JP2005505276A

JP2005505276A - 細菌ウラシル輸送体蛋白質及び細菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離核酸分子、前記核酸分子で形質転換した細胞とその使用

Info

Publication number: JP2005505276A
Application number: JP2003532626A
Authority: JP
Inventors: グラーブ，ウオーレン; スコーペク，トーマス
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2002-09-25
Publication date: 2005-02-24
Also published as: EP1438434A2; CA2461998A1; WO2003029407A3; US20050197497A1; EP1438434A4; WO2003029407A2; US7199232B2

Abstract

本発明は各々ネズミチフス菌に由来するウラシル輸送体蛋白質とウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの一方をコードする新規ポリヌクレオチドに関する。本発明のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質はヒト癌細胞を５−フルオロウラシル等の抗癌剤治療に対して感作するのに有用である。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は新規に同定されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、前記ポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、並びに前記ポリヌクレオチド及びポリペプチドの生産に関する。より特定的には、本発明のポリペプチドは細菌由来であり、即ちネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から単離される。特に、本発明はウラシル輸送体蛋白質及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ等の単離核酸分子とその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
殆どの生物ではホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＰＲＴアーゼ）として知られる１０種の酵素からなる群がプリン、ピリミジン及びピリジンのヌクレオチドと芳香族アミノ酸であるヒスチジン及びトリプトファンの生合成に関与している。これらの酵素は各々一般に芳香族である窒素性塩基、２価金属イオン及びα−Ｄ−５−ホスホリボシル１−ピロリン酸（ＰＲＰＰ）に高度に特異的である。いずれの場合も、ＰＲＰＰのピロリン酸部分の開裂はリボフラノース環のアノマー反転により行われ、β−Ｎリボシド一リン酸となる。脊椎動物では、数種のＰＲＴアーゼが顕著な臓器特異性を示すが、その他は殆どの組織に種々のレベルで存在する。全生物でＰＲＴアーゼは細胞内では可溶性細胞質フラクションに限定される。哺乳動物では、単一酵素オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴアーゼ）がピリミジン塩基のサルベージに関与している。他方、細菌、酵母及び植物細胞にはウラシル特異的酵素であるウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼも存在する。
【０００３】
細菌由来ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼはウラシルと５−ホスホリボシルα−１−ピロリン酸（ＰＲｉｂ−ＰＰ）からウリジン−５’−一リン酸（ＵＭＰ）及びＰＰｉへの変換を触媒する。Ｎｅｕｈａｒｄら，ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｈＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓａｎｄＮｕｃｌｅｏｂａｓｅｓｉｎＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｍｕｎｉｃｈ−ＰｅｔｅｒｓｅｎＡ．編）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，９５−１４８参照。重要な点として、細菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼは哺乳動物細菌には存在しないが、哺乳動物細胞のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ又はウリジン−５’−一リン酸シンターゼと機能的に等価であり、ピリミジンの分解により形成される内生ウラシルの利用とピリミジン合成における外生ウラシル、シトシン及びウリジンの利用に根本的な重要性をもつ。これは後述するようにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで立証されている。
【０００４】
大腸菌由来ＵＰＰ遺伝子は酵素ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードし、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，ＥｕｒＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０４：５１−５６（１９９２）（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，１９９２）により単離されている。酵素ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼを欠失するが無傷のウラシル輸送体系をもつ大腸菌突然変異体はピリミジン源としてウラシルで増殖できず、培地にウラシルを分泌する。ＭａｌｌｏｙＡら，ＦＥＢＳＬｅｔｔｓ．，５：２１１−２１３（１９６９）参照。更に、２０μＭ５−フルオロウラシルに耐性であり、これはＵＰＰ突然変異体の選択に使用された表現型である。
【０００５】
内生的に形成されたウラシルのサルベージと外生ウラシル及びシトシンの利用におけるウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの役割は大腸菌を含む数種の微生物で立証されている。ピリミジンサルベージ酵素は増殖培地又は細胞核酸の分解産物から予め形成されたヌクレオ塩基とヌクレオシドを細胞に利用させる。
【０００６】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＵＲＰＴアーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列が最近発表された。Ｋｅｒｎら，Ｇｅｎｅ，８８：１４９−１５７（１９９０）参照。この遺伝子は２８．７ｋＤａ蛋白質をコードする。大腸菌とＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの推定アミノ酸配列を比較すると、全体の一致度は３２％であるが、個別領域に多少の類似性があることが判明した。
【０００７】
天然ヌクレオシド及びヌクレオ塩基は重要な代謝産物であり、多数の臓器、系及び種に無数の生理的作用をもつ。ヌクレオシド及びヌクレオ塩基は代謝結果が多様であり核酸代謝に主要な役割を果たすことから、臨床的に有用な薬剤を開発する目的で過去４０年にわたってこれらの化合物の多数の類似体が合成されている。合成ヌクレオシドは白血病の化学療法や、抗ウイルス剤（例えばシトシンアラビノシド（ａｒａＣ）、アシクロビル、アジドチミジン、５−フルオロデオキシウリジン及び５−フルオロウラシル）として重要な用途がある。代謝拮抗剤及び抗生物質として作用するヌクレオ塩基及びヌクレオシドの新規類似体も治療用途を期待して合成と評価が続けられている。ヌクレオシドとヌクレオ塩基にはｄｅｎｏｖｏピリミジン及びプリン合成の特定阻害剤（例えばメトトレキセート、５−フルオロウラシル及びＮ−ホスホノアセチル−Ｌ−アスパラギン酸）の効果を逆転させるものもあるらしい。
【０００８】
細菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼは哺乳動物細胞のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ又はウリジン−５’一リン酸シンターゼと機能的に等価である。これらの酵素は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（注：５−ＦＵはＦＤＡにより癌治療に認可されている。しかし、患者に比較的毒性である。そのため、その用量は副作用を避けるように最少にする必要がある。Ｐｉｎｅｄｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，６：１６６３−１６６４（１９８８）参照。）から５−フルオロウリジン５’一リン酸（５−ＦＵＭＰ）への変換を媒介する。その後、５−フルオロウリジン５’一リン酸は哺乳動物ｄｅｎｏｖｏピリミジン経路で５−ＦｄＵＤＰと５−ＦｄＵＭＰに変換される。各５−ＦｄＵＭＰはチミジル酸シンターゼ（Ｔｈｙ−Ａ）の不可逆阻害剤であり、ｄＴＴＰ飢餓とそれに続くアポトーシスをもたらす。この変換は５−フルオロウラシルの細胞毒性作用を行うために必要な経路の一つである。細菌由来ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼが哺乳動物オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼと同様に５−フルオロウラシルを活性代謝産物である５−フルオロウリジン−５’一リン酸に変換できるという上記結論はＫａｗａｍｕｒａ，Ｋら，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．，７：６３７−４３（２０００）のデータにより裏付けられる。哺乳動物に存在しない細菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を腫瘍細胞で発現させると、導入した細胞で５−フルオロウラシルの細胞毒性作用を有効に強化できることが示唆されている。
【０００９】
データは５−フルオロウラシルと併用したウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子治療が５−フルオロウラシルの抗腫瘍作用を増強できることを示唆している。従って、このアプローチは癌遺伝子治療の新規化学増強ストラテジーであり、より実現性の高い膀胱癌治療法である。
【００１０】
ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする大腸菌遺伝子を担持させたアデノウイルスをヒト結腸癌細胞に感染させると、５−フルオロウラシル治療に対して感受性が著しく増すことも研究者らに報告されている。大腸菌ＵＰＰ遺伝子をアデノウイルスにより導入すると、ＤＮＡとＲＮＡの両者による５−フルオロウラシルの同化の活性化が増進し、ヒト結腸癌細胞が５−ＦＵ治療に対して感作されることはデータが立証しており、「ＵＰＲＴ／５−フルオロウラシル系を結腸直腸癌治療の新規生化学フルオロウラシル療法とみなすことができる」ことを示唆している。Ｋｏｙａｍａ，Ｆら，ＥｕｒＪＣａｎｃｅｒ，３６：２４０３−２４１０（２０００）参照。
【００１１】
