 4a Preparação de sal de cloridrato do composto I

Foi dissolvida 1,0 grama do óleo de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em 20 mL de acetato de etilo utilizando aquecimento ligeiro (30 °C) . Quando é obtida uma solução límpida, é adicionada, lentamente, uma solução de HC1 2 M em éter dietílico, até ser obtido um pH de aproximadamente 1-2. Durante a adição foi observada a precipitação espontânea. Após a adição final a suspensão foi 26 agitada durante 1 hora, antes do precipitado branco ser isolado por filtração e seco sob vácuo (40 °C), de um dia para o outro. Foram isoladas 1,1 grama (99%) de cloridrato de 1-[2-(2, 4-dimetilfenilsulfanil)-feniljpiperazina. A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 64,18% C, 8,25% N, 6,96% H (Teórica para o sal 1:1 quando corrigido para 0,66% de água como determinado por TGA: 64,13% C, 8,31% N, 6,95% H)

Exemplo 4b Caracterização do cloridrato do composto I O cloridrato, como preparado no exemplo 4a, é cristalino (XRPD) - ver Figura 7. Tem um ponto de fusão de -236 °C. Absorve cerca de 1,5% de água quando exposto a humidade relativa elevada e tem uma solubilidade de 3 mg/mL em água.

Exemplo 4c Preparação do mono-hidrato de cloridrato do

composto I

Foram dissolvidas 11,9 gramas do óleo de 1-[2-(2, 4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em 100 mL de etanol utilizando aquecimento. Quando foi obtida uma solução homogénea deu-se a adição de 3,5 mL de HC1 (aq) conc. Provocando a precipitação imediata de um sólido branco. A suspensão foi agitada durante 5 minutos, no inicio e, depois, num banho de gelo durante mais uma hora antes da filtração. O sólido branco foi lavado utilizando 100 mL de etanol arrefecido fresco (colocado num congelador a -18 °C durante 2 horas), 50 mL de acetona e, finalmente, 50 mL de éter dietilico antes da secagem a vácuo (50 °C), de um dia para o outro. Foram isoladas 27 5,1 gramas de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina HC1 em (38%). A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 61,23% C, 7,91% N, 7,16% H (Teórica para o mono-hidrato do sal 1:1: 61,26 de %C, 7,94% N, 7,14% H)

Exemplo 4d Caracterização do mono-hidrato de cloridrato do composto I 0 mono-hidrato do cloridrato, como preparado no exemplo 4c, é cristalino (XRPD) - ver Figura 8. Começa a desidratar a cerca de 50 °C. Alguns acontecimentos térmicos, provavelmente rearranjos, ocorrem por aquecimento posterior e funde a cerca de 230 °C, seguido por recristalização e fusão a cerca de 236 °C. Não absorve mais quantidade de água quando exposto a humidade relativa elevada e a água ligada ao hidrato não é libertada até a humidade relativa ter diminuído para menos de 10% HR à temperatura ambiente. Tem uma solubilidade de cerca de 2 mg/mL em água.

Exemplo 5a Preparação de sal de mesilato do composto I

Foi dissolvida 1,0 grama do óleo de 1—[2— (2,4— dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em 20 mL de acetato de etilo por aquecimento (70 °C) . Quando foi obtida uma solução límpida foram adicionadas, lentamente, 0,35 gramas do ácido sulfónico de metano (1,1 eqv.). Após a adição final, a solução foi arrefecida em gelo e foi adicionado, lentamente, éter dietílico, provocando a precipitação do produto. A suspensão foi agitada durante 2 horas em gelo, antes do precipitado branco ser 28 isolado por filtração e seco sob vácuo (40 °C), de um dia para o outro. Foram isoladas 1,1 gramas (85%) de mesilato de 1-[ 2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina. A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 57,81% C, 6,81% N, 6,68% H (Teórica para o sal 1:1: 57,81% C, 7,10% N, 6,64% H)

Exemplo 5b Caracterização do mesilato do composto I O mesilato, como preparado no exemplo 5a, é cristalino (XRPD) - ver Figura 9. Tem um ponto de fusão de ~163 °C. É higroscópico (absorve cerca de 8% de água quando exposto a uma humidade relativa de 80% e é, deste modo, transformado numa forma hidratada. Os últimos 6% da água absorvida não são libertados até a humidade relativa ser inferior a 10% HR. Tem uma solubilidade muito elevada em água (>45 mg/m).

