PT2017335E - Domínios da cinase abl mutados - Google Patents

Description

ΡΕ2017335 1 DESCRIÇÃO "DOMÍNIOS DE CINASE ABL MUTADOS"

Campo do invento:

Este invento está relacionado com polipéptidos isolados que compreendem um domínio cinase funcional compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio da cinase humana nativa Abl ou uma sequência essencialmente semelhante a esta, em que pelo menos um aminácido seleccionado entre Met244, Leu248, G1Í250, Glu252, Tir253, Val256, Glu258, Fen311, Ile313, Fen317, Met318, Met351, Glu355, Glu359, Ile360, His 361, Leu370, Asp381,Fen382,

His396, Ser417, Glu459 e Fen486 está substituído por um outro aminoácido, o referido domínio cinase funcional mutado sendo resistente à inibição da sua actividade tirosina cinase por N[4-metil-3-(4-piridin-3-il-pirimidin-2-ilamino)-fenil]-4-(4-metil-piperazin-l-ilmetil)-benzamida ou um sal deste, com a utilização de tais polipéptidos para seleccionar compostos que inibem a actividade tirosina cinase de tais polipéptidos, com moléculas de ácido nucleico codificadoras de tais polipéptidos, com vectores recombinantes e células hospedeiras compreendendo tais moléculas de ácido nucleico e com a utilização de tais moléculas de ácido nucleico na produção de tais polipéptidos para usar na detecção de compostos que inibam a actividade tirosina cinase de tais polipéptidos. 2 ΡΕ2017335

Fundamento do invento:

Bcr-Abl, uma tirosina cinase constitutivamente activa, resultante da formação do cromossoma Philadelphia [Nowell P.C. e Hungerford D.A., Science 132, 1497 (1960)] por translocação inversa entre os braços longos dos cromossomas 9 e 22 [Rowley J.D., Nature 243, 290-293 (1973)], foi estabelecida como a caracteristica molecular anormalmente presente em virtualmente todos os casos de leucemia mielóide crónica (CML) e em até 20 por cento da leucemia linfoblástica aguda em adultos (ALL) [Faderl S. et al., N Engl J Med 341, 164-172 (1999); Sawyers C.L., N Engl J Med 340, 1330-1340 (1990)]. Bcr-Abl é suficiente para provocar CML em murganhos [Daley G.Q. et al.r Science 247, 824-830 (1990)] e a sua capacidade de transformação está

absolutamente dependente da actividade de tirosina cinase [Lugo T.G. et al., Science 247, 1079 (1990)]. O composto N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il-pirimidin-2-ilamino)-fenil]-4-(4-metil-piperazin-l-metil)-benzamida (daqui em diante também referido como "STI571", STI571 está descrito em EP 0 564 409 e, na forma do sal metanossulfonato, em WO 99/03854), um inibidor competitivo do local de ligação a ATP de Bcr-Abl, assim como do receptor para o factor de crescimento derivado de plaquetas e tirosina cinase c-kit [Lugo T.G. et al., Science 247, 1079 (1990)], foi demonstrado ser capaz de muito rapidamente reverter as anormalidades clinicas e hematológicas de CML na fase crónica e na crise blástica, assim como a leucemia linfoblástica aguda positiva para o cromossoma Ph (Ph+) (Ph+ ALL) [Druker B.J. et al., N Engl J Med 344, 1031-1037(2001); Druker B.J. et 3 ΡΕ2017335 al., N Engl J Med 344, 1038-1042 (2001)]. Enquanto quase todos os doentes CML em fase crónica respondem de forma duradoira, as remissões em CML na fase de crise blástica e em Ph+ ALL são transitórias e a maioria dos doentes sofre relapso após vários meses, apesar da terapia continuada com STI571 [Druker B. et al., New Engl J Med 344, 1038-1042 (2001)]. O mecanismo de resistência a STI571 tem sido alvo de intensa pesquisa.

Surpreendentemente foi agora encontrado que as mutações presentes no domínio cinase do gene Bcr-Abl de doentes que sofrem de CML ou de Ph+ALL são responsáveis pela resistência biológica destes doentes face ao tratamento com STI571 por as referidas mutações conduzirem a resistência da tirosina cinase Bcr-Abl à inibição por STI571. Por exemplo, Gorre M.E. et ai., Science 293, 876-880 (2001) descrevem que uma substituição Tre—>Ile no domínio cinase Abl pode conferir resistência a STE571.

Estes resultados são extremamente importantes para, e.g., encontrar novos compostos ou combinações de compostos que sejam capazes de ultrapassar esta resistência ao tratamento com STI571. Ainda, o conhecimento de tais mutações é também muito útil no diagnóstico de leucemias Ph+ por permitir e.g. a detecção de clones resistentes a fármacos antes do relapso clínico do doente.