更に、Ｓｕｎａｍｕｒａ，Ｍ．ら，ＮｉｐｐｏｎＲｉｎｓｈｏ，５９：９８−１０３（２００１）は、細菌ＵＰＰ遺伝子を膵細胞に導入すると５−フルオロウラシルに対する膵細胞の感受性が有意に変化したと報告している。Ａｄａｃｈｉ，Ｙ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，１１：７７−８９（２０００）も参照。同様の結果がＩｎａｂａＭら，ＪｐｎＪＣａｎｃｅｒＲｅｓ．９０：３４９−３５４（１９９９）によりヒト胃癌細胞系で報告されている。更に、Ｋａｎａｉら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，５８：１９４６−５１（１９９８）は大腸菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をアデノウイルスにより導入すると、結腸、胃及び膵臓癌細胞系が著しく感作されたと報告している。更に、細菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入したヌードマウスにヒト肝臓癌又は胃癌を異種移植して５−フルオロウラシル治療すると、有意なｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍作用を生じた。
【００１２】
ヌクレオシドとヌクレオ塩基の輸送は多種多様の生物で共通しており、多種多様の生理作用がある（ＧｒｉｆｆｉｔｈとＪａｒｖｉｓ１９９６）。生体ヌクレオシド及びヌクレオ塩基と大半のヌクレオシド類似体は親水性であり、細胞内外への移動には特殊な輸送体系が必要である。細胞及び生物にヌクレオシド及びヌクレオ塩基輸送体が存在するか否かは薬物動態と生体化合物並びにヌクレオシド及びヌクレオ塩基薬剤の配置及びｉｎｖｉｖｏ生体活性に重要な影響がある。
【００１３】
ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ活性が高い条件下でも外生ウラシル濃度が低い場合のウラシル取込みにはウラシル輸送体蛋白質が必要であることは数種の文献が記載している。ウラシルは膜に結合したウラシル輸送体蛋白質により助長されて細胞膜を通って細胞質に入ることが研究者らにより示唆されている。
【００１４】
しかし、ウラシル輸送体蛋白質又はこの蛋白質をコードする遺伝子であるｕｒａＡ又はウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするＵＰＰ遺伝子をネズミチフス菌から単離したという記載はどの従来技術文献にも見当たらない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本明細書では上記のように従来技術に記載されていない単離核酸分子を開示するものであり、このような単離核酸分子が入手可能になれば、他の資源からの予想に基づいて核酸分子によりコードされる蛋白質の構造と機能の詳細な情報を入手できよう。
【００１６】
更に、本明細書に開示する単離核酸分子が入手可能になれば、現行癌治療プロトコールの治療効力を改善すると共に、従来の抗腫瘍薬等の治療に対して癌細胞を感作することが可能な治療候補を開発できよう。
【００１７】
更に、本明細書に開示する核酸分子によりコードされる蛋白質が同定されることにより、多数の化合物を迅速にスクリーニングし、治療用途の更に詳細な研究に適した候補を同定できよう。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明はネズミチフス菌に由来する単離核酸分子、コードされる蛋白質（ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む）、及びそのアンチセンス類似体を提供する。生物学的に活性で診断又は治療に有用なそのフラグメントと、本明細書に開示する蛋白質に対して免疫反応生の抗体も提供する。
【００１９】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドも提供する。上記ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はプラスミドを含む組換え細胞も提供する。
【００２０】
本発明の核酸分子を含むベクターと、組換え技術により本発明のペプチドを生産する方法も提供する。この方法は本発明のペプチドの発現を助長する条件下で本発明のペプチドをコードする核酸配列を含む形質転換原核及び／又は真核宿主細胞を培養した後、ポリペプチドを回収する。
【００２１】
本発明の更に別の側面によると、本発明のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする十分な長さの核酸分子を含む一本鎖核酸プローブも提供する。
【００２２】
本発明により提供される一本鎖核酸プローブとその混合物により、遺伝子工学の当業者は任意種に由来する類似ポリヌクレオチドとコードされるポリペプチドを同定及びクローニングすることができ、こうして本発明の配列の効用を更に拡大することができる。
【００２３】
プローブは本発明のペプチドをコードする核酸分子の全長又はそのフラグメントとすることができる。一般に、プローブはコーディング配列に相補的であるが、イントロンのプローブも予想される。
【００２４】
プローブはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ３９２ｍＤＮＡ／ＲＮＡ合成機等のオリゴヌクレオチド合成機を使用して合成することができ、検出可能なマーカーで標識することができる。核酸の種々の領域に対応する２種以上の標識プローブの組合せをキットに加え、ハイブリダイゼーションにより遺伝子を検出及び／又は分析できるようにしてもよい。
【００２５】
別の側面では、本発明は本発明のペプチドを検出するためのアッセイに関する。
【００２６】
別の側面では、本発明は本発明のペプチドをコードする核酸配列の突然変異に関連する疾患を検出し、コードされるポリペプチドの濃度変化を検出するための診断アッセイを提供する。
【００２７】
本発明の更に別の側面によると、ＤＮＡ合成及びＤＮＡベクター製造等のｉｎｖｉｔｒｏ目的のために本発明のペプチド又は前記ポリペプチドをコードする核酸分子を利用する方法が提供される。
【００２８】
本発明のペプチドを発現する細胞の同定方法も提供される。
【００２９】
本発明のポリペプチドに特異的な抗体が入手可能になれば、（例えば正常対疾患脳組織における）本発明のペプチドの分布と発現密度を監視するために免疫組織化学技術を利用することが可能になる。このような抗体を診断及び治療用途に利用することもできる。この抗体はウラシル輸送体蛋白質又はウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの生物活性を中和できることが好ましい。
【００３０】
本発明のペプチドの一方又は両方を種々の潜在的アゴニスト又はアンタゴニストで試験できるならば、本発明のペプチドの一方又は両方の機能と活性に関する更なる情報が得られ、本発明のペプチドのヒト対応物があるならば、これと非常に特異的に相互作用することが可能な化合物を同定及び設計できよう。
【００３１】
更に、種々の疾患状態の薬剤開発と治療処置に関連して本発明のペプチドをコードするＤＮＡを入手できるならば、従来未知の所定機能の存在と相関し得る前記遺伝子の任意変異（例えば突然変異）の識別が可能になる。
【００３２】
上述のように、５−フルオロウラシルは癌治療に認可されている。しかし、その使用に伴う大きな欠点は比較的毒性であるという点である。本発明の更に別の態様によると、５−フルオロウラシルの治療効力を改善するために十分な量のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする本発明の核酸を５−フルオロウラシル治療に反応性の宿主細胞に投与する方法が提供される。この効果はウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼが５−フルオロウラシルをその非毒性代謝産物である５−フルオロウラシル５’一リン酸に変換できるという性質により得られる。従って、本発明のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする新規遺伝子はより実現性の高いヒト癌の治療法に道を開くと考えられる。
【００３３】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の説明は本発明を理解し易くすることを目的とし、特許請求の範囲に記載する発明を制限するものではない。明細書と特許請求の範囲を更に熟考することにより本発明の他の特徴と利点も当業者に自明である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本明細書及び特許請求の範囲において使用する単数形はそうでないことが文脈から明白に読み取れる場合を除いて複数形も含むことに留意すべきである。従って、例えば「宿主細胞」と言う場合には複数のこのような宿主細胞を含み、「抗体」と言う場合には１種以上の抗体と当業者に公知のその等価物を含み、その他も同様である。
【００３５】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全技術及び科学用語は本発明が属する分野の当業者に一般に理解されている通りの意味をもつ。本発明の実施又は試験には本明細書に記載するものと類似又は等価の任意方法及び材料を使用することができるが、好適方法、装置及び材料は本明細書に記載するものである。
【００３６】
本明細書に引用した全刊行物はこれらの刊行物に報告されている方法、ベクター等で本発明に関連して使用可能なものを記載及び開示する目的で参考資料として本明細書に組込む。本明細書中の如何なる記載も本発明が先発明の理由でこれらの開示に既に記載されていると認めるものではない。
【００３７】
以下の記載では、組換えＤＮＡ技術の分野で使用されている多数の用語を広く使用する。これらの用語の範囲を含めて本明細書及び特許請求の範囲をより明瞭且つ矛盾なく理解できるように、以下に定義を示す。
【００３８】
本発明は各々ネズミチフス菌に由来する新規ウラシル輸送体蛋白質とウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする単離核酸分子を提供する。具体的には、本発明のペプチドをコードする単離ＤＮＡと組換えメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を記載する。単離ＤＮＡのスプライス変異体も記載する。
【００３９】
「本発明の核酸」と「核酸分子」は同義に使用し、本発明のペプチドをコードする本発明の核酸分子を意味する。
【００４０】
「ポリペプチド」又は「ペプチド」又は「蛋白質」とはアミノ酸残基のポリマーとその変異体及び合成類似体を意味し、本明細書では同義に使用する。従って、これらの用語は１個以上のアミノ酸残基が合成非天然アミノ酸（例えば対応する天然アミノ酸の化学的類似体）であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーを意味する。好適ポリペプチドは本発明のペプチドである。
【００４１】
本明細書で使用する「アミノ酸配列」なる用語はオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド又は蛋白質配列及びそのフラグメント又は部分と、天然又は合成分子を意味する。
【００４２】
「本発明のペプチド」なる用語は本発明の核酸分子によりコードされるポリペプチドを意味する。変異体とフラグメントも含む。
【００４３】
本明細書で使用する「ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子」又は「ＵＰＰ」とは配列番号１の核酸分子によりコードされるネズミチフス菌に由来するウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を意味する。本明細書に開示する核酸配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸分子も含む。このような核酸分子は多数の方法で特徴付けることができ、例えばＤＮＡが配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする場合や、ＤＮＡが配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む場合がある。ＵＰＰのコーディング配列は配列番号２の蛋白質をコードする図１に示すヌクレオチド９２９〜２２１８（１２９０塩基対によりコードされる４２９アミノ酸）に由来する。
【００４４】
