PT2044080T - Derivados da camptotecina com atividade antitumoral - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DERIVADOS DA CAMPTOTECINA COM ATIVIDADE ANTITUMORAL A presente invenção refere-se a novos derivados da camptotecina com atividade antitumoral, aos processos para a preparação dos mesmos, ao uso dos mesmos como fármacos antitumorais e a composições farmacêuticas contendo os mesmos.

CONTEXTO DA INVENÇÃO A Camptotecina é um alcaloide extraído da Camptotheca

acuminata (Nyssaceae), descrito pela primeira vez por Wall e Wani em 1966 (J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 3888-3890) . A captotecina, embora dotada de uma atividade antitumoral de amplo espetro, em especial contra tumores do cólon e outros tumores sólidos e leucemias, não é usada em terapia devido à sua elevada toxicidade, a qual é particularmente manifestada na forma de cistite hemorrágica, toxicidade gastrointestinal e mielossupressão.

Foi sintetizado um determinado número de análogos da camptotecina com o objetivo de se obter compostos com baixa toxicidade e elevada solubilidade. Atualmente, são usados dois fármacos na prática clínica, nomeadamente o CPT-11 e o topotecano. Outros derivados tais como o belotecano, rubitecano, exatecano, gimatecano, pegamotecano, lurtotecano, carenitecina, afeletecano, homocamptotecina, diflomotecano, e muitos outros, estão em fase de experimentação clinica. O composto CPT-11 é um pró-fármaco altamente solúvel da 10-hidroxi-7-etilcamptotecina (geralmente conhecida como SN-38), aprovado para o tratamento de muitos tumores sólidos e ascite (linfoma colorretal, cutâneo, gástrico, pulmonar, cervical, ovárico, e de não Hodgkin). 0 Topotecano é um composto solúvel em solução fisiológica, ativo contra os tumores do pulmão, estômago, fígado, ovários, mama, próstata, esófago, reto, sarcomas de tecidos moles, cabeça e pescoço, glioblastoma, leucemias mielocíticas crónica e aguda. 0 Topotecano apresenta, no entanto, importantes efeitos secundários tais como neutropenia e trombocitopenia. 0 Lurtotecano é um derivado mais solúvel, com atividade em tumores do pescoço, ovários, mama, colorretal, e microcitoma pulmonar. No entanto, o Lurtotecano também tem toxicidade hemática. 0 Rubitecano é um pró-fármaco para uso oral, eficaz contra tumores do pâncreas, ovários e mama. A Camptotecina e seus análogos, tal como acontece com todos os inibidores da topoisomerase I, são eficazes contra tumores resistentes a fármacos convencionais, incluindo os inibidores da topoisomerase II; mantêm níveis elevados de topoisomerases durante todo o ciclo celular; não induzem resistência a múltiplos fármacos (Pgo ou MRP) ou metabolismo desintoxicante mediado pela enzima. A pesquisa está agora focada em novos inibidores da topoisomerase I com toxicidade mais baixa do que a dos fármacos presentemente usados.

Os derivados da camptotecina de anel aberto apresentam elevada ligação às proteínas (em particular à albumina) e baixa distribuição nos tecidos tumorais. Como consequência, o produto acumula-se no corpo e os tumores sao pouco afetados.

Por outro lado, a elevada lipofilicidade da forma de lactona promove a adesão de derivados da camptotecina às membranas celulares, em particular aos eritrócitos, afetando a razão de distribuição tecido/plasma. Por esta razão, a pesquisa está a focar-se na direção de duas abordagens alternativas: a) conceção de produtos de baixa ligação às proteínas, que ainda assim tenham boa solubilidade; b) conceção de produtos muito potentes, com efeito terapêutico mesmo a doses extremamente baixas.

As modificações nas posições 7, 9, 10 e 11 provaram normalmente ser bem toleradas, ao mesmo tempo que não afetam a estabilidade do complexo ternário ADN-Topoisomerase I-camptotecina, cuja formação é responsável pela atividade antitumoral dos compostos.

Os produtos com configuração 20R provaram ser inativos ou muito menos ativos do que os produtos com configuração 20S - que coincide com a configuração natural.