Definições:

Dentro do contexto desta descrição as seguintes 4 ΡΕ2017335 expressões, termos e abreviaturas possuem os significados como definido abaixo:

Na expressão "um domínio cinase funcional", o termo "funcional" indica que o respectivo domínio cinase possui actividade tirosina cinase. De preferência, a actividade tirosina cinase de tal domínio cinase funcional é na gama do domínio da cinase Abl humana nativa.

Na expressão "um domínio cinase funcional resistente à inibição da sua actividade tirosina cinase por STI571 ou por um sal deste", o termo "resistente" significa que STI571 inibe o respectivo domínio cinase funcional com um IC50 que é superior ao do domínio da cinase Abl humana nativa, í.e. superior a cerca de 0,025 μΜ, de preferência superior a cerca de 0,15 μΜ, mais de preferência superior a cerca de 0,25 μΜ, mais de preferência superior a cerca de 5 μΜ.

Na expressão "sequência de aminoácidos do domínio da cinase Abl humana nativa ou uma sequência essencialmente semelhante a esta", a parte "ou sequência essencialmente semelhante a esta" refere-se à sequência de aminoácidos do domínio da cinase Abl humana nativa contendo mutações, incluindo substituições de aminoácidos, deleções de aminoácidos e/ou adições de aminoácidos, que não são essenciais para a funcionalidade da cinase e à sua resistência à inibição por STI571 ou por um sal deste dentro do significado do termo "funcional" e "resistente" como atrás definido. 5 ΡΕ2017335 A expressão "substituído por um outro aminoácido" refere-se à substituição de um determinado aminoácido natural por um outro aminoácido natural.

Os nomes dos aminoácidos são escritos por extenso ou são usados os códigos de uma letra ou de três letras. As mutações são referidas pela nomenclatura aceite, e.g. "Ala380Tre" ou "380 Ala->Tre", ambas indicando que a alanina na posição 380 é substituída por treonina. SEQ ID NO:l representa o cDNA codificador da proteína Abl humana nativa (mRNA c-abl humano; N° de Acesso GenBank: X16416). SEQ ID NO:2 representa a sequência de aminoácidos da proteína Abl humana nativa (c-Abl humana; SwissProt N° de Acesso: P00519). A menos que de outra forma seja indicado, o número dado a um determinado aminoácido refere-se à numeração dos aminoácidos em SEQ ID NO:2. Numa sequência de aminoácidos que é essencialmente semelhante à sequência de aminoácidos do domínio da cinase Abl humana nativa dentro do significado definido atrás, os aminoácidos são numerados de acordo com a numeração dos aminoácidos em SEQ ID NO:2. O termo "isolado" significa que o material é removido do seu ambiente original (e.g., o ambiente natural caso ocorra na natureza). 6 ΡΕ2017335

Uma "célula hospedeira", refere-se a uma célula procariótica ou eucariótica que possui DNA heterólogo que foi de alguma forma introduzido na célula, e.g., electro-poração, precipitação com fosfato de cálcio, microinjecção, transformação, infecção virai e similares.

Descrição do invento:

Na realização do presente invento, são usadas muitas técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante. Estas técnicas são bem conhecidas e estão explicadas, por exemplo, em "Current Protocols in Molecular Biology", Volumes I, II e III, 1997 (F.M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; "DNA Cloning: A Praticai Aproach", Volumes I e II, 1985 (D.N. Glover ed.); "Oligonucleotide Synthesis", 1984 (M, L. Gait ed.); "Nucleic Acid Hybridization", 1985 (Hames e Higgins); "Transcription and Translation", 1984 (Hames e Higgins eds.); "Animal Cell Culture", 1986 (R.I. Freshney ed.); "Immobilized Cells and Enzymes", 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, "A Praticai Guide to Molecular Cloning"; a série "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells", 1987 (J.H. Niller e M.P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); e "Methods in Enzymology" Vol. 154 e Vol. 155 (Wu e Grossmanm, e Wu, eds., respectivamente). 7 ΡΕ2017335