一般に、ＵＰＰ遺伝子がスプライス変異体の場合を除き、開示するＵＰＰＤＮＡは本明細書に記載するＵＰＰ遺伝子と実質的配列相同性（即ち＞約９０％）をもつ。スプライス変異体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡは本明細書に記載するＤＮＡ又はＲＮＡとの総体配列相同性が９０％未満の場合もあるが、このようなスプライス変異体でも開示ＤＮＡとほぼ１００％相同の領域を含む。
【００４５】
本明細書で使用する「ウラシル輸送遺伝子」又は「ｕｒａＡ」とは配列番号１の核酸分子又は配列番号１のヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされるネズミチフス菌に由来するウラシル輸送体蛋白質をコードする遺伝子を意味する。このような核酸分子は多数の方法で特徴付けることができ、例えばＤＮＡが配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする場合や、ＤＮＡが配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む場合がある。一般に開始及び停止コドンは図１に示す通りである。完全配列の任意番号はヌクレオチド１〜２５２０であり、２０８アミノ酸蛋白質をコードする合計６２７塩基対のヌクレオチド２１５〜８４１により規定される配列番号２のウラシル輸送体蛋白質のコーディング配列である。
【００４６】
本明細書に記載する核酸分子は当業者に公知の種々の蛋白質発現系にこのような核酸を組込んで本発明のペプチドを生産するのに有用である。更に、このような核酸分子又はそのフラグメントを容易に検出可能な置換基で標識し、所定試料中におけるＵＰＰ又はｕｒａＡをコードする遺伝子又はｍＲＮＡ転写産物の存在及び／又は量をアッセイするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００４７】
本明細書に記載する核酸分子とそのフラグメントは本明細書に記載する本発明のペプチドをコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応でプライマー及び／又は鋳型としても有用である。
【００４８】
「遺伝子」とはそのヌクレオチド配列がポリペプチド分子をコードする核酸分子を意味する。遺伝子は連続ヌクレオチド配列でもよいし、イントロン、プロモーター領域、スプライス部位及び反復配列等の介在セグメントを含んでいてもよい。遺伝子はＲＮＡでもＤＮＡでもよい。好適遺伝子は本発明のペプチドをコードする遺伝子である。
【００４９】
「核酸」又は「核酸分子」なる用語はリボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、そのフラグメント又は部分、及びプライマーを対象とする。ＤＮＡは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）でもよいし、ゲノムＤＮＡでもよく、例えば本発明のペプチドをコードする遺伝子である。
【００５０】
特に指定しない限り、ヌクレオチドとは糖部分（ペントース）、リン酸基、及び窒素性複素環塩基から構成されるＤＮＡ又はＲＮＡのモノマー単位を意味する。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部分に結合しており、この塩基と糖の組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドがペントースの３’又は５’位に結合したリン酸基を含む場合にはヌクレオチドと言う。機能的に連結したヌクレオチドの配列を一般に「塩基配列」又は「ヌクレオチド配列」等と言い、本明細書では一般原則に従って左から右に向かって５’末端から３’末端を示す式により表す。
【００５１】
本明細書に記載する各「ヌクレオチド配列」はデオキシリボヌクレオチド（略字Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴ）の配列として表す。但し、核酸分子の「ヌクレオチド配列」はＤＮＡ分子又はポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ分子又はポリヌクレオチドについては特定デオキシリボヌクレオチド配列中の各チミジンデオキシリボリボヌクレオチド（Ｔ）をリボヌクレオチドウリジン（Ｕ）で置換した対応リボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）配列を含む。例えば、デオキシリボヌクレオチド略字を使用して記載した配列番号１の配列をもつＲＮＡ分子と言う場合には、配列番号１の各デオキシリボヌクレオチドＡ、Ｇ又はＣを対応するリボヌクレオチドＡ、Ｇ又はＣで置換し、各デオキシリボヌクレオチドＴをリボヌクレオチドＵで置換した配列をもつＲＮＡ分子を意味する。
【００５２】
本明細書及び特許請求の範囲においてＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又は蛋白質の修飾語として「単離」及び／又は「精製」なる用語を使用する場合には、指定するＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又は蛋白質が人工的に指定形態で生産されており、従ってその天然ｉｎｖｉｖｏ細胞環境から分離されていることを意味する。この人的介入の結果として、本発明の組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド及び蛋白質は天然状態のこれらのＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又は蛋白質では得られない本明細書に記載する種々の点で有用である。
【００５３】
同様に、本明細書でＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又は蛋白質の修飾語として使用する「組換え」とは、指定するＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又は蛋白質が例えばクローニング、組換え発現等により人工的に作製されていることを意味する。従って、例えば本明細書で使用する組換え蛋白質とは、人工的に宿主に加えられたＤＮＡを発現する組換え宿主により生産された蛋白質を意味する。
【００５４】
核酸配列の定義においては、実質的に類似するアミノ酸配列をコードすることが可能な全該当核酸配列を本明細書に開示する参照核酸配列に実質的に類似するか又は実質的に同一のヌクレオチド配列を含むとみなす。
【００５５】
実際に、「実質的に同一配列」なる用語は２種の蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡが中等ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、同一アミノ酸配列をもつか又はその構造もしくは機能を変えない配列変異をもつ蛋白質をコードすることを意味する。
【００５６】
ヌクレオチド配列「類似性」は２種のポリヌクレオチド配列が（適宜ヌクレオチド挿入又は欠失により）最適に整列させた場合にその配列の対応位置に同一ヌクレオチド塩基をもつ程度の尺度である。配列類似性又は類似性百分率は例えばウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６等の配列分析ソフトウェアを使用して配列情報を比較することにより決定することができる。ＧＡＰプログラムはＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）の修正によるＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアラインメント法を利用している。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「実質的に一致するヌクレオチド配列」は一致度が少なくとも約９０％であり、実質的に一致するアミノ酸配列はアミノ酸一致度が９５％を上回る。但し、スプライス変異体として上記相同性レベルを下回るか又は保存アミノ酸置換（又は縮重コドンの置換）により変異した蛋白質（及び前記蛋白質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡ）も本発明の範囲に含むものとする。
【００５８】
本発明は配列番号１に記載の核酸と異なるが同一表現型をもつ核酸も含む。類似表現型の核酸を「機能的に等価の核酸」とも言う。
【００５９】
本明細書で使用する「機能的に等価の核酸」なる用語は重要でない僅少な配列変異をもつが、本明細書に開示する核酸と実質的に同様に機能して同一蛋白質産物を生産する核酸も含む。
【００６０】
機能的に等価の配列は本明細書及び特許請求の範囲に開示する核酸及びアミノ酸組成物と実質的に同様に機能して実質的に同一の組成物を生産する。特に、機能的に等価のＤＮＡは本明細書に開示すると同一であるか又は非極性残基を別の非極性残基もしくは電荷をもつ残基を同一電荷をもつ残基で置換する等の保存アミノ酸変異をもつ蛋白質をコードする。これらの変異としては蛋白質の三次構造を実質的に変えない変異として当業者に認められているものが挙げられる。
【００６１】
特に、機能的に等価の核酸は本明細書に開示すると同一であるか又は保存アミノ酸変異をもつか又は配列番号２又は３に記載のアミノ酸配列をもつものと実質的に類似するポリペプチドをコードする。
【００６２】
例えば、保存変異としては非極性残基を別の非極性残基で置換したり、電荷をもつ残基を同一電荷をもつ残基で置換することが挙げられる。これらの変異としては蛋白質の三次構造を実質的に変えない変異として当業者に認められているものが挙げられる。
【００６３】
遺伝コードの縮重により特定ハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸と必ずしもハイブリダイズしない本発明のポリペプチドをコードする核酸も提供される。本発明のポリペプチドをコードする好適核酸は配列番号２又は３に記載の実質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドから構成される。
【００６４】
本発明のポリペプチドをコードする核酸の１例は、
（ａ）配列番号２又は３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｂ）中等ストリンジェント条件下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズし、本発明の生物学的に活性なウラシル輸送体蛋白質又は本発明のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡ、あるいは
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に関して縮重のＤＮＡから選択することができる。
【００６５】
本明細書で使用する「縮重」なる用語は配列番号１と少なくとも１個のヌクレオチドが異なるが、配列番号２又は３と同一アミノ酸をコードするコドンを意味する。例えば、トリプレット「ＵＣＵ」、「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」及び「ＵＣＧ」で表す４種のコドンはいずれもアミノ酸セリンをコードするので相互に縮重である。
【００６６】
本明細書において配列番号１のヌクレオチド配列と言う場合には、一般に本発明のペプチドの各々又は一方をコードするコーディング配列を意味する。
【００６７】
核酸分子又はヌクレオチド配列の「フラグメント」は全長よりも短く、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で配列番号１のヌクレオチド配列、好ましくは本明細書に開示するコーディング配列の一方又は両方と特異的にハイブリダイズすることが可能な少なくとも最小長を含む核酸部分である。このようなフラグメントの長さは１５〜１７ヌクレオチド以上が好ましい。
【００６８】
