PT2094119E

PT2094119E - Polímeros de impressão molecular seletivos para nitrosaminas específicas para tabaco e métodos para uso dos mesmos

Info

Publication number: PT2094119E
Application number: PT07847322T
Authority: PT
Inventors: Rees Anthony; Billing Johan; Yilmaz Ecevit
Original assignee: British American Tobacco Investments Ltd
Priority date: 2006-12-07
Filing date: 2007-11-26
Publication date: 2016-06-03
Also published as: US20130139835A1; RU2504307C2; BRPI0720149B8; US9169341B2; US20140155555A1; KR20090098861A; US8733369B2; WO2008068153A2; MX2009005999A; RU2009125621A; ZA200903459B; UA98477C2; CN101547617B; JP2010511395A; PL2094119T3; AU2007329060B2; CN101547617A; JP5313913B2; MX289922B; US20150038648A1

Description

DESCRIÇÃO

"POLÍMEROS DE IMPRESSÃO MOLECULAR SELETIVOS PARA NITROSAMINAS ESPECÍFICAS PARA TABACO E MÉTODOS PARA USO DOS MESMOS" Âmbito da Invenção

Geralmente, a presente invenção relaciona-se com polímeros de impressão molecular e uso dos polímeros em bio análise e separação de metabolitos de nicotina. Mais especificamente, a invenção relaciona-se com polímeros de impressão molecular com especificidade para nitrosaminas específicas de tabaco e inclui métodos de uso dos polímeros para tratar tabaco, substituintes de tabaco, e seus derivados para reduzir o nível de compostos alvo nela contidos.

Antecedentes da invenção

Nos campos das ciências médicas, das dietas, ambientais e químicas há uma necessidade crescente da separação seletiva de substâncias específicas a partir de misturas complexas de substâncias relacionadas. 0 objetivo pode ser a extração quantitativa de um determinado composto ou compostos, a medida da sua concentração ou a remoção seletiva de um composto alvo a partir de uma mistura multicomponentes.

Controlos de saúde mais rigorosos aumentaram a procura de métodos que permitem a quantificação sensível e seletiva de produtos e metabolitos perigosos de certas substâncias de uso generalizado todos os dias. De particular interesse são compostos químicos relacionados para uso de produtos à base de tabaco, os quais compostos ou estão presentes originalmente na própria folha de tabaco em rama ou são gerados durante o processo de fumar. Compostos contendo nitroso, tais como nitrosaminas, são considerados como sendo de especial importância neste contexto.

Com o objetivo de reduzir a ocorrência de perigos relacionados com o tabagismo, têm sido produzidos certos produtos farmacêuticos contendo somente a substância neuroativa, nicotina, o químico reivindicado como sendo responsável pelos aspetos de dependência de material fumável.

Entre as formulações de nicotina para a terapia de cessação do tabagismo, a goma de mascar de nicotina tem encontrado um uso mais generalizado. 0 controlo de qualidade exigido durante a produção inclui a monitorização dos níveis de nicotina assim como a monitorização dos produtos de oxidação primária da nicotina cotinina, miosmina, nicotina-cis-N-óxido, nicotina-trans-N-óxido e beta-nicotirina. A quantificação de nornicotina, anatabina e anabasina é também desejável, se não exigida. Métodos e materiais melhorados para essa monitorização e quantificação são necessários na técnica. 0 uso de tais substitutos de cigarros pode provocar metabolitos de nicotina nitrosamina que são produzidos in vivo por processos metabólicos naturais durante a permanência da nicotina nos tecidos corporais. Os níveis desses metabolitos permanecem abaixo das concentrações às quais os procedimentos mais analíticos podem ser realizados quantitativamente. Assim, adicionalmente aos métodos e materiais para uso durante o fabrico de produtos, permanece uma necessidade de melhorar as vias para monitorizar os baixos níveis de metabolitos de nicotina in vivo.

Juntamente com as necessidades sentidas relativamente a novos produtos, os produtos de tabaco tradicionais também necessitam de métodos e materiais para quantificar, reduzir ou remover componentes de tabaco ou do fumo do tabaco. Tais componentes incluem nitrosaminas especificas de tabaco (TSNAs) e seus precursores alcaloides: 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona ("NNK"), 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)butanal ("NNA"), N-nitrosonornicotina ("NNN"), N-nitrosoanabasina ("NAB"), N-nitrosoanatabina ("NAT"), 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanol ("NNAL"), 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)-1-butanol ("iso-NNAL"), e ácido 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)butanóico ("iso-NNAC").

Para quantificar adequadamente a quantidade desses compostos presentes em fluidos biológicos humanos, estão a ser desenvolvidos métodos para analisar os alcaloides, especialmente os produtos de decomposição nitrosilados e metabolitos em tabaco. Os métodos existentes de separação ou extração cromatográficas usados para esta análise falta-lhes robustez, sensibilidade e velocidade requeridos com vista a manusear o grande número de amostras geradas quando se rastreia a população em geral. Com os métodos existentes, a baixa concentração de nitrosaminas, tipicamente presente em picogramas por mililitro, exige a preparação das amostras extensivas com extrações multi-passos e derivatização frequentemente química (por exemplo deuterização antes da espetrometria de massa) do analito em análise. Uma razão para esta complexidade é que os materiais de separação existentes são não seletivos dado que, por exemplo, um anticorpo ou recetor biológico deve sê-lo para os metabolitos em questão, mas assentam nas propriedades físico-químicas como carga ou hidrofobicidade dos metabolitos do ambiente de separação. Estas propriedades fisico-químicas podem ser partilhadas por muitas outras moléculas irrelevantes na amostra. Um método rápido e simples para a análise de TSNAs é, portanto, uma necessidade analítica médica significativa.