Como regra, as modificações na posição 5 são consideradas desfavoráveis para a formação do complexo ternário, enquanto que as modificações nos anéis piridona D e E foram relatadas como sendo prejudiciais para a atividade do produto.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

Num primeiro aspeto, a invenção refere-se a derivados da camptotecina de fórmula geral I:

d) em que: R é F;

Rl é hidrogénio, alquilo, aminoalquilo, hidroxialquilo, nitrilo, alcoxiamino, ariloxiamino, sililalquilo; R2 é hidrogénio, hidroxilo, alcóxi, aminoalquilo; R3 é hidrogénio, hidroxilo, alcóxi, aminoalquilo; desde que quando Rl é hidrogénio, R2 e R3 sejam hidrogénio; em que os grupos alquilo, alcóxi, aminoalquilo ou alcoxiamino podem conter 1 a 8, de preferência 1 a 4, átomos de carbono, numa cadeia linear ou ramificada, e os grupos arilóxi podem conter 5 a 10 átomos de carbono; e aos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, isómeros, enantiómeros, diastereoisómeros, e correspondentes misturas.

Os compostos da invenção apresentam baixa ligação às proteínas e têm boa solubilidade e potência elevada mesmo a doses muito baixas. A via sintética preferida para a preparação dos compostos da invenção é ilustrada no Esquema, e compreende as seguintes etapas: a) proteção dos grupos hidróxi do precursor; b) derivatização na posição 5 através da formação de um carbanião, e reação com um reagente eletrofílico; c) desproteção dos grupos hidróxi;

Esguema

No Esquema, R, Rl, R2 e R3 têm os significados descritos acima, e PG é um grupo hidróxi-protetor.

Os precursores podem estar disponíveis comercialmente ou ser obtidos como descrito na literatura.

Os carbaniões na posição 5 podem ser obtidos tratando o precursor com uma base orgânica forte, de preferência LiHMDS. 0 carbanião é reagido in situ com um reagente eletrofílico, tal como uma fonte de halogénio ou azadicarboxilato, isocianato, derivado de clorocarbonilo, tosilazida.

Os sililos e os carbamatos, ou uma combinação dos mesmos, são preferidos como grupos hidróxi-protetores.

Os compostos da invenção foram testados num ensaio de citotoxicidade num amplo espetro de células tumorais. A titulo de exemplo, são relatados os dados de citotoxicidade na linha celular NCI-H460 (cancro do NSCL) relativos a um composto de fórmula (I), usando camptotecina e os fármacos Topotecano e SN-38 como referências:

_(continuação)_

Os compostos mais ativos foram avaliados num ensaio de clivagem de ADN, medindo-se a concentração ativa e a lesão persistente (ver a secção "Exemplos"). Os derivados de fórmula (I) mostram, surpreendentemente, uma persistência mais elevada no bloqueio da replicação do ADN do que os padrões de referência (em particular o topotecano e a camptotecina), ao mesmo tempo que mantêm uma atividade citotóxica eficaz.

Num aspeto adicional, a invenção refere-se a composições farmacêuticas contendo um composto de fórmula (I), conjuntamente com veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As formas farmacêuticas adequadas para a administração oral ou parenteral dos compostos (I) podem ser sólidas, de preferência cápsulas, comprimidos e grânulos, ou líquidas, de preferência soluções injetáveis ou para infusão.

Os compostos da invenção, formulados de modo apropriado, podem ser usados para o tratamento de tumores sólidos e leucemias, em particular de tumores do pulmão, ovários, mama, estômago, fígado, próstata, sarcomas de tecidos moles, cabeça e pescoço, esófago, pâncreas, cólon, reto, glioblastoma, leucemias mielociticas crónica e aguda.

EXEMPLOS EXEMPLO I - 20-OTES-camptotecina

Suspende-se camptotecina (0,100 g, 0,287 mmol) em dimetilformamida anidra (3 mL) , sob atmosfera inerte, e à suspensão resultante adiciona-se imidazol (0,980 g, 1,44 mmol) . A mistura é agitada durante 10 minutos, e posteriormente junta-se-lhe gota-a-gota cloreto de trietilsililo (TES-CI) (0,193 mL, 1,15 mmol), seguido da adição de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,040 g, 0,287 mmol). Após 46 h a mistura reacional é evaporada sob vácuo, (controlo por TLC do desaparecimento completo do reagente, eluente CH2Cl2/MeOH = 30/1) . O sólido é posteriormente redissolvido em CH2C12 e lavado com H20 e NH4C1 saturado. A fase aguosa é extraída com CH2C12 (2 x 10 mL) . As fases orgânicas são combinadas e secas com Na2S04, filtradas e concentradas sob vácuo, obtendo-se assim o produto desejado (0,133 g, 0,287 mmol) como um sólido amarelo pálido. RMN de !H (CDC13, 400 MHz) δ 8,37 (s, 1 H, Ar, H-7), 8,25 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,92 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,82 (t, 1 H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,65 (t, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,57 (s, 1 Η, H-14), 5,67 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 5,29 (s, 2 Η, H-5), 5,25 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 2,00-1,84 (m, 2 Η, H-19), 1,03-0,93 (m, 12 H), 0,80-0,71 (m, 6 H) . RMN de 13C (CDCI3, 100 MHz) δ 171,7, 157, 6, 152,5, 151,5, 149, 0, 145, 9, 130, 9, 130,4, 130,0, 128,4, 128,1, 128,0, 127, 9, 118, 9, 94,4, 75, 3, 66, 0, 50, 0, 33, 2, 7, 9, 7,2, 6,4. EXEMPLO II - 20-OTES SN-38