Em particular, os polipéptidos do presente invento podem ser produzidos por tecnologia de DNA recombinante usando técnicas bem conhecidas na área. Métodos que são do conhecimento geral podem ser usados para construir vectores de expressão contendo as sequências codificadoras dos polipéptidos do invento e sinais de controlo da transcri-ção/tradução adequados. Uma variedade de sistemas hospe-deiro-vectores de expressão pode ser utilizada para expressar os polipéptidos do invento. (1) 0 invento está relacionado com um polipéptido isolado que compreende um dominio cinase funcional compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio cinase Abl humano nativo ou uma sequência essencialmente semelhante a esta, em que pelo menos G1Í250 é substituído por um outro aminoácido, o referido domínio cinase funcional sendo resistente à inibição da sua actividade de tirosina cinase por N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il-pirimidin-2-ilamino)-fenil]-4-(4-metil-piperazin-l-metil)-benzamida ou por um sal deste. (2) De forma semelhante, o invento está relacionado especialmente com um polipéptido isolado que compreende um domínio cinase funcional compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio da cinase Abl humana nativa ou uma sua sequência essencialmente semelhante que contem a mutação de aminoácido Gli250Glu, o referido domínio cinase funcional sendo resistente à inibição da sua actividade de tirosina cinase por N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il-pirimidin- 8 ΡΕ2017335 2-ilamino)-fenil]-4-(4-metil-piperazin-l-metil)-benzamida ou por um sal deste. (3) De forma semelhante, o invento está relacionado especialmente com um polipéptido isolado que compreende um domínio cinase funcional, compreendendo a sequência de aminoácidos do domínio da cinase Abl humana nativa ou uma sequência essencialmente semelhante a esta que possui a mutação de aminoácidos Gli250Ala, o referido domínio cinase funcional sendo resistente à inibição da sua actividade de tirosina cinase por N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il-pirimidin-2-ilamino)-fenil]-4-(4-metil-piperazin-l-metil)-benzamida ou um sal deste. (4) Numa realização preferida, o invento está relacionado com um polipéptido isolado de acordo com qualquer um dos parágrafos (1)-(3), em que a sequência de aminoácidos do domínio da cinase Abl humana nativa consiste nos aminoácidos 229-500 de SEQ ID NO:2. (5) Numa outra realização preferida, o invento está relacionado com um polipéptido isolado de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores (1)-(4), o referido polipéptido isolado sendo uma tirosina cinase Bcr-Abl. (6) Ainda numa outra realização preferida, o invento está relacionado com a utilização de um polipéptido isolado de qualquer um dos parágrafos anteriores (1)-(5) para testar compostos que inibem a actividade de tirosina cinase do referido polipéptido. 9 ΡΕ2017335 (7) 0 invento também está relacionado com uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores (1)-(5). (8) 0 invento ainda está relacionado com uma molécula de ácido nucleico do parágrafo anterior (53) na produção de um polipéptido de qualquer um dos parágrafos anteriores (1)-(5) para usar no rastreio de compostos que inibam a actividade tirosina cinase do referido polipéptido . (9) 0 invento também está relacionado com um vector recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com o parágrafo anterior (7). (10) O invento ainda está relacionado especialmente comum vector recombinante de acordo com o parágrafo anterior (9), o qual é um vector de expressão recombinante. (11) O invento também está relacionado com uma célula hospedeira compreendendo um vector recombinante de acordo com o parágrafo anterior (9) ou (10).

De preferência, o invento está relacionado com um polipéptido isolado que compreende um dominio cinase funcional compreendendo a sequência de aminoácidos do dominio da cinase Abl humana nativa em que pelo menos um aminoácido é substituído por um outro aminoácido, o referido dominio 10 ΡΕ2017335 cinase funcional sendo resistente à inibição da sua actividade tirosina cinase por N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il-pirimidin-2-ilamino)-fenil]-4-(4-metil-piperazin-l-metil)-benzamida ou por um sal deste.

Um sal preferido de STI571 é o sal metanos-sulfonato descrito em WO 99/03854. O rastreio de compostos que inibem a actividade tirosina cinase dos polipéptidos do invento pode ser feito, por exemplo, usando um polipéptido isolado do invento em qualquer ensaio in vitro de fosforilação por tirosina cinase conhecido na área e determinando o potencial de um composto para inibir a actividade de tirosina cinase de um polipéptido do invento em tal ensaio.

Os ensaios de rastreio de elevado número de amostras conhecidos na área podem ser usados para testar bibliotecas de um grande número de compostos relativamente a compostos que inibem a actividade tirosina cinase dos polipéptidos do invento.

Para além do rastreio aleatório de bibliotecas de um grande número de compostos, os polipéptidos do presente invento podem também ser usados na seguinte abordagem de rastreio: A estrutural tridimensional de um polipéptiodo do invento é determinada por e.g., cristalografia de raios X. As coordenadas atómicas de um polipéptido do invento são então usadas para projectar um potencial inibidor. O referido potencial inibidor é então sintetizado e testado 11 ΡΕ2017335 relativamente à sua capacidade para inibir a actividade tirosina cinase do polipéptido do invento em qualquer ensaio in vitro de fosforilação por tirosina cinase.