「変異体」核酸分子又はＤＮＡ分子とは本発明のポリペプチドをコードする天然ヌクレオチド配列（コーディング部分）に小変異、即ち好ましくは天然核酸分子の生物活性を実質的に維持しながら天然配列の１個以上のヌクレオチドを欠失、付加及び／又は置換する変異を含むＤＮＡ分子を意味し、当然のことながらこのような変異は配列番号１に指定するコーディング領域の一方又は両方に位置する。変異体ＤＮＡ分子は例えば標準ＤＮＡ突然変異誘発技術又は変異体ＤＮＡ分子もしくはその一部の化学合成により生産することができる。一般に、変異は参照ヌクレオチド配列と変異体が全体で密接に類似し、多くの領域が一致するように限定される。
【００６９】
変異体ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列変異はサイレントでもよい。即ち、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変異させないものとすることができる。変異がこのようなサイレント変異に限定される場合には、変異体は参照と同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする。
【００７０】
あるいは、変異は「保存」性でもよい。保存変異は参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えるヌクレオチド配列（コーディング領域又は配列／蛋白質コーディング領域の一方又は両方）の変異である。このようなヌクレオチド変異の結果、参照配列によりコードされるポリペプチドにアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び短縮が生じ得る。即ち、保存変異は核酸配列によりコードされるポリペプチドの１個以上のアミノ酸残基の保存変異即ちアミノ酸置換を生じる遺伝子の蛋白質コーディング領域の変異である。
【００７１】
本明細書で使用する「挿入」又は「付加」とは天然分子に比較して夫々１個以上のアミノ酸又はヌクレオチド残基を付加するアミノ酸又はヌクレオチド配列の変異を意味する。
【００７２】
本明細書で使用する「置換」とは１個以上のアミノ酸又はヌクレオチドを夫々別のアミノ酸又はヌクレオチドで置換することを意味する。
【００７３】
好ましくは、好適核酸分子の変異体形は本発明のペプチドをコードする天然遺伝子とのヌクレオチド配列類似度が少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
【００７４】
「プライマー」又は「核酸ポリメラーゼプライマー」とは核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が開始される条件下即ち適当な緩衝液中で適当な温度で４種の異なるヌクレオチド三リン酸と重合剤（即ちＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下にＤＮＡ合成開始点として作用することが可能な天然又は合成オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの厳密な長さは多数の因子に依存するが、一般には１５〜２５ヌクレオチドである。短いプライマー分子は鋳型と共に十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためには一般により低温が必要である。プライマーは鋳型の厳密な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。プライマーは所望により標識してもよい。
【００７５】
本発明のペプチドに関して「一致度」又は「相同度」とは最大相同百分率に達するように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に配列番号２又は４の一方における残基と一致する候補配列中のアミノ酸残基の百分率として本明細書では定義し、保存置換は配列一致とみなさない。Ｎ又はＣ末端伸長、欠失又は挿入はいずれも一致度又は相同度を低下するとみなさない。
【００７６】
本明細書で使用する本発明のペプチドの「変異体」とは本発明のペプチドの配列に比較して１個以上のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含むアミノ酸配列をもつポリペプチドを意味する。一般に、変異は参照配列（本発明のペプチド）と変異体が全体で密接に類似し、多くの領域が一致するように限定される。このような変異体は一般に生物学的に活性であり、必然的に着目ポリペプチドと配列一致度が１００％未満である。
【００７７】
１好適態様では、生物学的に活性な変異体は本発明のペプチドとのアミノ酸配列一致度が少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、更に好ましくは少なくとも約８５％、更に好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％である。アミノ酸置換は単一アミノ酸残基の置換が好ましい。
【００７８】
本発明のペプチド（参照蛋白質）の「フラグメント」とは野生型又は参照蛋白質の完全アミノ酸配列の一部を含む蛋白質分子を意味する。
【００７９】
本発明により提供されるＤＮＡから本発明のペプチドをコードする相補的ＤＮＡクローンを作製することもできる。本発明で提供される核酸クローンを使用し、本発明のペプチドをコードするゲノムクローンを単離したり、各種資源から作製したライブラリーのスクリーニングにより任意スプライス変異体を単離することができる。
【００８０】
あるいは、ライブラリーを適当なプローブでスクリーニングすることもできる。従って、本発明のペプチドをコードする核酸の１単離手段は当分野で周知の方法を使用して天然又は人工的に設計した核酸プローブで細菌ゲノムライブラリーを探査する方法である。この目的には本発明のペプチドをコードする遺伝子に由来する核酸プローブが特に有用である。核酸の例は本発明のペプチドをコードするＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は単離ゲノムＤＮＡである。限定するものではないが、このような核酸としては配列番号１と実質的に同一のヌクレオチド配列をもつ核酸、好ましくは前記配列に含まれるコーディング領域又は配列番号２もしくは３に記載のアミノ酸配列をコードする核酸が挙げられる。
【００８１】
本発明のペプチドのスプライス変異体を位置決定するためには当分野で周知の核酸増幅技術を使用することができる。これはヒトＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを増幅するためのプライマーとして不一致配列の周囲のＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドを利用することにより実施される。増幅産物の寸法と配列を決定するとスプライス変異体の存在を確認することができる。更に、ハイブリダイゼーションによりヒトゲノムＤＮＡ配列を単離すると、本発明のペプチドをコードする転写産物の種々のスプライス変異体に対応するイントロンにより分離された複数のエキソンを含むＤＮＡが得られる。核酸操作技術は一般に例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）やＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７，定期的に改訂）に記載されている。核酸の化学合成法は例えばＢｅａｕｃａｇｅとＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２，１９８１や、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１に記載されている。核酸の化学合成は例えば市販自動オリゴヌクレオチド合成機で実施することができる。
【００８２】
本明細書で使用する「スプライス変異体」とは２種以上のｍＲＮＡを生産するゲノムＤＮＡの一次転写産物の異なったプロセシングにより生産される本発明のペプチドをコードする核酸の変異体を意味する。異なってプロセシングされた一次転写産物に由来するｃＤＮＡは完全アミノ酸一致領域と異なったアミノ酸配列をもつ領域をもつ本発明のペプチドをコードする。従って、同一ゲノム配列から複数の関連するｍＲＮＡと蛋白質を生産することができる。得られるｍＲＮＡと蛋白質の両者を本明細書では「スプライス変異体」と言う。
【００８３】
本明細書で使用する核酸「プローブ」とは配列番号１のいずれかに記載の任意１４以上の連続塩基、好ましくは前記配列に含まれるコーディング領域の相補体と同一又は前記相補体である少なくとも１４、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも５０個の連続塩基を含むヌクレオチド配列をもつ１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ又はその類似体である。更に、本発明のポリペプチドの領域をコードする完全ｃＤＮＡ又は配列番号１に対応する完全配列をプローブとして使用してもよい。
【００８４】
本発明のプローブによる好適スクリーニング条件は温度約３７℃、ホルムアミド濃度約２０％及び塩濃度約５倍標準クエン酸（ＳＳＣ；２０×ＳＳＣはｐＨ７．０で３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）を含む。このような条件により、完全な相同を必要とすることなしにプローブ配列と実質的類似度をもつ配列を同定することが可能になる。
【００８５】
プローブとの相同度の低い配列に対して区別しながらプローブと少なくとも７０％の相同度をもつ配列を同定できるようなハイブリダイゼーション条件を選択することが好ましい。その結果、配列番号１に記載のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列をもつ核酸が得られる。
【００８６】
ライブラリーのスクリーニング後にハイブリダイゼーションシグナルを検出することにより陽性クローンを同定し、同定したクローンを制限酵素マッピング及び／又はＤＮＡ配列分析により特性決定した後、本明細書に記載する配列との比較により試験し、本発明の完全ペプチドをコードするＤＮＡを含むか否かを確かめる。選択したクローンが不完全である場合には、これらのクローンを使用して同一又は別のライブラリーを再スクリーニングし、オーバーラップクローンを得ることができる。所望により、本発明の完全ペプチドをコードするオーバーラップクローンが得られるまでライブラリーを陽性クローンで再スクリーニングしてもよい。ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーである場合には、オーバーラップクローンはオープンリーディングフレームを含む。ライブラリーがゲノムである場合には、オーバーラップクローンはエキソンとイントロンを含む可能性がある。いずれの場合にも、本明細書に記載するＤＮＡとコードされる蛋白質との比較により完全クローンを同定することができる。
【００８７】
従って、核酸プローブは種々の用途に有用である。他方、本発明の核酸分子の増幅用ＰＣＲプライマーとして使用することもできる。他方、例えばｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション又はノーザンブロットハイブリダイゼーションにより標的組織における本発明の分子の発現の検出用ツールとしても有用である。
【００８８】
本発明のプローブは以下に記載するような当分野で周知の方法により標識し、種々の診断キットで使用することができる。
【００８９】
「ラベル」とは化合物又は組成物と特異的に結合して検出を容易にする化合物又は組成物を意味し、標識化合物又は組成物を別の分子に特異的に結合できるようにする性質の付与も含む。「標識」とは一般に共有結合を介して特異的に結合した化合物又は組成物を意味するが、非共有相互作用を利用して化合物又は組成物をラベルで標識することもできる。従って、ラベルは直接検出可能なもの即ちラベルは放射性同位体（例えば^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）又は蛍光もしくは燐光分子（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド燐光体）でもよいし、間接検出可能なもの即ち酵素活性（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）又は別の分子（例えばストレプトアビジン、ビオチン、抗原、エピトープ又は抗体）とのその結合能でもよい。ラベルの組込みは種々の手段により行うことができ、即ちポリメラーゼ媒介プライマー伸長反応で放射性標識又はビオチン化ヌクレオチドを使用したり、組換え発現もしくは合成手段によるエピトープタグ法、又は抗体との結合により行うことができる。