Suspende-se SN-38 (0,100 g, 0,255 mmol) em dimetilformamida anidra (5 mL) , sob atmosfera inerte, e à suspensão resultante adiciona-se imidazol (0,087 g, 1,28 mmol). A mistura é agitada durante 10 minutos, e posteriormente junta-se-lhe gota-a-gota cloreto de trietilsililo (TES-CI), (0,171 mL, 1,02 mmol), seguido da adição de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,031 g, 0,255 mmol). Após 52 h a mistura reacional é evaporada sob vácuo, monitorizando-se por TLC (CH2Cl2/MeOH = 10/1) o desaparecimento completo do reagente. O sólido é posteriormente redissolvido em CH2C12 e lavado com H20 e NH4C1 saturado. A fase aquosa é extraída com CH2C12 (2 x 10 mL) . As fases orgânicas são combinadas e secas com Na2S04, filtradas e concentradas sob vácuo, obtendo-se assim o produto desejado (0,121 g, 0,240 mmol, 94%) como um sólido amarelo pálido. RMN de 3H (CDC13, 400 MHz) δ 9,26 (br s, 1 H, OH), 8,14 (d, 1 H, J = 9,2 Hz, Ar, H-12), 7,58 (s, 1 Η, H-14) , 7,49 (dd, 1 H, = 9,2 Hz J2 = 2,2 Hz, H-ll), 7,46 (d, 1 H, J = 2,2 Hz, H-9), 5,70 (d, 1 H, J = 16,5 Hz, H-17), 5,28 (d, 1 H, J = 16,5 Hz, H-17), 5,23 (s, 2 Η, H-5), 3,05 (q, 2 H, J = 7,5 Hz), 1,97-1,81 (m, 2 Η, H-19), 1,32 (t, 3 H, J = 7,5 Hz,

Me), 0, 98-0, 88 (m, 12 H) , 0,77-0, 68 (m, 6 H) . RMN de 13C (CDC13, 100 MHz) δ 172,1, 157, 9, 156, 6, 152,1, 149, 0, 146,7, 144, 6, 143, 6, 131, 9, 128,7, 126, 9, 122,8, 117, 9, 105,5, 98,5, 75,4, 65, 9, 49,5, 32, 9, 23, 2, 13,5, 7, 8, 7,2, 6, 4. EXEMPLO III - 10-OTBDMS-20-OTES SN-38

Dissolve-se 20-OTES SN-38 (0,121 g, 0,240 mmol) numa mistura anidra de CH2C12/THF = 1:1 (8 mL) sob atmosfera inerte. Adiciona-se-lhe imidazol (0,081 g, 1,20 mmol) seguido, após 10 minutos, de cloreto de tert- butildimetilsililo (TBDMS-CI), (0,144 mg, 0,957 mmol), e depois 4-dimetilaminopiridina (DMAP), (0,029 g, 0,240 mmol). Após 18 h a mistura reacional é evaporada sob vácuo, monitorizando-se por TLC (Hexano/AcOEt = 1/1) o

desaprecimento do reagente. O sólido é posteriormente redissolvido em CH2C12 e lavado com H20 e NH4C1 saturado. A fase orgânica é extraida com CH2C12 (2 x 10 mL) e as fases orgânicas combinadas, secas com Na2S04, filtradas e concentradas sob vácuo. O residuo é purificado por cromatografia flash (Si02, Hexano/AcOEt = 1/1), obtendo-se assim o produto desejado (0,127 g, 0,205 mmol, 85%) como um sólido amarelo pálido. RMN de 3H (CDC13, 400 MHz) δ 8,14 (d, 1 H, J = 8,8 Hz, Ar, H-12), 7,49 (s, 1 Η, H-14), 7,40 (d, 1 H, J = 2,2 Hz, H-9), 7,38 (dd, 1 H, 8,8 Hz J2 = 2,5 Hz, H-ll) , 5,67 (d, 1 H, J= 16,5 Hz, H—17) , 5,25 (d, 1 H, J = 16,5 Hz, H-17), 5,23 (s, 2H, H—5) , 3,11 (q, 2H, J = 7,6 Hz), 1, 99-1,82 (m, 2H, H-19) , 1,38 (t, 3 H, J = 7,6 Hz, Me), 1,04 (s, 9 H) , 1,00-0,92 (m, 12 H) , 0,78-0, 69 (m, 6 H) , 0,30 (s, 6 H) .RMN de 13C (CDC13, 100 MHz) δ 171, 9, 157,7, 155, 1, 151,5, 150,1, 146, 8, 145, 6, 143, 5, 132,2, 128,2, 126, 9, 125, 9, 118,0, 110,5, 97,7, 75, 4, 66, 0, 49, 3, 33,2, 25, 6, 23, 1, 18,3, 13,7, 7,9, 7,2, 6,4, 4,3. EXEMPLO IV - 20-OTES Topotecano