Exemplos

Os Exemplos que se seguem servem para ilustrar o invento sem limitar o seu âmbito. São descritas mutações de aminoácidos diferentes do resíduo 250 como referência.

Exemplo 1:

Usou-se uma estratégica de PCR para amplificar a região de ligação ao ATP do cDNA de Bcr-Abl e a região completa foi sequenciada em ambas as direcções. As mutações de Bcr-Abl foram encontradas em 4/6 doentes a receberem STI571 devido a CML com crise blástica (2 BC mielóides, 2 linfóides), fase acelerada (1) ou CML na segunda fase crónica (1) que tinha desenvolvido resistência hematológica a STI571. Um doente tinha a mutação Tre315Ile. Dois doentes tinham mutações na posição 250, tendo substituído glicina por ácido glutâmico. Um doente tinha uma mutação no aminoácido 253, a qual substituiu tirosina por histidina. O aminoácido 250 não forma uma ligação de hidrogénio com STI571, como o aminoácido 315, nem está envolvido na interacção de van der Waals com o inibidor, tal como o aminoácido 253. Quando da existência de amostras (3 casos) confirmámos que a mutação não estava presente antes da terapia com STI517, nem estava presente no alelo Abl 12 ΡΕ2017335 normal. Também sequenciámos a região de ligação a ATP de Bcr-Abl em 8 doentes com CML na fase avançada (5) ou na fase crónica (3) que tinham e mantiveram respostas hematológicas mas que apenas tinham resposta citogenética modesta ou ausente a receberem STI517. Nenhum destes doentes evidenciou mutações após 6-9 meses de terapia com STI517. Postulámos que várias mutações pontuais em Bcr-Abl emergem em doentes com CML em fase avançada, as quais, provavelmente, eliminaram, total ou parcialmente a ligação de STI517 a Bcr-Abl.

Exemplo 2:

Uma estratégia de RT-PCR foi usada para amplificar e sequenciar o domínio cinase Abl de Bcr-Abl em 28 doentes. Seleccionámos doentes sensíveis a STI517 e resistentes a STI517 de entre 253 doentes envolvidos em estudos de âmbito mais alargado em 5 centros australianos. 0 objectivo foi determinar a frequência e a altura da aquisição das mutações dentro de grupos clínicos cuidadosamente definidos, determinar a sua distribuição dentro do domínio cinase de Bcr-Abl e identificar qualquer associação entre mutações específicas e características clínicas.

Desenho do estudo

Doentes resistentes a STI571 (n=18) foram definidos como aqueles com uma perda de remissão hematológica completa que tinha estado presente durante pelo menos 3 13 ΡΕ2017335 meses ou com evolução para CML de fase aguda ou relapso de Ph+ALL. Doentes refratários a STI571 (n=10) foram aqueles que não atingiram uma resposta citogénica importante após pelo menos 6 meses de terapia.

Os processos de extracção de RNA a partir do sangue, transcrição reversa e sequenciação do DNA foram descritos anteriormente [Branford S. et ai., Br. j. Haematol. 107, 587-599 (1999)]. Um método de PCR longo [Branford S. et al., Br. J. Haematol. 109, 635-637 (2000)] foi usado para amplificar o dominio cinase Abl de Bcr-Abl com a sequência iniciadora directa BcrF (5'tgaccaactcgtgtgtgaaactc) e a sequência de iniciação reversa AblKinaseR (5'tccacttc-gtctgagatactggatt). Numa segunda reacção de PCR usou-se a sequência iniciadora AblkinaseF (5'cgcaacaagcccactgtct) e a sequência iniciadora AblkinaseR. O dominio cinase foi sequenciado na sua totalidade, uma área incluindo 863 bases (GenBank número de acesso M14752).

Resultados

Doentes resistentes a STI571:

Doze dos 18 doentes resistentes a STI571 tinham mutações na região de ligação a ATP de Bcr-Abl (Tabela 6) . Em 9 casos em que existiam amostras disponíveis, confirmámos que a mutação não estava presente antes da terapia com STI571, nem estava presente em 4 casos testados aos 3-9 meses, o que foi antes do aparecimento da resistência. Três 14 ΡΕ2017335 dos 6 doentes resistentes sem mutações Bcr-Abl tinham evidência de evolução clonal na altura do relapso, incluindo um cromossoma Philadelphia (Ph) em 2 casos. Um doente tinha uma mutação e um cromossoma Ph extra quando do relapso.