【００９０】
ラベルは直接結合してもよいし、立体障害を減らすように種々の長さのスペーサーアームを介して結合してもよい。本発明の目的には多様な標識試薬の任意のものを使用することができる。例えば、１種以上の標識ヌクレオシド三リン酸、プライマー、リンカー又はプローブを使用することができる。免疫蛍光分析技術については参考資料として本明細書に組込むＤｅＬｕｃａ，“ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ”，ｉｎＡｎｔｉｂｏｄｙＡｓａＴｏｏｌ，Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｃｓら編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ｐｐ．１８９−２３１（１９８２）に記載されている。
【００９１】
ラベルなる用語は標識分子に特異的に結合できる「タグ」を意味する場合もある。例えば、ビオチンをタグとして使用する場合には、タグに結合するためにアビジン化又はストレプトアビジン化西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用し、発色基質（例えばテトラメチルベンズアミン）を使用してＨＲＰの存在を検出することができる。同様に、タグはエピトープ又は抗原（例えばジゴキシゲニン）でもよいし、酵素、蛍光又は放射性標識抗体を使用してタグに結合してもよい。
【００９２】
本発明の１態様では、本明細書に開示する本発明のペプチドをコードするｃＤＮＡは配列番号１と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。本発明の蛋白質をコードする好適ｃＤＮＡ分子は配列番号１と同一のヌクレオチド配列、好ましくは本明細書に記載するコーディング領域を含む。
【００９３】
本発明の別の態様は配列番号２又は３と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする参照ヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列をもつ核酸に関する。
【００９４】
ハイブリダイゼーションとは染色体ＤＮＡに天然に存在する結合に類似する水素結合を介して核酸の相補鎖（即ちセンス：アンチセンス鎖又はプローブ：ターゲットＤＮＡ）が相互に結合することを意味する。所定プローブをターゲットＤＮＡとハイブリダイズするために使用するストリンジェンシーレベルは当業者が容易に変えることができる。
【００９５】
本明細書において「ストリンジェントハイブリダイゼーション」なる用語はポリ核酸ハイブリッドが安定な条件を表すために使用する。当業者に公知の通り、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融点（Ｔ_ｍ）で表される。Ｔ_ｍは式：
８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ
（式中、ｌはハイブリッドのヌクレオチド長である）により概算することができる。Ｔ_ｍは配列相同度が１％減る毎に約１〜１．５℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度と温度に依存する。一般に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーション反応を実施した後に、より高い別のストリンジェンシーで洗浄する。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーとはこのような洗浄条件を言う。
【００９６】
本明細書で使用する「中等ストリンジェントハイブリダイゼーション」なる用語はターゲットＤＮＡと約６０％、好ましくは約７５％、より好ましくは約８５％の一致度をもつ相補的核酸とターゲットＤＮＡを結合させることができる条件を意味し、ターゲットＤＮＡとの一致度が約９０％を上回ることが特に好ましい。中等ストリンジェント条件は４２℃で５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション後に６５℃で０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで洗浄するのに等価の条件である。
【００９７】
「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」なる用語は６５℃の０．０１８ＭＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する（即ち本明細書ではハイブリッドが６５℃の０．０１８ＭＮａＣｌ中で不安定ならば高ストリンジェンシー条件下で不安定であるとみなす）。高ストリンジェンシー条件は例えば４２℃で５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション後に６５℃で０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで洗浄することにより提供することができる。
【００９８】
「低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」なる用語は４２℃で１０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション後に５０℃で１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで洗浄するのに等価の条件を意味する。
【００９９】
Ｄｅｎｈａｒｔ溶液とＳＳＰＥ（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９参照）は他の適当なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に当業者に周知である。例えば、ＳＳＰＥはｐＨ７．４リン酸緩衝液、０．１８ＭＮａＣｌである。ＳＳＰＥは例えばＮａＣｌ１７５．３ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４２７．６ｇ及びＥＤＴＡ７．４ｇを水８００ｍｌに溶かし、ｐＨを７．４に調整した後に水を加えて１リットルとすることにより２０倍ストック溶液として調製することができる。Ｄｅｎｈａｒｔ溶液（例えばＤｅｎｈａｒｔ（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３：６４１参照）は例えばＦｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ４００，ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩＮＣ．，ＰｉｓｃａｔａｗａｙＮ．Ｊ．）５ｇとポリビニルピロリドン５ｇとウシ血清アルブミン（フラクションＶ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．ＬｏｕｉｓＭｏ．）５ｇを混合した後に水を加えて５００ｍｌとし、粒状物を濾去することにより５０倍ストック溶液として調製することができる。
【０１００】
本発明のポリペプチドをコードする好適核酸は中等ストリンジェント、好ましくは高ストリンジェンシー条件下で配列番号１に記載の核酸配列の実質的に完全配列又は実質的部分（即ち一般に少なくとも１５〜３０ヌクレオチド）とハイブリダイズする。
【０１０１】
本発明の核酸は当分野で周知の種々の方法により生産することができ、例えば配列番号１の種々の領域に由来するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅等を利用して本明細書に記載する方法により生産することができる。
【０１０２】
本明細書で使用する「発現」とはポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド又は蛋白質に翻訳されるプロセスを意味する。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合には、適切な真核宿主細胞又は生物を選択するならば発現はｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。
【０１０３】
本発明のポリペプチドの作製手段の１例は当分野で周知の方法を使用して細菌細胞等の適当な宿主細胞で本発明のポリペプチドをコードする核酸を発現させ、発現されたポリペプチドを同じく周知方法で回収する。本発明のポリペプチドは本発明のペプチド又はそのフラグメント／部分をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換させた細胞から直接単離することができる。
【０１０４】
クローニングしたＤＮＡを適当な発現ベクターに組込み、各々１個以上の別個遺伝子をコードするプラスミドベクターもしくはプラスミドベクター組合せ又は直鎖ＤＮＡを真核細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を選択する方法は当分野で周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ参照）。本発明の核酸構築物を含む発現ベクターを宿主細胞に導入（形質導入）し、形質導入した組換え細胞（即ち組換え異種核酸を含む細胞）を生産するのに適した手段は当分野で周知である（例えば各々参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込むＦｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２参照）。
【０１０５】
形質導入法の例としては例えばウイルスベクターを利用した感染（例えば米国特許第４，４０５，７１２号及び４，５６０，７６４号参照）、リン酸カルシウムトランスフェクション（米国特許第４，３９９，２１６号及び４，６３４，６６５号参照）、デキストラン硫酸トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション（例えば米国特許第４，３９４，４４８号及び４，６１９，７９４号参照）、サイトフェクション、粒子ビーズボンバードメント等が挙げられる。異種核酸は場合によりその染色体外（即ちエピソーム）維持を可能にする配列を含んでいてもよいし、異種核酸は宿主のゲノムに組込まれる供与核酸でもよい。その後、ＤＮＡによりコードされる本発明のペプチドを発現させる条件下で組換え細胞を培養することができる。好適細胞としては哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３、ＣＨＯ及びＬｔｋ−細胞）、酵母細胞（例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ等のメチロトローフ酵母細胞）、細菌細胞（例えば大腸菌）等が挙げられる。
【０１０６】
適当な発現ベクターは当分野で周知であり、該当ＤＮＡの発現を調節することが可能なプロモーター領域等の調節配列に機能的に連結したＤＮＡを発現させることが可能なベクターが挙げられる。従って、発現ベクターとは適当な宿主細胞に導入すると、挿入したＤＮＡを発現させる組換えＤＮＡ又はＲＮＡ構築物（例えばプラスミド、ファージ、組換えウイルス又は他のベクター）を意味する。適当な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞及び／又は原核細胞で複製可能なものや、エピソームに維持されるものや、宿主細胞ゲノムに組込まれるものが挙げられる。
【０１０７】