Exemplo 6a Preparação do fumarato do composto I

Foram aquecidas 5,5 gramas do óleo de 1-[2-(2, 4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina até refluxo numa mistura de 50 mL de metanol e 50 mL de acetato de etilo. A solução foi deixada a arrefecer ligeiramente antes de ter ocorrido a adição de 2,1 gramas de ácido fumárico provocando uma reacção exotérmica e precipitação de um sólido branco. A suspensão foi agitada enquanto estava a arrefecer para a temperatura ambiente, seguida por 2 horas num congelador a -18 °C. O sólido branco foi recolhido por filtração e lavado com 20 mL de acetato de etilo frio antes da secagem a vácuo (50 °C), de um dia para o outro. Foram isoladas 3,1 gramas (44%) de produto. 29 A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 63,42% C, 6,64% N, 6,42% H (Teórica para o sal 1:1: 63, 74% C, 6,76% N, 6,32% H)

Exemplo 6b Caracterização do fumarato do composto I 0 fumarato, como preparado no exemplo 6a, é cristalino (XRPD) - ver Figura 10. Tem um ponto de fusão de -194 °C. A solubilidade em água é de 0,4 mg/mL.

Exemplo 7a Preparação do maleato do composto I

Foram dissolvidas 2,5 gramas do óleo de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em 50 mL de acetato de etilo e aquecidas para 60 °C seguido pela adição de 1,1 gramas de ácido maleico. A mistura foi aquecida de novo até refluxo, durante 5 minutos, e deixada a arrefecer para a temperatura ambiente enquanto se agitava. Durante o arrefecimento, a precipitação começou e foi terminada no período de 4 horas num congelador (-18 °C). O sólido branco foi recolhido por filtração e lavado com 50 mL de éter dietílico antes da secagem a vácuo (50 °C), de um dia para outro. Isto produziu 1,3 gramas de Maleato de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina (38%) que foram recristalizadas por tratamento com 40 mL de acetato de etilo e 5 mL de metanol, a refluxo. A solução límpida foi arrefecida para a temperatura ambiente seguida por 2 horas no congelador (-18 °C), antes de filtrar e lavar duas vezes com 10 mL de acetato de etilo frio, seguido por secagem em vácuo (50 °C) durante dois dias. Foram isoladas 0,9 gramas (69%) de Maleato de 30

RMN

1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina. A corresponde à estrutura. Análise elementar: 63,57% C, 6,79% N, 6,39% H (Teórica para um sal 1:1: 63,74 de %C, 6,76% N, 6,32 de %H)

Exemplo 7b Caracterização do maleato do composto I 0 maleato, como preparado no exemplo 7a, é cristalino (XRPD) ver Figura 11. Tem um ponto de fusão de -152 °C. A solubilidade em água é -1 mg/mL.

Exemplo 8a Preparação de meso-tartarato do composto I

Foram tratados 11,1 mL de uma solução de 0,30 M de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em acetona com 0,5 gramas de ácido meso-tartárico em 5 mL de acetona. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, período durante o qual ocorreu a precipitação. A filtração e lavagem inicialmente com 5 mL de acetona e, depois, 3 mL de éter dietílico, produziram o produto como um sólido branco que foi seco sob vácuo (50 °C), de um dia para o outro. Foram isoladas 1,4 gramas do ácido meso-tartárico de 1-[2-(2, 4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina (93%). A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 58,58% C, 6,29% N, 6,40% H (Teórica para um sal 1:1: 58,91% C, 6,25% N, 6,29% H) 31

Exemplo 8b Caracterização do meso-tartarato do composto I 0 meso-tartarato, como preparado no exemplo 8a, é cristalino (XRPD) - ver Figura 12. Tem um ponto de fusão de ~ 164 °C. A solubilidade em água é de ~0,7 mg/mL.

