PT2062919E - Composições farmacêuticas e métodos úteis para a modelação de angiogénese, inibição de metástase e fibrose tumoral, e avaliação da malignidade de tumores de cancro do cólon - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS ÚTEIS PARA A MODELAÇÃO DE ANGIOGÉNESE, INIBIÇÃO DE METÁSTASE E FIBROSE TUMORAL, E AVALIAÇÃO DA MALIGNIDADE DE TUMORES DE CANCRO DO CÓLON"

CAMPO E ANTECENDENTES TÉCNICOS DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com um método de avaliação da malignidade de tumores do cólon e predição do prognóstico do cancro do cólon

Angiogénese

Num adulto, a formação de novos vasos sanguíneos em tecidos normais ou afetados por doença é regulada por dois processos, a vasculogénese recapitulada (a transformação de arteríolas preexistentes em pequenas artérias musculares) e angiogénse, o germinar de vasos sanguíneos existentes (que ocorre tanto no embrião como no adulto). 0 processo de angiogénese é regulado por estímulos biomecânicos e bioquímicos. Fatores angiogénicos tais como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o fator de crescimento de fibroblastos alcalino (bFGF) são libertados por células vasculares, macrófagos, e células rodeando vasos sanguíneos. Estes fatores angiogénicos ativam protéases específicas que estão envolvidas na degradação da membrana basal. Como um resultado desta degradação, células vasculares migram e proliferam assim levado à formação de novos vasos sanguíneos. Células peri-endoteliais, tais como pericitos nos capilares, células do músculo liso em vasos maiores e miócitos cardíacos no coração são recrutados para fornecer as funções de manutenção e modelação do vaso em formação. A criação e remodelação dos vasos sanguíneos é controlada por sinais parácrinos, muitos dos quais são mediados por ligandos proteicos que modelam a atividade de recetores tirosina cinase transmembranares. Entre estas moléculas estão o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e as suas famílias de recetores (VEGFR-1, VEGFR-2, neuropilina-1 e neuropilina-2), angiopoietinas 1-4 (Ang-1, Ang-2, etc.) e os seus respetivos recetores (Tie-1 e Tie-2), o fator de crescimento de fibroblastos alcalino (bFGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), e o fator de crescimento transformante f3 (TGF-f3) . 0 crescimento de tumores sólidos é limitado pela disponibilidade de nutrientes e oxigénio. Quando as células em tumores sólidos começam a produzir fatores angiogénicos or quando os níveis dos inibidores de angiogénese diminuem, o balanço entre as influências angiogénicas e antiangiogénica é perturbado, iniciando o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir da base de vasculatura existente no tumor. Este evento na progressão do tumor é conhecido como o interruptor angiogénico (Follanan, 1990; Hanahan and Follanan 1996). Tinha sido já demonstrado que inibidores da angiogénese tumoral são capazes de inibir completamente o crescimento tumoral em ratinhos (Boelun et al., 1997; Bergers et al., 1999) e também inibir a metastização tumoral, um processo que depende do contacto próximo entre a vasculatura e as células tumorais (Zetter, 1998) . Foi também demonstrado que a angiogénese desempenha um importante papel na progressão de cancro da mama (Weidner, N. 1998; Degani et al., 1997; Guidi et al. , 1997; Balsari et al., 1999).

Tais descobertas incentivaram o uso de fatores angiogénicos conhecidos na terapia de cancro da mama (Klauber et al., 1997; Harris et al., 1996; Weinstatsaslow et al., 1994) e uma procura por novos inibidores de angiogénese.

Durante a última década vários novos inibidores de angiogénese foram isolados incluindo inibidores da sinalização de VEGF (Neufeld et al., 1999) e inibidores de processos que levam à maturação e estabilização de novos vasos sanguíneos.

Anticorpos anti-integrinas foram usados como inibidores da maturação de vasos sanguíneos (Brooks et al., 1994; Brooks et al., 1998).

Embora vários fármacos antiangiogénicos estejam agora comercialmente disponíveis, os mecanismos antiangiogénicos da maior partes destes fármacos (p.ex., angiostatina e endostatina) permanecem por esclarecer (O'Reilly et al., 1997; Oreillyet al., 1996).

Uma vez que a angiogénese pode ser iniciada por muitos fatores angiogénicos (possivelmente compensatórios) , é lógico que fatores antiangiogénicos que direcionem os últimos processos na resposta angiogénica tais como a maturação de vasos sanguíneos ou uma combinação de fatores antiangiogénicos seriam mais eficazes no bloqueio da formação de vasos sanguíneos. 0 fator plaquetário-4 (PF4) é uma proteína antiangiogénica normalmente sequestrada em plaquetas (Tanaka et al., 1997; Maione et al., 1990; Neufeld et al., 2000) . PF4 inibe a angiogénese usando mecanismos pobremente definidos (Gengrinovitch et al., 1995; Brown, and Parish, 1994; Gupta, and Singh, 1994; Watson et al., 1994) . Foi previamente especulado que PF4 se liga à superfície celular de proteoglicanos como o sulfato de heparano e desta maneira inibe a atividades dos fatores de crescimento angiogénico tais como o fator de crescimento de fibroblastos alcalino (Watson et al., 1994).

Estadiamento e metastização tumoral A transição de um tumor localizado para um tumor metástico e invasivo representa um marco no desenvolvimento da doença maligna uma vez que é usualmente associado com um prognóstico marcadamente pior. 0 conhecimento dos processos que governam esta transição é assim de primeira importância.

Cancro da mama

No cancro da mama, a transição de um tumor localizado para um tumor invasivo/metástico é associada em muitos casos com a formação de nódulos fibróticos e desmoplasia, que é a presença de estroma colagenosas invulgarmente denso, dentro do tumor primário (Colpaert et al., 2001; Hasebe et al., 2000). Uma correlação similar pode existir noutros tipos de cancros tais como cancros do cólon e do pâncreas (Nishimura et al., 1998; Ellenrieder et al., 2000). Estas observações representam aparentes paradoxos à primeira vista, uma vez que a invasão tem sido já há muito tempo associada com a destruição da matriz extracelular por enzimas destruidoras de matriz extracelular como metalo-proteases (Stamenkovic, 2000; Duffy et al., 2000) e heparanases (Vlodavsky and

Friedmann, 2001). Contudo, é possível que a deposição do excesso de matriz extracelular possa estimular por sua vez a expressão de enzimas destruidoras de matriz extracelular que irao contribuir sob certas circunstâncias para a invasão tumoral. De facto, existe algumas evidências que um aumento na deposição de matriz extracelular possa de facto influenciar a produção de enzimas destruidoras de matriz extracelular (Schuppan et al., 2001; Swada et al., 2001). WO 02/11667 mostra a correlação entre o nível de expressão da proteína LOR-1 lisil oxidase e as propriedades metástica de linhas celulares derivadas de cancro da mama, e sugere que o nível de expressão de LOR-1 possa ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para determinar a malignidade de células cancerosas. Vários estudos anteriores do estado da técnica tentaram desenvolver agentes para o tratamento de metástases de cancro da mama (Sauer et al., 2002) incluindo um estudo por Kim et al., (2000) que descreve a apicidina [ciclo(N-O- metil-L-triptofanil-L-isoleucinil-D-pipecolinil-L2-amino8-oxodecanoil)], um metabolito fúngico que foi identificado como um agente antiprotozoário conhecido por a histona deacetilase parasita (HDAC), que pode inibir o fenótipo invasivo induzido por H-ras de células epiteliais da mama humana MCF10A. Outro agente é a forma polimérica de fibronectina que foi demonstrada como reduzindo o crescimento tumoral e que possui atividade antimetástica quando administrada sistemicamente a ratinhos contendo tumores (Yi and Ruoslahti, 2001).

Cancro do cólon O cancro do trato gastrointestinal (trato GI, especialmente o cancro do cólon, é uma doença muitas vezes curável e altamente tratável quando localizada no intestino). A cirurgia é o tratamento primário resulta na cura de aproximadamente 50% dos pacientes. A recidiva após cirurgia é o principal problema e muitas vezes é a última causa de morte. Praticamente todos os casos de cancro colorectal resultam de pólipos adenomatosos, alguns dos quais maturam em grandes pólipos, sofrendo um crescimento e desenvolvimento anormal, e ultimamente progredindo para cancro. Esta progressão demoraria pelo menos 10 anos em muitos pacientes, tornando-a uma forma prontamente tratável de cancro de diagnosticada precocemente, quando o cancro é localizado.

Os procedimentos estandardizados atualmente usados para o estabelecimento de um diagnóstico definitivo para o cancro do trato GI incluem estudos com bário, endoscopia, biópsia e tomografia computorizada [M. F. Brennan, et al. In: Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fourth

Edition, pp. 849-882, Philadelphia, Pa.: J. B. Lippincott

Co. (1993)]. 0 prognóstico do cancro do cólon é claramente relacionado com o grau de penetração do tumor através da parede intestinal e a presença ou ausência de envolvimento nodal. Estas duas caracteristicas formam a base para todos os sistemas de estádio desenvolvidos para esta doença. 0 estadiamento é normalmente realizado por um patologista nas secções de tecidos obtidas via biópsia e/ou cirurgia e ambiciona a determinação da extensão anatómica da doença.

Um estadiamento exato é critico para a predição do resultado do paciente e o fornecimento de critérios para o desenvolvimento de terapias otimizadas. Um estadiamento erróneo pode resultar em más decisões terapêuticas e é um grande problema clinico no cancro do cólon.

Assim, para aumentar a precisão da terapia e a taxa de sobrevivência de pacientes com cancro do cólon existe uma necessidade para desenvolver métodos sensíveis e precisos de estadiamento do cancro do cólon.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Embora reduzindo a presente invenção à prática, os presentes inventores descobrem uma nova proteína de ligação PF4, uma proteína lisil oxidase, LOR-1, que participa na modelação da angiogénese e da metastização de cancro da mama e como tal pode ser usada como um alvo para a inibição da metástase e redução da invasão tumoral.

Adicionalmente, os presentes inventores descobriram que a expressão de LOR-1 está correlacionada com a progressão de cancro do cólon e como tal pode ser usada para um estadiamento preciso do cancro do cólon.

De acordo com um aspeto da presente invenção, é fornecido um método ex vivo ou in vitro de avaliação da malignidade de um tumor do cólon compreendendo: (a) Determinação de um nivel tecidular de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido descrito na SEQ ID NO: 2, ou (b) determinação dos niveis de mRNA codificantes de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ ID NO: 2, num tecido de cancro do cólon, assim assegurando a malignidade do tumor do cólon.

De acordo com outro aspeto da presente invenção, é fornecido um método ex-vivo ou in vitro de predição de um prognóstico para um individuo diagnosticado com cancro do cólon compreendendo: (a) o fornecimento de um tecido do tumor do cólon proveniente do individuo e; (bl) determinação de um nivel tecidular de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ ID NO: 2, ou (b2) determinação dos niveis de mRNA codificantes de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ ID NO: 2, no referido tecido de tumor do cólon para assim determinar a malignidade do referido tecido de cancro do cólon e predizer o prognóstico do individuo diagnosticado com cancro do cólon.

Numa forma de realização adicional, o referido tecido do referido tumor do cólon é obtido usando uma biópsia do cólon e/ou uma cirurgia do cólon.

Numa forma de realização adicional, a determinação do referido nivel tecidular do referido polipéptido é efetuada por um método de deteção imunológico ou a determinação dos referidos niveis de mRNA é efetuada por um método de deteção de RNA.

Numa forma de realização adicional, o referido método de deteção imunológico é selecionado de um grupo consistindo de um rádio-imunoensaio (RIA), um ensaio de imunoadsorção enzimática competitiva (ELISA), uma análise de Western blot, e uma análise imunohistoquimica.

Numa forma de realização adicional, o referido Método de deteção de RNA é selecionado de um grupo consistindo de análise Northern blot, uma marcação de hibridação in situ, uma análise RT-PCR, e uma marcação RT-PCR in situ.

Numa forma de realização adicional, a malignidade do referido tecido do tumor do cólon é avaliada através da comparação do referido nivel tecidular do referido polipéptido no referido tecido do tumor do cólon com um nivel tecidular do referido polipéptido em tecido do cólon normal.

Numa forma de realização adicional, o método é realizado através da determinação dos niveis de mRNA codificantes de um polipéptido de SEQ ID NO: 2.

Numa forma de realização adicional, o método é realizado para determinação de um nível tecidular de um polipéptido de SEQ ID NO: 2.

Numa forma de realização adicional, a determinação do referido nivel tecidular do referido polipéptido é realizada usando um anticorpo anti-LOR-1 ou fragmento relacionado.

Numa forma de realização adicional, o referido anticorpo anti-LOR-1 é um anticorpo policlonal gerado usando um fragmento possuindo uma sequência aminoacidica dos 200 aminoácidos da região C-terminal da SEQ ID NO: 2.

De acordo com ainda outro aspeto da presente invenção, é fornecido um método ex vivo ou in vitro para a determinação do estádio de um tumor do cólon compreendendo: (a) determinação de um nivel tecidular de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ ID NO: 2, ou (b) determinação dos niveis de mRNA codificantes de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ ID NO: 2, num tecido de tumor do cólon, assim avaliando o estádio do tumor do cólon.

Numa forma de realização adicional, o referido tecido do referido tumor do cólon é obtido usando uma biópsia do cólon e/ou uma cirurgia do cólon.

Numa forma de realização adicional, a determinação do referido nivel tecidular do referido polipéptido é efetuada por um método de deteção imunológico ou a determinação dos referidos niveis de mRNA é efetuada por um método de deteção de RNA.

Numa forma de realização adicional, o referido método de deteção de RNA é selecionado de um grupo consistindo de análise Northern blot, marcação de hibridação in situ, análise RT-PCR, e marcação RT-PCR in situ.

Numa forma de realização adicional, a determinação do referido nível tecidular do referido polipéptido é realizada usando um anticorpo policlonal anti-LOR-1 gerado usando um fragmento possuindo uma sequência aminoacidica dos 200 aminoácidos da região C-terminal da SEQ ID NO: 2.

De acordo com um aspeto da presente publicação, é fornecido um método de modelação de angiogénese num tecido mamífero, o método compreendendo a administração ao tecido mamífero de uma molécula capaz de modificar um nível tecidular e/ou atividade de pelo menos um tipo de lisil oxidase para assim modelar a angiogénese no tecido mamífero.

De acordo com outro aspeto da presente publicação, é fornecido um método de modelação de angiogénese num tecido mamífero, o método compreendendo a administração ao tecido mamífero de uma construção de ácidos nucleicos capaz de expressar um polipéptido possuindo atividade lisil oxidase para assim modelar a angiogénese no tecido mamífero.

De acordo com ainda outro aspeto da presente publicação, é fornecida uma composição farmacêutica útil para a modelação de angiogénese em tecido mamífero compreendendo, como um ingrediente ativo, uma molécula capaz de modificar um nível e/ou atividade de pelo menos um tipo de lisil oxidase do tecido mamífero e um veículo farmaceuticamente eficaz.

De acordo com outro aspeto da presente publicação, é fornecido um método de modelação de angiogénese num tecido mamífero, o método compreendendo a administração ao tecido mamífero de uma molécula capaz de modificar um nível tecidular e/ou atividade de um polipéptido sendo pelo menos 75 % homólogo ao polipéptido definido na SEQ ID:2 ou 9 para assim modelar a angiogénese no tecido mamífero. De acordo com características adicionais em formas de realização preferenciais da publicação abaixo descritas, a molécula é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo capaz de se ligar com, e pelo menos parcialmente inibir a atividade de, pelo menos um polipéptido.

De acordo com ainda outras características adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é dirigido contra pelo menos uma porção do polipéptido definido na SEQ ID NO: 2, 3, 6, 8 ou 9.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, a molécula é um polinucleótido capaz de subregular a expressão de pelo menos um tipo de lisil oxidase.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, o polinucleótido é pelo menos parcialmente complementar ao polinucleótido definido na SEQ ID NO: 1, 4, 5 ou 7.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, a molécula é um polipéptido possuindo atividade lisil oxidase.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, o polipéptido é como definido na SEQ ID N0:2, 3, 6, 8 ou 9.

De acordo com outro aspeto da presente publicação, é fornecido um método de modelação de angiogénese num tecido mamífero, o método compreendendo a administração ao tecido mamífero de uma construção de ácidos nucleicos capaz de expressar um polipéptido possuindo atividade lisil oxidase para assim modelar a angiogénese no tecido mamífero.

De acordo com ainda outras características adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, o polipéptido é pelo menos 75 % homólogo ao polipéptido definido na SEQ ID NO: 2, 3, 6, 8 ou 9.

De acordo com ainda outro aspeto da presente publicação, é fornecido um método de identificação de moléculas capazes de modelarem a angiogénese, o método compreendendo: (a) o isolamento de moléculas que exibem reatividade especifica com pelo menos um tipo de lisil oxidase; e (b) o teste de moléculas no tecido mamífero de forma a determinar a atividade de modelação de angiogénese relacionada.

De acordo com ainda outras características adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, passo (a) é efetuado através de ensaios de ligação e/ou ensaios de atividade da lisil oxidase.

De acordo com um aspeto adicional da presente publicação, é fornecido um método de determinação da malignidade de um tecido canceroso, o método compreendendo (a) determinação do nível de expressão da lisil oxidase e/ou sua atividade no tecido canceroso; 3 (b) comparação do nível de expressão da lisil oxidase e/ou sua atividade com aquela determinada para o tecido de controlo para assim determinar a malignidade do tecido canceroso.

De acordo com outro aspeto da presente publicação, é fornecido um método de inibição de metastização e fibrose num tecido mamífero, o método compreendendo a administração ao tecido mamífero de uma molécula capaz de subregular um nível tecidular e/ou atividade de pelo menos um tipo de lisil oxidase para assim inibir a metastização no tecido mamífero.

De acordo com ainda outro aspeto da presente publicação, é fornecida uma composição farmacêutica útil para a inibição de metastização e fibrose num tecido mamifero compreendendo, como um ingrediente ativo, uma molécula capaz de subregular um nivel tecidular e/ou atividade de pelo menos um tipo de lisil oxidase do tecido mamifero e um veiculo farmaceuticamente eficaz.

De acordo com caracteristicas adicionais em formas de realização preferenciais da publicação abaixo descritas, a molécula é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo capaz de se ligar com, e pelo menos parcialmente inibir a atividade de, pelo menos um polipéptido.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é dirigido contra pelo menos uma porção do polipéptido definido na SEQ ID NO: 2, 3, 6, 8 ou 9.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, a molécula é um polinucleótido capaz de subregular a expressão de pelo menos um tipo de lisil oxidase.

Ainda de acordo com outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, o polinucleótido é pelo menos parcialmente complementar ao polinucleótido definido na SEQ ID NO: 1, 4, 5 ou 7.

De acordo com ainda outro aspeto da presente publicação, é fornecido um método de identificação de moléculas capazes de inibição de metastização e fibrose, o método compreendendo: (a) rastreio e identificação de moléculas que exibem reatividade especifica com pelo menos um tipo de lisil oxidase; e (b) teste do potencial inibitório de metastização e fibrose das referidas moléculas.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, passo (a) é efetuados através de ensaios de ligação e/ou ensaios de atividade da lisil oxidase. De acordo com ainda outro aspeto da presente publicação, é fornecido um método para a inibição de metastização e fibrose num tecido mamifero, o método compreendendo a administração ao tecido mamífero de uma molécula capaz de subregular um nível tecidular e/ou atividade de um polipéptido que é pelo menos 75 % homólogo ao polipéptido definido na ID NO: 2 ou 9, para assim inibir a metastização e fibrose num tecido mamífero.

De acordo com ainda outro aspeto da presente publicação, é fornecido um método de avaliação da malignidade de um tumor do cólon compreendendo a determinação um nível tecidular e/ou do nível de atividade de um polipéptido que é pelo menos 75 % homólogo ao polipéptido definido na SEQ ID NO:2 ou 9 num tecido de tumor do cólon, assim avaliando a malignidade do tumor do cólon.

De acordo com ainda outro aspeto da presente publicação, é fornecido um método de predição de um prognóstico de um indivíduo diagnosticado com cancro do cólon compreendendo: (a) obtenção de um tecido do tumor do cólon proveniente do indivíduo, e; (b) determinação do nível tecidular e/ou do nível de atividade de um polipéptido que é pelo menos 75 % homólogo ao polipéptido definido na SEQ ID N0:2 ou 9 no tecido do tumor do cólon para assim avaliar a malignidade do tecido do tumor do cólon e predizer o prognóstico do indivíduo diagnosticado com cancro do cólon.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, o tecido do tumor do cólon é obtido usando uma biópsia do cólon e/ou uma cirurgia do cólon.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, a determinação do nivel tecidular do polipéptido é efetuada por um método de deteção imunológico e/ou por um método de deteção de RNA.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, a determinação do nivel de atividade do polipéptido é efetuada por um método de deteção de atividade enzimática.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, o método de deteção imunológico é selecionado de um grupo consistindo de rádio-imunoensaio (RIA), ensaio de imunoadsorção enzimática competitiva (ELISA), Análise Western blot, e análise imunohistoquimica.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, o método de deteção de RNA é selecionado de um grupo consistindo de análise Northern blot, marcação de hibridação de RNA in situ, análise RT-PCR, e marcação RT-PCR in situ.

De acordo com ainda outras caracteristicas adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, o método de deteção de atividade enzimática é selecionado de um grupo consistindo de marcação citoquimica, ensaio de atividade in vitro, e gel de atividade.

De acordo com ainda outras características adicionais nas formas de realização preferenciais descritas na publicação, a malignidade do tumor do cólon é avaliada através da comparação do nivel tecidular e/ou do nivel de atividade do polipéptido no tecido do tumor do cólon com um nivel tecidular e/ou nivel de atividade do polipéptido num tecido do cólon normal. A presente publicação aborda com sucesso as deficiências das configurações presentemente conhecidas de fornecimento de composições farmacêuticas e métodos que podem ser usados para tratar cancro metástico, formação de fibrose tumoral e outros distúrbios caracterizados por formação de vasos sanguíneos excessiva ou deficiente assim como através do fornecimento de um método de avaliação da malignidade do cancro do cólon. A não ser indicado em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem o mesmo significado como comummente entendido por uma pessoa habilitada no estado da técnica a que esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são abaixo descritos. Em caso de conflito, as especificações da patente, incluindo definições, aplicar-se-ão. Adicionalmente, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A invenção é aqui descrita, por via de exemplos apenas, com referência às figuras anexas. Com referência específica agora às figuras em detalhe, é frisado que os elementos particulares aqui representados são-no por via de exemplo e para propósitos de discussão ilustrativa das formas de realização preferenciais da presente invenção apenas, e são apresentados na necessidade de fornecimento de uma descrição que seja mais útil e prontamente entendida dos princípios e aspetos conceptuais da invenção. A este respeito, nenhuma tentativa é feita para mostrar os detalhes estruturais da invenção em maior detalhe do que aquilo que é necessário para um entendimento fundamental da invenção, sendo que a descrição tida com as figuras tornam a invenção entendivel para aquelas pessoas habilitadas no estado da técnica e mostram como as várias formas da invenção podem ser colocadas em prática.