Suspende-se topotecano (0,100 g, 0,238 mmol) em dimetilformamida anidra (5 mL) , sob atmosfera inerte, e à suspensão resultante adiciona-se imidazol (0,081 g, 1,19 mmol) . A mistura é agitada durante 10 minutos, e posteriormente junta-se-lhe gota-a-gota cloreto de trietilsililo (TES-CI) (0,160 mL, 0,952 mmol), seguido da adição de 4-dimetilaminopiridina, (DMAP), (0,029 g, 0,238 mmol). Após 52 h a mistura reacional é evaporada sob vácuo, monitorizando-se por TLC (CH2Cl2/MeOH = 10/1) o desaparecimento completo do reagente. O sólido é posteriormente redissolvido em CHC13 e H20 e NH4C1 saturado, e a fase aguosa é extraída com CHC13 (2 x 15 mL). As fases orgânicas são combinadas e secas com Na2S04, filtradas e concentradas sob vácuo, obtendo-se assim o produto desejado (0,120 g, 0,224 mmol, 94%) como um sólido amarelo pálido. RMN de !H (CDC13, 400 MHz) δ 9,65 (br s, 1 H) , 8,26 (s, 1 H, Ar, H—7), 8,14 (d, 1 H, J= 8,8 Hz, Ar, H-12), 7,80 (d, 1 H, J = 8,8 Hz, Ar, H-ll), 7,58 (s, 1 Η, H-14), 5,67 (d, 1 H, J = 16,5 Hz, H-17), 5,25 (d, 1 H, J = 16,5 Hz, H-17), 5,20 (s, 2 Η, H-5), 4,71 (s, 2 H) , 2,81 (s, 6 H, 2 Me), I, 97-1,81 (m, 2 Η, H-19) , 0, 98-0, 88 (m, 12 H) , 0,77-0,68 (m, 6 H) . RMN de 13C (CDC13, 100 MHz) δ 172, 1, 157, 9, 156, 6, 152,1, 150,8, 146, 8, 144,3, 134,3, 131,2 129, 9, 127, 9, 123, 0, 118, 9, 110, 1, 98,5, 75,4, 65, 9, 51,1, 50,0, 43, 1, 32,9, 7,8, 7,2, 6,4. EXEMPLO V - 10—OTBDMS 20-OTES Topotecano

Dissolve-se 20-OTES Topotecano (0,120 g, 0,224 mmmol) numa mistura anidra de CH2C12/THF = 1:1 (8 mL) sob atmosfera inerte. Adiciona-se imidazol (0,076 g, 1,12 mmol) seguido, após 10 minutos, de cloreto de tert-butildimetilsililo (TBDMS-CI), (0,135 mg, 0,896 mmol), e depois 4- dimetilaminopiridina (DMAP), (0,027 g, 0,224 mmol). Após 21 h a mistura reacional é evaporada sob vácuo, moitorizando-se por TLC (Hexano/AcOEt = 1/1) o desaparecimento do reagente. O sólido é posteriormente redissolvido em CHC13 e H20 e NH4C1 saturado, e a fase aquosa extraída com CHC13 (2 x 15 mL) . As fases orgânicas são combinadas e secas com Na2S04, filtradas e concentradas sob vácuo. 0 resíduo é purificado por cromatografia flash (Si02, Hexano/AcOEt = 1/1), obtendo-se assim o produto desejado (0,116 g, 0,179 mmol, 80%) como um sólido amarelo pálido. RMN de 3Η (CDC13, 400 MHz) δ 8,26 (s, 1 H, Ar, H-7), 8,14 (d, 1 H, J = 8,8 Hz, Ar, H-12), 7,81 (d, 1 H, J = 8,8 Hz,