真核及び／又は原核発現ベクターの例としてはｐＳＶ−２ｇｐｔ系（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１０８−１１４）、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ系（Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，２：１６１−１７０）、ＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅにより記載された発現クローニングベクター（１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：８１０−８１５）及び種々の市販プラスミドベクター（例えばｐＵＣやｐＢＣ）等の真核カセットが挙げられる。これらのプラスミドベクターは各々本発明の目的蛋白質の発現を促進することが可能である。
【０１０８】
本明細書で使用する「異種又は外来ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ」は同義に使用し、該当ＤＮＡ又はＲＮＡが存在している細胞のゲノムの部分として天然に存在しないＤＮＡもしくはＲＮＡ又は天然に存在するものとは異なるゲノムの位置に存在するＤＮＡもしくはＲＮＡを意味する。一般に、異種又は外来ＤＮＡ及びＲＮＡとは宿主細胞に内在せず、人工的に細胞に導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。異種ＤＮＡの例としては本発明のペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
【０１０９】
好適態様では、ＤＮＡをベクターにライゲートし、本発明のペプチド又はそのフラグメントを発現する形質転換細胞系を生産するのに適した宿主細胞に導入する。その後、得られた細胞系を大量に生産し、受容体機能に及ぼす薬剤の効果を再現可能に定量分析できる。
【０１１０】
他の態様では、本発明のペプチドをコードするＤＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ転写によりｍＲＮＡを生産することができる。このｍＲＮＡをその後、アフリカツメガエル卵母細胞に注入すると、ＲＮＡは本発明のペプチドの合成を誘導する。あるいは、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを卵母細胞に直接注入し、本発明の機能的ペプチドを発現させることもできる。トランスフェクトした哺乳動物細胞又は注入した卵母細胞はその後、本明細書に記載する薬剤スクリーニング法で使用することができる。
【０１１１】
ＤＮＡ又はＲＮＡを導入することができる真核細胞としてはこのようなＤＮＡ又はＲＮＡをトランスフェクトすることが可能であるかあるいは前記ＤＮＡ又はＲＮＡを注入可能な任意細胞が挙げられる。好適細胞は一過的又は安定的にトランスフェクトできると共にＤＮＡとＲＮＡを発現する細胞である。本発明の最も好適な細胞は異種ＤＮＡによりコードされる組換え又は異種ウラシル輸送体蛋白質又はウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素を発現することができる細胞である。このような細胞は経験的に識別することもできるし、トランスフェクト又は注入が容易であることが知られている細胞から選択してもよい。
【０１１２】
ＤＮＡを導入する細胞の例としては哺乳動物由来細胞（例えばＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎細胞、アフリカミドリザル細胞及び当業者に公知の他の類似細胞）、両生類細胞（例えばアフリカツメガエル卵母細胞）、酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）等が挙げられる。注入したＲＮＡ転写産物を発現させる細胞の例としてはアフリカツメガエル卵母細胞が挙げられる。ＤＮＡのトランスフェクションに好適な細胞は当業者に公知であるか又は経験的に識別することができ、ＨＥＫ２９３、Ｌｔｋ−細胞、ＣＯＳ細胞及びＤＧ４４細胞（ｄｈｒｆ⁻ＣＨＯ細胞；例えばＵｒｌａｕｂら（１９８６）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５参照）が挙げられる。本明細書に記載する本発明のペプチドをコードするＤＮＡを発現させるための他の哺乳動物発現系（市販系や当業者に公知の他の類似系を含む）も好適である。
【０１１３】
当分野で公知の方法を使用して核酸分子を細胞に安定的に組込むか又は一過的に導入することができる。選択マーカー遺伝子（例えばチミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性等の遺伝子）をもつ発現ベクターを細胞にトランスフェクトし、マーカー遺伝子を発現する細胞に選択的な条件下にトランスフェクト細胞を増殖させることにより、安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞を作製することができる。このような細胞を生産するためには、異種ＤＮＡによりコードされる本発明のペプチドを形成するために十分な濃度の本発明のペプチドをコードする核酸を細胞にトランスフェクトすべきである。本発明のペプチドをコードするＤＮＡの厳密な量と割合は経験的に決定し、特定細胞及びアッセイ条件に合わせて最適化することができる。
【０１１４】
異種ＤＮＡはエピソームエレメントとして細胞に維持してもよいし、細胞の染色体ＤＮＡに組込んでもよい。その後、得られた組換え細胞を培養するか又はこのような培養物もしくはその継代培養物から継代培養することができる。トランスフェクション、注入及び組換え細胞の培養方法は当業者に公知である。同様に、当業者に公知の蛋白質精製法を使用して本発明のペプチドを精製することができる。例えば、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体又は他のリガンドを使用して本発明のペプチドをアフィニティー精製することができる。
【０１１５】
上記に従い、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトする。ノーザンブロット又はスロットブロット分析等の方法を使用し、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを含むトランスフェクト細胞を選択することができる。トランスフェクト細胞を分析し、本発明のペプチドを発現する細胞を識別することもできる。ｕｒａＡによりコードされる蛋白質については、例えばその結合パートナー即ち細菌ウラシル輸送体蛋白質に対して免疫反応性の抗体との細胞の結合能を測定することにより分析を実施することができる。
【０１１６】
本明細書で使用する本発明のペプチドの活性とはネズミチフス菌に由来するウラシル輸送体蛋白質又はウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの特徴を表す任意活性を意味する。このような活性は例えば放射性標識ウラシル取込み（ウラシル輸送活性）を測定するアッセイや、ガスクロマトグラフィー／質量分析によるウラシルとウリジンの直接測定（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼによるウラシル−ウリジン変換）等の当業者に公知の任意方法により測定することができる。
【０１１７】
本発明のペプチド、生物学的に活性なフラグメント及びその機能的等価物は化学的合成により生産することもできる。例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ４３０Ａ又は４３１Ａ自動ペプチド合成機（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を使用し、製造業者により記載されている化学反応を利用して合成ポリペプチドを生産することができる。
【０１１８】
ｍＲＮＡの翻訳を阻止するように本発明のペプチドの任意の一つをコードするｍＲＮＡの任意部分と特異的に結合することが可能なヌクレオチド配列をもつアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの配列の任意部分と特異的に結合することが可能な配列をもつことができる。
【０１１９】
本発明の更に別の態様によると、本発明のペプチドに対する抗体即ち本発明のペプチドのいずれかに対して特異的親和性をもつウラシル輸送体蛋白質又はウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ特異抗体も提供される。抗体の活性フラグメントも「抗体」の定義に含む。
【０１２０】
このような抗体は本発明のポリペプチド、蛋白質又はその部分を抗原として使用して当分野で公知の方法により生産することができる。例えば、参考資料として本明細書に組込むＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｂｏｒｙ（１９８８））に記載されているような当分野で周知の方法によりポリクローナル及びモノクローナル抗体を生産することができる。このような抗体を作製する際に本発明のポリペプチドを免疫原として使用することができる。あるいは、（市販合成機を使用して）合成ペプチドを作製し、免疫原として使用することもできる。当分野で周知の方法によりアミノ酸配列を分析し、対応するポリペプチドの疎水性又は親水性ドメインをコードするか否かを調べることができる。キメラ、ヒト化、ＣＤＲ−グラフト又は二官能性抗体等の改変抗体も当分野で周知の方法により生産することができる。このような抗体も例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，前出及びＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，前出に記載のハイブリドーマ、化学合成又は組換え法により生産することができる。抗ペプチド及び抗融合蛋白質抗体のどちらも使用することができる（例えば参考資料として本明細書に組込むＢａｈｏｕｔｈら，ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２：３３８（１９９１）；Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）参照）。
【０１２１】
こうして生産した抗体を特に診断法及びシステムで使用し、試料中に存在する本発明のペプチドの濃度を検出することができる。
【０１２２】
このような抗体は本発明のポリペプチドの免疫アフィニティー又はアフィニティークロマトグラフィー精製に使用することもできる。更に、細胞表面における本発明のポリペプチドの存在の検出方法も本発明に含まれ、本方法は抗体を少なくとも１種の本発明のポリペプチドに結合させる条件下で前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体と細胞を接触させ、細胞に結合した抗体の存在を検出することにより細胞表面における本発明のポリペプチドの存在を検出する。このようなポリペプチドの検出に関連して、ｉｎｖｉｔｒｏ診断又はｉｎｖｉｖｏイメージング法に抗体を使用することができる。
【０１２３】
試料中の本発明のポリペプチドのｉｎｖｉｔｒｏ検出に有用な免疫学的方法としては、検出可能な抗体を利用するイムノアッセイが挙げられる。このようなイムノアッセイとしては例えば当分野で周知のＥＬＩＳＡ、Ｐａｎｄｅｘマイクロフルオロメトリーアッセイ、凝集アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイ及び免疫組織化学染色法が挙げられる。当分野で周知の種々の手段により抗体を検出可能にすることができる。例えば、検出可能なマーカーを抗体に直接又は間接的に結合することができる。有用なマーカーとしては例えば放射性核種、酵素、蛍光原、色素及び化学発光ラベルが挙げられる。
【０１２４】