Ao longo dos últimos anos conhecem-se numerosos relatos de reconhecimento seletivo as pequenas moléculas com materiais preparados por impressão molecular (polímeros de impressão molecular ou MIPs). Os MIPs são polímeros com sítios reativos adaptados para se ligarem seletivamente a compostos alvo. Materiais impressos molecularmente preparados de modo não covalente foram usados para reconhecimento quiral de uma diversidade de pequenas moléculas incluindo fármacos terapêuticos, açúcares, bases nucleótidos, e pesticidas assim como esteróides e hormonas peptídicas. A alta afinidade e seletividade para o analito alvo exibida por alguns dos materiais impressos justificaram uma comparação com as correspondentes fases de imuno-afinidade (IA) . Porém, em contraste às fases posteriores, os materiais MIP são de preparação direta, estáveis na maioria dos meios e reutilizáveis durante longos períodos de tempo. As aplicações dos materiais MIP em cromatografia, separação (contínua ou por lotes), sensorialmente químico ou em ensaios específicos, estão, portanto, a ser investigados.

Outra aplicação é a extração por fase sólida (SPE) dos analitos presentes em baixas concentrações em amostras biológicas, ou em matrizes complexas. A SPE pode conduzir a enriquecimento seletivo e limpeza de uma substância a níveis não atingíveis com os métodos existentes. As extrações de fase sólida impressas molecularmente (MISPE) foram usadas em bioanálise, análise de alimentos e análises ambientais. Nesses exemplos é obtido o enriquecimento e limpeza seletivos do analito resultando em exatidão mais elevada e um abaixamento do limite de deteção (LOD) na subsequente quantificação cromatográfica (por exemplo HPLC) ou de espetrometria de massa.

Atendendo à sua alta seletividade combinada com boa afinidade para a molécula alvo ou um grupo de moléculas alvos, os MIPs têm atraído um interesse considerável proveniente da indústria alimentar como uma ferramenta para melhorar a qualidade alimentar. Isto requere o uso de um MIP para remoção seletiva de componentes indesejáveis da matriz alimentar. Uma vez que esses componentes estão frequentemente presentes em baixas concentrações, a capacidade de saturação dos MIP é tipicamente um fator não limitativo.

De acordo com a WO 05/112670, a qual é especificamente incorporada aqui como referência, pode ser preferido ter material MIP capaz de absorver seletivamente os mais comuns derivados nitrosilados de nicotina das matrizes complexas tais como urina, dando recuperação quantitativa e desse modo conduzindo a baixos erros na estimativa das concentrações químicas. Os exemplos da WO 05/112670 são limitados a MIPs preparados usando monómeros modelo acídicos ou altamente acídicos tais como ácido metacrílico (MAA), ácido trifluorometacrílico (TFMAA), ácido 4-vinilbenzóico, e ácido 4-vinil benzeno sulfónico. Para além da quantificação é também bem conhecido a tentativa de reduzir os efeitos nocivos do consumo de material contendo tabaco, substituintes de tabaco ou suas misturas reduzindo os níveis de compostos visados. Tais reduções podem ser feitas no próprio material ou num seu derivado tal como um extrato do material. A redução pode ser também efetuada nos produtos de decomposição térmica do material i.e., no fluxo de fumo principal e lateral obtido por combustão, ou os aerossóis produzidos pelo aquecimento do material até uma temperatura abaixo da sua temperatura de combustão. Um método bem conhecido para este tipo de redução consiste em contatar os produtos de decomposição térmica do material com um filtro que adsorve os componentes indesejados da mesma. Um método alternativo envolve a extração do solvente do material, por exemplo como divulgado na especificação da patente E.U.A. 5601097. De acordo com aquela especificação, o conteúdo em proteína do material de tabaco é reduzido pelo tratamento do tabaco com uma solução contendo um tensoativo para extrair polipéptidos, separar a solução, remover o tensoativo e os polipéptidos da solução, e recombinar a solução com o material de tabaco. A especificação da patente internacional WO 01/65954 divulga um processo em que o tabaco é contatado com um fluído de extração supercrítica tal como dióxido de carbono supercrítico para reduzir ou eliminar seletivamente as nitrosaminas.

Estes processos são igualmente aplicáveis tanto ao próprio tabaco como aos substituintes de tabaco, i.e., materiais naturais ou sintéticos com características semelhantes ao tabaco natural que lhes permitem ser consumidos de um modo semelhante ao do tabaco, tanto através de fumo, mastigação, inalação ou de outra forma.

Tem havido uma tentativa para remover nicotina a partir do fumo do tabaco usando MIPs, conforme referido em Liu, Y., et al., Molecularly imprinted Solid-Phase Extraction Sorbent for Removal of Nicotine from Tabaco Smoke, Analytical Letters, Vol. 36, No. 8, pp 1631-1645 (2003) . Os MIP descritos no artigo foram desenhados para ligar a nicotina e não aos metabolitos de nicotina mais tóxicos tais como nitrosaminas. Não é claro se os MIP foram de facto seletivos para a nicotina dado que o método científico que produz os dados tinha falta de elementos chave de verificação de controlo. Como descrito na WO 05/112670, os MIPs seletivos para TSNAs podem ser usados para tratar produtos do tabaco e assim, reduzir os niveis de um ou mais compostos contendo nitroso do produto do tabaco. Esses MIPs encontram uso adicional na análise e quantificação dos TSNAs in vivo, comummente na relação com o consumo dos produtos do tabaco, e na preparação e avaliação dos produtos não tabaco. Portanto apesar dos avanços permanece a necessidade na técnica de novos MIPs e métodos para empregar os mesmos no âmbito da nicotina e metabolitos da nicotina.

Sumário da Invenção A presente invenção atende às necessidades da técnica dado que fornece MIPs únicos que são particularmente seletivos para compostos contendo nitroso.

Os MIPs da invenção podem ser obtidos por copolimerização de um monómero ou monómeros funcionais neutros e um reticulador hidrofóbico na presença de um análogo estrutural de uma nitrosamina, num meio de polimerização contendo um iniciador de radical livre, após o que o modelo é removido do MIP. A invenção inclui o uso de MIPs para extrações analíticas e preparativas, em cromatografia, para pré-tratamento de amostras analíticas, em sensores químicos ou como um filtro de fase sólida para extração de TSNAs a partir de substâncias ou dispositivos contendo nicotina.