Exemplo 9a Preparação de L-(+)-tartarato do composto I

Foram tratados 11,1 mL de uma solução 0,30 M de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em acetona com 0,5 gramas de ácido L-( + )-tartárico dissolvidas em 5 mL de

acetona. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, periodo durante o qual ocorre a precipitação. A filtração e lavagem, inicialmente com 5 mL de acetona e depois com 3 mL de éter dietilico, proporcionaram o produto como um sólido branco que foi seco sob vácuo (50 °C), de um dia para o outro. Foram isoladas 1,2 gramas (81%) do ácido (+)-tartárico de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-feniljpiperazina. A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 58,86% C, 6,30% N, 6,38% H (Teórica para um sal 1:1: 58,91% C, 6,25% N, 6,29% H)

Exemplo 9b Caracterização do L-(+)-tartarato do composto I O L-(+)-tartarato, como preparado no exemplo 9a, é cristalino (XRPD) - ver Figura 13. Tem um ponto de fusão de -171 °C. A solubilidade em água é -0,4 mg/mL. 32

Exemplo 10a Preparação de D-(-)-tartarato do composto I

Foram tratadas 11,1 mL de uma solução 0,30 M de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em acetona com 0,5 gramas de ácido D-(-)-tartárico dissolvidas em 5 mL de acetona. A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, durante os quais ocorreu a precipitação. A filtração e lavagem, inicialmente com 5 mL de acetona e depois 3 mL de éter dietilico, produziram o produto como um sólido branco que foi seco sob vácuo (50 °C), de um dia para o outro. Foi isolado 1,0 grama (68%) do ácido D-(-)-tartárico de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina. A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 58,90% C, 6,26% N, 6,35% H (Teórica para um sal 1:1: 58,91% C, 6,25% N, 6,29% H)

Exemplo 10b Caracterização do D-(-)-tartarato do composto I O D-(+)-tartarato, como preparado no exemplo 10a, é cristalino (XRPD) - ver Figura 14. Tem um ponto de fusão de -175 °C. A solubilidade em água é -0,4 mg/mL.

Exemplo 11a Preparação de sulfato do composto I

Foram tratados 11,1 mL de uma solução 0,30 M de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em acetona com 2,2 mL de uma solução de H2S04 3 M (aq). A mistura foi agitada à temperatura ambiente, durante 30 minutos e, depois, num banho gelado durante mais 4 horas antes de ocorrer a precipitação, e foi finalizada. A filtração e lavagem, inicialmente com 5 mL de acetona e, depois, 3 mL de éter dietilico, produziram o produto 33 como um sólido branco que foi seco sob vácuo (50 °C), de um dia para o outro. Foram isoladas 0,51 gramas do sulfato de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina (39%). A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 54,53% C, 7,22% N, 6,28% H (Teórica para um sal 1:1: 54,52% C, 7,07% N, 6,10% H)

Exemplo 11b Caracterização do sulfato do composto I

O sulfato, como preparado no exemplo 11a, é cristalino (XRPD) - ver Figura 15. Tem um ponto de fusão de ~166 °C. A solubilidade em água é ~0,1 mg/mL.

Exemplo 12a Preparação do fosfato do composto I

Foram tratados 11,1 mL de uma solução 0,30 M de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em acetona com 0,2 mL de H3PO4 a 65% (aq). A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, durante os quais ocorreu a precipitação. A filtração e lavagem, inicialmente com 5 mL de acetona e depois com 3 mL de éter dietílico, produziram 0 produto como um sólido branco que foi seco sob vácuo (50 °C), de um dia para o outro. Foram isoladas 1,23 gramas (94%) de 1-[2-(2, 4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina. A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 54,21% C, 7,15% N, 6,43% H (Teórica para um sal 1:1: 54,53% C, 7,07% N, 6,36% H) 34

Exemplo 12b Caracterização do fosfato do composto I 0 fosfato, como preparado no exemplo 12a, é cristalino (XRPD) ver Figura 16. Tem um ponto de fusão de ~224°C. A solubilidade em água é ~1 mg/mL.

Exemplo 13a Preparação de nitrato do composto I

Foram tratados 11,1 mL de uma solução 0,30 M de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-fenil]piperazina em acetona com 0,2 mL de HN03 16,5 M (aq). A mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, durante os quais ocorreu a precipitação. A filtração e lavagem, inicialmente com 5 mL de acetona e, depois, com 3 mL de éter dietilico, produziram o produto como um sólido branco que foi seco sob vácuo (50 °C), de um dia para o outro. Foram isoladas 0,87 gramas (73%) de nitrato de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)-feniljpiperazina. A RMN corresponde à estrutura. Análise elementar: 59,80% C, 11,67% N, 6,51% H (Teórica para um sal 1:1: 59,81% C, 11,63% N, 6,41% H)