Ar, H-ll), 7,59 (s, 1 Η, H-14), 5,64 (d, 1 H, J = 16,5 Hz, H-17), 5,22 (d, 1 H, J = 16,5 Hz, H-17), 5,19 (s, 2 Η, H-5), 4,71 (s, 2 H) , 2,81 (s, 6 H, 2 Me), 1,97-1,81 (m, 2 H, H-19), 1,04 (s, 9 H) , 0, 98-0,88 (m, 12 H) , 0,77-0, 68 (m, 6 H) , 0,30 (s, 6 H) . RMN de 13C (CDC13, 100 MHz) δ 171,7, 157,7, 155,1, 151,5, 150,0, 146,8, 144,3, 134,3, 131,2 129, 9, 127, 9, 123, 0, 118, 9, 110,1, 98,5, 75, 4, 65, 9, 51,1, 50,0, 43, 9, 32, 9, 25, 6, 18,3, 7,8, 7,2, 6, 4, 4,3. EXEMPLO VI - Preparação da 20-OTES 10-hidroxicamptotecina

Suspende-se 10-hidroxicamptotecina (0,100 g, 0,275 mmol) em dimetilformamida anidra (5 mL) , sob atmosfera inerte, e à suspensão resultante adiciona-se imidazol (0,225 g, 3,31 mmol) . A mistura é agitada durante 10 minutos, e posteriormente junta-se-lhe gota-a-gota cloreto de trietilsililo (TES-CI), (0,460 mL, 2,75 mmol), seguido da adição de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,068 g, 0,550 mmol). Após 24 h a mistura reacional é evaporada sob vácuo, monitorizando-se por TLC o desaparecimento completo do reagente (CH2Cl2/MeOH = 20/1) . O sólido é posteriormente redissolvido em CH2C12 e lavado com H20 e NH4C1 saturado. A fase aquosa é extraída com CH2C12 (2 x 10 mL) . As fases orgânicas são combinadas, secas com Na2S04, filtradas e concentratadas sob vácuo, obtendo-se assim o produto desejado (0,124 g, 0,259 mmol, 94%) como um sólido amarelo pálido. RMN de !H (CDC13 + 5% de CD3OD, 400 MHz) δ 8,10 (s, 1 H, Ar, H—7) , 8,05 (d, 1 H, J = 9,2 Hz, Ar) , 7,50 (s, 1 Η, H-14), 7,39 (dd, 1 H, = 9,2 Hz J2 = 2,4 Hz, H-ll), 7,11 (d, 1 H, J = 2,2 Hz, H-9) , 5,60 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 5,21 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 5,15 (s, 2 Η, H-5), 1,97-1,81 (m, 2 Η, H-19), 0, 98-0,88 (m, 12 H) , 0,76-0,68 (m, 6 H) . RMN de 13C (CDCI3 + 5% de CD3OD, 100 MHz) δ 172,2, 157,8, 156, 7, 151,8, 149,2, 146, 1, 144,1, 130, 9, 129, 8, 129, 0, 128, 6, 123,2, 117,8, 108,8, 98,1, 75, 4, 65, 8, 50,0, 32, 9, 7,7, 7,1, 6,3. EXEMPLO VII - 10-OTBDMS-20-OTES Camptotecina

Dissolve-se 10-hidroxi-20-OTES-Camptotecina (0,105 g, 0,219 mmol) num mistura anidra de CH2C12/THF = 1:1 (4 mL) e sob atmosfera inerte. Adiciona-se imidazol (0,097 g, 1,42 mmol) seguido, após 10 minutos, de cloreto de tert-butildimetilsililo (TBDMS-CI), (0,164 mg, 1,10 mmol), e depois 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,040 g, 0,329 mmols) . Após 18 h a mistura reacional é evaporada sob vácuo, monitorizando-se por TLC o desaparecimento completo do reagente (Ciclohexano/AcOEt = 1/3). O sólido é posteriormente redissolvido em CH2C12 e lavado com H20 e NH4C1 saturado, e a fase aquosa é extraída com CH2C12 (2 x 10 mL). As fases orgânicas são combinadas, secas com Na2S04, filtradas e concentratadas sob vácuo. O resíduo é purificado por cromatografia flash (Si02, Ciclohexano/AcOEt = 1/3), obtendo-se assim o produto desejado (0,117 g, 0,197 mmol, 90%) como um sólido amarelo pálido. RMN de !H (CDCI3, 400 MHz) δ 8,22 (s, 1 H, Ar, H-7), 8,13 (d, 1 H, J = 9,2 Hz, Ar, H-12), 7,51 (s, 1 H, H-14), 7,39 (dd, 1 H, J2 = 9,2 Hz J2 = 2,8 Hz, H-ll), 7,22 (d, 1 H, J = 2,8 Hz, H-9), 5,66 (d, 1 H, J = 16,5 Hz, H-17), 5,25 (s, 2 Η, H-5), 5,24 (d, 1 H, J = 16,5 Hz, H-17), 1,99-1,82 (m, 2 Η, Η-19), 1,03 (s, 9 Η), 1, 00-0, 92 (m, 12 Η), 0, 78-0, 69 (m, 6 Η), 0,29 (s, 6 Η). RMN de 13C (CDC13, 100 MHz) δ 172,0, 157,7, 155, 1, 151,5, 150, 6, 146, 1, 145, 1, 131,4, 129, 4, 129, 3, 128,7, 126, 7, 118,3, 114,5, 97,7, 75, 3, 66, 0, 49, 9, 33, 1, 25, 6, 18, 3, 7,9, 7,2, 6,4, 4,3. EXEMPLO VIII - 5-F-20-OTES-Camptotecina