De acordo com uma forma de realização, é fornecido um polímero de impressão molecular seletivo para pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco (TSNA), o polímero tendo sido preparado usando materiais compreendendo um TSNA ou um seu análogo estrutural, um monómero funcional neutro, e um reticulador hidrofóbico. 0 análogo estrutural de um TSNA pode ser um análogo de enamina de um TSNA ou um análogo da sulfonamida de um TSNA ou um análogo amida de um TSNA, por exemplo um análogo da formamida de um TSNA. 0 monómero funcional neutro pode ser selecionado do grupo que consiste em 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA), acrilamida, metacrilamida, monoacrilato de glicerol, e monometacrilato de glicerol. 0 reticulador hidrofóbico pode ser selecionado do grupo que consiste em dimetacrilato de etileno glicol (EDMA) , trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM), e divinilbenzeno (DVB). Na forma de realização da invenção, o polímero pode ser seletivo para NNK, NNA, NNN, NAB, NAT, NNAL, iso-NNAL, ou iso-NNAC.

De acordo com uma forma de realização adicional da invenção, é fornecido um artigo de fumo, compreendendo um material de fumo e um polímero de impressão molecular de acordo com a forma de realização descrita acima.

De acordo com uma forma de realização adicional da invenção, um filtro de fumo pode compreender um polímero de impressão molecular de acordo com o acima.

De acordo com uma forma de realização adicional da invenção, um kit pode compreender um polímero de impressão molecular de acordo com o acima e instruções para uso do polímero de impressão molecular para realizar pelo menos a deteção, quantificação, e separação de pelo menos uma das nitrosaminas numa amostra.

De acordo com uma forma de realização adicional da invenção, é fornecido um método para preparar um polímero de impressão molecular seletivo para TSNAs, compreendendo a copolimerização de pelo menos um monómero funcional neutro e pelo menos um reticulador hidrofóbico na presença de pelo menos um análogo estrutural de TSNA num meio de polimerização contendo pelo menos um iniciador de radicais livres para produzir um polímero de impressão molecular ligado a um análogo estrutural TSNA e removendo o análogo estrutural TSNA do polímero de impressão molecular.

De acordo com uma forma de realização adicional da invenção, é fornecido um método para reduzir o nível de pelo menos um TSNA num produto de tabaco, compreendendo tratar o produto de tabaco com um polímero de impressão molecular de acordo com a invenção. 0 produto de tabaco pode ser produzido pela decomposição térmica de um material contendo tabaco, um substituto de tabaco ou uma mistura destes, por exemplo, por aquecimento do material a uma temperatura abaixo da sua temperatura de combustão, por combustão do material, ou por contato de um material contendo tabaco, um substituto de tabaco ou uma mistura destes com um solvente.

De acordo com uma forma de realização adicional da invenção um método de fabrico de um material de tabaco é fornecido, compreendendo os passos de tratar um material contendo tabaco, substituto de tabaco ou uma mistura destes com um solvente para produzir um extrato, contatando o extrato com um polímero de impressão molecular de acordo com a invenção de modo a reduzir o nível destes no extrato, e combinando o extrato tratado com o material de tabaco extraído.

Nesta especificação, "produto de tabaco" significa um material que contém tabaco (incluindo folha de tabaco ou caule de tabaco) , ou um substituto de tabaco, ou uma mistura de tabaco e substituintes de tabaco, e derivados desse material, incluindo extratos do material, fumo produzido pela decomposição térmica do material e aerossóis produzidos por aquecimento do material abaixo da sua temperatura de combustão.

Onde o produto de tabaco é um derivado produzido pela decomposição térmica do material contendo tabaco ou um substituto de tabaco, a decomposição pode ser efetuada por combustão do material, como num cigarro convencional, ou por aquecimento do material a uma temperatura abaixo da sua temperatura de combustão, de acordo com um processo usado em alguns produtos de tabaco alternativos conhecidos com vista a produzir um aerossol que seja inalado pelo consumidor.

Em alternativa, o produto de tabaco pode ser um derivado produzido pelo contato do material contendo tabaco ou um substituto de tabaco com um solvente. Em particular, a invenção fornece um método de fabrico de um material para fumar compreendendo os passos de extração do material fumável com um solvente, tratando o extrato com um MIP seletivo para pelo menos um composto nitroso para reduzir o seu nivel no extrato e combinando o extrato tratado com o material de fumo.