Nas Figuras: FIG. 1 ilustra uma análise SDS-PAGE de extratos de células endoteliais aórticas porcinas (células PAE) que foram transfectadas com o vetor contendo o cDNA de LOR-1 (faixa 3) e metabolicamente marcado com 35S-metionina. Extratos de células transfectadas com o vetor (faixa 2), do vetor contendo cDNA de LOR-1 de células transfectadas (faixa 4) ou de células endoteliais do cordão umbilical humano (HUVEC) marcadas com 35S-metionina (faixa 5) foram purificadas numa coluna de afinidade PF4. Uma banda correspondendo em tamanho à banda original observada para HUVEC é evidente (comparar faixas 4 e 5) ; esta banda está ausente nos extratos de células transfectadas com vetor. FIG. 2 ilustra a expressão diferencial de LOR-1 em células derivadas de cancro da mama de diferente potencial metástico. 0 potencial metástico das células aumenta da esquerda para a direita, e está correlacionado com a expressão aumentada de mRNA de LOR-1. Os resultados correspondem à análise Northern blot da expressão de mRNA de LOR-1. Dados relativos ao potencial metástico relativo das linhas celulares foi derivado da literatura. FIG. 3 ilustra a expressão de LOR-1 recombinante em céluLas de cancro da mama MCF-7 (faixa 1) . Células MCF-7 transfectadas com vetor (faixa 2) e dois clones de LOR-1 recombinantemente expresso em MCF-7 (faixa 3, clone 12, faixa 4, clone 22) foram crescidos durante dois dias em meio desprovido de soro. 0 meio de um número equivalente de células foi recolhido, concentrado 30 vezes usando coluna Centricon ™, e aliquotas de 10 μΐ foram submetidas a eletroforese num gel SDS-PAGE. As proteínas foram marcadas em nitrocelulose e a proteína LOR-1 foi identificada usando um anticorpo dirigido contra a região C-terminal de LOR-1. Um anticorpo secundário acoplado a fosfatase alcalina e a marcação NBT-BICP foram usadas para detetar o anticorpo primário ligado. FIG. 4 ilustra o tamanho do tumor como correlacionado com a expressão LOR-1. Células MCF-7 parentais (par), células MCF-7 transfectadas com o vetor PCDNA3 sozinho (vee) e células MCF-7 expressando dois LOR-1 recombinantes (clones 12 e 24) foram depositados na pele de ratinhos imunodeficientes (107/local de injeção) conjuntamente com um pellet de lenta libertação de estrogénio. Seis animais foram usados para cada tipo celular implantado. A área dos tumores foi medida a cada período curto de dias. As barras representam o desvio padrão da média. FIGs. 5a-b ilustra a marcação antifator 8 de tumores gerados por células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão sozinho (Figura 5a) ou com um vetor de expressão contendo o cDNA de LOR-1 (Figura 5b) . Marcação de contraste foi realizada com hematoxilina-eosina (azul). A invasão de vasos sanguíneos na massa tumoral é mais abundante em tumores com expressão de LOR-1 (Figura 5b) comparativamente com tumores gerados pelas células de controlo que não expressam LOR-1 (Figura 5a). FIGs. 6a-d ilustram secções de fígado provenientes de pacientes com a doença de Wilson (Figuras 6c-d) e pacientes normais (Figuras 6a-b) rastreadas com uma sonda sensível a LOR-1 (Figuras 6a, 6c) e uma sonda antissense (Figuras 6b, 6d) . FIG. 7 ilustra os resultados de uma montagem completa de hibridação in situ usando uma sonda de cDNA de LOR-1 e um embrião de galinha com 4 dias de idade. A forte expressão de mRNA de LOR-1 é observada em vasos sanguíneos amnióticos (ver setas). FIG. 8 ilustra o alinhamento de sequência de várias lisil oxidases incluindo LOR-1 FIGs. 9a-b. ilustra a expressão de LOR-1 e LOR-2 em células derivadas de cancro da mama humano: o RNA total foi preparado a partir de células MCF-7 (MCF-7) confluentes, células MDA-MB231 (MDA-231) confluentes e células MDA-MB435 (MDA-435) confluentes e foi sujeito a análise Northern blot usando sondas específicas para o cDNA de LOR-1 (Figura 9a) e LOR-2 (Figura 9b) . 0 sinal de hibridação específico para LOR-1 é visível em tumores derivados de células MDA-231 e MDA-435 mas não em tumores derivados de células MCF-7. 0 sinal de hibridação específico para LOR-2 é apenas visível em tumores derivados de células MDA-435. Os sinais de hibridação inespecíficos para LOR-1 e LOR-2 são visíveis em todos os tumores (RNAs) numa banda que corresponde ao rRNA 28S. FIGs. 9c ilustra o padrão de expressão de LOR-1 em tecido mamário humano normal (Figura 9c) , em carcinoma de mama não invasivo in situ (Figura 9d), em carcinoma ductal invasivo de grau-1 (Figura 9e) e em carcinoma ductal invasivo de grau-3 (Figura 9f) . Um anticorpo de coelho purificado com afinidade policlonal dirigido contra a região C-terminal de LOR-1 fpi usado para detetar a expressão de LOR-1. Um elevado nível de expressão da proteína LOR-1 +e visível no epitélio do dueto normal (Figura 9c, seta vazia); magnificação x 100. Em carcinoma da mama não-invasivo in situ (Figura 9d) as células cancerosas preencheram o dueto mas continuam ainda confinadas a ele. Muitas das células localizadas na periferia do tumor perderam a capacidade de expressar LOR-1, enquanto no centro, as células ainda expressam elevados níveis de LOR-1 (Figura 9d, seta vazia); magnificação x 200. Em carcinoma da mama invasivo de grau 1 as células tumorigénicas formaram pseudo-duetos (Figura 9e, setas preenchidas) mas não expressam mais LOR-1. Contudo, células encontradas num carcinoma próximo in situ expressam LOR-1 (Figura 9e, seta vazia); magnificação x 200. Em carcinoma da mama invasivo de grau 3 as células tumorigénicas expressam grandes quantidades de LOR-1 e a morfologia é completamente desordenada (Figura 9f); magnificação x 200. FIG. 10a ilustra a expressão de LOR-1 recombinante em células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão sozinho (vee) ou com um vetor de expressão contendo o cDNA de LOR-1 clone 12 ou 24 (#12 or #24, respetivamente) . As proteínas LOR-1 foram detetadas por Western blot com um anticorpo dirigido contra a região C-terminal de LOR-1 humano. FIG. 10b ilustra processos pós-tradução de LOR-1. Células MCF-7/Tet-LOR-1 crescidas na presença de tetraciclina foram tripsinizadas e plaqueadas numa microplaca de cultura de 24-poços (5 x 104 células/poço) em meio desprovido de soro na ausência de tetraciclina. As alíquotas celulares foram recolhidas a tempos definidos após a remoção de tetraciclina e foram analisadas para a presença de LOR-1 por Western blot como descrito na FIG 10a. FIG 10c ilustra a velocidade de crescimento de tumores derivados de Células MCF-7 expressando LOR-1 ou células de controlo. Células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão sozinho (vee) ou com um vetor de expressão contendo o cDNA de LOR-1 clone 12 ou 24 foram injetadas no tecido adiposo mamário de ratinhos nude atimicos fêmea. Cada tipo celular foi implantado em 8 animais. A área tumoral foi medida a tempos definidos. As barras de erro representem o erro padrão da média. A experiência foi terminada e os ratinhos sacrificados quando o tumor alcançou um diâmetro de cerca de 1 cm. FIG. lOd ilustra o tamanho relativo do tumor em ratinhos com 25 dias após a injeção de células MCF-7. Representados estão ratinhos alojando tumores que se desenvolveram a partir das células transfectas das com o vetor de expressão sozinho (esquerda) ou com o vetor de expressão contendo cDNA de LOR-1 clone 24 (centro) ou 12 (direita). FIGs. lla-h ilustram nódulos fibróticos e depósitos colagenosos em tumores derivados de células MCF-7 expressando LOR-1 recombinante. Marcação com hematoxilina-eosina demonstram alguns nódulos necróticos num tumor derivado de células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão sozinho (Figura 11a, seta, magnificação x 20) e numerosos nódulos necróticos num tumor derivado de células MCF-7 transfectadas com um vetor de expressão contendo cDNA de LOR-1 clone 12 (Figura 11b, setas, magnificação x 20) . Figura 11c ilustra imunomarcação de queratina-7 humana de tumores gerados por células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão contendo clone 12. Marcação de contraste foi realizada com hematoxilina-eosina (azul). As setas apontam para os núcleos de células hospedeiras concentradas nos nódulos fibróticos. Nenhuma necrose pode ser observada; magnificação x40. Figuras lld-f ilustram depósitos colagenosos em células tumorais como visível por marcação de tricomo de Masson. Alguns depósitos colagenosos são visíveis em tumores gerados por células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão sozinho (Figura 11 d, setas, magnificação x 200) . Agregados colagenosos espessos são visíveis entre células tumorais geradas a partir de células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão contendo clone 12 (Figura 11 e, magnificação x200) . A área fibrótica encontra-se preenchida com fibras de colagénio e espaçada com células derivadas do hospedeiro em tumores gerados a partir de células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão contendo clone 24 (Figura llf, magnificação x 200). Figuras llg-h ilustram vasos sanguíneos marcados com Tricomo de Masson em tumores gerados a partir de células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão sozinho (Figura llg) ou o vetor de expressão contendo clone 12 (Figura llh); magnificação x 400. FIGs. 12a-d ilustram a deposição de colagénio tipo-3 por marcação reticular em tumores gerados a partir de MCF-7 e Células do glioma C6 transfectadas com o vetor de expressão sozinho (Figura 12a, c) ou o vetor expressando cDNA de LOR-1 clone 12 (Figura 12b-d); magnificação x 200. FIGs 13a-h ilustram a invasão de tumores derivados de células MCF-7 expressando LOR-1 recombinante. Representadas estão secções histológicas de tumores gerados a partir de células MCF-7 transfectadas com um vetor de expressão sozinho (Figuras 13a, b) ou um vetor expressando LOR-1 (Figuras 13c-h). As secções foram marcadas com um anticorpo monoclonal específico para queratina-7 humana (Figuras 13 a-d 3 f-h, marcação azul-púrpura) ou com um anticorpo dirigido contra LOR-1 (Figura 13e, marcação vermelha). A marcação de contraste foi feita com Hematoxilina (azul claro) em todas as secções. Setas preenchidas designam células tumorais positivas para citoqueratina-7 invadindo a pseudo-cápsula do tumor (Figura 13c), infiltrando-se entre feixes musculares adjacentes (Figura 13d), ou invadindo a vasculatura (Figuras 13f,g) e o espaço peri-neural dos nervos (Figura 13h) . Setas brancas designam células tumorais positivas para LOR-1 infiltrando músculos próximos do tumor (Figura 13g). Vasos sanguíneos v; nervos n; fibras musculares m; magnificação x 100 para as Figuras 13a-c, f, hex 200 para as Figuras 23d, e, g. FIGs. 14a-d ilustram o padrão de expressão de LOR-1 no cólon humano normal (Figura 14a), num tumor do cólon incluindo hiperplasia (Figura 14b, setas diamante) e adenoma (Figura 14b, setas circulares) , num adenocarcinoma do cólon de grau reduzido (Figura 14c, setas, marcação castanha) e num adenocarcinoma do cólon de grau elevado (Figura 14d, marcação castanha). Um anticorpo de coelho purificado com afinidade policlonal dirigido contra a região C-terminal de LOR-1 foi usado para detetar a expressão de LOR-1 por imunohistoquimica em secções de tecido obtidas de vários tumores de cancro do cólon. De notar a marcação ligeira de LOR-1 em algumas células do cólon normal (Figura 14a, setas, magnificação x 10) , a marcação moderada de LOR-1 em tumores com hiperplasia (Figura 14b, círculos diamante) e a forte marcação de LOR-1 em células do adenoma do cólon (Figura 14b, setas circulares, magnificação x 4). Também de notar a marcação significativa de LOR-1 em adenocarcinoma de grau reduzido (Figura 14c, setas, magnificação x 10) e em carcinomas de grau elevado (Figura 14d, magnificação x 20).

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERENCIAIS A presente publicação é de composições farmacêuticas e métodos que podem ser usados para modelar a angiogénese e para inibir a invasão tumoral e fibrose tumoral. Especificamente, a presente publicação pode ser usada para suprimir o crescimento tumoral e metastização assim como para tratar distúrbios tais como, por exemplo, artrite, retinopatia diabética, psoríase e vasculite.

Adicionalmente, a presente invenção é de um método de determinação da malignidade de tumores de cancro do cólon que podem ser usados para estadiamento de cancro do cólon. Especificamente, a presente invenção pode ser usada para predizer o prognóstico de pacientes de cancro do cólon baseado no nível tecidular e/ou nível de atividade de LOR-1 em tumores do cólon.

Os princípios e operação da presente invenção podem ser melhor entendidos com referência às figuras e descrições que as acompanham. Antes de explicar pelo menos uma forma da realização em maior detalhe, deverá ser entendido que a invenção não está limitada na sua publicação aos detalhes de construção e ao arranjo dos componentes definidos na seguinte descrição ou ilustrados nas figuras descritas na secção dos Exemplos. A invenção é capaz de outras formas de realização ou de ser praticada ou realizada de várias formas. Também, deverá ser entendido que a fraseologia e terminologia aqui empregadas são para o propósito de descrição e não deverão ser vistas como limitantes.

Como descrito na secção dos Exemplos que se segue, os presentes inventores descobriram um novo constituinte proteico do processo angiogénico. Esta proteína, que será por aqui em diante designada por LOR-1 (SEQ ID N0:2) pertence à família de enzimas da lisil oxidase que catalisam a formação de ligações cruzadas covalentes entre resíduos de lisina em fibras de colagénio ou elastina adjacentes. Esta família de lisil oxidases inclui quatro genes (Saito et al., 1997; Kim et al., 1995; Reiser et al., 1992; Jang et al., 1999), as sequências proteicas das quais estão apresentadas na SEQ ID N0s:3, 6, 8 e 9. A comparação de homologia entre vários membros da família das lisil oxidases está representada na Figura 8, que é adicionalmente descrita na secção dos Exemplos que se segue.

Cada membro da familia de enzimas lisil oxidase inclui um dominio de lisil oxidase altamente conservado, a atividade do qual é altamente dependente da presença de cobre. Deverá ser notado que o estudo do estado da técnica anterior mostrou que a remoção de cobre dos tecidos tumorais leva à inibição da angiogénese (Rabinovitz, 1999; Yoshida et al., 1995). Esta observação substancia adicionalmente o papel da familia de enzimas da lisil oxidase na angiogénese uma vez que presumivelmente, a remoção de cobre leva à inibição das lisil oxidases. Demais suporte à atividade angiogénica das lisil oxidases é fornecida pelos ensaios de ligação PF4-LOR-1 aqui apresentados. Como acima mencionado, PF4 é um inibidor da angiogénese. Como tal, a atividade antiangiogénica exibida por PF4 pode ser efetuada através da inibição por LOR-1, a qual, é demonstrada da secção dos Exemplos que se segue, é altamente expressa nas células endoteliais dos vasos sanguíneos.

Assim, de acordo com um aspeto da presente invenção, é fornecido um método de modelação da angiogénse, o método sendo realizado através da administração ao tecido mamífero de uma molécula capaz de modificar um nível tecidular e/ou atividade de pelo menos um tipo de lisil oxidase para assim modelar a angiogénese no tecido mamífero. Como aqui usada a frase "nível tecidular" refere-se ao nível da proteína lisina oxidase presente na forma ativa no tecido a um determinado momento temporal. Os níveis de proteína são determinados por fatores tais como, taxas de transcrição e/ou tradução, volume de proteína ou de RNA e/ou localização na célula. Como tal, qualquer molécula que influencie qualquer um destes fatores pode modificar o nível tecidular da lisil oxidase.

Como aqui usado, o termo "atividade" refere-se a uma atividade enzimática da lisil oxidase. Uma molécula que pode modificar a atividade enzimática pode direta ou indiretamente alterar a especificidade ao substrato da enzima ou a atividade do local catalítico relacionado. Existem numerosos exemplos de moléculas que podem especificamente modificar o nivel tecidular e/ou atividade da lisil oxidase. Tais moléculas podem ser categorizadas em subreguladores ou sobrerreguladores da lisil oxidase.

Subreguladores

Um exemplo de um agente capaz de subregular uma proteína lisil oxidase é um anticorpo ou fragmento de anticorpo capaz de se ligar especificamente à lisil oxidase ou pelo menos parte da proteína lisil oxidase (p.ex., região abrangendo o local catalítico) e inibir a sua atividade quando introduzida no tecido mamífero. Como tal, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo dirigido à lisil oxidase pode ser usado para suprimir ou deter a formação de vasos sanguíneos, e para inibir a fibrose e metastização tumoral.

Numerosos exemplos de inibidores de anticorpos são conhecidos do estado da técnica, incluindo inibidores de angiogénese que são direcionados a fatores angiogénicos (Brooks et al., 1994; Brooks et al., 1998).

Preferencialmente, o anticorpo especificamente liga.se a pelo menos um epítopo da lisil oxidade. Como aqui usado, o termo "epítipo" refere-se a qualquer determinante antigénico de um antigénio para o qual o parátopo do anticorpo se liga.

Determinantes epitópicos usualmente consistem de agrupamentos de moléculas quimicamente ativas de superfície tais como aminoácidos ou cadeias laterais de hidratos de carbono e usualmente apresentam caracteristicas estruturais tridimensionais especificas, assim como caracteristicas de carga especificas. 0 termo "anticorpo" como usado nesta invenção inclui moléculas intactas assim como fragmentos funcionais relacionados, tais como Fab, F(ab')2, e Fv que são capazes de se ligarem a macrófagos. Estes fragmentos de anticorpos funcionais são definidos como se segue: (1) Fab, o fragmento que contém um fragmento de ligação ao antigénio monovalente de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido por digestão do anticorpo completo com a enzima papaína para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada; (2) Fab', o fragmento de uma molécula de anticorpo que pdoe ser obtida através do tratamento do anticorpo completo com pepsina, seguido por redução, para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; os dois fragmentos Fab' são obtidos por molécula de anticorpo; (3) (Fab')2, o fragmento do anticorpo que pode ser obtido através do tratamento do anticorpo completo com a enzima papaína sem redução subsequente; F(ab')2 é um dímero de dois fragmentos Fab' mantidos conjuntamente por duas ligações dissulfureto; (4) Fv, definido como um fragmento modificado geneticamente contendo uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada expressas como duas cadeias; e (5) Anticorpo de cadeia simples ("SCN'), uma moléculas geneticamente modificada contendo uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada, ligadas por um péptido de ligação como uma molécula de cadeia simples geneticamente fundida. (6) Métodos de produção de anticorpos monoclonais e policlonais assim como fragmentos relacionados são bem conhecidos do estado da técnica (ver, por exemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988. Fragmentos de anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser preparados por hidrólise proteolitica do anticorpo ou por expressão em E. coli ou células mamíferas (p.ex. cultura de células de ovários de hamster chinês ou outros sistemas de expressão proteica) de DNA codificante do fragmento. Fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por digestão com pepsina ou papaina dos anticorpos integrais por métodos convencionais. Por exemplo, fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para fornecer o fragmento 5S denotado como F(ab')2. Este fragmento pode adicionalmente ser clivado usando um agente redutor de tiol, e opcionalmente um grupo bloqueador para os grupos sulfohidrilo resultando da clivagem de ligações dissulfureto, para produzir fragmentos monovalentes 3,5S Fab'. Alternativamente, uma clivagem enzimática usando pepsina produz dois fragmentos monovalentes Fab' e um fragmento Fc diretamente. Estes métodos são descritos, p.ex., por Goldenberg, Pat. U.S. Nos. 4,036, 945 e 4,331,647, e referências aqui contidas.

Ver também Porter, R. R. [Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]. Outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como a separação de cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeias leve-pesada monovalentes, adicionalmente clivagem de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, quimica, ou genéticas podem também ser usadas, desde que os fragmentos se liguem ao antigénio que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

Fragmentos Fv compreendem uma associação das cadeias VH e VL. Esta associação pode ser não-covalente, como descrita em Inbar et ai. [Proc. Nat. Acad. Sei. USA 69: 2659-62 (1972)]. Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação dissulfureto intermolecular ou ligadas por químicos tais como gluteraldeído.

Preferencialmente, os fragmentos Fv compreendem cadeias VB e VL ligadas por um péptido de ligação. Estas proteínas de ligação ao antigénio de cadeia simples (sPv) são preparadas através da construção de um gene estrutural compreendendo sequências de DNA codificando os domínios VH e VL ligados por um oligonucleótido. 0 gene estrutural é inserido num vetor de expressão, que é subsequentemente introduzido numa célula hospedeira tal como E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma cadeia polipeptídica simples com um péptido de ligação a unir os dois domínios V. Métodos para a produção de sFcs são descritos, por exemplo, por Whitlow and Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Pack et al., Biotechnology 11:1271-77 (1993); e Pat. U.S. No. 4,946,778.

Outra forma de um fragmento de anticorpo é um péptido codificado para uma região determinante de complementaridade (CDR) simples. Os péptidos CDR ("unidades de reconhecimento mínimas") podem ser obtidos através da construção de genes codificando a CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, através do uso da reação em cadeia da polimerase para sintetizar a região variável do RNA de células produtoras de anticorpos.

Ver, por exemplo, Larrick and Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)]. Formas humanizadas de anticorpos não-humanos (p.ex., murinos) são moléculas quiméricas de imunoglobulinas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos relacionados (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab'), ou outras subsequências de anticorpos com ligação ao antigénio) que contém sequências mínimas derivadas de imunoglobulinas não-humanas. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpos recetores) nos quais os resíduos formam uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma espécie não-humana (anticorpo dador) tais como ratinho, rato ou coelho possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejada. Nalgumas circunstâncias, os resíduos de charneira Fv da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não-humanos correspondentes. Anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recetor nem da CDR importada ou sequências charneira. No geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem aqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também irá compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fe) , tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curro Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)] . Métodos para a humanização de anticorpos não-humanos são bem conhecidos do estado da técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado apresenta um ou mais resíduos aminoacídicos introduzidos de uma fonte que é não-humana.

Estes resíduos aminoacídicos não-humanos são muitas vezes referidos como resíduos importados, que são tipicamente retirados de um domínio variável importado. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Rieclunann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], por substituição das CDRs murinas ou sequências de CDR para as sequências correspondendo de um anticorpo humano. Concordantemente, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Pat. U.S. No. 4,816,567), onde substancialmente menos do que um domínio variável intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos murinos.

Os anticorpos humanos podem também ser produzidos usando várias técnicas conhecidas do estado da técnica incluindo bibliotecas fágicas [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)].

Similarmente, anticorpos humanos podem ser produzidos através da introdução de loci de imunoglobulinas humanas em animais transgénicos, p.ex., ratinhos nos quais os genes de imunoglobulina endógenos tenham sido parcial ou completamente inativados. Após exposição, a produção de anticorpos humanos é observada, assemelhando-se grandemente aquela observada em humanos a todos os níveis, incluindo rearranjo genético, montagem, e repertório de anticorpo. Esta abordagem é descrita, por exemplo nas Pat. U.S. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, e nas seguintes publicações cientificas: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al.,

Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994) ; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); w

Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Irnmunol. 13: 65-93 (1995) .

Como abaixo descritas, várias abordagens podem ser usadas para reduzir ou abolir a transcrição ou tradução de uma lisil oxidase. Estas incluem oligonucleótidos antisense, ribozimas, DNAzimas, siRNA e abordagens oligonucleotidicas formadores de hélices triplas.

Polinucleótidos antisense

Subregulação de uma lisil oxidade ser ser efetuada usando um polinucleótido antisense capaz de especificamente hibridar com um transcrito de mRNA codificando a proteína lisil oxidase. O desenho de moléculas antisense que podem ser usadas para eficientemente subregular a lisil oxidase devem ser efetuadas enquanto considerando dois aspetos importantes para a abordagem antisense. O primeiro aspeto é a entrega do oligonuleótido no citoplasma de células apropriadas enquanto o segundo aspeto é o desenho de um oligonucleótido que especificamente se liaga ao mRNA designado nas células numa forma que inibe o processo de tradução relacionado. Várias considerações deverão ser tidas em conta quando desenhando oligonucleótidos antisense. Para uma eficiente inibição in vivo da expressão genética usando oligonucleótidos antisense ou análogos, os oligonucleótidos ou análogos deverão cumprir os seguintes requerimentos: (i) especificidade suficiente na ligação à sequência-alvo; (ii) solubilidade em água; (iii) estabilidade contra nucleases intra- e extracelulares; (iv) capacidade de penetração através da membrana celular; e (v) quando usados para tratar um organismo, baixa toxicidade. Algoritmos para a identificação dessas sequências com a afinidade de ligação prevista para o seu mRNA-alvo baseadas num ciclo termodinâmico que tem em conta a energia de alterações estruturais tanto no mRNA-alvo como no oligonucleótido estão também disponíveis [ver, por exemplo, Walton et al. Biotechnol Bioeng 65: 1-9 (1999)].

Tais algoritmos foram usados com sucesso para implementar uma abordagem antisense nas células. Por exemplo, o algoritmos desenvolvido por Walton et al. permitiu aos cientistas desenharem com sucesso oligonucleótidos antisense para transcritos da beta-globulina de coelho (RBG) e do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa) murino. 0 mesmo grupo de investigação reportou mais recentemente que a atividade antisense de oligonucleótidos racionalmente selecionados contra três modelos de mRNAs-alvo (lactato desidrogenase A e B humana, e gpl30 murina) em cultura de células como avaliado por uma técnica de PCR cinética revelou-se eficaz em praticamente todos os casos, incluindo testes contra três diferentes alvos em dois tipos celulares com químicas de oligonucleótidos fosfodiéster e foforotioato.