Dissolve-se camptotecian 20-OTES (0,100 g, 0,216 mmol) em THF anidro (6 mL) com agitação, sob atmosfera inerte; de seguida arrefece-se a uma temperatura de -78 °C e junta-se-lhe gota-a-gota uma solução 1,0 M de Li HMDS em THF (0,260 mL, 0,260 mmol). Após 20 minutos adiciona-se NFSI (0,089 g, 0,281 mmol) em THF anidro (2 mL). Depois de 2 h a -78 °C, deixa-se a temperatura subir até 25 °C e o desaparecimento do reagente é monitorizado por TLC (Hexano/AcOEt = 1/2) . Observa-se a formação dos dois diasterioisómeros. Após 3 h à temperatura ambiente a reação é inativada pela adição de NH4C1 saturado. A fase aquosa é extraída com CH2C12 (3 x 15 mL) e as fases orgânicas combinadas, secas com Na2S04, filtradas e concentradas sob vácuo. O resíduo é purificado por cromatografia flash (Si02, Hexano/AcOEt = 3/1, depois 2/1, e finalmente 1/1), obtendo-se assim uma mistura dos dois isómeros (0,101 g, 0,210 mmol, 97%) (razão entre os isómeros 1:1) como um sólido amarelo pálido. Os dois isómeros são separados por meio de cromatografia adicional. Por ordem de eluição:

Io diasterioisómero: RMN de 3Η (CDC13, 400 MHz) δ 8,52 (s, 1 H, Ar, H-7) , 8,25 (d, 1 H, J= 8,4 Hz, Ar), 7,96 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,87 (t, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,69 (t, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,47 (d, 1 H, !JHF = 61,2 Hz, H-5), 7,45 (s, 1 Η, H-14), 5,62 (d, 1 H, J = 16,8 Hz, H-17), 5,22 (d, 1 H, J = 16,8 Hz, H-17), 2,02- 1,84 (m, 2 Η, H-l9) , 1,03-0, 93 (m, 12 H) , 0,80-0,71 (m, 6 H) . RMN de 13C (CDC13, 100 MHz) δ 171,4, 157,5, 152,3, 151.1, 150,2 (d, J = 1,5 Hz), 150,3 (d, J = 1,5 Hz), 143,6 (d, J = 5,3 Hz), 133, 7, 131,7, 130,2, 128, 9, 128,4, 127, 9 (d, J = 15,0 Hz), 126,3 (d, J= 15,0 Hz), 121, 8, 98, 9, 93, 8 (d, 1JCV = 213,2 Hz, C-5) , 75, 1, 65, 7, 33.1, 7,8, 7,2, 6,4. 2° diasterioisómero: RMN de 3H (CDC13, 400 MHz) δ 8,51 (s, 1 H, Ar, H—7) , 8,25 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar) , 7,96 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar) , 7,87 (t, 1 H, J = 8,4 Hz,

Ar) , 7,68 (t, 1 H, J= 8,4 Hz, Ar) , 7,51 (d, 1 H, 1<JHF = 60.8 Hz, H-5) , 7,42 (s, 1 Η, H-14), 5,62 (d, 1 H, J = 17,2 Hz, H-17), 5,20 (d, 1 H, J = 17,2 Hz, H-17), 2,02- 1,82 (m, 2 Η, H-19) , 1, 04-0, 93 (m, 12 H) , 0,80-0,71 (m, 6 H) . RMN de 13C (CDC13, 100 MHz) δ 171,2, 157,8, 152,5, 151.2, 150,3, 143, 7, 133, 7 (d, J = 2,4 Hz), 131,7, 130.2, 128, 9, 128,3, 127, 9 (d, J= 2,3 Hz), 126,3 (d, J = 16,7 Hz), 121,8 (d, J= 1,5 Hz), 99, 0, 93, 8 (d, ^ = 214.8 Hz, C-5), 75,0, 65,8, 33,3, 7,9, 7,1, 6,4. EXEMPLO IX - Preparação do Is diasterioisómero da 5-F-camptotecina