Neste processo, o material fumável pode ser em qualquer forma conveniente, por exemplo tiras, caules, desperdícios, cortes em laminas, caules moídos, ou qualquer combinação destes. 0 solvente pode ser aquoso ou não aquoso, tal como metanol, etanol ou um meio de extração fluído supercrítico, tal como um dióxido de carbono líquido supercrítico. A extração pode ser realizada sob quaisquer condições que favoreçam a extração a partir de tabaco de compostos contendo azoto. A invenção inclui também um artigo de fumo compreendendo tabaco ou substituto de tabaco e um MIP seletivo para a remoção de pelo menos um composto contendo nitroso a partir do produto da decomposição térmica destes. 0 artigo de fumo da invenção pode tomar qualquer forma convencional, por exemplo um cigarro, charuto ou cigarrilha. Em particular o artigo de fumo pode compreender um rolo de material para fumar opcionalmente num invólucro, com ou sem um filtro. 0 invólucro pode ser de papel, folha de tabaco, tabaco reconstituído ou um substituto de tabaco. Alternativamente, quando, por exemplo, o artigo de fumo é entendido para produzir baixas emissões de fumo lateral, ou níveis mais baixos de produtos de pirólise na corrente primária, o invólucro pode ser composto de material inorgânico não combustível tal como um material cerâmico. 0 filtro pode ser de qualquer material adequado, por exemplo acetato de celulose fibroso, polipropileno ou polietileno, ou papel. 0 material de fumo é preferencialmente tabaco, mas pode ser um substituto de tabaco, assim como material de fumo não de tabaco. Exemplos de material de fumo não de tabaco são material vegetal seco e curado, incluindo materiais de frutos, e um material de fumo sintético tal como pode ser produzido a partir de alginatos e uma substância geradora de aerossol tal como glicerol. 0 material de fumo pode também compreender uma mistura de tabaco e material de fumo não de tabaco. Onde o material de fumo compreende tabaco, o tabaco pode ser de qualquer tipo adequado, ou uma mistura destes, incluindo laminas ou caules curados ao ar, curados ao lume, curados ao fumo, ou curados ao sol, e pode ter sido processado usando qualquer processo apropriado. Por exemplo, o tabaco pode ser cortado, moído, expandido ou reconstituído. 0 material de fumo pode também incluir aditivos convencionais, tais como melhoradores, corantes, humectantes (tais como glicerol e propileno glicol), enchedores inertes (tal como giz), e aromatizantes (tais como açúcar, alcaçuz e cacau) . A invenção pode também ser aplicada ao tabaco que é destinado a consumo oral ou nasal por sucção, mastigação, ou ingestão nasal, em vez de fumado. Tais produtos incluem rapé, snus, e tabaco de mascar. 0 MIP pode ser incorporado no material fumável. Em conformidade, a invenção inclui material de fumo contendo um MIP seletivo para a remoção de pelo menos uma nitrosamina especifica de tabaco dos produtos de decomposição térmica do material fumável. Em alternativa, quando o artigo de fumo compreende um rolo de material fumável num invólucro, o MIP pode ser incorporado no invólucro. A invenção inclui, portanto, o material de invólucro para o artigo de fumos compreendendo um polimero de impressão molecular seletivo para a remoção de um componente visado a partir dos produtos de decomposição térmica de um material de fumo. 0 invólucro pode ser um material à base de celulose tal como um papel ou um material à base de tabaco tal como tabaco reconstituído.

Artigos de fumo preferidos da invenção são os cigarros, compreendendo um rolo de tabaco, invólucro, e um filtro incluindo um MIP seletivo para a remoção de pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco dos produtos de decomposição térmica de um material fumável. A invenção inclui também um filtro de fumo compreendendo um MIP seletivo para a remoção de pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco a partir dos produtos de decomposição térmica de um material de fumo. 0 filtro de fumo pode ser produzido separadamente a partir do artigo de fumo, por exemplo na forma de uma boquilha de cigarro ou charuto, ou pode ser integrado no artigo de fumo, por exemplo na forma de um cigarro com uma ponta de filtro.

Filtros de fumo na forma de pontas de filtro pode ser de gualguer constituição convencional. Por exemplo um filtro tipo "dalmata" compreendendo uma seção de material de filtro fibroso, tal como acetato de celulose, o MIP estando na forma de partículas e distribuído ao longo da secção. Em alternativa o filtro pode ser na forma de um filtro tipo "cavidade", compreendendo múltiplas secções em gue o MIP pode assentar entre duas secções adjacentes de material de filtro fibroso. 0 filtro de fumo pode também compreender outros materiais adsorventes tais como uma resina de permuta iónica, uma zeolite, sílica, alumina ou amberlite.

Em utilização, o fumo passa através do filtro, o MIP adsorve seletivamente e retém os compostos do fumo visados e o fumo filtrado é levado ao fumador.

Os filtros de fumo e artigos de fumo de acordo com a invenção podem incluir meios para proteger o MIP de, ou reduzir a sua exposição, ao fumo quando em utilização. Isto pode ser conseguido por várias vias diferentes. Por exemplo o filtro de fumo pode compreender um elemento de filtro para adsorver materiais a partir da fase de vapor ou de partículas de fumo. Esses elementos de filtro podem compreender um adsorvente geral tal como carvão ativado, o qual pode ser em qualquer forma conveniente, tal como filamentos, partículas, grânulos, tecido, ou papel. 0 elemento de filtro pode também ser um adsorvente seletivo tal como uma resina de permuta iónica, uma zeolite, sílica, alumina ou amerlite. Os meios para proteger o MIP podem incluir dois ou mais desses elementos de filtro de diferentes composições, por exemplo um primeiro elemento de filtro de acetato de celulose, e um segundo elemento de filtro de carvão ativado. A provisão de elementos de filtro múltiplos em filtros de fumo e artigo de fumos é bem conhecido, e qualquer configuração convencional de filtro, e métodos de construção associados, podem ser usados.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 mostra um esboço do procedimento para síntese de um polímero de impressão;

Figura 2 mostra nitrosaminas específicas de tabaco;

Figura 3 mostra análogos isoestéricos de nitrosaminas; Figura 4A mostra exemplos de análogos alvo à base de amida e sulfonamida;

Figura 4B mostra um análogo alvo de enamina (MPAPB) usada como um modelo para preparar um MIP para extração de NNAL; Figura 5 mostra a estrutura química de metacrilato de 2- hidroxietilo;

Figura 6 mostra a estrutura química de dimetacrilato de etileno glicol;

Figura 7 mostra resultados da extração de N- nitrosopiperidina e nicotina em que o modelo 1 é formamida, o modelo 2 é enamina e o modelo 3 é sulfonamida;

Figura 8 mostra a percentagem de TSNAs e nicotina extraídos da solução aquosa;

Figura 9 mostra a percentagem de TSNAs libertados após lavagem com água;

Figura 10 mostra a percentagem de TSNAs e nicotina extraídos da solução aquosa;

Figura 11 mostra a percentagem de TSNAs libertados após lavagem com água;

Figura 12 mostra a percentagem de nicotina não reagida após cinco cargas de amostras separadas;

Figura 13 mostra a percentagem de NNN não reagida após cinco cargas de amostras separadas;

Figura 14 mostra a percentagem de NNK não reagida após cinco cargas de amostras separadas;

Figura 15 mostra a percentagem de NAT não reagida após cinco cargas de amostras separadas;

Figura 16 mostra a percentagem de NAB não reagida após cinco cargas de amostras separadas;

Figura 17 é um alçado lateral, seção transversal parcialmente longitudinal e vista do corte parcial de um artigo de fumo com um filtro de fumo de acordo com a invenção; e

Figura 18 é uma vista semelhante à da Figura 17 de um artigo de fumo com um filtro de fumo alternativo de acordo com a invenção.