Adicionalmente, várias abordagens para o desenho e predição da eficiência de oligonucleótidos específicos usando um sistema in vitro foram também publicados [Matveeva et al., Nature Biotechnology 16: 1374-1375 (1998)].

Uma molécula antisense que pode ser usada na presente invenção inclui um polinucleótido ou um análogo de polinucleótido com pelo menos 10 bases, preferencialmente entre 10 e 15, mais preferencialmente entre 15 e 20, mais preferencialmente pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 22, pelo menos 25, pelo menos 30 ou pelo menos 40 bases que são hibridizáveis in vivo, sob condições fisiológicas, com uma porção de uma cadeia polinucleotidica codificando um polipéptido pelo menos 50 % homólogo à SEQ ID NO: 1, 4, 5 ou 7 ou pelo menos 75 % homólogo a uma porção N-terminal relacionada como determinado usando o software BestFit do pacote de análise de sequências Wisconsin, utilizando o algoritmo Smith e Waterman, onde a penalização de criação de desfasamento equivale a 8 e a penalização de extensão de desfasamento equivale a 2.

Os oligonucleótidos antisense usados pela presente invenção podem ser expressos a partir de uma construção de ácidos nucleicos administrados no tecido, caso em que promotores induziveis podem ser expressos a partir de uma construção de ácidos nucleicos administrada no tecido, caso em que promotores induziveis são preferencialmente usados de tal forma que a expressão antisense pode ser ativada e desativada, ou alternativamente tais oligonucleótidos podem ser quimicamente sintetizados e administrados diretamente no tecido, como parte de, por exemplo, uma composição farmacêutica. A capacidade de sintetizar quimicamente oligonucleótidos e análogos relacionados possuindo uma sequência pré- determinada selecionada oferecer meios de subregular a expressão genética. Quatro tipos de estratégias de modelação da expressão genética podem ser considerados. A nivel transcripcional, oligonucleótidos ou análogos sense ou antisense que se ligam ao DNA genómico por deslocamento da cadeia ou por formação de uma hélice tripla, podem prevenir a transcrição. A nivel transcripcional, oligonucleótidos ou análogos antisense que se ligam a moléculas de mRNA-alvo levam à clivagem enzimática do híbrido pela RNAse H intracelular. Neste caso, por hibridação do mRNA direcionado, os oligonucleótidos ou análogos de oligonucleótidos fornecem um híbrido duplex reconhecido e destruído pela enzima RNAse H. Alternativamente, tal formação do híbrido pode conduzir a interferência com o splicing correto. Como resultados, em ambos os casos, o número de transcritos intactos de mRNA-alvo prontos para tradução é reduzido ou eliminado.

Ao nivel da tradução, os oligonucleótidos ou análogos antisense que se ligam a moléculas de mRNA-alvo previnem, por proteção estérica, a ligação de fatores de tradução essenciais (ribossomas), para o mRNA-alvo, um fenómeno conhecido no estado da técnica como a sequestração da hibridação, impedindo assim a tradução de tais mRNAs.

Oligonucleótidos não-modifiçados são tipicamente pouco práticos para uso como sequências antisense uma vez que eles apresentam curtos tempos de meia-vida in vivo, durante os quais eles são degradados rapidamente por nucleases. Adicionalmente, eles são difíceis de preparar em quantidades superiores a miligramas. Adicionalmente, tais oligonucleótidos são pobres penetrantes da membrana celular. Assim é aparente que de forma a cumprir todos os requerimentos acima listados, os análogos de oligonucleótidos necessitam de ser pensados de um modo adequado. Por exemplo, problemas resultando conjuntamente com o reconhecimento de DNA de cadeia dupla (dsDNA) através da formação de hélices triplas foram diminuídos por um "regresso" inteligente na ligação quimica, onde a sequência de polipurina numa das cadeias é reconhecida, e pelo "regresso", uma sequência homopurina na outra cadeia pode ser reconhecida. Também, uma formação satisfatória da hélice foi obtida através do uso de bases artificiais, assim melhorando as condições de ligação relativamente à força iónica e pH. Adicionalmente, de forma a melhor o tempo de meia-vida assim como a penetração membranar, um grande número de variações no esqueleto polinucleotídico foi feito, muito embora com reduzido sucesso.

Os oligonucleótidos podem ser modificados tanto na base, no açúcar ou na fração fosfato. Estas modificações incluem, por exemplo, o uso de metilfosfonatos, monotiofosfatos, ditiofosfatos, fosforamidatos, ésteres fosfato, fosforotioatos ligados, fosforamidatos ligados, metilenofosfonatos ligados, análogos defosfo internucleótidos com ligações siloxano, ligações carbonato, ligações éster carboximetil, ligações carbonato, ligações éster carboximetil, ligações acetamida, ligações carbamato, ligações tioéter, ligações sulfóxi, ligações sulfona, vários DNAs "plásticos", ligações anoméricas e derivados borano [Cook (1991) Medicinal chemistry of antisense oligonucleotides-future opportunities. Anti-Cancer Drug Design 6: 585]. 0 pedido de patente internacional WO 89/12060 divulga várias unidades básicas para a sintese de análogos oligonucleotidicos, assim como análogos oligonucleotidicos formados através da junção das unidades básicas numa sequência definida. As unidades básicas podem ser "rígidas" (i.e., contendo uma estrutura em anel) ou "flexíveis" (i.e., carecendo de uma estrutura em anel). Em abos os casos, as unidades básicas contêm um grupo hidróxi e um grupo mercapto, através dos quais as unidades básicas se juntam para formar análogos oligonucleotídicos. A fração de ligação nos análogos oligonucleotidicos é selecionada do grupo consistindo de sulfureto (-S), sulfóxido (-S0), e sulfona (-SO2-) · 0 pedido de patente internacional WO 92/20702 descreve um oligonucleótido acíclico que inclui um esqueleto peptídico no qual quaisquer nucleobases químicas ou análogos selecionados são encadeados e servem como elementos de codificação tal como o fariam naturalmente em DNA ou RNA. Estes novos compostos, conhecidos como ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), não são apenas mais estáveis nas células do que os seus homólogos naturais, como também se ligam ao DNA e RNA natural 50 a 100 vezes mais fortemente do que os ácidos nucleicos naturais se ligam uns aos outros. Os oligómeros de PNA podem ser sintetizados a partir de quatro monómeros protegidos contendo timina, citosina, adenina e guanina oir síntese peptídica de fase sólida Merrifield. De forma a aumentar a solubilidade em água e para prevenir a agregação um grupo amida lisina é colocado na região C-terminal.

Os oligonucleótidos de RNA podem também ser usados para inibição antisense uma vez que eles formam um duplex estável RNA-RNA com o alvO, sugerindo uma inibição eficiente. Contudo, devido à sua baixa estabilidade, os oligonucleótidos de RNA são tipicamente expressos dentro das células usando vetores desenhados para este propósito. Esta abordagem é favorecida quando se tentando direcionado um mRNA que codifica uma proteína abundante e de longa-vida . 0 estado da técnica anterior ensina um número de estratégias de entrega que podem ser usadas para entregar eficientemente oligonucleótidos numa grande variedade de tipos celulares (ver, por exemplo, Luft J Mol Med 76: 75-6 (1998); Kronenwett et ai. Blood 91: 852-62 (1998); Rajur et ai. Bioconjug Chern 8: 935-40 (1997); Lavigne et al. Biochem Biophys Res Commun 237: 566-71 (1997) and Aoki et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 231: 540-5 (1997)]. A terapêutica antisense apresenta o potencial para tratar muitas doenças potencialmente mortais com um número de vantagens face aos fármacos tradicionais. Os fármacos tradicionais intervêm após a proteina causadora da doença estar formada. A terapêutica antisense, contudo, bloqueia a transcriçãO/tradução de mRNA e intervém antes da proteina ser formada, e uma vez que a terapêutica antisense apenas direciona um mRNA especifico, ela deverá ser mais eficaz e produzindo menos efeitos secundários do que a terapia atual de inibição de proteínas. Vários ensaios clínicos demonstraram a segurança, exequibilidade e atividade de oligonucleótidos antisense. Por exemplo, oligonucleótidos antisense adequados para o tratamento de cancro foram usados com sucesso [Holmund et al., Curr Opin Mol Ther 1: 372-85 (1999)], enquanto o tratamento de malignidade hematológicas via oligonucleótidos antisense direcionados aos genes c-myb, p-53 e Bcl-2 chegaram a entrar em ensaios clínicos e foram demonstrados como sendo bem tolerados pelos pacientes [Gerwitz Curr Opin Mol Ther 1: 297-306 (1999)].

Mais recentemente, a supressão mediada por oligonucleótidos antisense da expressão genética da heparanase humana foi reportada como inibindo a disseminação pleural de células cancerosas humanas num modelo murino [Uno et al., Cancer Res 61: 7855-60 (2001)]. O primeiro fármaco antisense foi recentemente aprovado pela FDA. O fármaco, Fomivirsen, foi desenvolvido pela empresa Isis, e é indicado para o tratamento local de citomegalovirus em pacientes com SIDA que são intolerantes a ou possuem contraindicações para outros tratamentos de retinite CMV ou que foram insatisfatoriamente responsivos a tratamentos anteriores para a retinite CMV (Pharmacotherapy News Network) .

Assim, o atual consenso é que desenvolvimentos recentes no campo da tecnologia antisense que, como acima descrito, levam à produção de algoritmos antisense desenvolvidos com elevada precisão e uma grande variedade de sistemas de entrega de oligonucleótidos, permitem a uma pessoa rotineiramente habilitada no estado da técnica desenvolver e implementar abordagens antisense adequadas para a subregulação da expressão de sequências conhecidas sem haver necessidade de recorrer a ensaios indevidos ou experimentação errónea.

Ribozima

Outro agente capaz de subregular uma lisil oxidade é uma molécula de ribozima capaz de especificamente clivar um transcrito mRNA codificando uma lisil oxidase. As ribozimas têm sido crescentemente usadas para a inibição especifica de sequências de expressão genética por clivagem dos mRNAs codificantes de proteinas de interesse [Welch et al., Curr Opin Biotechnol. 9: 486-96 (1998)]. A possibilidade de desenvolvimento de ribozimas para clivar qualquer RNA-alvo especifico tornou-as valorosas ferramentas tanto na investigação básica como em aplicações terapêuticas. Na área terapêutica, as ribozimas foram exploradas para direcionar RNAs viricos em doenças infeciosas, oncogenes dominantes em cancros e mutações somáticas especificas em distúrbios genéticos [Welch et al., Clin Diagn Virol. 10: 163-71 (1998)] . Mars notavelmente, vários protocolos de terapia genética com ribozimas para pacientes HIV encontram-se já em ensaios clinicos de fase 1. Mais recentemente, ribozimas têm sido utilizadas em pesquisa animal transgénica, validação de alvos genéticos e elucidação de vias celulares. Várias ribozimas encontram-se em várias fases de ensaios clinicos. ANGIOZYME foi a primeira ribozima sintetizada quimicamente a ser estudada em ensaios clinicos humanos. A ANGIOZYME inibe especificamente a formação de VEGF-r (recetor do fator de crescimento endotelial vascular), um componente-chave na via da angiogénese. Rybozyme Pharmaceuticals, Inc, assim como outras firmas demonstraram a importância da terapêutica antiangiogénse em modelos animais. HEPTAZYME, uma ribozima designada para destruir selectivamnete o RNA do Virus da Hepatite C (HCV), mostrou-se efetiva na diminuição do RNA do virus da Hepatite C em ensaios de cultura celular(Ribozima Pharmaceuticals, Incorporated -WEB home page). DNAzima

Outro agente capaz de subregular uma lisil oxidase é uma molécula DNAzima capaz de clivar especificamente um transcrito de mRNA ou uma sequência de DNA codificando uma lisil oxidase. DNAzimas são polinucleótidos de cadeia simples capazes de clivar cadeias simples ou duplas em sequências alvo (Breaker, R.R. and Joyce, G. Chemistry and Biology 1995; 2: 655; Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Nat, Acad. Sei. EUA 1997; 943: 4262). Um modelo geral (modelo "10-23") para a DNAzima foi proposto. "10-23" DNAzimas possuem um dominio catalitico de 15 deoxirribonucleótidos, ladeado por dois domínios de reconhecimento do substrato com sete a nove deoxirribonucleótidos cada. Este tipo de DNAzima pode clivar efetivamente o seu substrato de RNA nas junções purinarpirimidina (Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Nat, Acad. Sei. USA 1997; 943: 4262; para revisão de DNAzimas ver Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4: 119-21 (2002)].

Exemplos de construção e amplificação de DNAzimas sintéticas, projetadas que reconhecem cadeias simples ou duplas de locais alvo de clivagem foram divulgados em Pat. U.S. No. 6, 326, 174 a Joyce et al. DNAzimas de conceção similar, direcionadas contra o recetor da uroquinase humana, foram observadas recentemente capazes de inibir a expressão do recetor da Uroquinase e inibir com sucesso a metastização de células do cancro do colon in vivo (ltoh et al., 2002, Abstract 409, Ann Meeting Am. Soc. Gen. Ther. www.asgt.org). Noutra aplicação, DNAzimas complementares ao oncogene bcr-abl foram efetivas na inibição da expressão dos oncogenes nas células leucémicas, e na diminuição da taxa de recaída de transplantes autólogos da medula óssea nos casos de CML e ALL.

si RN A

Outro mecanismo para subregular uma lisil oxidase ao nível da transcrição é o RNA de interferência (RNAi), uma abordagem que utiliza pequenas moléculas de dsRNA interferente (siRNA) que são homólogas à sequência de RNA-alvo e levam à sua degradação [Carthew RW. Gene silencing by double-stranded RNA. Curr Opin Cell Biol 2001 Apr;13(2):244-8].

Interferência por RNA é um processo em dois passos. No primeiro passo, o qual é designado como o passo de iniciação, o dsRNA introduzido é digerido em pequenas moléculas de 21-23 nucleótidos (nt) de RNAs de interferência, provavelmente pela ação da Dicer, um membro da família de RNase tipo III de ribonucleases específicas de dsRNA, a qual processa (cliva) dsRNA (introduzido diretamente ou através de um transgene ou um vírus) num processo dependente de ATP. Eventos de clivagens sucessivas degradam o RNA em fragmentos de cadeia dupla de 19-21 pb (siRNA), cada um com 2-nucleótidos não pareados na extremidade 3' [Hutvagner and Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12: 225-232 (2002); and Bernstein Nature 409: 363-366 (2001)].

No passo efector, os fragmentos de cadeia dupla de siRNA ligam-se a um complexo de nuclease para formar o complexo silenciador induzido por RNA (RISC). Um desenrolamento dependente de ATP dos fragmentos de siRNA de cadeia dupla são necessários para a ativação do RISC. O RISC ativo posteriormente liga-se ao transcrito homólogo através de interação de pares de bases e cliva o mRNA em fragmentos de 12 nucleótidos a partir da extremidade 3' do siRNA [Hutvagner and Zamore Curro Opin. Genetics and Development 12: 225-232 (2002); Hammond et al. (2001) Nat. Rev. Gen. 2: 110-119 (2001); and Sharp Genes. Dev. 15: 485-90 (2001)]. Embora o mecanismo de clivagem encontre-se ainda por elucidar, investigação indica que cada RISC contém um único siRNA e uma RNase [Hutvagne e Zamore Curro Opin. Genetics and Development 12: 225-232 (2002)].

Devido à notável potência do RNAi, um passo de amplificação no interior do processo de RNAi tem sido sugerido. Amplificação pode ocorrer mediante a cópia do dsRNAs introduzido, o qual poderia formar mais siRNAs, ou através da replicação do siRNAs formado. Alternativamente e/ou adicionalmente, a amplificação pode ser efetuada por múltiplos eventos de renovação do RUSC [Hammond et al. Nat. Rev. Gen. 2: 110-119 (2001), Sharp Genes. Dev. 15: 485-90 (2001); Hutvagner e Zamore Curro Opin. Genetics and

Development 12: 225-232 (2002)]. Para mais informação sobre RNAi ver as seguintes revisões Tuschl Chern Biochem. 2: 239-245 (2001); Cullen Nat. Immunol. 3: 597-599 (2002); and Brant! Biochem. Biophys. Act. 1575: 15-25 (2002). A síntese de moléculas de RNAi adequadas para o uso com a presente invenção pode ser efetuada como se segue. Primeiro, a sequência de mRNA da lisil oxidase é copiada a jusante do codão de iniciação AUG para sequências de dinucleótidos AA. A ocorrência de cada AA e dos 19 nucleótidos adjacentes na extremidade 3' é gravada como potenciais locais alvo de siRNA. Preferencialmente, os locais alvo de siRNA são selecionados a partir da estrutura de leitura aberta, como regiões não traduzidas (UTRs) são mais ricas em locais de ligação de proteínas reguladoras.

Proteínas de ligação UTR e/ou complexos de iniciação de tradução podem interferir com a ligação do complexo endonuclease do siRNA [Tuschl Chern Biochem. 2: 239-245,2001]. Será apreciado, porém, que os siRNAs dirigidos a regiões não traduzidas podem também ser eficazes, como demonstrado para a GAPDH em que o siRNA dirigido a UTR 5' mediou decréscimo de cerca de 90% de mRNA de GAPDH celular e o nível da proteína foi completamente abolido (www.ambion.comltechlib/tn/91/912.html).

Em segundo lugar, locais alvo potenciais são comparados a uma base de dados genómica apropriada (p.ex., humano, murganho, rato etc.) usando qualquer software de alinhamento de sequências, tal como o software BLAST disponível no servidor NCBI (www.ncbi.nlm.nih.govIBLAST /). Locais alvo putativos que apresentam homologia significativa com outras sequências de codificação são filtrados para fora. Sequências alvo de qualificação são selecionados como molde para a síntese de siRNA.

Sequências preferidas são aquelas que incluem baixo conteúdo G/C uma vez que estas mostraram-se mais efetivas no silenciamento de genes quando comparadas com outras com conteúdos de G/C superiores a 55%. Vários locais alvo são preferencialmente selecionados ao longo do comprimento do gene alvo para avaliação. Para melhor avaliação dos siRNAs selecionados, um controlo negativo é preferencialmente usado em conjunto. 0 controlo negativo de siRNA inclui preferencialmente a mesma composição de nucleótidos dos siRNAs, mas não têm homologia significativa com o genoma. Assim, uma sequência de nucleótidos embaralhada do siRNA é utilizada preferencialmente, uma vez que não apresenta qualquer homologia significativa com qualquer outro gene.

As moléculas de siRNA da presente invenção são preferencialmente transcritas a partir de vetores de expressão que podem facilitar a expressão estável dos transcritos de siRNA, uma vez introduzidos numa célula hospedeira. Estes vetores são manipuladas para expressar estruturas pequenas de RNAs em forma de gancho (shRNAs), que são processados in vivo em moléculas de siRNA capazes de realizar silenciamento especifico de genes [Brummelkamp, T.R., et al., (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296: 550-53; Paddison, P.I., et al. (2002) Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequencespecific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16:948-58; Paul et al. (2002) Nature Biotech. 20: 505-08; Yu, J.Y., et al. (2002) RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 6047-52] .

Um exemplo de um vetor de expressão adequado é o pSUPER™, que inclui o gene promotor da HI-RNA polimerase III, com um começo de transcrição bem definido e um sinal de finalização que consiste em cinco timidinas consecutivas (T5) [Brummelkamp, T.R. et al. (2002), Science 296: 550-53J. Mais importante, a clivagem do transcrito no local de finalização está num local após a segunda uridina, obtendo-se assim um transcrito que se assemelha às extremidades de siRNAs sintéticos, que também contêm nucleótidos não pareados. siRNA é clonado de tal modo que inclui a sequência de interesse, isto é, lisil oxidase separada por um espaçador curto a partir do complemento inverso da mesma sequência. O transcrito resultante dobra para trás sobre si próprio para formar uma estrutura em stem-loop, a qual medeia o RNAi da lisil oxidase.

Outro vetor de expressão de siRNA adequado codifica sequências sense e antisense de siRNA sob a regulação de promotores polIII separados [Miyagishi and Taira (2002) Nature Biotech. 20: 497-500]. O siRNA, produzido por este vetor também inclui um sinal de finalização constituído por cinco moléculas de timidina (T5).

Uma vez que as abordagens para a introdução de siRNA sintético nas células por lipofecção podem resultar em baixa eficiência de transfecção em alguns tipos de células e/ou persistência curta dos efeitos de silenciamento, métodos mediados por vetores têm sido desenvolvidos. Deste modo, as moléculas de siRNAs utilizadas pela presente invenção são preferencialmente introduzidas nas células usando retrovirus. A introdução de siRNA usando retrovirus fornece várias vantagens sobre métodos, tais como a lipofecção, uma vez que a entrega por retrovirus é mais eficiente, uniforme e imediatamente seleciona para células "nocaute" estáveis [Devroe, E. and Silver, P.A. (2002). Retrovirus-delivered siRNA. BMC Biotechnol. 2:15].

Publicações cientificas recentes têm validado a eficácia de tais pequenas moléculas de cadeia dupla de RNA na inibição da expressão de mRNA-alvo e posteriormente demostraram claramente o potencial terapêutico de tais moléculas. Por exemplo, RNAi tem sido utilizada para inibir a expressão do virus da hepatite C (McCaffrey, A. P., et al., 2002, Gene expression: RNA interference in adult mice. Nature 418, 38-39), HIV-1 (Jacque, JM., et al. 2002, Modelation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature 418, 435-438), células malignas do colo do útero (Jiang, M., and Milner, J. 2002, Selective silencing of viral gene expression in HPV -positive human cervical carcinoma cells treated with siRNA, a primer of RNA interference. Oncogene 21, 6041-8) e células leucémicas [Wilda, M., et al., 2002, Killing of leukemic cells with a BCRfABL fusion gene by RNA interference (RNAi). Oncogene 21,5716-24].

Oligonucleótidos formando hélice tripla (TFO)

Um método adicional para a regulação da expressão da lisil oxidase nas células é através de um triplex formado por oligonucleótidos (TFOs). Estudos recentes mostraram que TFOs podem ser concebidos, os quais podem reconhecer e ligar-se a regiões de polipurina polipirimidina na hélice de cadeia dupla de DNA numa forma especifica de sequência. Estas regras de reconhecimento são descritas por Maher ill, L. J., et al., Science (1989), 245: 725-730; Moser, Η. E., et al., Science (1987), 238: 645-630; Beal, P. A., et al., Science (1992), 251: 1360-1363; Cooney, M., et al., Science (1988), 241: 456-459; and Hogan, Μ. E., et al., EP Publication 375408. Modificação dos oligonucleótidos, tais como a introdução de intercaladores e substituições do cerne e otimização das condições de ligação (pH e concentração de catiões) têm ajudado a superar os obstáculos inerentes à atividade de TFO tais como repulsão de cargas e instabilidade, e foi recentemente mostrado que oligonucleótidos sintéticos podem ser direcionados para sequências especificas [para uma revisão recente ver Seidman and Glazer, J. Clin. Invest. (2003), 112: 487-94].

De modo geral, o triplex formado por oligonucleótidos tem a sequência de correspondência:

oligo 3 '--A G G T duplex 5'--A G C T duplex 3' —T C G A

No entanto, foi verificado que os tripletos A-AT e G-GC têm a maior estabilidade da hélice tripla (Reither and Jeltsch, BMC Biochem, 2002, Septl2, Epub). Os mesmos autores demonstraram que TFOs concebidos de acordo com a regra A-AT e G-GC não formam triplex não-especificos, indicando que a formação de triplex é de facto especifica de sequência.

Assim, para qualquer sequência dada na região reguladora da lisil oxidase uma sequência formadora de triplex pode ser concebida. Complexos de oligonucleótidos em tripla hélice possuem preferencialmente pelo menos 15, mais preferencialmente 25, ainda mais preferencialmente 30 ou mais nucleótidos em extensão, até 50 ou 100 bp.