Dissolve-se o primeiro diasterioisómero da 5-F-20-OTES-camptotecina (0,025 g, 0,052 mmol) em THF anidro (5 mL) , com agitação, sob atmosfera inerte. Posteriormente, adiciona-se-lhe Et3N·3HF (0,060 mL, 0,368 mmol). A mistura reacional é reagida durante 28 h à temperatura ambiente, monitorizando-se por TLC o desaparecimento do reagente (Hexano/AcOEt = 1/2). O solvente é removido por evaporação sob vácuo e o resíduo cromtografado (Si02, Hexano/AcOEt = 1/1), obtendo-se assim o produto desejado (0,019 g, 0,051 mmol, 98%) como um sólido amarelo pálido. RMN de 3H (CDCI3, 400 MHz) δ 8,52 (s, 1 H, Ar, H-7), 8,25 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,96 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7.87 (t, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,69 (t, 1 H, J = 8,4 Hz,

Ar), 7,59 (s, 1 Η, H-14) , 7,46 (d, 1 H, 61,2 Hz, H- 5), 5,69 (d, 1 H, J = 16,8 Hz, H-17), 5,26 (d, 1 H, J = 16,8 Hz, H-17), 3,87 (br s, 1 H, OH), 2,01-1,81 (m, 2 H, H- 19), 1,05 (t, 3 H, J = 7,6 Hz, Me). RMN de 13C (CDC13, 100 MHz) δ 173, 5, 157, 6, 151, 1, 151, 0, 150,2, 144, 1, 133, 9, 131, 9, 130,0, 129, 0, 128,5, 127, 8, 126, 4, 121,7, 98,8, 93,8 (d, 1JCF = 214,0 Hz, C-5) , 72,5, 66, 0, 31, 5, 7, 8. EXEMPLO X - Preparação do 2 2 diasterioisómero da 5-F-camptotecina

Dissolve-se o segundo diasterioisómero da 5-F-20-OTES-camptotecina (0,025 g, 0,052 mmol) em THF anidro (5 mL) , com agitação, sob atmosfera inerte; posteriormente, adiciona-se-lhe gota-a-gota Et3N*3HF (0,060 mL, 0,368 mmol). A mistura reacional é reagida durante 28 h à

temperatura ambiente, monitorizando-se por TLC o desaparecimento do reagente (Hexano/AcOEt = 1/2). O solvente é removido por evaporação sob vácuo e o resíduo cromatografado (Si02, Hexano/AcOEt = 1/1), obtendo-se assim o produto desejado (0,018 g, 0,050 mmol, 97%) como um sólido amarelo pálido. RMN de 3H (CDC13, 400 MHz) δ 8,52 (s, 1 H, Ar, H-7) , 8,24 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,96 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7.88 (t, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,69 (t, 1 H, J = 8,4 Hz,

Ar), 7,56 (s, 1 H, H-14), 7,51 (d, 1H, 1JEF = 60,4 Hz, H-5), 5,69 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 5,25 (d, 1 H, J = 16,4

Hz, H-17), 3,87 (br s, 1 H, OH), 1, 98-1, 78 (m, 2H, H-19) , 1,04 (t, 3 H, J= 7,6 Hz, Me). RMN de 13C (CDC13, 100 MHz) δ 173,3, 157,7, 151,2, 151,2, 150,2, 144,2, 133,8, 131,9, 130,0, 129, 0, 128,5, 127, 8, 126, 4, 121, 6, 98, 9, 93,7 (d, 214,0 Hz, C-5), 72,5, 66, 1, 31, 6, 7,8. EXEMPLO XI - Ensaio de inibição do crescimento celular

Cultivou-se células H460 de tumor humano do pulmão de células grandes em meio RPMI-1640 contendo soro fetal de vitelo a 10%. Determinou-se a sensibilidade das células por meio de um ensaio de inibição do crescimento celular após 1 ou 72 horas de exposição aos fármacos. As células em crescimento logarítmico foram recolhidas e semeadas em duplicado em placas de 6 poços. Vinte e quatro horas depois de semeadas, as células foram expostas aos fármacos e contadas com um contador Coulter 72 horas após exposição aos fármacos para a determinação das IC50. A IC50 define-se como a concentração que inibe em 50% o crescimento das células, em comparação com o crescimento de controlos não tratados.