As 6 mutações identificadas são T313I (n=3 doentes), Y253H (n=l), F317L (n=l), E255K (n=4), G250E (n=2) e M351T (n=l).

Os 18 doentes resistentes a STI571 puderam ser subdivididos entre aqueles que tiveram relapso na crise blástica ou Ph+ ALL (n=8), os que tiveram relapso na fase acelerada (n=6) e os que evidenciaram perda da remissão hematológica que permaneceram na fase crónica (n=4). Os 3 grupos incluiam doentes com mutações. Seis dos 8 doentes que tiveram relapso directamente para crise blástica/ALL tiveram mutações. Em 3 destes, a mutação T315I estava presente. Dois dos 6 doentes que tiveram relapso na fase acelerada tinham mutações.

Doentes resistentes a STI571:

Apenas 1 dos 10 doentes resistentes tinha uma mutação (Tabela 6) . Não houve evidência da mutação pré-terapia com STI571 ou 3 meses após inicio do tratamento. O clone mutante misturado com Bcr-Abl selvagem emergiu aos 8 meses e persistiu num padrão misto até o clone mutante se tornar predominante aos 11 meses. Até à data não houve evidência clínica de resistência neste doente. ΡΕ2017335 - 15 -

Tabela 6. Curso clínico e análise das mutações de doentes tratados com STI571

Doente Idade Estado da Duração do Melhor Resposta Tempo da Resultado da Substituição ID /sexo doença no tratamento resposta a quando da análise da mutação de nucleótidos início de com STI571 STI571* análise da mutação (Genbank STI571* mutação* t N° M14752) Resistência de Emergência 01 61 Γ 3(3°) 9m lb Pré-estudo NM 7 7 3m NM 7 6m NM lb 9M T315I G para C nt 944 02 75 Γ la 4,5m la Pré-estudo 4 la 4,5m T315I G para C nt 944 03 62 M lb 2m lb Pré-estudo 4 lb 2m T315I G para C nt944 04§ 59 F lc 3m 7 lc Pré-estudo NM lc 5m Y253H T para C nt 757 lc 5,5m Y253H Tpara C nt 757 05 40 M 3 8m 3 Pré-estudo NM 5 5 4m F317L C para G nt 951 4 7m F317L C para G nt 951 06 66 M lb 8m4 4 lb 8m G250E G para C nt 749 - 16 - ΡΕ2017335 (continuação)

Doente ID Idade / sexo Estado da doença no início de STI571* Duração do tratamento com STI571 Melhor resposta a STI571* Resposta quando da análise da mutação* Tempo da análise da mutação t Resultado da mutação [ Substituição de nucleótidos (Genbank N° M14752) Resistência de Emergência 07 54 F Ia 10,5m la Pré-estudo NM 5 5 6m NM 5 9m NM 5 lOm G250E G para C nt 749 4 10,5 G250E G para C nt 749 08 41 M 2 6m 5 2 6m E255K G para A nt 769 09 60 M 2 5m 5 5 3m NM 4 6m E255K G para A nt 769 10 44 M 2 4,5m 2 Pré-estudo NM 5 4 4m E255K G para Ant 769 11§ 60 F lc 3m lc Pré-estudo NM 5 lc 3m E255K G para A nt 769 12 52F 3 9m 3 Pré-estudo NM 7 7 6m NM 7 7m NM 6 8m M351T T para C nt 1052 2P 9m M351T T para C nt 1052 13 64 M 3 10,5m 5 2P lOm NM - 17 - ΡΕ2017335 (continuação)