Transfecção de células (por exemplo via lipossomas catiónicos) com TFOs, e formação da estrutura de hélice tripla com o DNA alvo induz transfecção de células (por exemplo, via lipossomas catiónicos) com TFOs, e formação da estrutura em hélice tripla com o DNA-alvo induz alterações estéreoquimicas e funcionais, bloqueando a iniciação da transcrição e alongamento, permitindo a introdução de alterações de sequência pretendidas no DNA endógeno e resultando na subregulação da expressão do gene especifico. Exemplos de tal supressão na expressão genética nas células tratadas com TFOs incluem nocaute do epissoma supFGl e gene endógeno HPRT nas células de mamíferos (Vasguez et al., Nucl Acids Res. 1999; 27: 1176-81, and Puri, et al., J Biol Chern, 2001; 276: 28991-98), e a seguência e subregulação alvo específica da expressão do fator de transcrição ETS2, importante na etiologia do cancro da próstata, (Carbone, et al., Nucl Acid Res. 2003; 31: 833- 43), e o gene proinflammatório ICAM-1 (Besch et al., J Bioi Chern, 2002; 277: 32473-79). Adicionalmente, Vuyisich e Beal mostraram recentemente que sequências especificas de TFOs podem ligar dsRNA, inibindo a atividade de enzimas dependents de dsRNA tais como cinases dependents de RNA (Vuyisich and Beal, Nuc. Acids Res 2000; 28: 2369- 74).

Adicionalmente, TFOs construídos de acordo com os princípios referidos acima podem induzir diretamente mutagenese capaz de efetuar a reparação de DNA, proporcionando assim a subregulação e a sobreregulação da expressão de genes endógenos (Seidman and Glazer, J Clin Invest 2003; 112: 487-94).

Descrição detalhada do desenho, síntese e administração de TFOs efetivos pode ser encontrada em Ped. Pat. U.S. Nos. 2003 017068 e 2003 0096980 a Froehler et al., e 2002 0128218 e 2002 0123476 a Emanuele et al., e Pat. U.S. No. 5,721,138 a Lawn.

Os subreguladores descritos aqui anteriormente seriam particularmente utéis para inibição da angiogenese nos tecidos tumorais. Tem sido demonstrado que o PF4, uma proteína de ligação da lisil oxidase, a qual inibe a angiogénese nos tecidos tumorais especificamente acumula-se nos vasos sanguíneos recém-formados do tumor (vasos formados por angiogénese) mas não nos vasos sanguíneos já estabelecidos (Hansell, P., et al., 1995, Selective binding of platelet fator 4 to regions of ative angiogénese in vivo. Amer. J. Physiol-Heart. Circ. Phy. 38, H829- H836; Reiser, K., et al., 1992, Enzymatic and nonenzymatic cross-linking of collagen and elastin. FASEB J. 6,2439-2449).

Os vasos sanguíneos recém-formados por angiogénese são mais permeáveis a proteínas que os já estabelecidos porque o principal indutor da angiogénese em muitas doenças dependentes da angiogenese é o VEGF, um fator de crescimento que também funciona como um potente fator permeabilizante dos vasos sanguíneos (VPF) [Neufeld et al., 1999, Vascular endotelial growth fator (VEGF) and its receptors. FASEB J. 13(1): 9-22]. Os vasos sanguineos associados ao tumor estão portanto num permanente estado de hiperpermeabilidade devido à sobreexpressão do VEGF (Shweiki et al., 1995; Rak et al., 1995) e deste modo, uma molécula subreguladora usada de acordo com o método da presente invenção seria capaz de se extravasar eficientemente a partir dos vasos sanguineos tumorais mas menos eficientemente a partir dos vasos sanguineos normais já estabelecidos.

Sobre reguladores Várias abordagens podem ser usadas para aumentar os niveis da lisil oxidase e como tal potenciar a formação de vasos sanguineos. Por exemplo, uma construção de ácido nucleico incluindo um promotor constitutivo, indutivel ou especifico do tecido, posicionado a montante de um polinucleótido que codifica um polipeptideo possuindo atividade lisil oxidase, tal como o poipeptideo definido em SEQ ID N0:2, 3, 6, 8 ou 9 pode ser administrado em tecidos dos mamíferos. A lisil oxidase expressa a partir desta construção pode aumentar substancialmente os níveis da lisil oxidase no interior das células dos tecidos e como tal aumentar a angiogénese.

Os segmentos de polinucleótido codificando a lisil oxidase pode ser ligada a um vetor de expressão disponível comercialmente. Um tal vetor de expressão inclui uma sequência promotora para dirigir a transcrição da sequência de polinucleótido na célula de uma forma constitutiva ou indutivel. Um promotor adequado pode ser, por exemplo, um promotor Tie-2 o qual é capaz de direcionar a expressão génica especifica da lisil oxidase nas células endoteliais (ver Schlaeger,T.M., Bartunkova,S., La.witts,J.A., Teichmann,G., Risau,W., Deutsch,U., and Sato,T.N. (1997). Uniform vascular-endothelial-cell-specific gene expression in both embryonic and adult transgenic mice. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A 94, 3058-3063). O vetor de expressão da presente invenção pode ainda incluir sequências de polinucleótidos adicionais, tais como, por exemplo, sequências que codificam marcadores de seleção ou polipeptideos repórter, sequências que codificam origem de replicação em bactérias, sequências que permitem a tradução de várias proteínas a partir de um único mRNA, tais como um local interno de entrada do ribossoma (IRES), sequências para integração genómica do polipeptídeo promotor quimérico codificando regiões e / ou sequências geralmente incluídas no vetor de expressão usado nos mamíferos tais como pcDNA3, pcDNA3. 1 (+1-), pZeoSV2(+I-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/mydcyto, pCR3,l, os quais estão disponiveis na Invitrogen, pCI o qual está disponível na Promega, pBK-RSV e pBK-CMV que está disponível na Strategene, pTRES disponível na Clontech, e seus derivados.

Será verificado que tais sistemas de vetores disponíveis comercialmente podem facilmente ser modificados através de técnicas recombinantes, usadas geralmente de modo a substituir, duplicar ou mutar promotores existentes ou potenciar sequências e /ou introduzir qualquer sequência de polinucleótido adicional.

Um agente capaz de sobreregular uma lisil oxidase pode também ser qualquer composto capaz de aumentar a transcrição e/ou tradução de DNA endógeno ou mRNA codificando uma lisil oxidase usando por exemplo técnicas genéticas "knock in".

Elementos intensificadores podem ser "knocked-in" em posição adjacente às sequências codificadoras da lisil oxidase endógena para aumentar desse modo a transcrição dos mesmos. Mais detalhes relacionados com a construção e utilização de construções Knock out e knock-in é fornecido em outros lugares [Fukushige S. and Ikeda, J.E. Trapping of mammalian promoters by Cre-Iox site-specific recombination. DNA Res 3 (1996) 73- 80; Bedell, M.A., et al. Mouse models of human disease. Part I: Techniques and resources for genetic analysis in mice. Genes and Development 11 (1997) 1-11; Bermingham, J.J., et al. Tst-l/Oct-6/SCIP regulates a unique step in peripheral myelination and is required for normal respiration. Genes Dev 10 (1996) 1751-62].

Será demonstrado que a administração direta de um polipeptideo possuindo atividade de lisil oxidase pode também ser usada para potenciar a angiogénese.

Assim, os ensaios de afinidade de ligação e/ou ensaios de atividade, cujos princípios são bem conhecidos no estado da técnica, podem ser utilizados para o rastreio de novos compostos (p.ex., substratos análogos) que podem especificamente regular a atividade de uma lisil oxidase e como tal podem ser utilizados com a presente invenção.

Um ensaio adequado para utilização com este aspeto foi previamente descrito num estudo conduzido por Bedell-Hogan et al., 1993. Como está claramente ilustrado na secção de exemplos seguinte, o presente estudo também correlaciona os niveis de expressão de LOR-1 a propriedades de metastização das linhas celulares derivadas de cancro da mama, indicando que LOR-1 pode desempenhar um papel adicional na capacidade de invasão tumoral em adição ao seu papel na angiogénese.

Deste modo, a presente publicação fornece também um método para inibição de metástases e/ou fibrose num tecido mamífero. 0 método é efetuado pela administração ao tecido mamífero de uma molécula capaz de subregular o nível tecidular e/ou a atividade de pelo menos um tipo de lisil oxidase. 0 método da presente publicação pode ser usado para tratar doentes humanos que tenham sido diagnosticados com cancros, através da administração de qualquer uma das moléculas subreguladoras descritas previamente, de modo a reduzir os níveis tecidulares e/ou atividade de pelo menos um tipo de lisil oxidase.

Como usado aqui, o expressão "cancro" refere-se a qualquer tumor maligno no interior do corpo humano incluindo, mas não se limitando a, tumores com metástases. Adicionalmente, e sem estar ligado a qualquer tipo de cancro, a presente invenção é útil para tratar cancro da mama, com ou sem metástases.

Como usado aqui, o conceito "administração" refere-se a todos os modos de administração descritos a seguir com respeito à composição farmacêutica da presente invenção. Esta inclui, mas não limitada a, administração local no tecido tumoral, um órgão onde o cancro foi diagnosticado e/ou tecidos relacionados para onde tipicamente se apresentam metastases [Hortobagyi, 2002, Semin Oncol 29 (3 Suppl 11): 134-44; Morrow and Gradishar, 2002, 324: 410-4]. Exemplos de tecidos relacionados incluem os nódulos linfáticos adjacentes a, por exemplo, tecido mamário e osso.

Administração pode também ser efetuada de um modo sistemático de modo a tratar o tecido afetado, i.e., o tecido onde o cancro se formou e onde se apresentam metástases ou onde provavelmente se formarão com a progressão do tumor.

Uma vez que qualquer molécula capaz de subregular a atividade da lisil oxidase pode ser usada pelos métodos descritos previamente, a presente invenção fornece também um método para identificar moléculas capazes de inibir a metastização e/ou a fibrose.

Este método é efetuado por rastreio e identificação de moléculas que exibem reatividade especifica com pelo menos um tipo de lisil oxidase e testando o potencial inibitório de metastização e/ou fibrose destas moléculas.

Numerosos tipos de moléculas podem ser avaliadas para a reatividade com pelo menos um tipo de lisil oxidase, exemplos incluem, mas não estão limitados a, moléculas tais como oligonucleótidos antisense, siRNA, DNAzimas, ribozimas e oligonucleótidos formando hélice tripla (TFOs) que interagem com um polipeptídeo que expressa atividade lisil oxidase ou moléculas tais como anticorpos que interagem com polipeptideos possuindo atividade lisil oxidase.

Adicionalmente, pequenos peptídeos e outras moléculas pequenas podem também ser avaliadas pelo método da presente invenção.

Avaliação de reatividade cruzada pode ser efetuada por ensaios de atividade enzimática da lisil oxidase, através de ensaios de ligação e similares. Exemplos de ensaio adequados são apresentados por Rodriguez et al., 2002, Arterioscler Thromb Vase Biol 22: 1409-14; Wilson and Nock, 2002, Curr Opin Chern Biol 6: 81-5; Uetz, 2002, Curr Opin Chern Biol 6: 57-62; Stoll et al., 2002, Front Biosci 2002 7: cl3-32) .

Avaliação do fenótipo metastático de células tumorais transformadas pode ser realizada in vitro uma vez que aproximadamente todos os passos do processo de metastização, incluindo a adesão, degradação da matriz e migração, podem ser modelados experimentalmente in vitro mediante a medição da invasão da membrana basal reconstituída (RBM). A invasão metastática das células tumorais pode ser modelada através da migração de células tumorais para dentro da membrana basal reconstituída (RBM)na presença ou ausência de um quimioatractivo, tal como o meio de acondicionamento de fibroblastos (FCM) . O ensaio determina células que aderiram à RBM, degradaram a RBM enzimaticamente e, finalmente, células que penetraram o lado da membrana que possui FCM.

Uma vez que o processo de metastização in vitro corresponde a passos observados na metastização in vivo de células tumorais através da membrana basal, a capacidade de invasão celular in vitro pode ser analisada pelos métodos descritos em Albini et al., 1987 Cancer Research 47: 3239-3245. Ensaios para avaliação da capacidade de invasão e outros métodos para determinar o efeito da metastização, são descritos em Leyton et al., 1994 Cancer Research 54: 3696-3699. Preparações de membrana basal reconstituída para utilização em conformidade com os ensaios aqui descritos acima estão facilmente disponíveis a partir de vários fornecedores comerciais. Um exemplo adequado neste tópico é "MATRIGEL" disponível a partir da Collaborative Biomedical Products of Bedford, MA.

Avaliação in vitro do fenótipo cellular metastático pode também ser efetuada pela daterminação dos níveis e padrão de expressão de um ou mais marcadores associados à metastização tais como marcadores derivados de protéases, os quais são considerados como parte integral da metastização tumoral (ver Pat. U.S. No.: 6, 303, 318). Um exemplo é o ácido araquidónico, a libertação deste nas células podendo servir como indicador do potencial metastático do tumor (Pat. U.S. No. 6,316,416). Neste sentido, a determinação da atividade da fosfolipase A-2 (PLA2), e a atividade ou abundância dos fatores que afetam a atividade da PLA2, tais como a proteína uteroglobina (Pat. U.S. No. 6,316,416) pode servir como uma indicação do potencial metastático. A determinação do padrão e níveis de expressão dos marcadores associados a metástases pode ser efetuada por um de vários métodos descritos no estado da técnica. A presença ou nível de proteínas indicativas de potencial metastático pode ser determinada nas células através de métodos convencionais bem conhecidos no estado da técnica pelos peritos. Por exemplo, as técnicas para preparação e utilização de anticorpos e outros reagentes imunológicos e para a deteção de proteínas específicas em amostras usando tais reagentes estão descritos em protocolos correntes de imunologia, Coligan et al., Eds., John Wiley & Sons, New

York, (1995) . Como um outro exemplo, métodos imunohistoquimicos para a determinação de proteínas nas células dos tecidos são descritos no volume 2, capítulo 14 dos protocolos correntes de biologia molecular, Ausubel et al., Eds., John Wiley & Sons, Inc. (1994). Finalmente, Linnoila et al., AJ.C.P. 97(2): 235-243 (1992) e Peri et al. , J. Clin. Invest. 92: 2099-2109 (1992), aqui incorporados como referido previamente, descrevem técnicas que podem ser necessárias, em parte, neste aspeto da presente invenção. O potencial metastático pode também ser determinado in vivo ao nível do mRNA. A presença e/ou o nível de transcritos de mRNA pode ser determinada por uma variedade de métodos conhecidos pelos peritos no estado da técnica. Um dado mRNA pode ser detetado nas células mediante hibridação com uma sonda específica. Tais sondas podem ser DNAs clonado ou os seus fragmentos, RNA, tipicamente feito por transcrição in vitro, ou sondas de oligonucleótidos, geralmente por síntese em fase sólida. Métodos para a produção e utilização de sondas adequadas para hibridação específica são bem conhecidos e usados no estado da técnica.

Uma variedade de controlos pode ser utilmente empregada para melhorar a precisão nos ensaios de deteção de mRNA. Por exemplo, as amostras podem ser hibridadas com uma sonda irrelevante e tratado com RNase, antes da hibridação, para avaliar uma falsa hibridação.

De modo a modelar a angiogénese ou inibir a metastização do tumor ou fibrose, as moléculas utilizadas numa publicação presente podem ser administradas, por si só, ao indivíduo ou numa composição farmacêutica, na qual é misturado com transportadores ou excipientes adequados.

Como usado aqui uma "composição farmacêutica" refere-se à preparação de um ou mais dos ingredientes ativos aqui descritos com outros componentes químicos tais como transportadores fisiológicos adequados e excipientes. 0 objetivo de uma composição farmacêutica é facilitar a administração/introdução de um composto num mamífero.

Como usado aqui o termo "ingrediente ativo" refere-se à preparação responsável pelo efeito biológico, isto é, as moléculas de sobreregulador / subregulador utilizadas pela presente invenção para modelar a angiogénese e as moléculas subreguladoras utilizadas por uma publicação presente para inibir a metastatização do tumor e fibrose.

Daqui em diante, as expressões "transportador fisiologicamente aceitável" e "veículo farmaceuticamente aceitável" são indiferentemente usadas para referir-se a um transportador, tais como, por exemplo, um lipossoma, um vírus, uma micela, ou uma proteína, ou um diluente que não causam irritação significativa para o mamífero e não anula a atividade biológica e propriedades do ingrediente ativo. Um adjuvante é incluído nestas frases.

Aqui o termo "excipiente" refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar ainda mais a administração de um ingrediente ativo. Exemplos, sem limitação, de excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e glicóis de polietileno.

As técnicas para formulação e administração de composições podem ser encontrados em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, P A, última edição. As vias adequadas de administração podem, por exemplo, incluir a via oral, retal, transmucosa, transnasal, intestinal ou entrega parentérica, incluindo injeções intramusculares, subcutâneas e intramedulares, bem como intratecal, intraventricular direta, endovenosa, intraperitoneal, intranasal, ou injeções intraoculares.

Para injeção, os ingredientes ativos da divulgação podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico. Para administração transmucosa, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos no estado da técnica.

Para administração oral, os compostos podem ser formulados prontamente por combinação do ingrediente ativo com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos no estado da técnica. Tais transportadores permitem que o ingrediente ativo da invenção seja formulado como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um paciente. Preparações farmacológicas para uso oral podem ser preparadas utilizando um excipiente sólido, opcionalmente moendo a mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou drageias coloridas. Excipientes adequados são, em particular, formas de preenchimento tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose tais como por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma de tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil-celulose, carbometilcellulose de sódio; e/ou polímeros fisiologicamente aceitáveis tais como polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentes de desintegração, podem ser adicionados, tais como, polivinilpirrolidona com ligações cruzadas, ágar, ou ácido algínico ou um seu sal tal como alginato de sódio.

Drageias coloridas são formadas com um revestiemnto adequado. Para este pressuposto,soluções concentradas de açucares podem ser usadas, as quais podem opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenoglicol, dióxido de titânio,soluções de vernizes e solventes orgânicos adequados ou mistura de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados ao revestimento dos comprimidos ou drageias para a sua identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses do composto ativo.

As composições farmacêuticas, que podem ser utilizadas oralmente, incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, bem como cápsulas seladas, moles, feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerina ou sorbitol. As cápsulas seladas podem conter o ingrediente ativo misturado com compostos de preenchimento, tais como lactose, ligantes, tais como amido, lubrificantes, tais como o talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente estabilizadores. Nas cápsulas moles, o ingrediente ativo pode ser dissolvido ou suspenso em liquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina liquida, ou polietilenoglicóis liquidos. Adicionalmente, estabilizadores podem ser adicionados. Todas as formulações para administração oral podem estar em dosagens adequadas para a via de administração escolhida.

Para administração oral, a composição pode ser tomada na forma de comprimidos ou pastilhas fabricadas de modo convencional.

As preparações descritas aqui podem ser produzidas para administração parentérica, por exemplo, por bolus injetável ou por infusão contínua. As formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem única, por exemplo, em ampolas ou num contentor multidoses com a adição opcional de um agente de conservação. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em óleo ou num veículo aquoso, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização, e/ou dispersão.

Composições farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas da preparação ativa numa forma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões de ingredientes ativos, podem ser preparadas como suspensões injetáveis adequadas, de base aquosa ou oleosa. Solventes lipofílicos adequados ou veículos incluem óleos gordos tais como o óleo de sésamo, ou esteres de ácidos gordos sintéticos tais como oleato de etil, triglicerídeos ou lipossomas.

Suspensões aquosas injetáveis podem conter substâncias, as quais aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose sódica, sorbitol ou dextrano.

Opcionalmente, a suspensão pode conter também estabilizadores adequados ou agentes que aumentem a solubilidade do ingrediente ativo para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para reconstituição com um veículo adequado antes da sua utilização, por exemplo, uma solução aquosa estéril, livre de pirogénios. A preparação da presente publicação pode também ser formulada em composições para administração retal tais como supositórios ou enemas de retenção, usando, por exemplo, bases convencionais para supositórios tais como manteiga de coco ou outros glicerideos.

As composições farmacêuticas adequadas para utilização no contexto da presente publicação incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos numa quantidade eficaz para atingir o objetivo pretendido. A composição farmacêutica pode formar uma parte de um artigo de fabricação que também inclui um material de embalagem para conter a composição farmacêutica e um folheto que fornece indicações de utilização para a composição farmacêutica.

Deste modo, a presente publicação fornece um método e uma composição farmacêutica úteis na modelação da angiogénese. Esta atividade modelatória pode ser usada para tratar artrite (Koch, 1998; Paleolog and Fava, 1998), retinopatia diabética (Miller et al., 1997), psoriase (Detmar et al., 1994; Creamer et al., 1997) and vasculites (Lie, 1992;

Klipple and Riordan, 1989).

Adicionalmnete, a presente publicação pode também ser usada para tratar doenças associadas a fragilidade dos vasos sanguíneos, incluindo sindrome de Marfan, Kawasaki, Ehlers-Danlos, cutis-Iaxa, and takysu (Lie, 1992; Klipple and Riordan, 1989; Brahn et al., 1999; Cid et al., 1993; Hoffman et al. , 1991). É possível que algumas destas doenças resultem de uma atividade da lisil oxidase reduzida ou ausente a qual leva à síntese de uma matriz extracelular frágil, e consecuentemente, à formação de vasos sanguíneos fragéis. Deste modo, a administração de sequências codificadoras da lisil oxidase ou de polipeptídeos pode ser usada para corrigir algumas das manifestações destas doenças. A presente publicação pode também ser usada para tratar doenças caracterizadas por alterações nas paredes dos vasos sanguíneos. Por exemplo, a reestenose a qual é uma complicação comum após terapia com balão, displasia fibromuscular (Begelman and Olin, 2000) e estenose aórtica (Palta et al., 2000) são todas potencialmente tratáveis com o método da presente publicação.

Adicionalmente, como está ilustrado na secção dos exemplos que se segue, LOR-1 está mais altamente expresso nos tumores metastáticos e respetivas linhas celulares que em tumores não metastáticos e suas respetivas linhas celulares (Figuras 3, 9, e 13). Isto sugere que os níveis de expressão de LOR-1 podem ser usados como ferramentas de diagnóstico para determinar a malignidade das células cancerosas, assim como, para determinar e implementar protocolos de tratamento adequados. O cancro do colon é uma doença altamente tratável e frequentemente curável quando localizado ao intestino. No entanto, em muitos casos, devido a erros de diagnóstico, uma hiperplasia do colón pré-maligna progride para adenoma do cólon, o qual posteriormente, se desenvolve em formas malignas de baixo a elevado graus de adenocarcinoma do cólon. Uma vez que um indivíduo tenha sido diagnosticado com cancro do cólon a malignidade do tumor necessita de ser determinada de modo a selecionar formas de tratamento adequadas. A prática corrente para avaliação da malignidade de um tumor do cólon é baseada no sistema de estadiamento tumor-nodulo linfático-metastases (TNM) desenvolvido pelo American Joint Connnittee on Cancer (AJCC). De acordo com este método, o estadiamento é baseado em avaliação da presença ou ausência de células cancerosas no próprio tumor, na submucosa da parede intestinal, na camada muscular da parede intestinal (muscularis propria), e/ou na subserosa, tecidos pericólicos ou perirectais,assim como nos linfonodos regionais e metástases à distância.

Assim, o estadiamento dos tumores do cólon envolvem múltiplas biópsias e avaliações patológicas complexas as quais consomem tempo e podem resultar em erros de diagnóstico.

Embora reduzindo a presente invenção à prática, os presentes inventores também descobriram que a expressão de LOR-1 nas células epiteliais e / ou células do tecido conjuntivo num tecido do cólon é indicativo de um cancro do cólon proporcionando assim um novo método para avaliar uma doença maligna do cólon desprovido das limitações acima referidas.

Como descrito no exemplo 3 na secção dos exemplos que se segue, a expressão de LOR-1 esta correlacionada com a formação de tumores benignos do cólon (Figura 14b) e está aumentada nas formas mais malignas de cancro de cólon (Figuras 14c and 14d) deste modo sugerindo o uso de LOR-1 na determinação do estádio dos cancros do cólon.

Deste modo, de acordo com outro aspeto da presente invenção é fornecido um método de avaliação da malignidade de um tumor do cólon. 0 método é efetuado pela determinação do nivel tecidular e/ou do nivel de atividade de um polipéptido que é pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ ID N0:2 no tecido do tumor do cólon, assim avaliando a malignidade do tumor do cólon.

Como é usado aqui, a expressão "avaliar a malignidade de um tumor do cólon" refere-se à determinação do estádio do tumor do colon, i.e., o progresso do tumor do cólon a partir de um tumor benigno para um tumor altamente maligno o qual invade o tecido envolvente. 0 polipeptideo detetado pela presente publicação é pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % homólogo à SEQ ID NO: 2 ou 9, como determinado usando o software BestFit do pacote de análise de sequências Wisconsin, utilizando o algoritmo Smith e Watennan, onde penalização de criação de hiatos é igual a 8 e penalização de extensão de lacuna igual a 2.