Exemplo 13b Caracterização do nitrato do composto I O nitrato, como preparado no exemplo 13a, é cristalino (XRPD) - ver Figura 17. Não se funde mas decompõem-se sob uma reacção exotérmica a cerca de 160 °C. A solubilidade em água é ~0,8 mg/mL. 35

Exemplo 14 Efeitos de dor no teste da formalina intradérmica em murganho

Neste modelo, os murganhos receberam uma injecção de formalina (4,5%, 20 pL) na pata traseira esquerda. A irritação provocada pelas injecções de formalina induziram uma resposta comportamental bifásica caracteristica, como quantificado pela quantidade de tempo dispendido a lamber a pata lesionada. A primeira fase (-0-10 minutos) representa a irritação quimica directa e nocicepção, enquanto a segunda (-20-30 minutos), pensa-se que represente a dor de origem neuropática. As duas fases são separadas por um periodo aquiescente no qual o comportamento regressa ao normal. A eficácia dos compostos de teste para reduzirem o estimulo doloroso é avaliada pela contagem da quantidade de tempo gasto a lamber a pata lesionada nas duas fases. O composto I mostrou uma redução significativa nas avaliações de dor de segunda fase (Figura 18b), indicando eficácia contra a dor de origem neuropática. Além disso, os compostos da presente invenção mostraram uma redução significativa nas avaliações de primeira fase (Figura 18a), indicando uma acção mais analgésica à dose mais elevada. Em suma, estes resultados indicam que os compostos da presente invenção são, provavelmente, eficazes no tratamento de distúrbios de dor. 36

Exemplo 15 Efeitos nos níveis extracelulares de acetilcolina no cérebro de ratos que se movem livremente - apenas para referência Métodos

Foi administrado o sal de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)fenil]piparazina HBr aos animais.

Animais

Foram utilizados ratos Sprague-Dawley machos, pesando inicialmente 275-300 g. Os animais foram colocados em gaiolas sob um ciclo de luz/escuro de 12 h sob condições controladas, para temperatura interna regular (21 ± 2 °C) e humidade (55 ± 5%), com comida e água da torneira disponível ad libitum.

Experiências de cirurgia e microdiálise

Os ratos foram anestesiados com hipnorm/dormicum (2 mL/kg) e foram implantadas estereotaxicamente cânulas guias intracerebrais (CMA/ 12) no cérebro, de modo a posicionar a ponta da sonda de diálise no hipocampo ventral (coordenadas: 5,6 mm posterior a bregma, lateral -5,0 mm, 7,0 mm ventral a dura) ou no cortéx préfrontal (coordenadas: 3,2 mm anterior a bregma; lateral, 0,8 mm; 4,0 mm ventral a dura). Foram utilizados parafusos de âncora e cimento acrílico para fixação das cânulas guias. A temperatura corporal dos animais foi monitorizada por sonda rectal e mantida a 37 °C. Os ratos foram deixados a recuperar da cirurgia durante 2 dias, colocados em 37 gaiolas individuais. No dia da experiência, foi inserida uma sonda de microdiálise (CMA/12, 0,5 mm de diâmetro, 3 mm de comprimento), através da cânula guia.

As sondas foram ligadas via um canal duplo de rotação a uma bomba de microinjecção. A perfusão da sonda de microdiálise com solução de Ringer filtrada (NaCl 145 mm, KC1 3 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1,2 mM contendo neostigmina 0,5 μΜ) foi iniciada brevemente antes da inserção da sonda no cérebro e continuada durante a experiência, a um fluxo constante de 1 pL/min. Após 180 min de estabilização, as experiências foram iniciadas. Os dialisados foram recolhidos a cada 20 min. Após as experiências, os animais foram sacrificados, os seus cérebros removidos, congelados e cortados em fatias finas para verificação da colocação da sonda. 0 composto dissolvido em HPbetaCD a 10% e injectado subcutaneamente (2,5 - 10 mg/kg). As doses foram expressas como mg de sal/kg de peso corporal. O composto foi administrado num volume de 2,5 mL/kg.