Nos desenhos, características semelhantes são dadas como referências numéricas.

Descrição detalhada da invenção A impressão molecular tipicamente consiste nos seguintes passos: (1) um composto modelo, o qual pode ser a molécula visada ou um seu análogo estrutural, é deixado interagir com um monómero funcional selecionado, ou monómeros, em solução para formar um complexo modelo-monómero; (2) o complexo modelo-monómero é copolimerizado com um monómero de reticulação que resulta numa matriz polimérica que incorpora o composto modelo; (3) o composto modelo é extraído a partir da matriz de polímero para formar um MIP que possa ser usado para se ligar seletivamente à molécula visada.

Ante do passo (3) , em que o MIP é preparado como um polímero sólido (ou monólito) é tipicamente moído e peneirado para obter uma fração do material de partículas do tamanho desejado. Quando preparado pelos métodos polimerização de suspensão ou de emulsão, essa moagem e peneiramento são desnecessários uma vez que o tamanho de partícula pode ser controlado dentro dos limites desejados durante o processo de polimerização. 0 material de partículas preparado por qualquer dos métodos acima mencionados pode ser compactado numa coluna de extração cromatográfica ou de fase sólida e usado para separação cromatográfica do modelo a partir de outros componentes de uma mistura, incluindo moléculas com estruturas ou funcionalidades semelhantes.

Os sítios reativos no polímero de impressão molecular expostos pela remoção do composto modelo será numa configuração estereoquímica apropriada para reação com moléculas frescas da molécula visada. Como resultado, o polímero de impressão molecular pode ser usado para ligação seletiva à molécula visada. A via ' não-covalente' tem sido largamente usada para gerar locais de ligação com impressão molecular. Esta faz uso da automontagem não-covalente do composto modelo e dos monómeros funcionais para formar o complexo modelo-monómero, seguido pela polimerização do radical livre na presença de um monómero de reticulação e finalmente pela extração do composto modelo. A impressão covalente, na qual a molécula modelo e um monómero ou monómeros adequados são ligados covalentemente em conjunto antes da polimerização, podem também ser realizada de acordo com métodos conhecidos. As propriedades de ligação dos MIPs formados por qualquer dos métodos acima podem ser examinadas pela religação da molécula modelo. A polimerização é realizada na presença de um solvente formador de poro, um porogénio. Com vista a estabilizar as interações eletroestática entre os monómeros funcionais e o composto modelo o porogénio e muitas vezes escolhido de entre os solventes apróticos de polaridade baixa a moderada. Os compostos modelos exibem muitas vezes solubilidade moderada a alta no meio de polimerização e estes, ou os seus análogos estruturais, podem, portanto, ser utilizados diretamente neste procedimento padrão.

Enquanto é possivel usar a própria molécula visada como modelo, um análogo estrutural da molécula alvo é comummente preferido porque: (a) a molécula visada pode ser instável sob as condições de polimerização ou pode inibir a polimerização; (b) a molécula visada pode não estar disponível em quantidades suficientes devido à complexidade da sua síntese ou custos, ou ambos; (c) o modelo pode ser insolúvel ou pobremente solúvel na mistura de pré-polimerização; (d) o MIP pode permanecer contaminado pelos baixos níveis da molécula visada retidos em regiões fracamente acessíveis da matriz do polímero, os quais podem ser vertidos a partir do MIP durante o uso; e/ou (e) o(s) analito(s) alvo podem apresentar um risco significativo para a saúde e não devem ser usados como modelos (s) . No caso dos compostos de nitroso, particularmente dos compostos conhecidos como TSNAs descritos a seguir, é muitas vezes mais conveniente usar os seus análogos funcionais como compostos modelo. Por exemplo, sulfonamida, enamina, ou amida, por exemplo formamida, derivadas de TSNAs podem ser compostos modelo, ver Figura 2 para exemplos dos mesmos.

Quando o MIP é derivado usando um análogo funcional do composto alvo, o análogo funcional deverá ser isostérico e preferencialmente também isoeletrónico com o composto visado, ou este pode conter uma subestrutura dos composto visados onde podem ser prováveis as interações fortes.

Como aqui usado um "análogo estrutural" de uma molécula não é idêntico ao da molécula original, mas é em parte ou no todo semelhante a parte ou a toda a molécula original em termos de formato molecular, distribuição de eletrões ou outras características.

Compostos que contêm nitroso, particularmente nitrosaminas, as quais têm a fórmula geral 0=N-N(Ri) (R2) , estão entre os numerosos componentes do tabaco e fumo de tabaco que foram sugeridos como tendo um efeito prejudicial nos consumidores. De interesse para a presente invenção é o grupo de nitrosaminas que ocorre naturalmente em tabaco, TSNAs, ver Figura 2.

Análogos isostéricos possíveis direcionados às nitrosaminas são vistos na Figura 3. As moléculas mostradas são todas derivadas da amina parente e podem ser sintetizadas num único passo a partir de uma amina secundária e aldeído ou ácido clorídrico correspondentes. Modelos moleculares de enamina (Figura 4B) mostraram uma boa complementaridade estérica com NNAL.