Preferencialmente, o polipeptideo da presente invenção é LOR-1 (SEQ ID NO:2), um membro da família lisil oxidase, o qual é completamente descrito a seguir. De acordo com o método da presente invenção, o tecido tumoral do cólon é obtido usando uma biópsia do cólon e/ou uma cirurgia do cólon usando métodos conhecidos no estado da técnica. Uma vez obtido, o nivel tecidular e/ou nivel de atividade do polipéptido da presente invenção é determinado no tecido do tumor do cólon. A determinação do nivel tecidular do polipeptideo da presente invenção pode ser conseguida usando diretamente métodos imunológicos.

Os métodos de deteção imunológicos usados no contexto da presente invenção são completamente explicados em, por exemplo, "Using Antibodies: A Laboratory Manual" (Ed Harlow, David Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)) e aqueles familiarizados com a arte serão capazes de implementar as várias técnicas sumarizadas aqui em baixo como parte da presente invenção. Todas as técnicas imunológicas requerem anticorpos específicos a pelo menos um epitopo do polipeptideo da presente invenção.

Os métodos de deteção imunológica adequados para a utilização como parte da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, radioimunoensaio (RIA), ensaio de imunoadsorção enzimática competitiva (ELISA), western blot, análise imunohistoquimica. Rádio-imunoensaio (RIA): Numa versão, este método envolve a precipitação do substrato desejado, p.ex., LOR-l,com um anticorpo especifico e uma proteina de ligação ao anticorpo radiomarcada (p.ex., proteina A marcada com 1125) imobilizada num transportador precipitável tal como moléculas de agarose. 0 número de contagens no sedimento precipitado é proporcional à quantidade de substrato.

Numa versão alternativa da técnica de RIA, um substrato marcado e uma proteina de ligação ao anticorpo não marcada são utilizados. A amostra contendo uma quantidade não conhecida de substrato é adicionada em quantidades variadas. A diminuição da contagem do precipitado a partir do substrato marcado é proporcional à quantidade de substrato na amostra adicionada.

Ensaio de imunoadsorção enzimática competitiva (ELISA):

Este método envolve a fixação de uma amostra (p.ex., células fixadas ou uma solução proteica) que contém um substrato proteico (p.ex., LOR-1) a uma superfície, tal como um poço de uma placa de microtitulação.

Um anticorpo específico de um substrato acoplado a uma enzima é aplicado e deixado ligar-se ao substrato. A presença do anticorpo é então detetada e quantificada por uma reação colorimétrica que emprega a enzima acoplada ao anticorpo. Enzimas vulgarmente utilizadas neste método incluem a peroxidase de rábano e fosfatase alcalina. Se bem calibrada e dentro do intervalo linear de resposta, a quantidade de substrato presente na amostra é proporcional à quantidade de cor produzida. Um padrão de substrato é geralmente empregado para melhorar a precisão quantitativa.

Análise Western blot:

Este método envolve a separação de um substrato (p.ex., proteina de LOR-1) a partir de outras proteínas, por meio de um gel de acrilamida seguido por transferência do substrato para uma membrana (p.ex., náilon ou PVDF). A presença do substrato é então detetada por anticorpos específicos para o substrato, que são por sua vez detetados por reagentes de ligação a anticorpos. Os reagentes de ligação a anticorpos podem ser, por exemplo, proteína A, ou outros anticorpos. Os reagentes de ligação de anticorpos podem ser marcados radioactivamente ou com enzimas ligadas como descrito acima. A deteção pode ser feita por autorradiografia, reação colorimétrica ou por quimioluminescência. Este método permite tanto a quantificação de uma quantidade de substrato como a determinação da sua identidade, por uma posição relativa na membrana, a qual é indicativa de uma distância de migração no gel durante a eletroforese em acrilamida.

Análise imunohistoqulmica:

Este método envolve a deteção de um substrato in situ num tecido fixado através de anticorpos específicos para o substrato. 0 anticorpo específico para o substrato pode estar ligado a uma enzima ou ao fósforo. A deteção é efetuado por microscopia e a avaliação é subjetiva. Se anticorpos ligados a enzimas são empregues, uma reação colorimétrica pode ser esperada.

Uma vez que os níveis tecidulares de um polipeptídeo podem ser inferidos a partir dos níveis de mRNA que codificam o respetivo polipeptídeo, o método, de acordo com este aspeto da presente invenção, para determinar o nível tecidular do polipeptídeo da presente invenção também pode empregar várias abordagens para deteção de polinucleótidos.

As moléculas de RNA podem ser detetadas usando métodos conhecidos no estado da técnica incluindo por exemplo, análise Northern blot, análise por RT-PCR, marcação por hibridação de RNA in situ e marcação por RT-PCR in situ.

Análise Northern Blot: este método envolve a deteção de um RNA particular (p.ex., a molécula de RNA que codifica LOR-1) numa mistura de RNAs. Uma amostra de RNA é desnaturada por tratamento com um agente (p.ex., formaldeído) que previne ligações de hidrogénio entre pares de bases, garantindo que todo a molécula de RNA possui uma conformação linear, desdobrada. As moléculas individuais de RNA são posteriormente separadas de acordo com o tamanho por eletroforese em gel e transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou feita à base de náilon para que o RNAs desnaturado adira. A membrana é depois exposta a sondas de DNA marcadas. As sondas podem ser marcadas usando radioisótopos ou nucleótidos ligados a enzimas. A determinação pode ser feita usando autoradiografia, reação colorimétrica ou quimioluminiscência como descrito aqui previamente. Este método permite quer a quantificação quer a determinação de uma quantidade de moléculas de RNA particular e a determinação da sua identidade através de uma posição relativa na membrana, a qual é indicadora da distância de migração no gel durante a eletroforese.

Análise RT-PCR: este método usa amplificação PCR de moléculas relativamente raras de RNAs. Primeiramente, moléculas de RNA a partir de um tecido (p.ex., tecido tumoral do cólon) são purificadas e convertidas em DNA complementar (cDNA) usando a enzima transcriptase reversa (tail como um MMLV-RT)e primers tais como, oligo dT, hexameros aleatórios ou primers específicos de genes, todos os quais estão disponíveis na Invitrogen Life Technologies, Frederick, MD, USA. Posteriormente, aplicando primers específicos de genes e DNA polimerase Taq, uma reação de amplificação PCR é conduzida num aparelho PCR especifico. Os peritos no estado da técnica serão capazes de selecionar o comprimento e a sequência dos primers específicos do gene e as condições de PCR (isto é, as temperaturas de recozimento, o número de ciclos e semelhantes) que são adequados para a deteção de moléculas de RNA específicas.

Procedimento de hibridação de RNA in situ : neste método sondas de DNA ou RNA são ligadas a moléculas de RNA presentes no tecido. Geralmente, uma amostra de tecido (p.ex., tecido do cólon) é fixada para preservar a sua estrutura e para prevenir a degradação do RNA e posteriormente seccionada para utilização em microscopia e colocada numa lâmina. Alternativamente, amostras de tecido congelado podem ser primeiramente seccionadas e colocadas numa lâmina e posteriormente fixadas antes da hibridação.

As condições de hibridação incluem reagentes tais como formamida e sais (p.ex., cloreto de sódio e citrato de sódio) os quais permitem a hibridação in situ especifica das sondas de DNA ou RNA com as suas moléculas de mRNA alvo, enquanto evita ligações não especificas da sonda. Os peritos no estado da técnica são capazes de ajustar as condições de hibridação (i.e., temperatura, concentração de sais e formamida e seus semelhantes) a sondas espeificas e tipo de células.

Aqueles habilitados no estado da técnica são capazes de ajustar as condições de hibridação (i.e., temperature, concentração de sais e formamida e semelhantes) para sondas específicas e tipos de células. Após a hibridação, qualquer sonda não liqada é lavada e a lâmina é sujeita quer a uma emulsão fotográfica, que revela os sinais gerados utilizando sondas radio marcadas ou a uma reação colorimétrica que revela os sinais gerados utilizando sondas marcadas com enzimas ligadas, tal como descrito aqui acima.

Marcação in situ por RT-PCR: este método é descrito em Nuovo GJ, et al. (Intracellular localization of polimerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA. Am J Surg Pathol. 1993, 17: 683-90) e Komminoth P, et al. [Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of histology, immunohistochemistry, in situ hybridization, transcriptase reversa reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) and in situ RT-PCR. Pathol Res Pract. 1994, 190: 1017-25]. Brevemente, a reação RT-PCR é realizada sem secções fixadas de tecidos através da incorporação de nucleótidos marcados na reação PCR. A reação é conduzida usando um aparelho específico para RT-PCR tal como o sistema de microdissecção por captura a laser PixCell I LCM disponível a partir de Arcturus Engineering (Mountainview, CA). A determinação do nível de atividade do polipeptideo da presente invenção (p.ex., LOR-1) num tecido do cólon pode ser efetuada usando substratos adequados numa marcação citoquímica e /ou em ensaios in vitro de atividade.

Marcação citoquímica: de acordo com este método, um substrato cromogénico é aplicado no tecido tumoral do cólon contendo uma enzima ativa (p.ex., LOR-1). A enzima cataliza a reação na qual o substarcto é decomposto ara produzir um produto cromogénico visível por um microscópio ótico ou de fluorescência.

Ensaios de atividade in vitro: neste método a atividade de uma enzima particular é medida numa mistura proteica extraída a partir do tecido de interesse (p.ex., tecido tumoral do cólon). A atividade pode ser determinada num poço com um espectrofotómetro usando métodos colorimétricos (ver por exemplo, Wande Li, et al. Localization and activity of lisil oxidase within nuclei offibrogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, 94: 12817-12822) ou pode ser medida num gel de acrilamida não desnaturado (i.e.r gel de atividade) . Após eletroforese, o gel é embebido numa solução que contém um substrato e reagentes colorimétricos. A banda corada resultante corresponde à atividade enzimática do polipéptido de interesse (p.ex., LOR-1). Se bem calibrado e dentro do intervalo linear de resposta, a quantidade de enzima presente na amostra é proporcional à quantidade de cor produzida. Um padrão de enzima é geralmente empregado para melhorar a precisão quantitativa. Uma vez que o nível tecidular e/ou do nível de atividade do polipéptido (ou mRNA) da presente invenção (p.ex., LOR-1) é determinado no tecido tumoral do cólon, a malignidade do tumor é determinada pela comparação dos níveis de expressão e/ou atividade no tecido tumoral do cólon com os mesmos no tecido normal do cólon. Será demonstrado que o tecido normal do cólon ode ser obtido a partir de biópsias e /ou cirurgia do cólon em indivíduos normais. Alternativamente, o tecido normal do colon pode ser obtido a partir de segmentos não afetados no mesmo indivíduo. Métodos para determinar o estado do tecido normal do colón são conhecidos pelos peritos no estado da técnica e incluem por exemplo, uma avaliação morfológica de secções tecidulares.

Uma vez que a malignidade do cancro esteja determinada como descrito acima, o nivel tecidular e /ou nivel de atividade do polipeptideo (ou mRNA do mesmo) da presente invenção pode ser utilizado para estadiar o tumor e para deste modo prever o prognóstico de um doente diagnosticado com cancro do colón. Tal estadiamento, pode ser efetuado pela determinação do nivel tecidular e /ou nivel de atividade do polipeptideo e correlacionando-os com os resultados obtidos a partir de tecido tumoral do cólon em vários estádios (obtidos mediante avaliação patológica dos tumores do cólon). Será demonstrado que tal estadiamento preciso e rápido permitirá a determinação de um prognóstico preciso e rápido em indivíduos afetados com cancro do colón e a administração oportuna de protocolos de tratamento adequados. Objetivos adicionais, vantagens e novas caracteristicas da presente invenção serão evidentes para um perito no estado da técnica após o exame dos seguintes exemplos, que não se destinam a ser limitativos. Além disso, cada uma das várias formas de realização e aspetos da presente invenção, tal como o delineado acima e como reivindicado na secção das reivindicações descritas abaixo, encontra suporte experimental nos seguintes exemplo.

EXEMPLOS É agora feita referência aos exemplos seguintes, que em conjunto com as descrições acima, ilustram a invenção de uma forma não limitante.

Geralmente, a nomenclatura aqui usado e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção, incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológica e de DNA recombinante. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current

Protocols in Molecular Biology" Volumes I-ill Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Filhos, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Filhos, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (Eds.) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologias como definidas em Pat. U.S. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook",

Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (Eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi (Eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman e Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são descritos extensivamnet na invenção e na literature cientifica, ver, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3, 879,262; 3, 901, 654; 3, 935, 074; 3, 984,533; 3, 996, 345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); ''Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Fresbney, R. 1., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986) ; "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996).

Outras referências gerais são fornecidas ao longo deste documento. Os procedimentos aqui apresentados acreditam-se serem bem conhecidos no estado da técnica e são proporcionados para conveniência do leitor. EXEMPLO 1

O PAPEL DE LOR-1 NA ANGIOGÉNESE

Um estudo foi conduzido com o objetivo de fundamentar adicionalmente e caracterizar o papel de LOR-1 na angiogénese.

Materiais e Métodos

Fator plaquetário-4 recombinante humano (PF4, GenBank numero de acesso M20901) o qual foi produzido em bactérias e redobrado posteriormente foi fornecido por Dr. Maione da Repligen Corp. (Boston, USA). Esferas de libertação lenta de estrogénios foram obtidas a partir de Innovative Research of America, Sarasota, FL, USA.

Construções de vetores de expressão de LOR-1, transfecção nas células MCF-7, e expressão: o cDNA de LOR-1 (SEQ ID N0:1) foi clonado num vetor de expressão 3,1-higro pCDNA (Invitrogen Inc., USA) sob o controlo de um promotor CMV. Clones de células expressando LOR-1 foram selecionadas usando higromicina e analisadas quanto à expressão de LOR-1, usando o antissoro policlonal abaixo descrito.

Construção de colunas de afinidade para o fator plaquetário-4 e purificação de LOR-1 em tais colunas: PF4 foi ligado a sefarose usando uma modifcação do método de Miron and Wilchek (Wilchek and Miron, 1982) como foi previamnete descrito para o fator de crescimento endotelial vascular (Soker et al., 1998). Meio de condicionamento livre de soro foi colhido de células MCF-7 marcadas com 35S-metionina, as quais sobreexpressam LOR-1. 0 meio de condicionamento foi passado através da coluna duas vezes. A coluna foi lavada com tampão salino de fosfato (300 mM NaCl, pH-7,2) e eluido com PBS (contendo 2M NaCl).

Experiências com ratinhos nude: células MCF-7 (107 células por animal) modificadas ou progenitoras foram implantadas sob a pele de ratinhos nude. Uma esfera de libertação lenta de estrogénios foi implantada 1 cm distante como previamente descrito (Zhang et al., 1995). Os tumores foram medidos periodicamente, após o qual, os tumores com pelo menos 1 cm de tamanho foram removidos e analisados imunologicamente usando um anticorpo comercialmente disponível dirigido contra um fator 8 semelhante a antigénio, o qual serve como um marcador especifico de células endoteliais.

Hibridação in situ: fragmentos possuindo nucleótidos 922-1564 de LOR-1, nucleótidos 976-1391 de LOL, nucleótidos 400-950 de LO e nucleótidos 1061-1590 de LOR-2 (como numerado a partir do codão ATG desta sequência) onde cada um de forma independente é suclonado nos vetores Bluescript SK e KS (Strategene) vectors. Um kit DIG de cDNA marcado de Boehringer-Mannheim foi usado para transcrever sondas sense(s)e antisense (as) de cRNA marcadas com digoxigenina a partir do promotor T7 da construção Bluescript. Hibridação e consecuente deteção de sondas hibridadas foi conduzida essencialmente como previamente descrito (Cohen et al., 2001).

Antissoro policlonal antí-LOR-1: o antissoro foi produzido mediante a administração de peptídeos recombinantes possuindo a extremidade C-terminal de 200 aminoácidos de LOR-1 (aminoácidos 540-744 de SEQ ID NO:2) nas fêmeas de coelhos. O soro foi colhido 10 dias após cada injeção e a fração de imunoglobulinas foi purificada usando uma coluna de sefarose com afinidade para a proteína A (Pharmacia).

Resultados

Purificação de LOR-1: uma coluna de afinidade do PF4 foi usada para detetar proteínas das células endoteliais as quais especificamente interagem com PF4.

Duas proteínas ligantes ao PF4 foram detetadas no meio de condicionamento de células endoteliais do cordão umbilical humano (HUVEC), ao passo que proteínas ligantes do PF4 não foram detetadas nos extratos de detergentes usados em células endoteliais.

Dois litros de meio de condicionamento permitiram uma purificação parcial de uma das tais proteínas ligantes a qual eluiu a partir da coluna a uma concentração de sal relativamente elevada (0,4-0,5 M NaCl).

Purificação adicional destas proteínas foi conduzida usando cromatografia líquida de alta pressão em fase reversa e cromatografia SDS/PAGE. A proteína de ligação ao PF4 não se liga a heparina nem eram um proteoglicano de sulfato de heparano, uma vez que a digestão elas heparinases não conseguiu alterar a sua mobilidade no ensaio SDS/PAGE.

Sequênciação parcial e comparação com base de dados revelou que as proteínas de ligação ao PF4 da presente invenção (LOR-1) pertencem a uma família de proteínas contendo um domínio semelhante ao encontrado na lisil oxidase (Kim et al., 1995; Kim et al., 1999). Lisil oxidases são enzimas dependentes de cobre que participam na síntese da matriz extracelular através da catalisação da formação ligações covalentes entre lisinas de fibras de colagénio ou elastina adj acentes. 0 comprimento completo da sequência de aminoácidos de LOR-1 (como deduzido a partir de sequências isoladas de cDNA) apresentou um elevado grau de semelhança com WS9-I4,uma proteina sobrexpressa em fibroblastos senescentes, em vários tipos de células aderentes (mas não em células não aderentes) e em fibroblastos, nos quais foi correlacionado com os niveis de expressão de procolagénio I-al, assim como sendo induzido por TGF-j3 e inibida por ésteres de forbol e ácido retinóico (Saito et al., 1997). 0 papel de LOR-1 no desenvolvimento tumoral: LOR-1 recombinante expressada nas células PAE especificamente se liga com a coluna de afinidade ao PF4 (Figura 1) . Uma vez que LOR-1 é um membro da familia LO, foi proposto que esta participa na formação da ECM durante a angiogénese. Adicionalmente, foi também proposto que pf4 suprime ou inibe a atividade proangiogénica de LOR-1, inibindo assim os últimos estádios da formação de vasos sanguíneos e como resultado limitando o crescimento tumoral.

Expressão de LOR-1: hibridação in situ demonstrou que LOR-1 está expressada numa ampla variedade de tecidos e tipos celulares incluindo fibroblastos, adipócitos, células nervosas, células endoteliais e uma variedade de células epiteliais. Vários tipos celulares, tais como hepatócitos, não expressam LOR-1; dos 4 membros examinados da familia LO (todos exceto LoxC) LOR-1 foi o único expressado nas células endoteliais dos vasos sanguíneos. LOR-1 e cancro: como mostrado na Figura 2, uma correlação direta entre os níveis de expressão de LOR-1 e as propriedades metastáticas das linhas celulares derivadas de cancro da mama foi demonstrado aqui.

Uma vez que células epiteliais que revestem os duetos de leite do tecido mamário normal (a partir do qual a maioria dos tumores mamários crescem), expressam grandes quantidades de LOR-1 é possível que as linhas celulares menos metastáticas percam expressão de LOR-1 em vez de a ganharem. Para fundamentar o seu papel na metastização, moléculas de cDNA foi expressada em linhas celulares MCF-7 derivadas de cancros mamários não metastáticos, as quais normalmente não expressam LOR-1. A expressão de LOR-1 foi examinada usando anticorpos policlonais produzidos no coelho e gerados como descrito acima (Figura 3).

Uma linha celular que foi transfectada com um vetor de expressão vazio, e uma linha celular MCF-7 expressando LOR-1 foram implantadas sob a pele de ratos imunologicamente comprometidos juntamente com uma esfera de libertação lenta de estrogénios como descrito acima. Os estrogénios foram adicionados uma vez que o desenvolvimento tumoral a partir desta linha celular não metastática está dependente de estrogénios (Mcleskeyet al., 1993). A taxa de desenvolvimento tumoral no rato foi monitorizada continuamente (Figura 4); tumores com 1 cm de tamanho foram excisados e submetidos a analise histológica como previamente descrito. Curiosamente, a taxa de desenvolvimento tumoral variou entre os dois tipos de linhas celulares, com alguns tumores exibindo crescimentos mais lentos nas linhas MCF-7 expressando LOR-1 e ainda outro exibindo um crescimento mais lento nas células de controlo. A fim de superar os problemas de nível de expressão, moléculas de cDNA de LOR-1 foram colocadas sob o controlo de um promotor induzido por tetraciclina (o sistema TET-off). Tal construção permitirá determinar de forma conclusiva se a taxa reduzida de crescimento tumoral observada em células expressando LOR-1 é de fato causado por LOR-1. Os tumores expressando grandes quantidades de LOR-1 foram seccionados e marcados com um anticorpo dirigido contra o fator 8 semelhante a antigénio, um marcador específico para células endoteliais.

Tecido tumoral de controlo predominantemente apresentou marcação na cápsula em redor do tumor enquanto nos tumores com expressão de LOR-1 apresentaram marcação pronunciada nas regiões interiores do tecido tumoral (Figura 5a e Figura 5b, respetivamente). 0 papel de LOR-1 na doença de Wilson e outras doenças hepáticas crónicas: Tecido hepático normal e afetado foram rastreados com o sensor LOR-1 (Figuras 6a e 6c) e sondas antisense (Figuras 6b e 6d) . Tecidos hepáticos normais expressam níveis muito reduzidos de LOR-1 Contudo, tecidos hepáticos fibróticos tais como aqueles observados na doença de Wilson, exibem um forte aumento na expressão de hepatócitos de LOR-1 (Figura 6d).

Expressão de LOR-1 em embriões de galinha: A Figura 7 ilustra a expressão LOR-1 de mRNA de LOR-1 em vasos sanguíneos de um embrião de galinha em desenvolvimento. A totalidade de embriões de galinhas com 4 dias de idade via hibridização in situ revelou mRNA da expressão de LOR-1 em vasos sanguíneos localizados no âmnio (seta) A família Lisil Oxidase: Uma comparação de homologia entre cinco membros da família de lisil oxidase que inclui a subfamília LO e LOL e a subfamília LOR-1 e LOR-2 revelou uma forte homologia na porção C-terminal que inclui o motive conservado da lisil oxidase. LOR-1 e LOR-2 são caracterizadas por logos segmentos N-terminais que não são encontrados em LO e LOL. EXEMPLO 2

CÉLULAS DE CANCRO DA MAMA MCF-7 EXPRESSANDO PROTEÍNA-1 RELACIONADA COM LISIL OXIDASE RECOMBINANTE (LOR-1) FORMAM TUMORES INVASIVOS CARACTERIZADOS POR FIBROSE EXTENSA

Um estudo foi levado a cabo para adicionalmente substanciar e caracterizar o papel de LOR-1 na inibição de metastização e de fibrose tumoral.

Materiais e Métodos

Esferas de libertação lenta de estrogénios (17p-estradiol, 0,72 mg/esferas, 60-dias de libertação) foram produzidas da empresa Innovative Research of America, FL, USA. O kit de marcação de tricoma de Masson foi adquirido da empresa Bio-Optica (Milano, Italy); Transcriptase reversa, G418 foi adquirido da empresa Gibco BRL (U.K.), Higromicina B, Hidrocloreto de tetraciclina, Kit de marcação reticular com Verde Rápido e Vermelho de Sirius (Direct Red 80) foram adquiridos da empresa Sigma (USA), enzimas de restrição, T4.1igase foram adquiridos da empresa New England Biolabs (USA). O vetor de expressão bacteriano pQE-30 e a coluna de afinidade níquel foram obtidos da empresa Qiagen (Germany), 32P-dATP foi adquirido da empresa NEN (USA). Anticorpo Monoclonal anticitoqueratina7 (CAM 5,2) ligado a FITC foi adquirido da empresa Becton Dickinson (USA), e anticorpo monoclonal murino antivimentina (clone V9) foi adquirido da empresa DAKO Denmark). Anticorpo anti-FITC conjugado com fosfatos alcalinos foi adquirido da empresa ROCHE (USA), soluções-tampão de bloqueio CAS, citrato e de recuperação de antigénio EDTA foram adquiridos da empresa Zymed (USA).