Análise da acetilcolina no dialisado A concentração da acetilcolina (ACh) nos dialisados foi analisada através de HPLC com detecção electroquimica utilizando uma fase móvel consistindo de hidrogenofosfato de disódio 100 mM, ácido sulfónico octano 2,0 mM, cloreto de tetrametil-amónio 0,5 mM e 0, 005% de MB (ESA), pH 8,0. Um reactor de enzima pré-coluna (ESA) contendo a oxidase de colina imobilizada eliminou a colina da amostra injectada (10 pL) antes da separação de ACh na coluna analítica (ESA ACH-250); fluxo de 0,35 mL/min, temperatura: 35 °C. Após a coluna analítica, a 38 amostra passou através de um reactor de fase sólida pós-coluna (ESA) contendo acetilcolineesterase imobilizada e colina oxidase. Este último reactor converteu a ACh em colina e, subsequentemente, a colina em betaina e H202. Esta última foi detectada electroquimicamente utilizando um eléctrodo de platina (Célula analitica: ESA, modelo 5040).

Apresentação de dados

Em experiências de injecção única, o volume médio de 3 amostras de ACh consecutivas imediatamente após a administração do composto, serviram como o nível basal para cada experiência e os dados foram convertidos em percentagem do basal (valores de pré-injecção basal média normalizada para 100%) .

Resultados O composto aumentou significativamente os níveis extracelulares de ACh no cortéx pré-frontal do rato e o hipocampo ventral - ver figura 19a e 19b.

Exemplo 16 Condicionamento do medo contextuai em ratos -apenas para referência O composto administrado nas presentes experiências foi o sal de 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)fenil]piperazina HBr.

Foi estudado o efeito do composto na aquisição, consolidação e memória do condicionamento do medo contextuai em ratos. No 39 paradigma do condicionamento pelo medo, os animais aprenderam a associar um ambiente neutro (contexto, a câmara de treino, CS) com uma experiência dolorosa (um choque eléctrico na pata, US) . Durante a reexposição à câmara de treino, os animais expressaram um comportamento de bloqueio, que é considerado como uma medida directa da memória relacionada com o medo [Pavlov j. Biol. Sei., 15, 177-182, 1980] . A neuroanatomia do condicionamento pelo medo contextuai tem sido investigada exaustivamente e vários estudos demonstraram que o hipocampo e amígdala são necessários para a formação desta memória [Hippocampus, 11, 8-17, 2001; J Neurosci., 19, 1106-1114, 1999; Behav. Neurosci., 106, 274-285, 1992] .

Animais e fármacos

Foram utilizados ratos Sprague-Dawley machos adultos (pesando 250-300 g na altura do treino) dos Laboratórios Charles River, colocados dois por cada gaiola sob um ciclo de luz/escuro de 12 h. A comida e bebida foram disponibilizados ad libitum. Os ratos foram utilizados 1 semana após a chegada. O composto foi dissolvido em HPbetaCD a 10% e injectados subcutaneamente. O fármaco foi administrado num volume de 2,5 mL/kg.

Dispositivos O treino e testes foram efectuados numa câmara à prova de som (30 x 20 x 40 cm), colocada numa sala isolada e ligada a um sistema de ventilação. A iluminação foi proporcionada por uma luz branca (60 Watt). O soalho da câmara consistia numa grelha metálica ligada a um gerador de choques eléctricos. Antes do 40 treino e testes, a câmara foi limpa com uma solução de etanol a 70%. Uma câmara de video permitiu observações comportamentais e registo da sessão de treinos para análise off-line.

Teste de aquisição e retenção

Durante a aquisição, os animais foram deixados a explorar livremente o novo ambiente, durante um período de habituação de 1 min, que co-terminou com um choque na pata inevitável (estímulo incondicional, US) através de um chão em grelha electrifiçado. O choque na pata teve uma duração de 2 s e uma intensidade de 0,75 mA. Os animais permaneceram na câmara de condicionamento durante mais 60 s após o US. O comportamento de bloqueio foi avaliado durante os primeiros 58 s (aquisição do pré-choque; experiência com ocultação a grupos) para determinar as repostas de bloqueio de linha de base ao contexto. No final da aquisição, os animais foram cuidadosamente removidos e

colocados nas suas gaiolas. Após 24 h, os mesmos animais foram reintroduzidos no contexto de treino (câmara de condicionamento do medo) e foi efectuado um teste de retenção de 2 min. Durante este período não foram aplicados choques na pata. O comportamento de bloqueio foi avaliado durante todo o período de teste com experiência com ocultação a grupos e apresentado como percentagem do total.