本発明のペプチドの「免疫学的活性フラグメント」も本発明に含まれる。このようなフラグメントはターゲット免疫系（例えばマウス又はウサギ）で本明細書に開示する本発明の２種のペプチドのいずれかに特異的な抗体を生成することが可能であるか又はウラシル輸送体もしくはウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ特異抗体との結合を天然ペプチドと競合することが可能な蛋白質であり、従って、例えば生体試料中のヒトオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの存在のイムノアッセイに有用である。
【０１２５】
本発明の核酸、オリゴヌクレオチド（アンチセンスを含む）、これらを含むベクター、形質転換宿主細胞、ポリペプチド及びその組合せ並びに本発明の抗体を使用して化合物をｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングし、化合物が本発明のペプチドの潜在的アゴニスト又はアンタゴニストとして機能するか否かを調べることができる。
【０１２６】
本発明の別の態様によると、適当なパッケージング材料中に少なくとも１種の本発明の核酸を含む好ましくはキット形態の診断システムが提供される。診断用核酸は本明細書に記載する本発明のペプチドをコードする核酸に由来する。１態様では、例えば診断用核酸は配列番号１に由来する。別の態様では、核酸は本明細書に記載するコーディング領域に由来する。本発明の診断システムは本発明のペプチドをコードするゲノムＤＮＡ又は転写核酸（例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）における本発明のペプチドをコードする核酸の有無をアッセイするのに有用である。
【０１２７】
利用可能な診断システムは少なくとも１回のアッセイに十分な量の個別にパッケージした化学試薬として少なくとも１種の本発明の核酸、好ましくは２種以上の本発明の核酸を含む。一般にパッケージした試薬の使用説明書も含む。当業者は本明細書に記載するような本発明の方法を実施するのに適した緩衝液及び溶液と共に本発明の核酸プローブ及び／又はプライマーを適切なキット形態に容易に組込むことができる。
【０１２８】
別の側面では、本明細書に開示する本発明の核酸は外生及び内生化合物の変異原性能を調べるためにネズミチフス菌における微生物フォワード突然変異アッセイで有用である。アッセイは、両酵素の基質である５−フルオロウラシルの毒性作用に対する耐性により選択可能な、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ又はウラシル輸送体遺伝子の突然変異としてスコアすることができる。この微生物突然変異アッセイは試験化合物の高スループットスクリーニングに適した簡便で迅速な突然変異アッセイを提供することができる。
【０１２９】
現在利用可能な化学療法計画が殆どの種類の癌を治癒できない原因は主に薬剤耐性にある。有意義なことに、化学療法剤代謝拮抗剤である５−フルオロウラシルは主にピリミジン生合成の経路で主要段階を阻害する。簡単に言うと、これらの経路の阻害はＤＮＡの構成ブロックの欠乏に続いてＤＮＡ合成の阻害を招き、細胞型に応じて迅速又は最終的にＤＮＡ鎖切断を誘導する。５−フルオロウラシルの詳細な作用メカニズムはＫｉｎｓｅｌｌら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７５：９３５−９４５とその引用文献に既に広く記載されている。
【０１３０】
上記の結果として、本発明は５−フルオロウラシル等の代謝拮抗剤治療に対する癌細胞の感受性を改善するための方法を提供する。実際に、本発明の１態様は抗癌剤の治療効力の改善方法に関し、本方法は前記抗癌剤治療に対して前記細胞を感作するために十分な治療的に有効な量の配列番号１の核酸分子、好ましくは配列番号２の蛋白質であるウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質又は実質的に類似配列又はその変異体をコードするコーディング領域を抗癌剤治療に反応性の細胞即ち膀胱癌細胞にトランスフェクトする。
【０１３１】
抗癌剤は５−フルオロウラシル又は配列番号２の蛋白質をコードする本明細書に開示するヌクレオチド配列の作用を受けて代謝産物を介して非毒性物質に変換することが可能な他の任意の物質とすることができる。
【０１３２】
同様に、本発明の別の態様は５−フルオロウラシル治療に反応性の病態（例えば膀胱癌等）を緩和するように設計された治療計画の進行の追跡方法を提供し、配列番号２の蛋白質をコードする核酸分子による治療（細胞トランスフェクション）の前後に癌細胞試料をアッセイし、配列番号１、好ましくはウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするコーディング領域の遺伝子産物による５−フルオロウラシルの活性化の結果である活性化／非毒性代謝産物即ち５−フルオロウリジン５’一リン酸の濃度を比較する。これを経時的におこなって比較する。
【０１３３】
一般に、代謝産物の生産レベルの経時的増加が治療プロトコールの効力を示す。換言するならば、配列番号１、好ましくは配列番号２の蛋白質をコードする配列番号１のコーディング部分、特にヌクレオチド２１５〜８４１又はこれに実質的に類似する配列番号を細胞にトランスフェクトした後に代謝産物濃度が経時的に増加するならば、遺伝子治療法は抗癌剤治療に対して細胞を感作するのに成功し、従って患者に有益であることを示唆している。
【０１３４】
以上、添付図面を参考に本発明の好適態様について説明したが、当然のことながら本発明はこれらの厳密な態様に制限されず、特許請求の範囲に記載する本発明の範囲又は趣旨から逸脱せずに当業者は種々の変更及び変形を加えることが可能である。
【実施例１】
【０１３５】
ネズミチフス菌からウラシル輸送体蛋白質をコードするＤＮＡとウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質をコードするＤＮＡの単離
まずＱｉａｇｅｎＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（カタログ番号６９５０４）を製造業者により記載されているように使用してネズミチフス菌ＴＡ１００からゲノムＤＮＡを得た。まずＳａｌｍｏｎｅｌｌａＵＰＰ遺伝子を単離しようとして既知大腸菌ＵＰＲＴ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＸ５７１０４）の両側のＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーは大腸菌配列と相同であり（フォワード：５’−ＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＧＧ３’；リバース：５’ＡＡＡＡＧＣＣＧＡＣＴＣＴＴＡＡＡＧＴＣＧＧＣＴＴ３’）、数回試みたが、精製ゲノムＤＮＡからＳａｌｍｏｎｅｌｌａＵＰＰ遺伝子を増幅できないことがわかった。次に、大腸菌ＵＰＰ遺伝子をヌクレオチドＢＬＡＳＴ検索エンジン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）に入力した処、ｐｕｒＮ及びｐｕｒＩ遺伝子配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎＵ６８７６５．１）についてＳａｌｍｏｎｅｌｌａＧｅｎＢａｎｋサブミッションの小部分と８８％相同を示した。大腸菌ＵＰＰの約５０％がこのＳａｌｍｏｎｅｌｌａｐｕｒＮ及びｐｕｒＩ配列の末端に存在していた。ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＵＰＰ配列の前半を大腸菌ＵＰＰ配列の後半と整列させることにより、仮想ＵＰＰハイブリッドを構築した。次にフォワードプライマーがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ配列（フォワード１：５’ＴＴＴＧＴＧＧＴＴＧＣＣＡＧＴＣＡＴＣＴＧＡＧＧ３’；フォワード２：５’ＡＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＧＴＧＴＴＧ３’；フォワード３：５’ＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＧＧＴＴＴＡＣＧＡＣ３’）と相同となり、数個のリバースプライマーが大腸菌配列（リバース１：５’ＣＴＧＧＡＴＣＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴ３’；リバース２：５’ＡＴＡＡＧＣＣＧＧＡＡＴＴＴＴＣＣＣＴＴＴ３’；リバース３：５’ＣＣＣＣＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＣＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡ３’）と相同になるようにＰＣＲプライマーを設計した。これらの大腸菌プライマーはＳａｌｍｏｎｅｌｌａでホモポリマー重合をプライミングして十分にＰＣＲ増幅できるように設計した。ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＴＡ１００から増幅して予想寸法のＰＣＲ産物が得られ、その後、配列決定した処、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＵＰＰヌクレオチド配列であることが判明した。異なる資源から３種のＴＡ１００培養物を得、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＵＰＰ遺伝子を増幅し、配列決定してＤＮＡ配列を確認した。ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＵＰＰ配列は大腸菌配列とヌクレオチドレベルで８８％相同、アミノ酸レベルで９９％相同を示した。
【０１３６】
次に、同様のアプローチを使用してＳａｌｍｏｎｅｌｌａｕｒａＡ配列を配列決定した。まず、大腸菌ｕｒａＡ配列をＧｅｎＢａｎｋ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎＡＥ０００３３６Ｕ０００９６）から得た。驚くべきことに、大腸菌ＵＰＰはｕｒａＡ開始コドンから８６ヌクレオチド上流に位置することが分かった。従来決定されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａＵＰＰヌクレオチド配列では、ＵＰＰ停止コドンから下流の約８００ヌクレオチドが決定され、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｕｒａＡ遺伝子の約半分であった。決定されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ配列（フォワード１：５’ＡＡＡＣＣＡＣＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＣＡＣＡＣＴＴＡＧ３’；フォワード２：５’ＣＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＴＣＣＧＴＡＣＴＧＴ３’）と相同となるようにＳａｌｍｏｎｅｌｌａフォワードＰＣＲプライマーを設計した後、十分ＰＣＲ増幅できるような所定相同性レベルの検出を期待してホモポリマー重合を開始するように大腸菌リバースＰＣＲプライマーを設計した（リバース１：５’ＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡ３’；リバース２：５’ＧＣＣＡＧＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＣ３’；リバース３：５’ＣＧＧＡＡＣＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＧＴＴＴ３’）。ＰＣＲ増幅は次のように実施した。９４℃で２分後に、９４℃で１５秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分間を３２サイクル行い、最後に７２℃で３分間伸長した。増幅は成功し、その後、ＰＣＲ産物を配列決定した処、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｕｒａＡヌクレオチド配列が判明した。ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｕｒａＡ遺伝子を増幅し、３個の独立培養物から配列決定し、コンセンサスＤＮＡ配列を得た。ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｕｒａＡ配列は大腸菌配列とヌクレオチドレベルで８２％相同、アミノ酸レベルで９３％相同であった。