Cultura de células: Células de cancro da mama MCF-7 foram gentilmente fornecidas por Dr. Hadasa Degani (Weizmann Institute, Israel). A linha celular de cancro da mama MDA-MB435 foi gentilmente fornecida por Dr. Israel Vlodavsky (Technion, Israel). As células MDA-MB231 foram gentilmente fornecidas por Dr. Michael KJagsbrun (Harvard University, USA). Estas linhas celulares foram rotineiramente cultivadas em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com gentamicina, anfotericina, glutamina e 10% de Soro Fetal Bovino (FCS). Células endoteliais derivadas do cordão umbilical humano foram isoladas e cultivadas como descrito (Neufeld e Gospodarowics, 1988). Meio de cultura de tecidos, soro, e suplementos para cultura de células foram adquiridos da empresa Beth-Haemek Biological Industries, Israel, ou de Gibco-BRL. Células MCF-7 (Clontech, USA) contendo o trans-ativador tetraciclina (tTAforam crescidas em meio DMEM contendo 10 % soro fetal bovino (Clontech), na presença de 100 pg/ml G418, 150 pg/ml Higromicina Bei pg/ml Tetraciclina.

Clonagem do cDNA LOR-1 e LOR-2: RNA Total (4 pg) de células HUVEC (para LOR-1) ou células de melanoma (para LOR-2) foi submetido a trancripção reversa usando a transcriptase reversa MMLV (GmCO BRL) como descrito (Chomczynski e Sacchi, 1987) . Os cDNAs de LOR-1 e LOR-2 foram amplificados usando o sistema de PCR Expand Long High Fidelity PCR (ROCHE) e os seguintes pares de primers de amplificação: Para LOR-1 SEQ ID NOs:10 e 11, e para LOR-2 SEQ ID NOs:12 e 13. 0 cDNA de 2,3 kb de LOR-1 (SEQ ID NO:l) e o cDNA de 2,26KB de LOR-2 (SEQ ID NO:4) foram subclonados no vetor pGEM-T Easy (Promega) por clonagem T-A.

Produção de anticorpos policlonais contra LOR-1 humano: Um fragmento de cDNA contendo os nucleótidos 1641 - 2253 de LOR-1 (SEQ ID NO: 14) foi amplificado usando o Kit de PCR Expand High Fidelity PCR e um par de primers de amplificação (SEQ ID N0s:15 e 16) . 0 produto de PCR foi subclonado no vetor pGEM-T Easy vetor (Prom ega) por clonagem T-A.

Um fragment de cDNA de 613 bp de LOR-1 (SEQ ID NO: 14) foi digeridoo com as enzimas de restrição SphI e Hindlll e ligado no vetor de expressão bacteriano pQE-30, que contém uma sequência in-frame codificando uma sequência de terminação com 6 histidinas (6xHis) na extremidade 5' da inserção. 0 plasmídeo resultante foi usado para produzir um péptido de 23 kDa recombinante, marcado com 6xHis (SEQ ID N0:17). 0 péptido foi purificado por extratos celulares bacterianos usando uma cromatografia de afinidade niquel, e adicionalmente purificado usando SDS-PAGE. 0 gel foi eletromarcado cem nitrocelulose e a banda contendo o péptido foi cortada do gel, solubilizada em DMSO, e usada para imunizar coelhos. 0 antisoro foi purificado por cromatografia de afinidade em colunas de sefarose-Proteína A seguido por purificação com cromatografia de afinidade numa coluna em que o péptido recombinante foi marcado usando um método previamente descrito (Wilchek and Miron, 1982). 0 anticorpo foi eluído da coluna usando glicina 0,1M a pH 3.

Transfecções: Para constitutivamente expressar LOR-1, o cDNA LOR-1 de comprimento integral (SEQ ID N0:1), foi digeridoo do vetor pGEM-T easy (Promega) com Hindlll e Xbal (que foram incorporados nos primers usados para a clonagem de CDNA LOR-1) e ligados no vetor de expressão mamifero pcDNA3.1 Hygro (Invitrogen, USA) para gerar o vetor de expressão pcDNA-LOR-1. 0 vetor vazio pCDNA3.1 Hygro ou o plasmideo pcDNA-LOR-1 (10-20 pg) foram estavelmente transfectados em células MCF-7 usando electroporação com um gerador de pulsos elétricos BioRad (960 pF, 0,28 V) . As células estavelmente transfectadas foram selecionadas usando 300 pg/ml de Higromicina B. Clones expressando LOR-1 recombinante foram obtidos em duas transfecções estáveis consecutivas e rastreados para a expressão de LOR-1 usando os nossos anticorpos policlonais anti-LOR-1. Meio condicionado foi recolhido após 48 horas das células transfectadas e a expressão de LOR-1 foi monitorizada usando análise Western blot (Figura 10A).

Para produzir indutivamente LOR-1, CDNA LOR-1 de comprimento integral (SEQ ID NO:l) foi clonado no vetor pTET-Splice (Clontech), que permite uma expressão induzível sob o control de tetraciclina (Sistema Tet off). O plasmideo de DNA pTET-Splice foi digeridoo com HindIII e Spel e ligado ao fragmento de cDNA LOR-1 de 2,3 kb que foi recuperado do vetor pcDNA-LOR-1 usando HindIII e Xbal. O plasmideo resultante, que foi designado de pTET-LOR-1, foi cotransfectado e células MCF-7 TetOff conjuntamente com pTK-Hygro a um rácio de 20:1, respetivamente. Células expressando LOR-1 foram selecionadas em meio contendo 100 pg/ml G418, 150 pg/ml higromicina Bei pg/ml tetraciclina. As células estavelmente transfectadas foram rastreadas para a expressão induzivel de LOR-1 usando análise Western blot 48 horas após a remoção de tetraciclina do meio de cultura. O clone apresentando os niveis de indução mais elevados na ausência de tetraciclina e os niveis de expressão basais mais baixos na presença de tetraciclina foi selecionado e designado por MCF-7ffet-LOR-1. Células do glioma C6 foram transfectadas e rastreadas para a expressão de LOR-1 como acima descrito.

Análise Northern Blot: 0 RNA total foi extraido de células cultivadas usando Tri-Reagente (MRC, Cincinnati) de acordo com as instruções do fabricante. RNA total (15 μς) foi carregado num gel de agarose 1,2% e análise Northern blot foi realizada como previamente descrito (Cohen et al., 2001) . Fragmentos de cDNA LOR-1 e LOR-2 marcados com 32P; nucleótidos 1-660 da SEQ ID NO: 18 e 1061-1590 da SEQ ID NO: 19 (respetivamente) foram usados como sondas.

Análise Western blot: Meio condicionado desprovido de soro (40 μΐ) foi separado num gel SDS-PAGE 8 % e as proteínas foram electromarcadas num filtro de nitrocelulose usando electromarcação semisseca. O filtro foi bloqueado durante 1 hora à temperatura ambiente com solução-tampão TSBT contendo 10 mM Tris-HCl (pH-7,0), 0,15 M NaCl, e 0,3 % Tween-20 suplementado com 10 % leite magro. O filtro foi incubado overnight a 4°C, purificado com coluna de afinidade e anticorpos policlonais anti-LOR-1 de Coelho em TSBT (1:2500) . O gel foi subsequentemente lavado 3 vezes em TBST e incubado com anticorpos secundários conjugados com IgG peroxidase anticoelho de cabra durante 1 hora à temperatura ambiente. O anticorpo marcado foi visualizado usando o sistema de deteção ECL (Biological Industries, Israel).

Experiências com Ratinhos nude: Esferas de libertação lenta de estrogénios contendo ΙΙβ-βεΡ^άίοΙ (0,72 mg/esferas, 60 dias de liberação, Innovative Research) foram pré-implantadas subcutaneamente em ratinhos nude atímicos fêmea com 6-8 semanas de idade (CD1) . Células MCF-7 (107 células/ratinho) foram injetadas no tecido adiposo mamário. 0 tamanho do tumor foi medido com um compasso uma ou duas vezes por semana, e o volume do tumor foi determinado usando a seguinte formula: volume = largura2 x comprimento x 0,52 (O'Reilly et al., 1999). Os ratinhos foram sacrificados 4 semanas após a injeção de células MCF-7. Noutras experiências, os tumores foram excisados quando atingiram um diâmetro de 0,8 cm. O tumor primário, ofigado e os pulmões foram removidos, pesados, ficados em formalina 10% tamponizada e embebidos em parafina. 0 desenvolvimento de tumores de células do glioma C6 expressando LOR-1 recombinante foi também estudado. Células (2xl05 células/animal) transfectadas num vetor de expressão de controlo ou com um vetor de expressão contendo CDNA LOR- 1 foram injetados subcutaneamente nos membros posteriroes. Os ratinhos foram sacrificados 3 semanas após a injeção das células. Os tumores primários foram removidos, fixados em formalina 10% tamponizada, e embebidos em parafina para análise.

Histologia e Imunohistoquimica: Tecidos fizados em formalina, embebidos em parafina foram cortados de secções seriais de 5pm cada e usados para imunohistoquimica. As secções foram desparafinizadas por aquecimento a 60 °C durante 1 hora, lavadas duas vezes com xileno durante 5 min e etanol 70% seguido por uma lavagem em água. A atividade de peroxidase endógena foi inibida através de uma incubação de 15 min com peróxido de hidrogénio 3% em methanol, seguido por lavagens com água e PBS. As secções foram então recuperadas para o antigénio através do aquecimento duas vezes durante 10 minutos num micro-ondas a 90 °C em tampão citrato a pH-6,2 (para anticorpos citoqueratina e vimentina) ou em solução-tampão EDTA lmM (para o anticorpo LOR-1); o bloqueio foi realizado usando bloqueio CAS (Zymed). Após o bloqueio, as secções foram incubadas durante l,5h à temperatura ambiente com os seguintes anticorpos, todos diluídos em solução reagente diluente de anticorpos (Zymed): anticorpo anti-LOR-1 purificado por cromatografia de afinidade (1:30-1:50), anticorpos monoclonais anticitoqueratina7 conjugada com FITC (1:50), ou com anticorpos monoclonais dirigidos contra vimentina (1:50). As secções foram então lavadas 3 vezes com TBST, e a deteção secundária foi aplicada usando anticorpos anti-FITC conjugados com fosfatos alcalinos (Roche) a uma diluição 1:200 (para anticitoqueratina) ou sistema de deteção DAKO Envision (anticorpos HRP anticoelho e antirratinho). As secções foram desenvolvidas em solução 3-amino9-etilcarbazolo (DAKO), com marcação de contraste por hematoxilina, e fotografadas sob um micorscópio. Em experiências de controlo, os anticorpo primários foram omitidos. Marcações de Tricoma de Masson e reticular foram feitas de acordo com os protocolos dos fabricantes. Para a marcação com vermelho de Sirius, as secções foram incubadas durante 5 min com solução de verde rápido 0,03 % (w/v) , lavadas duas vezes com ácido acético 1 %, incubadas durante 15 min com solução de vermelho de Sirius 0,1 %, lavadas como acima descrito, desidratadas e examinadas num microscópio com luz polarizada.

Resultados Experimentais LOR-1 é expresso em linhas celulares derivadas do cancro da mama altamente metásticas mas não em células MCF-7 não-metásticas: Desmoplasia e formação de nódulos fibróticos em tumores de cancro da mama está associado com a transição de um tumor localizado, relativamente benigno para um tumor invasivo/metástico (Colpaert et al., 2001; Hasebe et al., 2000). As lisil oxidases contribuem para a deposição de colagénio por ligação cruzada de monómeros de colagénio (Smith-Mungo and Kagan, 1998) . Para descobrir se a expressão de lisil oxidases está associada com o fenótipo invasivo/metástico, vários tipos de linhas celulares derivadas de cancro da mama humano foram rastreadas relativamente à expressão de lisil oxidases. Análise Northern Blot revelou que o gene LOR-1 é expresso em células MDA-MB231 e MDA-MB435 independentes de hormonas (Price et al., 1990) mas não em células MCF-7 não-metásticas dependentes de hormonas (Figura 9a). LOR-2, por sua vez, foi apenas expresso em células MDA-MB435 mas não em células MDA-MB231 ou em células MCF-7 (Figura 9b). Células do carcinoma da mama de grau 1 altamente malignas não expressam LOR-1 enquanto células de carcinoma de grau 3 altamente malignas expressam LOR-1: A expressão de LOR-1 foi confirmada nos duetos de leite tanto em tecido mamário normal (Figura 9c) como em carcinoma ductal in situ (Figura 9d) . Contudo, em carcinoma da mama ductal bem-diferenciado de grau 1, onde as células tumorais migram para for a dos duetos para formar pseudo-duetos, as células não expressão LOR-1 (Figura 9e, setas preenchidas9. Por outros lado, tumores de carcinoma da mama ductal de grau 3, um tumor altamente malign caracterizado por desmoplasia, expressam elevados niveis de LOR-1 (Figura 9f).

Tumores gerados em ratinhos de células MCF-7 LOR-1 transfectadas apresentam uma taxa de crescimento mais baixa: De forma a determinar se a expressão LOR-1 contribui para a progressão de tumores da mama e para um fenótipo invasivo/metástico, células MCF-7 não-invasivas foram transfectadas com um plasmídeo de expressão contendo cDNA de LOR-1 (SEQ ID NO:l). Vários clones transfectantes foram isolados e selecionados com base na sua expressão de LOR-1. O meio condicionado de dois clones expressando LOR-1 (clone 12 e 24) e de um clone transfectado com um vetor de expressão sozinho (vee) foi rastreado com anticorpos LOR-1 dirigidos contra a porção C-terminal de LOR-1 (SEQ ID N0:17). Análise Western blot revelou niveis mais elevados de expressão de LOR-1 em células no clone 12 comparativamente comcélulas do clone 24, e nenhuma expressão em céluals transfectadas com o vetor de expressão sozinho (Figura 10a).

Adicionalmente, ambas as células expressando LOR-1 apresentaram outras bandas de prote+inas a cerca de 70 kDa (Figuras 10a, 10b), sugerindo que LOR-1 pode ser sujeita a processamento proteolitico como outros membros da família da lisil oxidase (Borel et al., 2001; Panchenko et al., 1996) . Para verificar que formas de baixo peso molecular são produzidas como um resultado de processamento pós-tradução, cDNA de LOR-1 foi expresso em células MCF-7 sob o controlo de um promotor induzível por tetraciclina (Shockett and Schatz, 1996) . Pode ser observado que uma vez que a inibição via tetraciclina é removida, as células começam a produção LOR-1 de comprimento integral que é então convertido numa forma contendo um segment C-terminal de 70 kDa (Figura 10b) . Não é claro se todas estas formas são enzimaticamente ativas.

Para cosubstanciar o seu papel no crescimento tumoral e mestastização, células produtoras de LOR-1 e células transfectadas com o vetor de expressão sozinho foram pré-implantadas subcutaneamente em ratinhos nude (abaixo descritos). Interessantemente, a taxa de crescimento de tumores contendo células produtoras de LOR-1 foi diminuída comparativamente com a de tumores desenvolvidas por células parentais ou células transfectadas com o vetor de expressão sozinho (Figuras 10c, d).

Para determiner se a taxa de crescimento tumoral diminuida doi um resultado de uma proliferação mais baixa, a taxa de proliferação de células MCF-7 transfectadas com o vetor vazio das células do clone 12 e das células do clone 24 foi também comparada; não foram detetadas diferenças significativas nas suas taxas de proliferação.

Tumores que desenvolvem de células MCF-7 produtoras de LOR-1 contêm muitos nódulos necróticos e fibróticos ricos em depósitos colagenosos: Marcação com hematoxilina-eosina de secções tumorais revelou uma maior necrose em tumores gerados a partir de células MCF-7 expressando LOR-1 (Figura llb) e apenas algumas áreas necróticas em tumores gerados a partir de células parentais ou células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão sozinho (Figura 11a).

Tumores com expressão de LOR-1 também continham extensas áreas fibróticas principalmente compostos de células derivadas do hospedeiro tais como fibroblastos murinos em vez de células MCF-7. Estas células são facilmente distinguíveis das células hospedeiras uma vez que não reagem com um anticorpo contra queratina-7 humana (Figura llc) .

Uma vez que LOR-1 foi demonstrado como oxidando resíduos de lisina em colagénio-I (Vadasz et al., 2002) foi antecipado que pode induzir ligações cruzadas de colagénio e sua deposição. Contudo, esta atividade é provavelmente dependendo da existência de colagénio uma vez que células MCF-7 expressando LOR-1 crescidas em cultura não produzem mais colagénio do que células MCF-7 parentais. Para adicionalmente entender o envolvimento de LOR-1 na progressão tumoral, tumores derivados de céluals MCF-7 expressando LOR-1 foram marcadas com Tricoma de Masson, um reagent que reage primariamente com colagénio-I e produz uma cor azulada (Pinder et al., 1994). (1) Tumores que se desenvolveram a partir de céluals parentais ou células MCF-7 transfectadas com um vetor de expressão sozinho continham quantidades limitadas de colagénio que foi distribuído entre células tumorais (Figura lld, setas). Em contraste, tumores que se desenvolveram a partir de células MCF-7 expressando LOR-1 do clone 12 ou clone 24 continham depósitos muito mais densos de colagénio entre as células tumorais (Figura lie) .

Adicionalmente, as áreas fibróticas e necróticas nesses tumores aparentaram ser preenchidas com firas de colagénio (Figura llf). Adicionalmente, enquanto os vasos sanguíneos em tumores que se desenvolveram a partir de céluals MCF-7 transfectadas com vetores permaneceram praticamente sem marcação (Figura llg, setas), os vasos sanguíneos em tumores derivados de Células MCF-7 expressando LOR-1 foram revestidos om uma camada muito mais espessa de colagénio. (Figura llh, setas). Estas experiências indicam que LOR-1 afeta tanto a produção como a deposição de colagénio-I em tumores de cancro da mama derivados de células MCF-7. Para substanciar o envolvimento de LOR-1 na deposição de colagénio, célilas do glioma C6 foram também injetadas subcutaneamente em ratinhos. Enquanto tumores gerados a partir de células de glioma C6 não continham grandes quantidades de colagénio, tumores gerados a partir de células de glioma C6 expressando LOR-1 eram ricos em colagénio. Estes resultados indicam um efeito mais genérico para LOR-1 em depósitos de colagénio-1 em tumores. Adicionalmente, a marcação reticular de colagénio-III revelou que tumores gerados a partir de células MCF-7 expressando LOR-1 ou Células de glioma C6 expressando LOR-1 continham concentrações maiores de colagénio-III e fibras mais espessas (Figura 12b, 12d) comparativamente com tumores gerados a partir de células transfectadas com o vetor de expressão sozinho (Figuras 12a, c).

Expressão de LOR-1 em células MCF-7 transforma as células em células invasivas in vivo: Foi reportado que o aparecimento de nódulos fibróticos em tumores de cancro da mama correlaciona-se com o grau de invasividade (Hasebe et al., 2000). Para cosubstanciar o envolvimento de LOR-1 na invasividade tumoral, marcação de queratina-7 humana foi utilizada. Tumores gerados a partir de células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão sozinho foram rodeados por cápsulas espessas com extremidades afuniladas. Nenhuma marcação de queratina-7 humana foi observada na cápsula (Figura 13a) ou entre os vasos sanguineos, nervos e músculos localizados numa posição adjacente às cápsulas (Figuras 13b, setas). Em contraste, m tumores gerados a partir de Células MCF-7 expressando LOR-1, células positivas para queratina-7 humana foram observadas na cápsula (Figura 13c) . Adicionalmente, em muitas áreas as células tumorais migraram em massa através das cápsulas e invadiram os músculos (Fugura 13d), nervos (Figura 13e) e vasos sanguineos (Figura 13f) . As células invasivas foram identificadas como as células MCF-7 transfectadas expressando LOR-1 através do uso de um anticorpo anti-LOR-1 (Figura 13g) . Estas observações fornecem uma forte evidência que a produção de LOR-1 em células tumorais de cancro da mama contribuem para a transição de tumores não-invasivos localizados para tumores invasivos. Adicionalmente, agregados de células tumroais foram também detetados dentro de vasos linfáticos adjacentes aos tumores indicando que células MCF-7 expressando LOR-1 são metásticas (Luna, 1968). EXEMPLO 3

A EXPRESSION DE LOR-1 ESTÁ CORRELACIONADA COM A MALIGNIDADE DE TUMORES DO CÓLON

Para estudar a correlação entre a expressão de LOR-1 e a malignidade de tumores de colon, várias secções de tumores do colon foram sujeiotas a marcação imunohistoquimica usando um anticorpo dirigido contra LOR-1.

Resultados experimentais LOR-1 é moderadamente expresso em tumores do cólon benignos: Tecidos do colon normais e tumores do cólom benignos incluindo tecidos de hyperplasia e adenoma foram sujeitos a imunohistoquimica usando um anticorpo dirigido contra a região C-terminal de LOR-1 humano. Como é demonstrado nas Figuras 14a-b, enquanto um baixo nivel de expressão de LOR-1 foi visível em algumas células do tecido do colon normal (Figura 14a), um nível moderado de expressão foi detetado em tecido de hyperplasia e um nível substancial de expressão foi detetado em células compreendendo o tecido de adenoma de tumores do colon benignos (Figura 14b). Assim, estes resultados demonstram que a expressão de LOR-1 se correlaciona com a formaçãod e tumroes do colon benignos.

Tumores do colon altamente malignos expressam elevados níveis de LOR-1: Para substanciar adicionalmente a correlação entre LOR-1 e a progressão de tumores do colon, tecidos de adenocarcinoma do colon de baixo e elevado grau foram sujeitos a imunohistoquimica PARA LOR-1. Como é representado nas Figuras 14c-d, um elevado nível de expressão de LOR-1 foi detetado em tecidos de adenocarcinoma de elevado grau e reduzido grau. Contudo, enquanto em adenocarcinomas de baixo grau a expressão de LOR-1 é maioritariamente confinada às estruturas de carcinoma (Figura 14c, setas), em adenocarcinomas de elevado grau, mais malignos, elevados niveis de expressão de LOR-1 foram detetados através de tecido tumoral desorganizado. Estes resultados demonstram que um elevado nivel de expressão de LOR-1 está correlacionado com tumores do colon mais malignos.

Conjuntamente, estes resultados demonstram que a expressão de LOR-1 está correlacionada com a progressão de cancro do colon e sugerem o uso de LOR-1 na determinação do estadiamento de tumores de cancro do cólon. É apreciado que certas propriedades da invenção, que são, para efeitos de clareza, descritas no context de formas de realização separass, pode também ser fornecida em combinação com uma forma de realização única. Por outro lado, várias propriedades da invenção, que são, para efeitos de brevidade, descritas no context de uma forma de realização única, podem tambéms er fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada.