Doente Idade Estado da Duração do Melhor Resposta Tempo da Resultado da Substituição ID /sexo doença no tratamento resposta a quando da análise da mutação de nucleótidos início de com STI571 STI571* análise da mutação (Genbank STI571* mutação* t N° M14752) Resistência de Emergência 14 78 F la 8m 5 2 C+P 8m NM 15 47 M 2C 9m 2C lc 7m NM 16 56 F 3 7m 5 2 6m NM 17 37 M la 7m 4 la 4,5m NM 18 63 M 2 7m 4 2 8m NM Refractário 19 55 F 2C 6m 4 4C 3,5m NM 20 63 M 2C llm 2C Pré-estudo NM f 2C 3m NM ΐ 8m M351T T para C nt 1052 ΐ 9m M351T T para C nt 1052 ΐ lOm M351T T para C nt 1052 ΐ llm M315T T para C nt 1052 21 62 F 2 10,5m 5 4 9m NM 22 54 M 2 8m 5 5 6m NM 23 61 F 3 6m 5 4 5m NM 24 61 F 3 10,5 5 4 6m NM - 18 - ΡΕ2017335 (continuação) Doente Idade Estado da Duração do Melhor Resposta Tempo da Resultado da Substituição ID / sexo doença no tratamento resposta a quando da análise da mutação de nucleótidos início de com STI571 STI571* análise da mutação (Genbank STI571* mutação* t N° M14752) Refractário 25 47 F 3 lOm 5 5 6m m 26 40 F 3 6m 5 5 4m m 27 60 H 3 6m 5 5 4m NM 28 42 H 3 7m 5 5 6m NM F: mulher; M : homem; m: meses. NM Indica ausência de detecção de mutação após sequenciação da região cinase de Bcr-Abl em ambas as direcções. c indica evolução clonal p indica duplo cromossoma Philadelphia *Estado da doença/resposta: la) crise blástica mielóide b) crise blástica linfóide c) relapso de ALL Ph-positiva. 2) Fase acelerada, 3) Fase crónica, 4) resposta parcial (blastos no sangue + medula óssea <15%), 5) resposta hematológica completa (Contagem de glóbulos brancos <10,0, Plaquetas <450, sem blastos, mielócitos + metamielócitos <5%, sem promielócitos, sem sintomas relacionados com a doença ou doença extramedular), 6) resposta citogénica major, 7) resposta citogénica completa, fMeses desde o início do tratamento f Apesar do doente estar há apenas 8 meses em estudo, STI571 foi alternado mensalmente com arsénico oral e depois o doente recebeu apenas 4 meses de STI571 ao longo deste período. § Doentes ALL Ph positivos. 19 ΡΕ2017335

Outros estudos revelaram a presença de duas mutações adicionais, i.e. Met244Val e Fen486Ser, em doentes resistentes a STI571/refratários a STI571 que sofrem de leucemia positiva para o cromossoma Ph.

Num outro estudo, doentes CML de 12 centros dentro da Austrália e Nova Zelândia foram testados relativamente à análise de mutações. As amostras foram essencialmente colhidas para avaliação molecular dos níveis de BCR-ABL e apenas prosseguiram para análise de mutações se o RNA guardado contivesse um nível mensurável de BCR-ABL e o nível do gene controlo indicasse RNA não degradado. Os doentes tinham recebido 6 ou mais meses de terapia com imatinib ou tinham desenvolvido resistência e cessaram a terapia 6 meses antes (n=2) . As amostras de 156 doentes estavam disponíveis mas 12 não puderam ser testadas, 4 devido aos baixos níveis de BCR-ABL e 8 devido à qualidade inadequada do RNA. Os restantes 144 doentes foram agrupados de acordo com a fase da doença no início de imatinib; 40 em AP, 64 em CP tardio definido com >12 meses desde o diagnóstico e 40 em CP precoce definido com <12 meses desde o diagnóstico. Dezasseis dos doentes com CP precoce tinham falhado a terapia anterior com interferão e 24 tinham apenas recebido hidroxiureia antes da terapia com imatinib. A resposta a imatinib foi classificada por análise citogenética aos 6 meses como resposta citogenética major 20 ΡΕ2017335 (MCR) se o número de células positivas para o cromossoma Philadelphia era <35% ou sem MRC se era de 35-100%. A resistência a imatinib foi definida como a perda de uma remissão hematológica completa (CH) que tinha estado presente durante pelo menos 3 meses, perda de CHR com transformação para fase acelerada ou blástica, ou perda de uma MCR estabelecida ou de uma resposta citogenética completa (CCR definida como negativa para o cromossoma Philadelphia). 346 amostras de RNA foram analisadas como já aqui referido. Dependendo do RNA disponível, os doentes foram testados relativamente a mutações entre 1-15 pontos do tempo diferentes. A duração média da terapia com imatinib foi assim determinada a partir do último ponto de tempo da análise. Os doentes AP tinham recebido uma média de 9 meses de imatinib (gama 4 a 24), CP tardia 10 meses (gama 6-24) e CP precoce 14 meses (gama 5-24).

Resistência a imatinib em doentes em fase acelerada

Catorze dos 40 doentes AP desenvolveram resistência ao imatinib, 5 com transformação para a fase de blastos, 8 com recorrência de AP e 1 com perda de CCR. As mutações foram detectadas em 12 de 14 (86%) doentes resistentes em média com 8 meses de terapia com imatinib (gama 4-13) . 21 ΡΕ2017335

Resistência a imatinib em doentes de fase crónica tardia (CP tardia)

Treze de 64 doentes CP tardia desenvolveram resistência a imatinib, 5 com transformação para a fase de blastos, 6 para AP e 2 perderam uma MCR. As mutações foram detectadas em 11 de 13 (85%) dos doentes resistentes com uma média de 8 meses de terapia com imatinib (gama 3-18).