Os MIPs descritos na WO 05/112670 mostraram resultados promissores quando usados para análise e extração de numerosos metabolitos da nicotina das soluções analíticas, fluídos corporais, e materiais de tabaco. No entanto, como as TSNAs apresentam um campo de interesse específico e estreito, a investigação sobre novas formas de recuperação destes compostos a partir de vários materiais está em curso. Com este objetivo, foi avaliada a formação de MIP usando novos materiais e métodos. O desenho de novos MIPS começou com a escolha de um modelo adequado. Como referido acima, o modelo confere seletividade ao polímero e deve idealmente ser quimicamente estável, disponível rapidamente, fácil de manusear, e transmitir seletividade das propriedades de ligação. Como um objetivo da invenção é reduzir a exposição humana a nitrosaminas estas não foram modelos potenciais. Por outro lado, as formamidas, enaminas e sulfonamidas (ver Figura 2) poderiam ser usadas para substituir o grupo nitroso dada as suas semelhanças geométricas e o facto de possuírem uma carga parcial negativa na mesma posição. 0 monómero, o reticulador e as condições de polimerização (por exemplo, solvente ou porogénio, iniciador, e temperatura) também influenciam as propriedades do MIP final. Os monómeros avaliados foram ο ΜΔΑ acídico assim como o monómero neutro 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA), ver Figura 5. 0 reticulador, que eventualmente constitui a maior parte do polímero, também tem influência em que o polímero seja hidrofílico ou hidrofóbico. Assim o reticulador hidrofílico PETRA e o hidrofóbico EDMA foram avaliados, ver Figura 6. Para a polimerização, foi avaliada tanto a iniciação térmica como a fotoquimica. As experiências iniciais indicaram que os MIPs neutros, hidrofóbicos impressos com uma enamina ou sulfonamida e preparados usando polimerização UV mostraram resultados surpreendentes. Para continuar a acompanhar a análise, que incluiu um MIP acídico e um hidrofílico para comparação, os resultados são sumariados a seguir. A título de explicação e não de limitação, a invenção será ainda descrita com mais pormenor com referência a alguns exemplos. A invenção refere-se a moléculas modelo, materiais poliméricos desenhados para ligar TSNAs presentes em sistemas orgânicos ou aquosos, e finalmente ao uso dos referidos materiais em, por exemplo, separações analíticas ou preparativas, em cromatografia, para pré-tratamento de amostras analíticas, e em sensores químicos. A menos que descrito de outro modo, os materiais estão disponíveis comercialmente ou podem ser preparados por técnicas convencionais.

Exemplo 1: Preparação de MIPs para Avaliação

Prepararam-se doze MIPs diferentes os quais representaram todas as combinações possíveis de três modelos (formamida, enamina e sulfonamida), dois monómeros (acídico e neutral), e dois reticuladores (hidrofílico e hidrofóbico). Os MIPs foram avaliados usando uma mistura 1:1 de N- nitrosopiperidina e (-)-nicotina em água. Polímeros não impressos de referência foram também gerados e avaliados sob estas condições. Os resultados são sumariados na Figura 7. Exemplos da preparação de enamina e modelos de piridina carbinol assim como outras descrições de métodos que podem ser usados para os fins da presente invenção podem ser encontrados na WO 05/112670.

Como é evidente a partir da Figura 7, os MIPs usando monómeros acídicos ligam grandes quantidades de nicotina. Para aplicações onde os TSNAs são para serem triados enquanto aos níveis de nicotina devem permanecer sem serem afetados, então, um tal monómero é menos favorável. Para além disso, é evidente que os MIPs com um reticulador hidrofóbico são melhores na ligação à nitrosamina do que os MIPs hidrofílicos.

Exemplo 2: Preparação de MIPs para Comparação Analítica

Perante o desempenho surpreendentemente positivo dos MIPs neutros, hidrofóbicos como sumariado na Figura 7, os MIPs neutros, hidrofóbicos impressos com modelos enamina ou sulfonamida e polimerizados usando UV foram selecionados para análise adicional. Para comparação, o melhor desempenho de MIP hidrofílico foi também incluído na amostra. Foram preparados sete MIPs usando os parâmetros sumariados na Tabela 1.

Tabela 1.

Exemplo 3: Avaliação de MIPs Selecionados com Misturas de TSNA/Nicotina

As colunas SPE foram preparadas, cada contendo 25 mg dos MIPs 1-7. Para cada coluna foram adicionados 1 mL de solução aquosa contendo 0,30 yg/mL de TSNA total e 0,2 yg/mL de nicotina. Usou-se o HPLC para determinar a quantidade de TSNA que não havia sido extraído de cada coluna, permitindo o cálculo do material extraído, ver Figura 8. 1 mL de água foi então passado através de cada coluna e a quantidade de TSNA libertada, se alguma, foi determinada, ver Figura 9. Cada uma das Figuras 8 e 9 representa a média de duas experiências.

Com base na forte realização dos MIPs neutros, hidrofóbicos, a avaliação para os MIPs 1 e 3-7 foi repetida usando 1 mL da solução de teste contendo 0,30 yg/mL de TSNA total e 4 yg/mL de nicotina em tampão fosfato pH 6,3 (força iónica 0,09). Os resultados são mostrados nas Figuras 10 e 11, onde ambos representam uma média de duas experiências. Como pode ser visto, os MIPs 1, 3, e 4 tiveram o melhor desempenho, retendo 100% do TSNA enquanto permitiram que a maioria da nicotina passasse sem impedimento.

A realização dos MIPs 1, 3, e 4 foi também avaliada a pH 5,3 e 7,3. Com o aumento do pH, a retenção da nicotina aumentou desde aproximadamente 10% até 30%, indicando que quando a nicotina não é para ser afetada, o desempenho ótimo é alcançado usando pH levemente acídico. Um MIP acídico formado usando o monómero MAA acídico e o reticulador hidrofóbico EDMA foi também avaliado usando as mesmas condições a pH 6,3, retém cerca de 90% da nicotina. A regeneração dos MIPs foi realizada usando um TFA a 0,5% em lavagem de MeOH. Outras misturas de ácido/álcool podem ser também usadas.