EXEMPLO XII - Ensaio de rutura do ADN dependente da topoisomerase I

As ruturas do ADN foram determinadas usando um gel de ADN de SV40 purificado com BamHI-EcoRI de 751-bp (Beretta G. L., Binaschi M., Zagni E, Capuani L., Capranico G. Tethering a type IB topoisomerase to a DNA site by enzyme fusion to a heterologous site-selective DNA-binding protein domain. Cancer. Res. 1999; 59:3689-97) . Os fragmentos de ADN foram apenas marcados em 3'. A reação de rutura do ADN (20.000 cpm/amostra) foi levada a cabo em 20 mL de Tris-HCl 10 mM (pH 7,6), KC1 150 mM, MgCl2 5 mM, BSA a 15 pg/mL, tiotreitol 0,1 mM, e enzima recombinante humana (topl de comprimento total) durante 30 minutos a 37 °C. As reações foram bloqueadas usando SDS a 0,5% e K proteinase a 0,3 mg/mL durante 45 minutos a 42 °C. A persistência de lesões no ADN foi testada a tempos diferentes por adição de NaCl 0,6 M após 30 minutos de incubação com fármaco 10 μΜ. Após precipitação, o ADN foi novamente suspenso em tampão de desnaturação (formamida a 80%, NOH 10 mM, EDTA 0,01 M e corante a 1 mg/mL) antes de semeadura em gel desnaturante (poliacrilamida a 7% em tampão TBE) . Todos os níveis de rutura do ADN foram medidos por meio de um modelo Phos-pholmager 425 (Molecular Dynamics) (Dallavalle S., Ferrari A., Biasotti B., et al.r Novel 7-oxyiminomethyl camp-tothecin derivatives with potent in vitro and in vivo antitumor activity., J. Med. Chem. 2001; 44:3264-74).

Persistência de lesões no ADN (%)

Lisboa, 5 de Junho de 2017

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES

1. Compostos de fórmula geral (I):

(D em que: R é F; Rl é hidrogénio, alquilo, aminoalquilo, hidroxialquilo, nitrilo, alcoxiamino, ariloxiamino, sililalquilo; R2 é hidrogénio, hidroxilo, alcóxi, aminoalquilo; R3 é hidrogénio, hidroxilo, alcóxi, aminoalquilo; desde que quando Rl é hidrogénio, R2 e R3 sejam hidrogénio; em que os grupos alquilo, alcóxi, aminoalquilo ou alcoxiamino podem conter 1 a 8 átomos de carbono, numa cadeia linear ou ramificada, e os grupos arilóxi podem conter 5 a 10 átomos de carbono; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, enantiómeros, diastereoisómeros, e correspondentes misturas.

2. Um composto de fórmula (I) como reivindicado na reivindicação 1, que é: a) 5-F-camptotecina.

3. Um processo para a preparação de compostos de fórmula (I) como reivindicado na reivindicação 1, compreendendo as etapas apresentadas no Esquema que se segue, em que: a) proteção dos grupos hidróxi do precursor; b) derivatização na posição 5, através da formação de um carbanião, e reação com um reagente eletrofílico; c) desproteção dos grupos hidróxi;

em que R, Rl, R2 e R3 têm os significados descritos acima e PG é um grupo protetor de OH.

4. Uma composição farmacêutica contendo um composto de fórmula (I) como reivindicado na reivindicação 1, conjuntamente com veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

5. Uma composição farmacêutica como reivindicada na reivindicação 4, que está numa forma adequada para administração oral ou parenteral.

6. 0 uso de um composto como reivindicado nas reivindicações 1 ou 2, ou de uma composição como reivindicada nas reivindicações 4 ou 5, para a preparação de um medicamento para o tratamento de tumores.

7. 0 uso como reivindicado na reivindicação 6, em que o referido medicamento é usado para o tratamento de tumores sólidos e leucemias.

8. 0 uso como reivindicado na reivindicação 6 ou 7, em que o referido medicamento é usado para o tratamento de tumores do pulmão, ovários, mama, estômago, fígado, próstata, sarcomas de tecidos moles, esófago, pâncreas, cabeça e pescoço, glioblastoma, e leucemias mielocíticas crónica e aguda.

9. Um composto de fórmula geral (I) como reivindicado na reivindicação 1 ou 2, para uso no tratamento de tumores.

10. Um composto para uso como reivindicado na reivindicação 9, em que os tumores são tumores sólidos ou leucemias.

11. Um composto para uso como reivindicado na reivindicação 9 ou 10, em que os tumores são selecionados do grupo que consiste em tumores do pulmão, ovários, mama, estômago, fígado, próstata, sarcomas de tecidos moles, esófago, pâncreas, cabeça e pescoço, glioblastoma, e leucemias mielocíticas crónica e aguda. Lisboa, 5 de Junho de 2017