Resistência a imatinib em doentes na fase crónica precoce (CP precoce)

Seis dos 40 doentes CP tardia desenvolveram resistência, 1 transformado para crise blástica, 2 para AP, 2 perderam CCR e 1 perdeu MCR. Não foram detectadas mutações nos doentes resistentes.

Duração de CML e o desenvolvimento de mutações

Quando todos os doentes no estudo que atingiram uma resposta citogénica major (MCR) dentro de 6 meses foram estudados, os tratados >4 anos desde o diagnóstico tinham uma incidência 9 vezes superior de mutações do que os tratados dentro de 4 anos (6 de 22 (27%) versus 2 de 72 (3%)). Quando todos os doentes que não atingiram uma MCR dentro de 6 meses foram estudados, os tratados >4 anos desde o diagnóstico tinham uma incidência 2 vezes mais 22 ΡΕ2017335 elevada de mutações do que os tratados dentro de 4 anos (12 de 22 (54%) versus 7 de 28 (25%) ) . A incidência mais elevada de mutações foi em doentes AP tratados >4 anos desde o diagnóstico e que falharam o atingir uma MCR em 6 meses (8 de 12, 67%) . Neste estudo 27 dos 144 doentes desenvolveram mutações. A duração média de CML antes do inicio da terapia com imatinib dos 27 doentes com mutações (5,3 anos, gama 1,1 a 11) foi estatisticamente diferente dos 117 doentes sem mutações (1,3 anos, gama 0,02-17,7) p<0,0001.

Mutações no domínio cinase BCR-ABL A Tabela 7 detalha as 17 mutações diferentes no domínio cinase BCR-ABL detectadas em 27 doentes. Estas eram todas mutações pontuais e estavam situadas dentro de uma sequência de 728 nucleótidos envolvendo os aminoácidos 244 a 486. Sete doentes tinham 2-4 mutações e um doente tinha 2 mutações diferentes no mesmo nucleótido que alteravam a posição de aminoácidos na posição 252 de glutamina para histidina. As mutações L248V no extremo N e S417Y, E459K e F486S no extremo C do domínio cinase não tinham sido anteriormente descritas. As 3 primeiras mutações foram todas detectadas num doente resistente a imatinib que também tinha a mutação G250E. 23 ΡΕ2017335

Tabela 7, Mutações do domínio cinase BCR-ABL

Mutação Substituição de Nucleótido Número de doentes (GenBank número M14752) com mutação* M24 4V 73 0A>G 1 L248V 742C>G 1 G250E 749G>A 3 Q252H 756G>C 3 Q252H 756G>T 1 Y253F 758A>T 2 E255K 763G>A 1 E255V 76 4A>T 5 T315I 944C>T 2 F317L 951C>G 2 M351T 1052T>C 8 E355G 1064T>C 3 F359V 10 75T>G 2 H396R 1187A>G 1 S417Y 1250OA 1 E459K 13 75G>A 1 F486S 1457T>C 1 * 7 doentes tinham múltiplas mutações

Exemplo 3:

Neste exemplo estudámos 43 doentes CML (18 em fase crónica e 25 em fase avançada da doença) que se tornaram citogeneticamente ou hematologicamente resistentes ao tratamento com mesilato de imatinib. Os doentes em fase 24 ΡΕ2017335 avançada foram tratados com mesilato de imatinib durante um tempo médio de 3 meses e os doentes em fase crónica durante um tempo médio de 13 meses. Após uma primeira amplificação incluindo fusão BCR-ABL (1300 pb), realizámos duas reacções sucessivas de PCR para amplificar um fragmento de 584 pb incluindo o dominio de ligação a ATP e um fragmento de 386 pb contendo os domínios SH2 e SH3. Os produtos de PCR foram sequenciados permitindo cobrir os diferentes domínios ABL incluindo o aminoácido 72 a 180 e o aminoácido 234 a 396 para estudar respectivamente os domínios SH2/SH3 e de ligação a ATP.

Relativamente ao domínio de ligação a ATP entre os 43 doentes, foram detectados 5 casos de mutações. Três doentes (um em fase acelerada e 2 em crise blástica) apresentaram a mutação T315I. Num outro doente em fase acelerada foi detectada a mutação E255K. Num doente resistente citogenético (em fase crónica) tratado por mesilato de imatinib mais de um ano, as pesquisas encontraram uma nova substituição Gli250Ala. Relativamente aos domínios SH2 e SH3 não foram detectadas mutações nas diferentes amostras disponíveis para a totalidade dos 43 doentes CML estudados.