【０１３７】
ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＵＰＰ及びｕｒａＡ核酸の決定後、数個のＦＵ耐性クローンを単離し、ゲノムＤＮＡを配列決定し、ＦＵ耐性生化学経路におけるその役割を確認した。ゲノムＤＮＡをＦＵ耐性クローンから単離し、ＵＰＰ及びｕｒａＡ遺伝子の両者をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を配列決定した。分析した全クローンはＵＰＰ遺伝子に分子欠損があり、いずれも蛋白質のアミノ酸配列が改変しており、ＵＰＰが主にＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおけるＦＵ耐性に関与していることが確認された。
【０１３８】
以上、所定の好適態様について本発明を詳細に説明したが、当然のことながら、各種変更及び変形も明細書及び特許請求の範囲に記載する発明の趣旨と範囲に含むものとする。
【０１３９】
配列の要約
配列番号１はネズミチフス菌に由来するウラシル輸送体蛋白質（ｕｒａＡ蛋白質）とウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質（ＵＰＰ／ＵＰＲＴ）をコードする２５２０ヌクレオチドの複合ヌクレオチド配列である。ｕｒａＡのコーディング部分はヌクレオチド９２９〜２２１８により定義され、ＵＰＲＴ遺伝子のコーディング領域はヌクレオチド２１５〜８４１により定義される。
【０１４０】
配列番号２はウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質の推定アミノ酸配列である。
【０１４１】
配列番号３はウラシル輸送体蛋白質の推定アミノ酸配である。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】いずれもネズミチフス菌に由来する本発明のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼと本発明のウラシル輸送体蛋白質の各々をコードするヌクレオチド配列を含む複合核酸配列（ＤＮＡ）を示す。
【図２】ネズミチフス菌に由来し、図１に示すヌクレオチド配列によりコードされるウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図３】ネズミチフス菌に由来し、図１に示すヌクレオチド配列によりコードされるウラシル輸送体蛋白質のアミノ酸配列を示す。

Claims

細菌源に由来するウラシル輸送体蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むウラシル輸送体蛋白質をコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）ウラシル輸送体蛋白質をコードし、配列番号１に記載のヌクレオチド配列の相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、ＤＮＡである場合にはその単離源である細菌株に内在するｍＲＮＡと完全に相補的であり、ＲＮＡである場合にはこれに一致するヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をもつ蛋白質をコードするヌクレオチド配列、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のウラシル輸送体蛋白質をコードする配列に対するヌクレオチド縮重配列から構成される群から選択される前記単離核酸分子。
細菌源に由来するウラシル輸送体蛋白質のスプライス変異体をコードするコーディング領域を含む単離核酸分子であって、ウラシル輸送体蛋白質が配列番号１に記載のヌクレオチド配列によりコードされる前記単離核酸分子。
単離核酸分子がゲノムＤＮＡである請求項１に記載の単離核酸分子。
前記単離核酸分子がｍＲＮＡである請求項１に記載の単離核酸分子。
前記単離核酸分子がｃＤＮＡである請求項１に記載の単離核酸分子。
配列番号３に記載のアミノ酸配列をもつウラシル輸送体蛋白質をコードする単離核酸分子。
細菌源に由来するウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質をコードするヌクレオチド配列又はそのコーディング部分、
（ｂ）ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質をコードし、配列番号１に記載のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするコーディング領域により規定されるヌクレオチド配列の相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、ＤＮＡである場合にはその単離源である細菌株に内在するｍＲＮＡと完全に相補的であり、ＲＮＡである場合にはこれに一致するヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質をコードする配列に対するヌクレオチド縮重配列から構成される群から選択される前記単離核酸分子。
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質をコードする単離核酸分子のスプライス変異体であるヌクレオチド配列によりコードされる実質的に純粋なポリペプチド。
配列番号２又は３の一方に記載のアミノ酸配列を含む実質的に純粋なポリペプチド。
前記ポリペプチドが配列番号２に記載のアミノ酸配列から構成される請求項９に記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドが配列番号３に記載のアミノ酸配列から構成される請求項９に記載のポリペプチド。
宿主細胞における核酸分子の発現を調節する調節ヌクレオチド配列に機能的に連結した請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
宿主細胞における核酸分子の発現を調節する調節ヌクレオチド配列に機能的に連結した請求項７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
請求項１に記載の核酸分子で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞。
請求項７に記載の核酸分子で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞。
細菌由来ウラシル輸送体蛋白質をコードするＤＮＡ配列の同定方法であって、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む標識プローブでｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーを探査する段階と、プローブに対して有意相同度をもつ配列をライブラリーから回収する段階を含む前記方法。
細菌由来ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質をコードするＤＮＡ配列の同定方法であって、配列番号２の蛋白質をコードするコーディング領域により規定されるヌクレオチド配列を含む標識プローブでｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーを探査する段階と、プローブに対して有意相同度をもつ配列をライブラリーから回収する段階を含む前記方法。
ウラシル輸送体蛋白質の同定方法であって、
（ａ）請求項１に記載の核酸分子を真核細胞に導入する段階と、
（ｂ）導入した核酸分子によりコードされるポリペプチドにより媒介されるヌクレオシド輸送体活性を段階（ａ）の細胞で検出する段階を含む前記方法。
生体試料中のウラシル輸送体蛋白質メッセンジャーＲＮＡの検出方法であって、
（ａ）配列番号１に記載の核酸配列と前記メッセンジャーＲＮＡの複合体を形成させる条件下で前記核酸配列の全部又は一部を生体試料と接触させる段階と、
（ｂ）前記複合体を検出する段階と、
（ｃ）前記メッセンジャーＲＮＡのレベルを測定する段階を含む前記方法。
生体試料中のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質メッセンジャーＲＮＡの検出方法であって、
（ａ）配列番号１に記載の核酸配列と前記メッセンジャーＲＮＡの複合体を形成させる条件下で前記核酸配列の全部又は一部を生体試料と接触させる段階と、
（ｂ）前記複合体を検出する段階と、
（ｃ）前記メッセンジャーＲＮＡのレベルを測定する段階を含む前記方法。
段階１の核酸配列が配列番号１のヌクレオチド２１５〜８４１の領域をコードするウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質により規定される請求項２０に記載の方法。
生体試料中のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ蛋白質の検出方法であって、（ｉ）プローブ／遺伝子産物複合体の形成を助長する条件下で請求項７に記載の単離核酸分子の遺伝子産物に特異的な検出可能なプローブと前記蛋白質を含む疑いのある試料を接触させる段階と、（ｉｉ）前記複合体を検出する段階を含む前記方法。
プローブが抗体である請求項２２に記載の方法。
前記抗体が放射性ラベル又は酵素で標識されている請求項２３に記載の方法。
配列番号１に記載のヌクレオチド配列に相補的なアンチセンス配列をコードし、細胞における前記ヌクレオチド配列の遺伝子産物の翻訳を阻害するオリゴヌクレオチドであって、遺伝子産物が配列番号３に記載のウラシル輸送体蛋白質又は配列番号２に記載のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの一方である前記オリゴヌクレオチド。
抗癌剤の治療効力の改善方法であって、前記抗癌剤治療に対して前記細胞を感作するために十分な治療的に有効な量の請求項７に記載の核酸分子を前記抗癌剤治療に反応性の細胞にトランスフェクトする段階を含む前記方法。
前記抗癌剤が５−フルオロウラシルである請求項２６に記載の方法。
５−フルオロウラシル治療に反応性の病態を緩和するように設計された治療計画の進行の追跡方法であって、
（ａ）請求項７に記載の核酸分子の遺伝子産物である５−フルオロウラシル変換酵素による治療後に対象からの細胞試料をアッセイし、前記遺伝子産物による前記５−フルオロウラシルの活性化に起因する５−フルオロウリジン５’一リン酸のレベルを第１の時点で定量する段階と、
（ｂ）５−フルオロウリジン５’一リン酸のレベルを第２の時点で定量する段階と、
（ｃ）治療計画の効果の判定として（ａ）で測定したレベルと第２の時点の前記レベルを比較する段階を含む前記方法。
請求項１に記載の核酸分子又はその相補鎖を含むプローブ。
検出可能なマーカーで標識した請求項２９に記載のプローブ。
請求項１に記載の核酸分子の遺伝子産物と結合することが可能な化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）組換え核酸から配列番号２に記載のアミノ酸を含むポリペプチドを発現させる段階と、
（ｂ）１種以上の試験化合物を含む試験調製物を前記ポリペプチドに加える段階と、
（ｃ）前記試験調製物が前記ポリペプチドに結合する能力を測定する段階を含む前記方法。
前記段階（ｂ）及び（ｃ）をｉｎｖｉｔｒｏで実施する請求項３１に記載の方法。
全細胞を使用して前記段階（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を実施する請求項３１に記載の方法。
請求項１又は７に記載の核酸分子の遺伝子産物に対して免疫反応性の抗体。
ポリクローナルである請求項３４に記載の抗体。
モノクローナルである請求項３４に記載の抗体。