Exemplo 4: Avaliação de MIPs Selecionados com TSNAs específicos e Nicotina

Depois de encontrar o desempenho surpreendentemente positivo dos MIPs 1, 3, e 4 nas experiências descritas acima, foi conduzida uma outra avaliação. As colunas SPE foram preparadas com 25 mg de MIP moido e cinco cargas de solução de teste a 1 mL cada foram carregados nas colunas. A solução de teste foi ca. De 80 ng/mL cada de NNN, NNK, NAT, 40 ng/mL de NAB e 4 yg/mL de nicotina em tampão fosfato a pH 6,3 (força iónica 0,09). Após carregar cada amostra a quantidade de nicotina não reagida e cada TSNA foi determinada usando HPLC. Um controlo de polímero não impresso foi também avaliado. Os resultados são mostrados nas Figuras 12-16. Como visto nas figuras, cerca de 10% da nicotina é ligada pelos MIPs no primeiro passo de carga. Isto satura o MIP com nicotina e adicionando mais amostra na coluna não resulta numa retenção adicional significativa de nicotina. NNN é a mais fracamente ligada ao MIP e é vista a rutura no segundo passo de carga. Cada um dos MIPs 1, 3, e 4 é excelente na retenção de NNK, NAB, e NAT. Assim, a combinação de modelos de monómero funcional neutro, enamina ou sulfonamida, e de reticulador hidrofóbico resulta numa retenção surpreendentemente alta de TSNA a partir de uma amostra misturada enquanto retém somente uma quantidade minima de nicotina.

Esses MIPs são particularmente atrativos para aplicações onde os TSNAs são para ser removidos a partir de uma amostra, mas a nicotina não deve ser afetada, de modo a que o tratamento do tabaco ou do fumo de tabaco remova os TSNAs. Adicionalmente, esses MIPs podem ser utilizados numa capacidade analítica para medir a quantidade de TSNA é uma amostra de um produto ou uma amostra de um doente. Nesses casos, se a nicotina é um componente de interesse a quantidade de nicotina retida pelo MIP pode ser quantificada e outros métodos, por exemplo, MIPs específicos de nicotina podem ser usados para quantificar a quantidade restante de nicotina na amostra. O passo adicional de avaliação dos níveis de nicotina pode ser feito antes ou a seguir ao uso de MIPs específicos de TSNA da presente invenção.

Exemplo 5: Uso de um MIP da invenção no Tratamento de

Extratos de Tabaco 0 polímero produzido de acordo com os parâmetros descritos acima pode ser incorporado numa coluna SPE e a coluna pode ser condicionada como necessário. 0 monómero funcional neutro usado no polímero pode ser, por exemplo, HEMA, acrilamida, metacrilamida, N-metacrilamida, monoacrilato de glicerol, monometacrilato de glicerol, ou 2-(4-vinilfenil)-1,3-propanediol. Reticuladores hidrofóbicos podem ser, por exemplo, EDMA, TRIM, DVB, m-diisopropenilbenzeno, dimetacrilato de tetrametileno glicol, tetracrilato de pentaeritritol, N,N'-Metilenobisacrilamida, N,N'-

Etilenebisacrilamida, N,N'-Butilenebisacrilamida, N,N'-Hexametilenobisacrilamida. São conhecidos outros materiais aplicáveis, ver, por exemplo, Molecularly Imprinted Material: Science and Technology, Yan, M; Ramstrõm, 0;

Eds., Marcel Dekker, New York, 2005.

Folhas de tabaco cortadas ou trituradas podem ser extraídas com água durante 15-25 minutos a 60°C. 0 tabaco é separado da solução por filtração e seco. A solução é passada através da coluna SPE e o TSNA é absorvido do extrato. A coluna é então drenada e a solução concentrada por evaporação em película, o concentrado é então recombinado com o tabaco extraído e seco com ar. 0 desempenho do MIP pode ser avaliado eluindo os compostos ligados a MIP usando 2 x 1 mL de metanol contendo 0,5% de TFA e o extrato analisado usando HPLC-UV.

Exemplo 6: Uso de um MIP da invenção no Tratamento de Extratos de Tabaco

Usando um processo de extração contínua, folha de tabaco triturados do tipo Mistura US é carregado na primeira câmara de extração na qual é alimentado dióxido de carbono supercrítico. Após contatar o tabaco, o dióxido de carbono é introduzido numa segunda câmara de extração contendo um MIP de acordo com a invenção. Tendo contactado o polímero, o dióxido de carbono é devolvido para a primeira câmara de extração e contatado novamente com o tabaco. 0 processo cíclico é continuado até que o conteúdo de TSNA do tabaco foi reduzido para um nível desejado, após o que o dióxido de carbono é ventilado a partir do sistema, e o tabaco removido da primeira câmara. 0 MIP na segunda câmara é então regenerado para reutilização.

Exemplo 7: Uso de um MIP da invenção para Análise de Amostras

Uma coluna é preparada por adição de 25 mg de MIP de acordo com a invenção. Uma amostra de teste é adicionada à coluna, por exemplo 5 mL de urina humana potencialmente contendo TSNAs. A amostra é deixada passar através da coluna, a qual, em seguida, deve ser submetida a vácuo para remover todo o líquido e garantir que o material MIP está seco. A lavagem pode ser realizada para remover quaisquer compostos interferentes que podem estar associados não especificamente com o MIP, por exemplo 1 mL de água destilada. Após secagem dos TSNAs pode ser recuperada dos MIP usando, por exemplo, 1 mL de DCM e quantificado usando HPLC.

Exemplo 8: Uso de um MIP da Invenção nos Artigos de Fumo

Em referência aos desenhos, as Figuras 17 e 18 ilustram os artigos de fumo na forma de cigarros com um rolo 1 de tabaco encerrado em um invólucro 2 ligado ao filtro m de fumo 3 por meio de um papel de boquilha 4. Para clarificação, o papel de boquilha 4 é mostrada espaçada do invólucro 2, mas na prática pode assentar no ponto de contato fechado.