Os nossos dados confirmam que nos doentes CML tratados com STI571, as mutações ABL não se restringem à fase acelerada da doença e descrevemos uma nova mutação pontual não descrita anteriormente. 25 ΡΕ2017335

Após mutagénese in vitro, as linhas celulares Ba/F3 foram manipuladas para expressarem o tipo selvagem e os mutantes T315I, E255K e A250G, com o objectivo de estudar a sensibilidade diferencial ao mesilato de imatinib. Resultados preliminares confirmaram o nivel elevado de resistência do BaF/BCR-ABL*T315I. Os outros estudos funcionais estão em curso no laboratório e serão comparados com este.

Lisboa, 23 de Fevereiro de 2011

Claims (11)

1. ΡΕ2017335 1 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido isolado que compreende um domínio cinase funcional compreendendo a sequência de amino-ácidos do domínio da cinase humana nativa Abl, ou uma sequência essencialmente semelhante a esta em que a Glicina 250 é substituída por um outro aminoácido, o referido domínio cinase funcional sendo resistente à inibição da sua actividade de tirosina cinase por N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il-pirimidin-2-ilamino)-fenil]-4-(4-metil-piperazin-l-metil)-benzamida ou um sal deste.
2. 2. 0 polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 1, em que Glicina 250 é substituída por ácido glutâmico.
3. 3. O polipéptido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2,em que a sequência de aminoácidos do domínio da cinase Abl nativa consiste nos aminoácidos 229-500 de SEQ ID NO:2.
4. 4. Um polipéptido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que é uma tirosina cinase Bcr-Abl.
5. 5. Utilização de um polipéptido de acordo com 2 ΡΕ2017335 qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para testar os compostos que inibem a actividade tirosina cinase do referido polipéptido.
6. 6. Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
7. 7. Utilização de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6 na produção de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para usar no rastreio de compostos que inibem a actividade tirosina cinase do referido polipéptido.
8. 8. Um vector recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6.
9. 9. Um vector recombinante de acordo com a reivindicação 8, que é um vector de expressão recombinante.
10. 10. Uma célula hospedeira compreendendo um vector recombinante de acordo com a reivindicação 8 ou 9.
11. 11. Um método de identificação da mutação G250E em doentes Bcr-Abl refractários ou resistentes ao tratamento de N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il-pirimidin-2- 3 ΡΕ2017335 ilamino)-fenil]-4-(4-metil-piperazin-l-metil)-benzamida ou um seu sal, o método compreendendo a determinação da sequência nucleotídica da região de ligação a ATP do cDNA de Bcr-Abl e a determinação se a Glicina 250 é substituída por ácido glutâmico. Lisboa, 23 de Fevereiro de 2011 1 ΡΕ2017335 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição spmvmA · wsmmAA Literatura que não é de patentes citada na Descrição *: Nowsíf P.C,; 3 32, ϊ'497 Aíafeís·, 3873, ¥£il. 243it 23S-23S * FsKteri S. ú&mwJ-áiá, *. Sswysr» <1 'yd. 34¾ 3330-334Q * Date* «í ai Sc&stss, 247;, S24-83S: * ; tugeT-S. * Dn«sr •303MGS7: » Orofc» B.Ji MA N Sig ,í. Még 20St·. 344, f Drutar £. X st ai Mstét 208t. 4ci 344. 4038-1042. » Qerrs> Scòtòíâ, 2SSt. *0. 2S3. S76-3S0 ·♦ Gssrsá Ps-tóseds· is KsfesÊsf ΒΜψΛΜΙ, 4*8.I, SU: * Safáísfsait ®í a}. RfcíeoBJar Cfeáiag; A LStesSsy yságaj. CsSES^íAí Hamsr Lató^^Éraá%' íSSO * Í3ft C^Pírs; A iM£< i 8 * O!iigi3!5Ma;S!0ííde %rfcssX 1884 '* Hs«»* í * .Teansctls^Bn ars-á Tasslates. 'ÍSS4 * ArwsiCsiiCXiws t98s :* toscAsisi CsSa mi Erzwjss·. íRl Press, 1SS8 * Pwtfeai A * Mettesfc Is» Epzyrwsogy. Aeácfentc; p?ess, *>·;, ·" tãea* TraRi?«· Víss^s; Cate Ssd Sptfag H®scíí LatesateÁ ÍS87. ·♦ «Aetteds ia Er^m-ofos* vof. ISA Í5S * Bfât5f«rd 5. st si. Sr. J. ítts#, im vM ;07. S87-5S9 * Bfsnfard S, eê »3, Sr. X 20»). vd. 10«, ;®35·β37