Embora a invenção tenha sido descrita em conjugação com formas de realização especificas relacionadas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para aqueles habilitados no estado da técnica. A identificação de qualquer referência neste pedido de patente não deverá ser vista como uma admissão de que tal referência esteja disponível como um estado da técnica anterior ao da presente invenção.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Neufeld, Gera Akiri, Gal Vadasz, Zahava Gengrinovitch, Stela

<120> COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS ÚTEIS PARA A MODELAÇÃO DE ANGIOGÉNESE, INIBIÇÃO DE METÁSTASE E FIBROSE TUMORAL, E AVALIAÇÃO DA MALIGNIDADE DE TUMORES DE CANCRO DO CÓLON <130> 26376 <160> 19 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 2325

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggagaggc ctctgtgctc ccacctctgc agctgcctgg ctatgctggc cctcctgtcc 60 cccctgagcc tggcacagta tgacagctgg ccccattacc ccgagtactt ccagcaaccg 120 gctcctgagt atcaccagcc ccaggccccc gccaacgtgg ccaagattca gctgcgcctg 180 gctgggcaga agaggaagca cagcgagggc cgggtggagg tgtactatga tggccagtgg 240 ggcaccgtgt gcgatgacga cttctccatc cacgctgccc acgtcgtctg ccgggagctg 300 ggctatgtgg aggccaagtc ctggactgcc agctcctcct acggcaaggg agaagggccc 360 atctggttag acaatctcca ctgtactggc aacgaggcga cccttgcagc atgcacctcc 420 aatggctggg gcgtcactga ctgcaagcac acggaggatg tcggtgtggt gtgcagcgac 480 aaaaggattc ctgggttcaa atttgacaat tcgttgatca accagataga gaacctgaat 540 atccaggtgg aggacattcg gattcgagcc atcctctcaa cctaccgcaa gcgcacccca 600 gtgatggagg gctacgtgga ggtgaaggag ggcaagacct ggaagcagat ctgtgacaag 660 cactggacgg ccaagaa^tc ccçcgtçgzc tgcggcacgt ctggctzccc tggggagagg 720 acatacaata ccaaagtgta caaaatgttt gcctcacgga ggaagcagcg ctactggcca 780 ttctccatgg actgeacegg cacagaggcc cacatctcca gctgcaagct gggcccccag 640 gtgecactgg accccatgaa gaatgtcacc tgcgagaatg ggotaccggc cgtggtgogt 900 tgtgtgcctg ggcaggtctt cagccctgac ggaccctcaa gattccggaa agcgtacsag 960 ccagagcaac ecctggtgcg actgagaggc ggtgcctaca tcggggaggg ccgcgtggag 1020 gtgctcaaaa atggagaatg ggggaccgtc cgcgacgaca agtgggacct ggtgtcggcc 1080 agfcgtggtet gcagagagct gggctttggg agtgccaaag aggcagtcac tggctcccga 1140 ctggggcaag ggatcggaec catccacctc aacgagatcc agtgcaeagg caatgagaag 1200 tccattatag actgcaagtt caatgccgag tctcagggct gcaaccacga ggaggatgct 1260 ggtgtgagat gcaacaccoc tgccafcgggc ttgcagaaga agctgcgcct gaacggcggc 1320 cgcaatccct acgagggceg agtggaggtg ctggtggaga gaaacgggtc ccttgtgtgg 1380 gggatggtgt gtggccaaaa ctggggcatc gtggaggcca tggtggtctg ccgccagctg 1440 ggcctgggat tcgccagcaa cgccttccag gagacctggt attggcacgg agatgtcaac 1S00 agcaacaaag tggtcatgag tggagtgaag tgctcgggaa cggagctgtc cctggcgcac 1560 tgccgccacg acggggagga cgtggcctgc ccccagggcg gagtgcagta cggggccgga 1620 gttgcctgct cagaaaccgc ccctgacctg gtccbcaatg cggagatggt gcagcagacc 1680 acctacctgg aggaccggec catgttcatg ctgeagtgtg ccatggagga gaactgcctc 1740 tcggcctcag ccgcgcagac cgaccccacc acgggctacc gccggcfccct gcgcttctcc 1800 tcccagatcc acaacaatgg ccagtccgac ttccggccca agaacggccg ccacgcgtgg 1860 atetggcacg actgtcacag gcactaccac agcatggagg cgttcaccca ctatgacctg 1920 ctgaacctca atggcaccaa ggtggcagag ggccaeaagg ccagcttctg cttggaggac 1980 acagaatgtg aaggagacat ccagaagaat tacgagtgtg ccaacttcgg cgatcagggc 2040 atcaccatgg oetactggça catgtaccgc catgacatcg actgccagtg ggttgacatc 2100 actgacgtgc cccctggaga ctacctgttc caggttgtta ttaaccccaa cttcgaggtt 2160 gcagaatccg attactccaa caacatcatg aaatgcagga gccgctatga cggccaccgc 2220 atctggatgt acaactgcca cataggtggt tccttcagcg aagagacgga aaaaaagttt 2280 gagcacttca gcgggctctt aaacaaccag ctgtccccgc agtaa 2325

<210> 2 <211> 774 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Glu Arg Pro Leu Cys Ser His Leu Cys Ser Cys Leu Ala Met Leu 15 10 15

Ala Leu Leu Ser Pro Leu Ser Leu Ala Gin Tyr Asp Ser Trp Pro His 20 25 30

Tyr Pro Glu Tyr Phe Gin Gin Pro Ala Pro Glu Tyr His Gin Pro Gin 35 40 45

Ala Pro Ala Asn Val Ala Lys He Gin Leu Arg Leu Ala Gly Gin Lys 50 55 60

Arg Lys His Ser Glu Gly Arg Val Glu Val Tyr Tyr Asp Gly Gin Trp 65 70 75 80

Gly Thr Val Cys Asp Asp Asp Phe Ser lie His Ala Ala His Val Val 85 90 95

Cys Arg Glu Leu Gly Tyr Val Glu Ala Lys Ser Trp Thr Ala Ser Ser 100 105 110

Ser Tyr Gly Lys Gly Glu Gly Pro He Trp Leu Asp Asn Leu His Cys 115 120 125

Thr Gly Asn Glu Ala Thr Leu Ala Ala Cys Thr Ser Asn Gly Trp Gly 130 135 140

Val Thr Asp Cys Lys His Thr Glu Asp Val Gly Val Val Cys Ser Asp 145 150 155 160

Lys Arg He Pro Gly Phe Lys Phe Asp Asn Ser· Leu He Asn Gin tie 165 Π0 175

Glu Asn Leu Asn He Gin Val Glu Asp lie Arg He Arg Ala He Leu 180 185 180

Ser Thr Tyr Arg Lys Arg Thr Pro Val Met Glu Gly Tyr Val Glu Val 195 200 205

Lys Glu Gly Lys Thr Trp Lys Gin lie Cys Asp Lys His Trp Thr Ala 210 21S 220

Lys Asn Ser Arg Val Val Cys Gly Met Phe Gly Phe Pro Gly Glu Arg 225 230 235 240

Thr Tyr Asn Thr Lys Val Tyr Lys Met Phe Ala Ser Arg Arg Lys Gin 245 250 255

Arg Tyr Trp Pro Phe Ser Met Asp Cys Thr Gly Thr Glu Ala His He 260 265 270

Ser Ser Cys Lys Leu Gly Pro Gin Val Ser Leu Asp Pro Met Lys Asn 275 280 205

Val Thr Cys Glu Asn Gly Leu Pro Ala Val Val5ftt* Cys Val Pro Gly 290 295 300

Gin Vai Phe Ser Pro Asp Gly Pro Ser Arg Phe Arg Lys Ala Tyr 305 310 315 320

Pro Glu Gin Pro Leu Val Arg Leu Arg Gly Gly Ala Tyr lie Gly Glu 325 330 335

Gly Arg Val Glu Val Leu Lys Asn Gly Glu Trp Gly Thr Val Cys Asp 340 345 350

Asp Lys Trp Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val Cys Arg Glu Leu Gly 355 360 365

Phe Gly Ser Ala Lys Glu Ala Val Thr Gly Ser Arg Leu Gly Gin Gly 310 375 380 lie Gly Pro lie His Leu Asn Glu He Gin Cys Thr Gly Asn Glu Lys 385 390 395 400

Ser lie He Asp Cys Lys Phe Asn Ala Glu Ser Gin Gly Cys Asn HÍ3 405 410 415

Glu Glu Asp Ala Gly Val Arg Cys Asn Thr Pro Ala Met Gly Leu Gin 420 425 430

Lys Lys Leu Arg Leu Asn Gly Gly Arg Asn Pro Tyr Glu Gly Arg Val 435 440 445

Glu Val Leu Val Glu Arg Asn Gly Ser Leu Val Trp Gly Met Val Cys 450 455 460

Gly Gin Asn Trp Gly lie Val Glu Ala Met Val Val Cys Arg Gin Leu 465 470 475 480

Gly Leu Gly Phe Ala Sar Asn Ala Phe Gin Glu Thr Trp Tyr Trp His 465 490 495

Gly Asp Val Asn Ser Asn Lys Val Val Met Ser Gly Val Lys Cys Ser 500 505 5X0

Gly Thr Glu leu Ser Leu Ala His Cys Arg His Asp Gly Glu Asp Val 515 520 525

Ala Cys Pro Gin Gly Gly Val Gin Tyr Gly Ala Gly Val Ala Cys Ser 530 535 540

Glu Thr Ala Pro Asp Leu Val Leu Asn Ala Glu Met Val Gin Gin Thr 545 550 555 560

Thr Tyr Leu Glu Asp Arg Pro Met Phe Met Leu Gin Cys Ala Met Glu 565 570 575

Glu Asn Cys Leu Ser Ala Ser Ala Ala Gin Thr Asp Pro Thr Thr Gly 580 585 590

Tyr Arg Arg Leu Leu Arg Phe Ser Ser Gin He His Asn Asn Gly Gin 595 600 605

Ser Asp Phe Arg Pro Lys Asn Gly Arg His Ala Trp lie Trp His Asp 610 615 620

Cys His Arg His Tyr His Ser Met Glu Val Phe Thr His Tyr Asp Leu 625 630 635 640

Leu Asn Leu Asn Gly Thr Lys Val Ala Glu Gly His Lys Ala Ser Phe 645 650 655

Cys Leu Glu Asp Thr Glu Cys Glu Gly Asp lie Gin Lys asn Tyr Glu 660 665 670

Cys Ala Asn Phe Gly Asp Gin Gly lie Thr Met Gly Cys Trp Asp Met 675 680 685 *

Tyr Arg His Asp lie Asp Cys Gin Trp Val Asp He Thr Asp Val Pro 690 695 700

Pro Gly Asp Tyr Leu Phe Gin Val Val lie Asn Pro Asn Phe Glu Val 705 710 715 720

Ala Glu Ser Asp Tyr Ser Asn Asn lie Met Lys Cys Arg Ser Arg Tyr 725 730 735

Asp Gly His Arg He Trp Met Tyr Asn Cys His lie Gly Gly Ser Phe 740 745 750

Ser Glu Glu Thr Glu Lys Lys Phe Glu His Phe Ser Gly Leu Leu Asn 755 760 765

Asn Gin Leu Ser Pro Gin 770

<210> 3 <211> 757 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Met Met Trp Pro Gin Pro Pro Thr Phe Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Leu Ser Gin Ala Pro Ser Ser Arg Pro Gin Ser Ser Gly Thr Lys Lys 20 25 30

Leu Arg Leu Val Gly Pro Ala Asp Arg Pro Glu Glu Gly Arg Leu Glu 35 40 45

Vai Leu His Gin Gly Gin Trp Gly Thr Vai Cys Asp Asp Asp Phe Ala 50 55 60

Leu Gin Glu Ala Thr Vai Ala Cys Arg Gin Leu Gly Phe Glu Ser Ala 65 70 75 80

Leu Thr Trp Ala His Ser Ala Lys Tyr Gly Gin Gly Glu Gly Pro lie 85 90 95

Trp Leu Asp Asn Vai Arg Cys Leu Gly Thr Glu Lys Thr Leu Asp Gin 100 105 110

Cys Gly Ser Asn Gly Trp Gly Tie Ser Asp Cys Arg His Ser Glu Asp 115 120 125

Vai Gly Vai Vai Cys His Pro Arg Arg Gin His Gly Tyr His Ser Glu 130 135 140

Lys Vai Ser Asn Ala Leu Gly Pro Gin Gly Arg Arg Leu Glu Glu Vai 145 150 155 160

Arg Leu Lys Pro lie Leu Ala Ser Ala Lys Arg His Ser Pro Vai Thr 165 170 175

Glu Gly Ala Vai Glu Vai Arg Tyr Asp Gly His Trp Arg Gin Vai Cys 180 185 190

Asp Gin Gly Trp Thr Met Asn Asn Ser Arg Vai Vai Cys Gly Met Leu 195 200 205

Gly Phe Pro Ser Gin Thr Ser Vai Asn Ser His Tyr Tyr Arg Lys Vai 210 215 220

Trp Asn Leu Lys Met Lys Asp Pro Lys Ser Arg Leu Asn Ser Leu Thr 225 230 235 240

Lys Lys Asn Ser Phe Trp lie His Arg Vai Asp Cys Phe Gly Thr Glu 245 250 255

Pro His Leu Ala Lys Cys Gin Val Gin Val Ala Pro Gly Axg Gly Lys 260 265 270

Leu Arg Pro Ala Cys Pro Gly Gly Met His Ala Val val See Cys val 275 280 285

Ala Gly Pro His Phe Arg Arg Gin Lys Pro Lys Pro Thr Arg Lys Glu 230 295 300

Ser His Ala Glu Glu Leu Lys Val Arg Leu Arg Ser Gly Ala Gin Val 305 310 315 320

Gly Glu Gly Arg Val Glu Val Leu Met Asn Arg Gin Trp Gly Thr Val 325 330 335

Cys Asp His Arg Trp Asn Lea lie Ser Ala Ser Val val Cys Arg Gin 340 345 350

Leu Gly Phe Gly Ser Ala Arg Glu Ala Leu Phe Gly Ala Gin Leu Gly 355 360 365

Gin Gly Leu Gly Pro He His Leu Ser Glu Val Arg Cys Arg Gly Tyt 370 375 380

Glu Arg Thr Leu Gly Asp Cys Leu Ala Leu Glu Gly Ser Gin Asn Gly 385 390 395 400

Cys Gin His Ala ftsn Asp Ala Ala Val Arg Cys Asn He Pro Asp Met 405 410 415

Gly Phe Gin Asn Lys Val Arg Leu Ala Gly Gly Arg Asn Ser Glu Glu 420 425 430

Gly Val Val Glu Val Gin Val Glu Val Asn Gly Gly Pro Arg Trp Gly 435 440 445 '

Thr Val Cys Ser Asp His Trp Gly Leu Thr Glu Ala Met Val Thr Cys 450 455 460

Arg Gin Leu Gly Leu Gly Phe Ala Asn Phe Ala Leu Lys Asp Thr Trp 465 4 "70 475 480

Tyr Trp Gin Gly Thr Pro Glu Ala Lys Glu Val Val Met Ser Gly Val 485 490 495

Arg Cys Ser Gly Thr Glu Met Ala Leu Gin Gin Cys Gin Arg His Gly 500 505 510

Pro Val His Cys Ser His Gly Pro Gly Arg Phe Ser Ala Gly Val Ala 515 520 525

Cys Met Asn Ser Ala Pro Asp Leu Val Met Asn Ala Gin Leu Val Gin 530 535 540

Glu Thr Ala Tyr Leu Glu Asp Arg Pro Leu Ser Met Leu Tyr Cys Ala 545 550 555 560

His Glu Glu Asn Cys Leu Ser Lys Ser Ala Asp His Met Asp Trp Pro 565 570 575

Tyr Gly Tyr Arg Arg Leu Leu Arg Phe Ser Ser Gin lie Tyr Asn Leu 580 585 590

Gly Arg Ala Asp Phe Arg Pro Lys Ala Gly Arg His Ser Trp lie Trp 595 600 605

His Gin Cys His Arg His Asn His Ser lie Glu Val Phe Thr His Tyr 610 615 620

Asp Leu Leu Thr Leu Asn Gly Ser Lys Val Ala Glu Gly His Lys Ala 625 630 635 640

Ser Phe Cys Leu Glu Asp Thr Asn Cys Pro Ser Gly Val Gin Arg Arg 645 650 655

Tyr Ala Cys Ala Asn Phe Gly Glu Gin Gly Val Ala Val Gly Cys Trp 660 665 670

Asp Thr Tyr Arg His Asp lie Asp Cys Gin Trp Val Asp lie Thr Asp 675 680 685

Val Gly Pro Gly Asp Tyr lie Phe Gin Val Val Val Asn Pro Thr Asn 690 695 700

Asp Val Ala Glu Ser Asp Phe Ser Asn Asn Met lie Arg Cys Arg Cys 705 710 715 720

Lys Tyr Asp Gly Gin Arg Val Trp Leu His Asn Cys His Thr Gly Asp 725 730 735

Ser Tyr Arg Ala Asn Ala Glu Leu Ser Leu Glu Gin Glu Gin Arg Leu 740 745 750

Arg Asn Asn Leu He 755 <210> 4 <211> 2262 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgcgacctg tcagtgtctg gcagtggagc ccctgggggc tgctgctgtg cctgctgtgc 60 agttcgtgct tggggtctcc gtccccttcc acgggccctg agaagaaggc cgggagccag 120 gggcttcggt tccggctggc tggcttcccc aggaagccct acgagggccg cgtggagata 180 cagcgagctg gtgaatgggg caccatctgc gatgatgact tcacgctgca ggctgcccac 240 atcctctgcc gggagctggg cttcacagag gccacaggct ggacccacag tgccaaatat 300 ggccctggaa caggccgcat ctggctggac aacttgagct gcagtgggac cgagcagagt 360 gtgactgaat gtgcctcccg gggctggggg aacagtgact gtacgcacga tgaggatgct 420 ggggtcatct gcaaagacca gcgcctccct ggcttctcgg actccaatgt cattgaggta 480 gagcatcacc tgcaagtgga ggaggtgcga attcgacccg ccgttgggtg gggcagacga 540 cccctgcccg tgacggaggg gctggtggaa gtcaggcttc ctgacggctg gtcgcaagtg 600 tgcgacaaag gctggagcgc ccacaacagc cacgtggtct gcgggatgct gggcttcccc 660 agcgaaaaga gggtcaacgc -ggccttctac aggctgctag cccaacggca gcaacactcc 720 tttggtctgc atggggtggc gtgcgtgggc acggaggccc acctctccct ctgttccctg 780 gagttctatc gtgccaatga caccgccagg tgccctgggg ggggccctgc agtggtgagc 840 tgtgtgccag gccctgtcta cgcggcatcc agtggccaga agaagcaaca acagtcgaag 900 cctcaggggg aggcccgtgt ccgtctaaag ggcggcgccc accctggaga gggccgggta 960 gaagtcctga aggccagcac atggggcaca gtctgtgacc gcaagtggga cctgqatgca 1020 gccagcgtgg tgtgtcggga gctgggcttc gggagtgctc gagaagctct gagtggcgct 1080 cgcatggggc agggcatggg tgctatccac ctgagtgaag ttcgctgctc tggacaggag 1140 ctctccctct ggaagtgccc ccacaagaac atcacagctg aggattgttc acatagccag 1200 gatgccgggg tccggtgcaa cctaccttac actggggcag agaccaggat ccgactcagt 1260 gggggccgca gccaacatga ggggcgagtc gaggtgcaaa tagggggacc tgggcccctt 1320 cgctggggcc tcatctgtgg ggatgactgg gggaccctgg aggccatggt ggcctgtagg 1380 caactgggtc tgggctacgc caaccacggc ctgcaggaga cctggtactg ggactctggg 1440 aatataacag aggtggtgat gagtggagtg cgctgcacag ggactgagct gtccctggat 1500 cagtgtgccc atcatggcac ccacatcacc tgcaagagga cagggacccg cttcactgct 1560 ggagtcatct gttctgagac tgcatcagat ctgttgctgc actcagcact ggtgcaggag 1620 accgcctaca tcgaagaccg gcccctgcat atgttgtact gtgctgcgga agagaactgc 1680 cfcggccagct cagcccgctc agccaactgg ccctatggtc accggcgtct gctccgattc 1740 tcctcccaga tccacaacct gggacgagct gacttcaggc ccaaggctgg gcgccactcc 1800 tgggtgtggc acgagtgcca tgggcattac cacagcatgg acatcttcac tcactatgat 1860 atcctcaccc caaatggcac caaggtggct gagggccaca aagctagttt ctgtctcgaa 1920 gacactgagt gtcaggagga tgtctccaag cggtatgagt gtgccaactt tggagagcaa 1980 ggcatcactg tgggttgctg ggatctctac cggcatgaca ttgactgtca gtggattgac 2040 atcacggatg tgaagccagg aaactacatt ctccaggttg tcatcaaccc aaactttgaa 2100 gtagcagaga gtgactttac caacaatgca atgaaatgta actgcaaata tgatggacat 2160 agaatctggg tgcacaactg ccacattggt gatgccttca gtgaagaggc caacaggagg 2220 tttgaacgct accctggcca gaccagcaac cagattatct aa 2262 <210> 5 <211> 1725

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggctctgg cccgaggcag ccggcagctg ggggccctgg tgtggggcgc ctgcctgtgc 60 gtgctggtgc acgggcagca ggcgcagccc gggcagggct cggaccccgc ccgctggcgg 120 cagctgatcc agtgggagaa caacgggcag gtgtacagct tgctcaactc gggctcagag 180 tacgtgccgg ceggacetca gcgctccgag agtagctccc gggtgctgct ggccggcgcg 240 ccccaggccc agcagcggcg cagccacggg agcccceggc gtcggcaggc gccgtccctg 300 cccctgccgg ggcgcgtggg ctcggacacc gkgcgcggcc aggcgcggca cccatteggc 360 tttggccagg tgcccgacaa ctggcgcgag gtggccgtcg gggacageae gggcatggcc 420 ctggcccgca cctccgtctc ccagcaacgg cacgggggct ccgcctcctc ggtctcggct 480 tçggçcttcg ccagcaccta ccgccagcag ccçtcctacc cgcagcagtt eccetacccg 540 caggcgccct tcgtcagcca gtacgagaac tacgaccccg cgtcgcggac ctacgaccag 600 ggtttcgtgt actaccggcc cgcgggcggc ggcgtgggcg cgggggcggc ggccgtggcc 660 tcggcggggg fccatctaccc ctaccagccc cgggegcgct acgaggagta cggcggcggc 720 gaagagctgc ccgagtaccc gcctcagggc ttctaccegg cccccgagag gccctacgtg 780 ccgccgccgc cgccgccccc cgacggcctg gaccgccgct actcgcacag tctgtacagc 840 gagggcaccc ccggcttcga gcaggcctac cctgaccccg gtcccgaggc ggcgcaggcc 900 catggcggag acccacgcct gggctggtac ccgccetacg ccaacccgcc gcccgaggcg 960 tacgggccgc cgcgcgcgct ggagcegccc taccfcgccgg tgcgcagctc cgacacgccc 1020 ccgccgggtg gggagcggaa cggcgcgeag cagggccgcc tcagcgtagg cagcgtgtac 1080 cggcccaacc agaacggccg cggtctccct gacttggtcc cagaccccaa ctatgtgcaa 1140 gcatccactt atgtgcagag agcccacctg tactccctgc gctgtgctgc ggaggagaag 1200 tgtctggcca gcacagccta tgcccctgag gccaccgact acgatgtgcg ggtgctactg 1260 cgcttccccc agcgcgtgaa gaaccagggc acagcagact tcctccccaa ccggccacgg 1320 cacacctggg agtggeacag ctgccaccag cattaecaca gcatggacga gtfccagccac 1380 tacgacctac tggatgcagc cacaggcaag aaggtggccg agggccacaa ggccagtttc 1440 tgcctggagg acagcacctg tgacttcggc aacctcaagc gctatgcatg cacctctcat 1500 acccagggcc tgagcecagg ctgctatgac acctacaatg cggacatcga ctgccagtgg 1560 atcgacataa ccgacgtgca gcctgggaac tacatcctca aggtgcacgt gaacccaaag 1620 tatattgttt tggagtctga cttcaccaac aacgtggtga gatgcaacat tcactacaca 1680 ggtcgctacg tttctgcaac aaactgcaaa attgtccaat cctga 1725

<210> 6 <211> 574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met Ala Leu Ala Arg Gly Ser Arg Gin Leu Gly Ala Leu Val Trp Gly 15 10 15

Ala Cys Leu Cys Val Leu Val His Gly Gin Gin Ala Gin Pro Gly Gin 20 25 30

Gly Ser Asp Pro Ala Arg Trp Arg Gin Leu lie Gin Trp Glu Asn Asn 35 40 45

Gly Gin Val Tyr Ser Leu Leu Asn Ser Gly Ser Glu Tyr Val Pro Ala 50 55 60

Gly Pro Gin Arg Ser Glu Ser Ser Ser Arg Val Leu Leu Ala Gly Ala 65 70 75 00

Pro Gin Ala Gin Gin Arg Arg Ser His Gly Ser Pro Arg Arg Arg Gin 85 90 95

Ala Pro Ser Leu Pro Leu Pro Gly Arg Val Gly Ser Asp Thr Val Arg 100 105 110

Gly Gin Ala Arg His Pro Phe Gly Phe Gly Gin Val Pro Asp Asn Trp 115 120 125

Arg Glu Vai Ala Vai Gly Asp Ser Thr Gly Met Ala Leu Ala Arg Thr 130 135 140

Ser Vai Ser Gin Gin Arg His Gly Gly Ser Ala Ser Ser Vai Ser Ala 145 150 155 160

Ser Ala Phe Ala Sex Thr Tyr Arg Gin Gin Pro Ser Tyr Pro Gin Gin 165 170 175

Phe Fro Tyr Pro Gin Ala Pro Fhe vai Ser Gin Tyr Glu Asn Tyr Asp 180 185 190

Pro Ala Ser Arg Thr Tyr Asp Gin Gly Phe Vai Tyr Tyr Arg Pro Ala 195 200 205

Gly Gly Gly Vai Gly Ala Gly Ala Ala Ala Vai Ala Ser Ala Gly Vai 210 215 220 lie Tyr Pro Tyr Gin Pro Arg Ala Arg Tyr Glu Glu Tyr Gly Gly Gly 225 230 235 240