Resultados e Discussão

Efeito do composto na cognição do medo contextualizado em ratos 41 0 efeito do composto no condicionamento do medo contextuai em ratos foi estudado (i) na aquisição (fármaco aplicado antes da aquisição, Figura 20), (ii) na memória (fármaco aplicado antes do teste, Figura 21) e (iii) na consolidação (fármaco aplicado imediatamente após a aquisição, Figura 22) . No primeiro grupo de experiências, o composto (1, 5 e 10 mg/kg) foi administrado 1 h antes da sessão de aquisição. A Figura 20 representa a aquisição do comportamento de bloqueio durante o treino (58 s antes do choque na pata) e o teste de retenção 24 após. Foram observadas as seguintes situações: - O composto não afecta o comportamento de bloqueio de linha de base antes da apresentação do choque na pata, a qualquer dose testada. O composto a 5 mg/kg tem uma tendência para aumentar o tempo dispendido bloqueado, durante o teste de retenção, 24 h após a aquisição (39,24 ± 13,76%, n= 6, versus 24,30 ± 4,40%, n= 16, nos animais tratados com veiculo) . O composto a 10 mg/kg aumentou significativamente o tempo gasto bloqueado durante o teste de retenção, 24 h após a aquisição (52,15 ± 5,68%, n= 10, versus 24,30 ± 4,40%, n= 16, nos animais tratados com veiculo, p<0,01) . O modelo de condicionamento pelo medo, como descrito na Figura 20, é um processo convencional descrito na literatura para a investigação da aprendizagem e memória. De modo a elucidar também os efeitos agudos deste fármaco na memória, o 42 composto (5, 10 e 20 mg/kg) foi aplicado 1 h antes do teste de retenção. Foi observado que o o composto inibe a expressão do comportamento de bloqueio a 5 mg/kg, durante o teste de memória (12,86 ± 3,57%, n= 9, versus 33,61 ± 4,29%, n= 13, nos animais tratados com veiculo, p< 0,05) (Figura 21).

Como descrito acima, o composto por si só não afecta o comportamento de bloqueio de linha de base antes do inicio do US (Figura 20), assim, a hipótese mais plausível é a observada na Figura 21 ser devido a um efeito ansiolítico. A memória condicionada é avaliada via comportamento de bloqueio, uma resposta que é reduzida por compostos com efeitos ansiolíticos potenciais. Esta experiência demonstra que o composto administrado, de modo agudo, antes da memória, tem uma eficácia ansiolítica, é por isso pouco provável que o aumento do bloqueio apresentado na Figura 20 seja devido a um efeito ansiogénico do composto.

De modo a fortalecer a hipótese que o composto não é ansiogénico mas tem um potencial pro-cognitivo, o composto foi administrado a 5, 10 e 20 mg/kg após a sessão de aquisição. Consequentemente, neste conjunto de experiências, o composto não foi administrado nem durante a aquisição nem através do teste de retenção. Aqui, foi observado que o composto a 5 mg/kg, aumenta significativamente o tempo dispendido no bloqueio durante o teste de retenção, 24 h após a sessão de aquisição (45,58 ± 4,50%, n= 8, versus 25,26 ± 3,57%, n= 19, nos animais tratados com veículo, p< 0,05) . A percentagem de tempo dispendido no bloqueio durante o contexto de reexposição foi descrito como uma medida da memória relacionada com o medo [Pavlov J. Biol. Sei, 15, 177-182, 1980], que é potenciada nos ratos tratados com composto quando comparados com animais 43 tratados com veículo (Figura 20 e 21). Considerados em conjunto, os dados mostram que os compostos potenciam a memória contextuai.

Exemplo 17 Efeito do composto I no modelo de lesão do nervo de constrição crónica O composto I foi avaliado no modelo de lesão de constrição crónica [Pain, 33, 87-107, 1988] . Este modelo de dor neuropática envolve a aplicação de quatro voltas soltas à volta de um nervo ciático do rato durante um período de tempo para desenvolver a hiperalgesia e alodinia. O efeito dos compostos de teste neste teste é medido como o tempo para retirar a pata após um estímulo térmico. O composto I (sal de HBr) a 7,9 mg/kg s.c. 60 minutos) produziu uma latência de retirada significativa e dependente da dose após o estímulo térmico. Estes dados (ver figura 26) demonstraram que o composto I tem um efeito do tipo analgésico.