Na Figura 17, o filtro de fumo 3 compreende três elementos de filtro cilíndrico 3a, 3 b, 3c. 0 primeiro elemento de filtro 3a na extremidade da boca do filtro é 7 mm em comprimento, composto por fibras de acetato de celulose impregnado com 7% em peso de plastificante de triacetina com uma queda de pressão de calibre 25 milímetros de água ao longo do seu comprimento. 0 segundo elemento de filtro 3b, posicionado centralmente é uma cavidade de 5 mm de comprimento contendo 150 mg de grânulos de carvão ativado. O terceiro elemento de filtro 3c adjacente ao rolo 1 é de 15 mm de comprimento, tem uma queda de pressão de água de 90 mm ao longo do seu comprimento, e compreende 80 mg de fibras de acetato de celulose. As fibras são impregnadas com 4% em peso de triacetina e tem 80mg de MIP específico para TSNAs como aqui descrito, distribuído uniformemente ao longo do seu volume num estilo "Dalmata". O cigarro mostrado na Figura 18 é semelhante ao da Figura 17 exceto que o filtro de fumo 3 tem quatro elementos de filtro coaxiais, cilíndricos 3a, 3b, 3c e 3d. O primeiro elemento de filtro 3a na extremidade bucal do cigarro tem 5 mm de comprimento, e é composto de fibras de acetato de celulose impregnadas com 7% em peso de plastificante de triacetina. O segundo elemento de filtro 3b, posicionado adjacentemente ao primeiro elemento de filtro 3a é uma cavidade com 5 mm de comprimento contendo 200 mg de MIP especifico para TSNAs, produzido como aqui descrito. O terceiro elemento de filtro 3c adjacente ao segundo elemento de filtro 3b tem 10 mm em comprimento e compreende fibras de acetato de celulose impregnadas com 7% em peso de triacetina. 0 quarto elemento de filtro 3d assenta entre o terceiro elemento de filtro 3c, é de 7 mm de comprimento e compreende 80 mg de carvão ativado granulado. Um anel de orifícios de ventilação 5 é formado no papel de boquilha 4 num plano radial A-A o qual leva o ar para o terceiro elemento de filtro 3c de cerca de 3 mm a jusante da junção com o quarto elemento de filtro 5 3d quando o fumo é inalado através do cigarro.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um polímero de impressão molecular seletivo para pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco (TSNA), o polímero tendo sido preparado usando materiais compreendendo: um TSNA ou um seu análogo estrutural; um monómero funcional neutro; e um reticulador hidrofóbico.
2. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o referido análogo estrutural de um TSNA é um análogo de enamina de um TSNA.
3. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o referido análogo estrutural de um TSNA é um análogo amida de um TSNA, tal como formamida.
4. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o referido análogo estrutural de um TSNA é um análogo de sulfonamida de um TSNA.
5. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o referido monómero funcional neutro é selecionado a parir do grupo que consiste em 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA), acrilamida, metacrilamida, monoacrilato de glicerol, e monometacrilato de glicerol.
6. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o referido reticulador hidrofóbico é selecionado a partir do grupo que consiste em dimetacrilato de etileno glicol (EDMA), trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM), e divinilbenzeno (DVB).
7. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é seletivo para NNK.
8. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é seletivo para NNA.
9. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é seletivo para NNN.
10. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é seletivo para NAB.
11. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é seletivo para NAT.
12. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é seletivo para NNAL.
13. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é seletivo para iso-NNAL.
14. Um polímero de acordo com a reivindicação 1, em que o polímero é seletivo para iso-NNAC.
15. Um artigo de fumo, compreendendo: um material de fumo; e um polímero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14.
16. Um filtro de fumo, compreendendo um polímero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5.
17. Um kit, compreendendo: um polímero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14; e instruções para uso do polímero de impressão molecular para realizar pelo menos a deteção, quantificação, e separação de nitrosaminas numa amostra.
18. Um método de preparação de um polímero de impressão molecular seletivo para TSNAs, compreendendo: copolimerização de pelo menos um monómero funcional neutro e pelo menos um reticulador hidrofóbico na presença de pelo menos um análogo estrutural de TSNA num meio de polimerização contendo pelo menos um iniciador de radicais livres para produzir um polímero de impressão molecular ligado a um análogo estrutural de TSNA; e remoção do análogo estrutural TSNA do polímero de impressão molecular.
19. Um método de acordo com a reivindicação 18, em que o monómero funcional é selecionado a partir do grupo que consiste em: HEMA, acrilamida, metacrilamida, monoacrilato de glicerol, e monometacrilato de glicerol.
20. Um método de acordo com a reivindicação 18, em que o reticulador é selecionado a partir do grupo que consiste em: EDMA, TRIM e DVB.
21. Um polímero de impressão molecular produzido pelo método de qualquer uma das reivindicações 18-20.
22. Um método para reduzir o nível de pelo menos um TSNA num produto de tabaco, compreendendo o tratamento do produto de tabaco com um polímero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14.
23. Um método de acordo com a reivindicação 22, em que o produto de tabaco é produzido pela decomposição térmica de um material contendo tabaco, um substituto de tabaco ou uma mistura destes.
24. Um método de acordo com a reivindicação 22, em que o produto de tabaco é produzido por aquecimento do material a uma temperatura abaixo da sua temperatura de combustão.
25. Um método de acordo com a reivindicação 22, em que o produto de tabaco é produzido pela combustão do material.
26. Um método de acordo com a reivindicação 22, em que o produto de tabaco é produzido contatando um material contendo tabaco, um substituto de tabaco ou uma mistura desses com um solvente.
27. Um método de fabrico de um material de tabaco, compreendendo os passos de: tratar um material contendo tabaco, substituto de tabaco ou uma mistura dessas com um solvente para produzir um extrato; contatar o extrato com um polímero de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14 de modo a reduzir o nível deste no extrato; e combinar o extrato tratado com o material de tabaco extraido.