Glu Glu Leu Pro Glu Tyr Pro Pro Gin Gly Phe Tyr Pro Ala Pro Glu 245 250 255

Arg Pro Tyr Vai Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Gly Leu Asp Arg 260 26S 270

Arg Tyr Ser His Ser Leu Tyr Ser Glu Gly Thr Pro Gly Phe Glu Gin 275 280 285

Ala Tyr Pro Asp Pro Gly Pro Glu Ala Ala Gin Ala His Gly Gly Asp 290 295 300

Pro Arg Leu Gly Trp Tyr Pro Pro Tyr Ala Asn Pro Pro Pro Glu Ala 305 310 315 320

Tyr Gly Pro Pro Arg Ala Leu Glu Pro Pro Tyr Leu Pro Val Arg Ser 325 330 33^

Ser Asp Thr Pro Pro Pro Gly Gly Glu Arg Asn Gly Ala Gin Gin Gly 340 345 350

Arg Leu Ser val Gly Ser val Tyr Arg Pro Asn Gin Asn Gly Arg Gly 355 360 365

Leu Pro Asp Leu Val Pro Asp Pro Asn Tyr val Gin Ala Ser Thr Tyr 370 375 380

Val Gin Arg Ala Bis Leu Tyr Ser Leu Arg Cys Ala Ala Glu Glu Lys 385 390 395 <00

Cys Leu Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Pro Glu Ala Thr Asp Tyr Asp Val 405 410 415

Arg Val leu Leu Arg Phe Pro Gin Arg val Lys Asn Gin Gly Thr Ala 420 425 430

Asp Phe Leu Pro Asn Arg Pro Arg His Thr Trp Glu Trp His Ser Cys 435 440 445

His Gin His Tyr His Ser Met Asp Glu Phe Sex His Tyr Asp Leu Leu 450 455 460

Asp Ala Ala Thr Gly Lys Lys Val Ala Glu Gly His Lys Ala Ser Phe 465 470 475 480

Cys Leu Glu Asp Ser Thr Cys Asp Phe Gly Asn Leu Lys Arg Tyr Ala 485 490 495

Cys Thr Ser His Thr Gin Gly Leu Ser Pro Gly Cys Tyr Asp Thr Tyr 500 505 510

Asn Ala Asp He Asp Cys Gin Trp lie Asp He Thr Asp Val Gin Pro 515 520 525

Gly Asn Tyr He Leu Lys Val His Val Asn Pro Lys Tyr He Val Leu 530 535 540

Glu Ser Asp Phe Thr Asn Asn Val Val Arg Cys Asn He His Tyr Thr 545 550 555 560

Gly Arg Tyr Val Ser Ala Thr Asn Cys Lys He Val Gin Ser 565 570 <210> 7 <211> 1254

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgcgcttcg cctggaccgt gctcctgctc gggcctttgc agctctgcgc gctagtgcac 60 tgcgcccctc ccgccgccgg ccaacagcag cccccgcgcg agccgccggc ggctccgggc 120 gcctggcgcc agcagatcca atgggagaac aacgggcagg tgttcagctt gctgagcctg 180 ggctcacagt accagcctca gcgccgccgg gacccgggcg ccgccgtccc tggtgcagcc 240 aacgcctccg cccagcagcc ccgcactccg atcctgctga tccgcgacaa ccgcaccgcc 300 gcggcgcgaa cgcggacggc cggctcatct ggagtcaccg ctggccgccc caggcccacc 360 gcccgtcact ggttccaagc tggctactcg acatctagag cccgcgaagc tggcgcctcg 420 cgcgcggaga accagacagc gccgggagaa gttcctgcgc tcagtaacct gcggccgccc 480 agccgcgtgg acggcatggt gggcgacgac ccttacaacc cctacaagta ctctgacgac 540 aacccttatt acaactacta cgatacttat gaaaggccca gacctggggg caggtaccgg 600 cccggatacg gcactggcta cttccagtac ggtctcccag acctggtggc cgacccctac 660 tacatccagg cgtccacgta cgtgcagaag atgtccatgt acaacctgag atgcgcggcg 720 gaggaaaact gtctggccag tacagcatac agggcagatg tcagagatta tgatcacagg 780 gtgctgctca gatttcccca aagagtgaaa aaccaaggga catcagattt cttacccagc 840 cgaccaagat attcctggga atggcacagt tgtcatcaac attaccacag tatggatgag 900 tttagccact atgacctgct tgatgccaac acccagagga gagtggctga aggccacaaa 960 gcaagtttct gtcttgaaga cacatcctgt gactatggct accacaggcg atttgcatgt 1020 actgcacaca cacagggatt gagtcctggc tgttatgata cctatggtgc agacatagac 1080 tgccagtgga ttgatattac agatgtaaaa cctggaaact atatcctaaa ggtcagtgta 1140 aaccccagct acctggttcc tgaatctgac tataccaaca atgttgtgcg ctgtgacatt 1200 cgctacacag gacatcatgc gtatgcctca ggctgcacaa tttcaccgta ttag 1254

<210> 8 <211> 417 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Met Arg Phe Ala Trp Thr Val Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gin Leu Cys 15 10 15

Ala Leu Val His Cys Ala Pro Pro Ala Ala Gly Gin Gin Gin Pro Pro 20 25 30

Arg Glu Pro Pro Ala Ala Pro Gly Ala Trp Arg Gin Gin lie Gin Trp 35 -JO 45

Glu Asn Asn Gly Gin Val Phe Ser Leu Leu Ser Leu Gly Ser Gin Tyr 50 55 60

Gin Pro Gin Arg Arg Arg Asp Pro Gly Ala Ala Val Pro Gly Ala Ala 65 70 75 80

Asn Ala Ser Ala Gin Gin Pro Arg Thr Pro He Leu Leu lie Arg Asp 85 90 95

Asn Arg Thr Ala Ala Ala Arg Thr Arg Thr Ala Gly Ser Ser Gly Val 100 105 110

Thr Ala Gly Arg Pro Arg Pro Thr Ala Arg His Trp Phe Gin Ala Gly 115 120 125

Tyr Ser Thr Ser Arg Ala Arg Glu Ala Gly Ala Ser Arg Ala Glu Asn 130 135 140

Gin Thr Ala Pro Gly Glu Val Pro Ala Leu Ser Ann Leu Arg Pro Pro 145 ‘ 150 155 160

Ser Arg val Asp Gly Met Val Gly Asp Asp Pro Tyr Asn Pro Tyr Lys 165 170 175

Tyr Ser Asp Asp Asn Pro Tyr Tyr Asn Tyr Tyr Asp Thr Tyr Glu Arg 180 185 130

Pro Arg Pro Gly Gly Arg Tyr Arg Pro Gly Tyr Gly Thr Gly Tyr Phe 195 200 205

Gin Tyr Gly Leu Pro Asp Leu Val Ala Asp Pro Tyr Tyr lie Gin Ala 210 215 220

Ser Thr Tyr Val Gin Lys Met Ser Met Tyr Asn Leu Arg Cys Ala Ala 225 230 235 240

Glu Glu Asn Cys Leu Ala Ser Thr Ala Tyr Arg Ala Asp Val Arg Asp 245 250 255

Tyr Asp His Arg Val Leu Leu Arg Phe Pro Gin Arg Val Lys Asn Gin 260 265 270

Gly Thr Ser Asp Phe Leu Pro Ser Arg Pro Arg Tyr Ser Trp Glu Trp 275 280 285

His Ser Cys His Gin His Tyr His Ser Met Asp Glu Phe Ser His Tyr 290 295 300

Asp Leu Leu Asp Ala Asn Thr Gin Arg Arg Val Ala Glu Gly His Lys 305 310 315 320

Ala Ser Phe Cys Leu Glu Asp Thr Ser Cys Asp Tyr Gly Tyr His Arg 325 330 335

Arg Phe Ala Cys Thr Ala His Thr Gin Gly Leu Ser Pro Gly Cys Tyr 340 345 350

Asp Thr Tyr Gly Ala Asp lie Asp Cys Gin Trp He Asp lie Thr Asp 355 360 365

Val Lys Pro Gly Asn Tyr He Leu Lys Val Ser Val Asn Pro Ser Tyr 370 375 380

Leu Val Pro Glu Ser Asp Tyr Thr Asn Asn Val Val Arg Cys Asp He 385 390 395 400

Arg Tyr Thr Gly His His Ala Tyr Ala Ser Gly Cys Thr He Ser Pro 405 410 415

Tyr

<210> 9 <211> 752 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Met Arg Pro Val Ser Val Trp Gin Trp Ser Pro Trp Gly Leu Leu Leu 15 10 15

Cys Leu Leu Cys Ser Ser Cys Leu Gly Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gly 20 25 30

Pro Glu Lys Lys Ala Gly Ser Gin Gly Leu Arg Phe Arg Leu Ala Gly 35 40 45

Phe Pro Arg Lys Pro Tyr Glu Gly Arg Val Glu He Gin Arg Ala Gly 50 55 60

Glu Trp Gly Thr lie Cys Asp Asp Asp Phe Thr Leu Gin Ala Ala His 65 70 75 80 lie Leu Cys Arg Glu Leu Gly Phe Thr Glu Ala Thr Gly Trp Thr His 85 90 95

Ser Ala Lys Tyr Gly Pro Gly Thr Gly Arg He Trp Leu Asp Asn Leu 100 105 110

Ser Cys Ser Gly Thr Glu Gin Ser Val Thr Glu Cys Ala Ser Arg Gly 115 120 125

Trp Gly Asn Ser Asp Cys Thr His Asp Glu Asp Ala Gly Val lie Cys 130 135 140

Lys Asp Gin Arg Leu Pro Gly Phe Ser Asp Ser Asn val lie Glu Val 145 150 155 160

Glu His His Leu Gin Val Glu Glu Val Arg lie Arg Pro Ala Val Gly 165 170 175

Trp Gly Arg Arg Pro Leu Pro Val Thr Glu Gly Leu Val Glu Val Arg 180 185 190

Leu Pro Asp Gly Trp Ser Gin Val Cys Asp Lys Gly Trp Ser Ala His 195 200 205

Asn Ser His val Val Cys Gly Met Leu Gly Phe Pro Ser Glu Lys Arg 210 215 220 val Asn Ala Ala Phe Tyr Arg Leu Leu Ala Gin Arg Gin Gin His Ser 225 230 235 240

Phe Gly Leu His Gly Val Ala Cys Val Gly Thr Glu Ala His Leu Ser 245 250 255

Leu Cys Ser Leu Glu Phe Tyr Arg Ala Asn Asp Thr Ala Arg Cys Pro 260 265 270

Gly Gly Gly Pro Ala Val Val Ser Cys Val Pro Gly Pro Val Tyr Ala 275 280 285

Ala Ser Ser Gly Gin Lys Lys Gin Gin Gin Ser Lys Pro Gin Gly Glu 290 295 300

Ala Arg Val Arg Leu Lys Gly Gly Ala His Pro Gly Glu Gly Arg Val 305 310 315 320

Glu Val Leu Lys Ala Ser Thr Trp Gly Thr Val Cys Asp Arg Lys Trp 325 330 335

Asp Leu His Ala Ala Ser Val Val Cys Arg Glu Leu Gly Phe Gly Ser 340 345 350

Ala Arg Glu Ala Leu Ser Gly Ala Arg Met Gly Gin Gly Met Gly Ala 355 360 365 lie His Leu Ser Glu val Arg Cys Ser Gly Gin Glu Leu Ser Leu Trp 370 375 380

Lys Cys Pro His Lys Asn He Thr Ala Glu Asp Cys Ser His Ser Gin 385 390 395 400

Asp Ala Gly Val Arg Cys Asn Leu Pro Tyr Thr Gly Ala Glu Thr Arg 405 410 415 lie Arg Leu Ser Gly Gly Arg Ser Gin Kis Glu Gly Arg Val Glu Val 420 425 430

Gin lie Gly Gly Pro Gly Pro Leu Arg Trp Gly Leu lie Cys Gly Asp 435 440 445

Asp Trp Gly Thr Leu Glu Ala Met Val Ala Cys Arg Gin Leu Gly Leu 450 455 460

Gly Tyr Ala Asn His Giy Leu Gin Glu Thr Trp- Tyr Trp Asp Ser Gly 465 470 475 480

Asn lie Thr Glu Val Val Met Ser Gly Val Arg Cys Thr Gly Thr Glu 485 490 495

Leu Ser Leu Asp Gin Cys Ala His His Gly Thr His He Thr Cys Lys 500 SOS 510

Arg Thr Gly Thr Arg Phe Thr Ala Gly Val lie Cys Ser Glu Thr Ala 515 520 525

Ser Asp Leu Leu Leu His Ser Ala Leu Vai Gin Glu Thr Ala Tyr lie 530 535 540

Glu Asp Arg Pro Leu His Met Leu Tyr Cys Ala Ala Glu Glu Asn Cys 5^5 550 555 560

Leu Ala Ser Ser Ala Arg Ser Ala Asn Trp Pro Tyr Gly His Arg Arg 565 570 575

Leu Leu Arg Phe ser Ser Gin He His Asn Leu Gly Arg Ala Asp phe 580 585 590

Arg Pro Lys Ala Gly Arg His Ser Trp Vai Trp His Glu Cys His Gly 595 ' 600 605

His Tyr His Ser Met Asp He Phe Thr His Tyr Asp He Leu Thr Pro 610 615 620

Asn Gly Thr Lys Vai Ala Glu Gly His Lys Ala Ser Phe Cys Leu Glu 625 630 635 640

Asp Thr Glu Cys Gin Glu Asp Vai Ser Lys Arg Tyr Glu Cys Ala Asn 645 650 655

Phe Gly Glu Gin Gly He Thr Vai Gly Cys Trp Asp Leu Tyr Arg His 660 665 670

Asp lie Asp Cys Gin Trp lie Asp He Thr Asp Vai Lys Pro Gly Asn 675 680 685

Tyr He Leu Gin Vai Vai He Asn Pro Asn Phe Glu Vai Ala Glu Ser 690 695 700

Asp Phe Thr Asn Asn Ala Met Lys Cys Asn Cys Lys Tyr Asp Gly His 705 710 715 720

Arg lie Trp Val His Asn Cys His He Gly Asp Ala Phe Ser Glu Glu 725 730 735

Ala Asn Arg Arg Phe Glu Arg Tyr Pro Gly Gin Thr Ser Asn Gin lie 740 745 750

<210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Oligonucleótido de DNA de cadeia simples <400> 10 cgcaagcttg gatccgggat ggagaggcct ctgtgc 36

<210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Oligonucleótido de DNA de cadeia simples <400> 11 cgctctagag gatccttact gcggggacag ctggttg 37

<210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Oligonucleótido de DNA de cadeia simples <400> 12 gccatgcgac ctgtcagtgt c 21

<210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Oligonucleótido de DNA de cadeia simples <400> 13 gggcagtggc acttagat 18 <210> 14 <211> 613 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ccctgacctg gtcctcaatg cggagatggt gcagcagacc acctacctgg aggaccggcc 60 catgttcatg ctgcagtgtg ccatggagga gaactgcctc tcggcctcag ccgcgcagac 120 cgaccccacc acgggctacc gccggctcct gcgcttctcc tcccagatcc acaacaatgg 180 ccagtccgac ttccggccca agaacggccg ccacgcgtgg atctggcacg actgtcacag 240 gcactaccac agcatggagg tgttcaccca ctatgacctg ctgaacctca atggcaccaa 300 ggtggcagag ggccacaagg ccagcttctg cttggaggac acagaatgtg aaggagacat 360 ccagaagaat tacgagtgtg ccaacttcgg cgatcagggc atcaccatgg gctgctggga 420 catgtaccgc catgacatcg actgccagtg ggttgacatc actgacgtgc cccctggaga 480 ctacctgttc caggttgtta ttaaccccaa cttcgaggtt gcagaatccg attactccaa 540 caacatcatg aaatgcagga gccgctatga cggccaccgc atctggatgt acaactgcca 600 cataggtggt tcc 613

<210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido de DNA de cadeia simples <400> 15 acatgcatgc cctgacctgg tcctcaatgc 30

<210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido de DNA de cadeia simples <400> 16 cccaagcttg gaaccaccta tgtggcagtt 30

<210> 17 <211> 210 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência da proteína derivada da ilusão de LOR--1 fragmento {.1641-2253} a um tag 5' 6XHis <400> 17

His His His His His His Pro Asp Leu Val Leu Asn Ala Glu Met Val 15 10 15

Gin Gin Thr Thr Tyr Leu Glu Asp Arg Pro Met Phe Met Leu Gin Cys 20 25 30

Ala Met Glu Glu Asn Cys Leu ser Ala Ser Ala Ala Gin Thr Asp Pro 35 40 45

Thr Thr Gly Tyr Arg Arg Leu Leu Arg Phe Ser Ser Gin lie His Asn 50 55 60

Asn Gly Gin Ser Asp Phe Arg Pro Lys Asn Gly Arg His Ala Trp Ile 65 70 75 80

Trp His Asp Cys His Arg His Tyr His Ser Met Glu Vai Phe Thr His 85 90 95

Tyr Asp Leu Leu Asn Leu Asn Gly Thr Lys Vai Ala Glu Gly His Lys 100 105 110

Ala Ser Phe Cys Leu Glu Asp Thr Glu Cys Glu Gly Asp Ile Gin Lys 115 120 125

Asn Tyr Glu Cy3 Ala Asn Phe Gly Asp Gin Gly lie Thr Met Gly Cys 130 135 140

Trp Asp Met Tyr Arg His Asp Ile Asp Cys Gin Trp Vai Asp Ile Thr 145 ISO 155 160

Asp Vai Pro Pro Gly Asp Tyr Leu Phe Gin Vai Vai lie Asn Pro Asn 165 170 175

Phe Glu Vai Ala Glu Ser Asp Tyr Ser Asn Asn lie Met Lys Cys Arg 180 185 190

Ser Arg Tyr Asp Gly His Arg lie Trp Met Tyr Asn Cys His Ile Gly 195 200 205

Gly Ser 210

<210> 18 <211> 660 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sonda de Northern blot consistindo era nucleótidos 1-660 do ADNc de LOR - 1 <400> 18 atggagaggc ctctgtgctc ccacctctgc agctgcctgg ctatgctggc cctcctgtcc 60 cccctgagcc tggcacagta tgacagctgg ccccattacc ccgagtactt ccagcaaccg 120 gctcctgagt atcaccagcc ccaggccccc gccaacgtgg ccaagattca gctgcgcctg 180 gctgggcaga agaggaagca cagcgagggc cgggtggagg tgtactatga tggccagtgg 240 ggcaccgtgt gcgatgacga cttctccatc cacgctgccc acgtcgtctg ccgggagctg 300 ggctatgtgg aggccaagtc ctggactgcc agctcctcct acggcaaggg agaagggccc 360 atctggttag acaatctcca ctgtactggc aacgaggcga cccttgcagc atgcacctcc 420 aatggctggg gcgtcactga ctgcaagcac acggaggatg tcggtgtggt gtgcagcgac 480 aaaaggattc ctgggttcaa atttgacaat tcgttgatca accagataga gaacctgaat 540 atccaggtgg aggacattcg gattcgagcc atcctctcaa cctaccgcaa gcgcacccca 600 gtgatggagg gctacgtgga ggtgaaggag ggcaagacct ggaagcagat ctgtgacaag 660

<210> 19 <211> 530 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sonda de Northern blot consistindo em nucleótidos 1061-1590 do cDNA de LOR-2 <400> 19 gagaagctct gagtggcgct cgcatggggc agggcatggg tgctatccac ctgagtgaag 60 ttcgctgctc tggaeaggag ctctccctct ggaagtgccc ccacaagaac atcacagctg 120 aggattgttc acatagccag gatgccgggg tccggtgcaa cctaccttac actggggcag 180 agaccaggat ccgactcagt gggggccgca gccaacatga ggggcgagtc gaggtgcaaa 240 tagggggacc tgggcccctt cgctggggcc tcatctgtgg ggatgactgg gggaccctgg 300 aggccatggt ggcctgtagg caactgggtc tgggctacgc caaccacggc ctgcaggaga 360 cctggtactg ggactctggg aatataacag aggtggtgat gagtggagtg cgctgcacag 420 ggactgagct gtccctggat cagtgtgccc atcatggcac ccacatcacc tgcaagagga 480 cagggacccg cttcactgct ggagtcatct gttctgagac tgcatcagat 530

Lisboa, 2 de junho de 2016

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Um método ex-vivo ou in-vitro de avaliação de uma malignidade de um tumor do colon compreendendo: (a) determinação de um nível tecidular de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ 10 NO: 2, ou (b) determinação dos níveis de mRNA codificantes de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ 10 NO: 2, num tecido de tumor do cólon, assim avaliando a malignidade do tumor do cólon.

2. Um método ex-vivo ou in-vitro de predição de um prognóstico de um indivíduo diagnosticado com cancro do cólon compreendendo: (a) o fornecimento de um tecido do tumor do cólon proveniente do indivíduo, e; (bl) determinação de um nível tecidular de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ 10 NO: 2, ou (b2) determinação dos níveis de mRNA codificantes de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ 10 NO: 2, no referido tecido de tumor do cólon para assim avaliar a malignidade do referido tumor do cólon e predizer o prognóstido do indivíduo diagnosticado com cancro do cólon.

3. O método da reivindicação 1 ou 2, onde o referido tecido do referido tumor do cólon é obtido usando uma biópsia do cólon e/ou uma cirurgia do cólon.

4. O método da reivindicação 1 ou 2, onde a determinação do referido nível tecidular do referido polipéptido é efetuada por um método de deteção imunológico ou a determinação dos referidos níveis de mRNA é efetuada por um método de deteção de RNA.

5. 0 método da reivindicação 4, onde o referido método de deteção imunológico é selecionado de um grupo consistindo de rádio-imunoensaio (RIA), um ensaio de imunoadsorção enzimática competitiva (ELISA), uma Análise Western blot, e uma análise imunohistoquimica.

6. 0 método da reivindicação 4, onde o referido método de deteção de RNA é selecionado de um grupo consistindo de análise Northern blot, marcação de hibridação in situ, uma análise RT-PCR, w marcação RT-PCR in situ.

I. 0 método da reivindicação 1 ou 2, onde a malignidade do referido tecido de tumor do cólon é avaliada por comparação do referido nivel tecidular do referido polipéptido no referido tecido do tumor do cólon com o nivel tecidular do referido polipéptido num tecido do cólon normal.

8. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, onde o método é realizado através da determinação dos niveis de mRNA codificando um polipéptido de SEQ 10 NO: 2.

9. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, onde o método é realizado por determinação do nivel tecidular de um polipéptido de SEQ 10 NO: 2.

10. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, onde a determinação do referido nivel tecidular do referido polipéptido é realizada usando um anticorpo anti-LOR-1 ou fragmento relacionado.

II. 0 método da reivindicação 10, onde o referido anticorpo anti-LOR-1 é um anticorpo policlonal gerado usando um fragmento possuindo uma sequência aminoacidica dos 200 aminoácidos da região C-terminal da SEQ 10 NO: 2.

12. Um método ex-vivo ou in-vitro para a determinação do estadiamento de um tumor do cólon compreendendo: (a) determinação de um nivel tecidular de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ 10 NO: 2, ou (b) determinação dos niveis de mRNA codificantes de um polipéptido sendo pelo menos 95% homólogo ao polipéptido definido na SEQ 10 NO: 2, num tecido de tumor do cólon, assim avaliando o estádio do tumor do cólon.

13. 0 método da reivindicação 12, onde o referido tecido do referido tumor do cólon é obtido usando uma biópsia do cólon e/ou uma cirurgia do cólon.

14. 0 método da reivindicação 12, onde a determinação do referido nivel tecidular do referido polipéptido é efetuada por um método de deteção imunológico ou a determinação dos referidos niveis de mRNA é efetuada por um método de deteção de RNA.

15. 0 método da reivindicação 14, onde o referido método de deteção de RNA é selecionado de um grupo consistindo de análise Northern blot, marcação de hibridação in situ, uma análise RT-PCR, e marcação RT-PCR in situ.

16. 0 método da reivindicação 12, onde a determinação do referido nivel tecidular do referido polipéptido é realizada usando um anticorpo policlonal anti-LOR-1 gerado usando um fragmento possuindo uma sequência aminoacidica dos 200 aminoácidos da região C-terminal da SEQ 10 NO: 2. Lisboa, 2 de junho de 2016