Lisboa, 26 de Janeiro de 2011 44

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. 1-[2-(2,4-dimetilfenilsulfanil)fenil]piperazina

   E seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis (composto I), para utilização num método para o tratamento da dor.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o composto I é o sal de adição do ácido de HBr
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 2, em que o referido sal de adição de HBr é cristalino com reflexões xrpd a 6,89, 9,73, 13,78 e 14,64 (°2Θ).
4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 3, em que o referido sal de adição de ácido de HBr tem um XRPD como apresentado na figura 3.
5. 5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o referido composto é para ser administrado em doses diárias de cerca de 1-20 mg. Lisboa, 26 de Janeiro de 2011 1 1/26 Difractograma de Raio X de pós da base cristalina livre Intensidade (contagens)

   Fig. 1 2/26 Difractograma de Raio X de pós da forma alfa do bromidrato Intensidade (contagens)

   Fig. 2 3/26 Difractograma de Raio X de pós da forma beta do bromidrato Intensidade (contagens)

   Fig 3 4/26 Difractograma de Raio X de pós da forma gama do bromidrato Intensidade (contagens)

   Fig. 4 5/26 Difractograma de Raio X de pós do hemi-hidrato de bromidrato Intensidade (contagens)

   Fig. 5 6/26 Difractograma de Raio X de pós de uma mistura do solvato de acetato de etilo e a forma alfa do bromidrato Intensidade (contagens)

   Fig.
6. 6 7/26 Difractograma de Raio X de pós do sal de cloridrato Intensidade (contagens)

   Fig.
7. 7 8/26 Difractograma de Raio X de pós do mono-hidrato de cloridrato Intensidade (contagens)

   Fig.
8. 8 9/26 Difractograma de Raio X de pós do mesilato Intensidade (contagens)

   Fig.
9. 9 10/26 Difractograma de Raio X de pós do fumarato Intensidade (contagens)

   Fig. 10 11/26 Difractograma de Raio X de pós do maleato Intensidade (contagens)

   Fig. 11 12/26 Difractograma de Raio X de pós do meso-tartarato Intensidade (contagens)

   Fig. 12 13/26 Difractograma de Raio X de pós do L-(+)-tartarato Intensidade (contagens)

   Fig. 13 14/26 Difractograma de Raio X de pós do D-(+)-tartarato Intensidade (contagens)

   Fig. 14 15/26 Difractograma de Raio X de pós do sulfato Intensidade (contagens)

   Fig. 15 16/26 Difractograma de Raio X de pós do fosfato Intensidade (contagens)

   Fig. 16 17/26 Difractograma de Raio X de pós do sal de nitrato Intensidade (contagens)

   Fig. 17 Lambidelas na pata (s) Lambidelas na pata (s) <=t8T *£>-p.a

   μ co \ K) G) 19/26 Ach no córtex pré-frontal de ratos em movimentação livre

   50 -¾ Ach no dialisado 0 -100 -50 0 50 100 150 200 mg/kg Fig. 19a Ach no hipocampo ventral de ratos em movimentação livre

   mg/ kg Fig. 19b 60-1 ο a s a) -P ω Ό 40- I teste l-1 aquisição o\° o H 0 2 01 0 1 -1 m 20- 0-·

   T Veiculo 1 20/26 ** T 5 10 (mg/kg) Fig. 20 6(H 21/26 Bloqueio (% de tempo) 40- f-------^aquisição * 20- 0J Veículo I

   n=l!)

   10 20 mg/kg Fig. 21 60 oa! 4°- Q) o\° O H Q)σ 0 1 -1 ffl 20- 0-1 ^Hteste I jaquisição

   Veículo *T 11=9 5 22/26 ii=I3
10. 10 20 mg/kg Fig. 22 23/26 Ham-D Insónia Precoce

    Semanas Fig. 23 24/26 Ham-D Insónia Moderada

    Semana Fig. 24 25/26 Ham-D Insónia Tardia

    Placebo

    Fig. 25 26/26 15· Limiar da retirada (s) vlvWXy!

    Is V.'.W.V.·. xtíxtí: ViWAWi VAWAVi 19

    «wk*; XíWíwi

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