PT1978919E - Síntese de um novo antioxidante de nitróxido e métodos de utilização em composições cosméticas e dermatológicas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "SÍNTESE DE UM NOVO ANTIOXIDANTE DE NITRÓXIDO E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO EM COMPOSIÇÕES COSMÉTICAS E DERMATOLÓGICAS"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a novos compostos fotoabsorventes-antioxidantes, métodos de síntese de compostos fotoabsorventes-antioxidantes e sua utilização em composições dermatológicas e/ou cosméticas. Além disso, a presente invenção refere-se à utilização de metoxicinamato e compostos de nitróxido para a preparação de uma composição para o tratamento dermatológico e/ou cosmético da pele.

Antecedentes

Sabe-se que entre as formas mais comuns de cancro que afectam os humanos, o cancro da pele é, sem dúvida, um dos mais comuns. Em particular, nos últimos vinte anos, a incidência do cancro da pele aumentou acentuadamente. Parte deste aumento é devido ao facto de que, para uma pessoa comum, a quantidade de tempo a que está exposta a radiação solar, natural e artificial, aumentou. Além disso, a radiação solar tornou-se menos filtrada devido às diminuições concomitantes na camada do ozono. A sobreexposição da pele a radiação solar contribuiu para o aumentado da utilização de protectores solares. No entanto, os próprios protectores solares podem estar sujeitos a reacções 1 fotolíticas induzidas pela luz, resultando na formação de espécies radicais livres que são prejudiciais para a pele saudável.

Sabe-se que o componente ultravioleta da radiação solar (raios UV) , desempenha uma função primária na indução de tumores na pele, uma vez que estes raios UV atacam directamente as células, danificando o seu ADN. Acredita-se agora que, devido à distribuição espectral dos UV solares, o componente UVA (380-315 nm) da luz do sol é a causa principal de fotoenvelhecimento e fotocarcinogénese e é muito mais eficaz que os UVB (315-280 nm) na indução de lesões peroxidativas.

Consequentemente, hoje em dia, a maioria dos produtos de cosmética para o cuidado da pele incluem filtros UVA nas suas formulações em conjunto com filtros UVB e, separadamente, incluem antioxidantes, tal como vitamina E, para desactivar os radicais livres (e. g., espécies reactivas do oxigénio (ROS), tais como superóxido, hidroxilo, óxido nítrico e peroxilo), gerados durante a exposição aos UVA.

Os protectores solares actuais deverão proporcionar e manter a sua absorvância de UV inicial e, deste modo, a protecção da pele, durante todo o período de exposição à luz solar. No entanto, nem todos os filtros UVA e UVB são suficientemente fotoestáveis. Por exemplo, ensaios in vitro simples mostram que existe uma diminuição na absorvância espectral da maioria dos filtros UV utilizados normalmente e isto está amplamente correlacionado com a peroxidação lipídica induzida por UVA aumentada. A magnitude deste efeito é afectada pelo absorvente de UV específico utilizado, quer seja utilizado sozinho ou em combinação e quer estejam outros antioxidantes presentes. O documento "Free radical biology & medicine" 2 vol. 26, n° 7/8, páginas 809-816, divulga que os radicais nitróxido na presença de dibenzoilmetano, protegem o ADN de lesões. A adição de agentes antioxidantes aos cremes de protecção solar é conhecida e em muitos casos inclui categorias de compostos, tais como vitamina E e ácido ascórbico. Outros compostos antioxidantes que foram utilizados para este objectivo incluem a classe dos radicais mono-nitróxido cíclico, tais como, por exemplo, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-l-oxilo (TEMPO) e 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-3-hidroxi-l-oxilo (TEMPOL) . Estes são ambos nitróxidos alifáticos cíclicos. Outra classe de antioxidantes inclui o bis(2,2,6,6-tetrametil-l-oxil-piperidina-4-il)sebacatonitróxido, que parece ser um foto-antioxidante mais eficiente do que a vitamina E.

Muitos cremes de cosmética contendo filtros solares ou cremes de cosmética que estão disponíveis actualmente, contêm vários agentes antioxidantes e co-formulantes. No entanto, a utilização de agentes antioxidantes num creme contendo filtros solares ou num creme para objectivos dermatológicos e/ou de cosmética têm várias complicações e desvantagens.

Uma primeira desvantagem é que uma vez aplicados na pele, alguns compostos, incluindo os antioxidantes, poderão, eles próprios serem submetidos a degradação devido aos raios solares com a consequente formação das espécies reactivas de oxigénio. Os radicais livres formados são, eles próprios, prejudiciais para a pele, células e componentes celulares, tais como lípidos, proteínas e ácidos nucleicos. Além disso, os radicais livres formados podem reagir quimicamente com outros radicais ou co-formulantes presentes no creme solar. 3

Outra desvantagem dos produtos existentes é devido ao facto de que quando o número de compostos ou agentes antioxidantes utilizados num creme de cosmética é aumentado, torna-se muito mais difícil preparar um produto no qual as características benéficas do composto são estáveis ao longo do tempo.

Ainda outra desvantagem dos produtos existentes é devido ao facto de que após aumentar o número de compostos ou agentes antioxidantes utilizados num creme de cosmética, torna-se muito difícil preparar um produto com características de compatibilidade elevada relativamente aos vários tipos de pele nos quais é para ser aplicado. Na realidade, pode acontecer que a aplicação tópica de um creme contendo um filtro solar ou um creme de cosmética, induza certas reacções alérgicas devido à composição química específica do produto.

Além disso, outra desvantagem é que aumentando o número de agentes antioxidantes activos utilizados na preparação de um creme contendo um filtro solar ou um creme de cosmética, aumentam os custos do produto final.

Deste modo, seria altamente desejável ter à disposição um novo antioxidante ou classe de compostos antioxidantes que supere estas desvantagens dos produtos e métodos utilizados actualmente. Em particular, seria desejável ter à disposição um composto protector solar hipoalergénico único que possua uma actividade de bloqueio de UV de eficácia elevada e actividade antioxidante, mas que seja também estável quimicamente ao longo do tempo. 4

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a uma nova composição química útil para a preparação de uma composição dermatológica ou cosmética para o tratamento da pele. A composição e métodos da presente invenção são adequados para melhorar a eficácia das formulações de cosmética fotoprotectoras. Deste modo, um objectivo da presente invenção é proporcionar um composto para utilização em aplicações de cosmética ou dermatológicas que demonstre uma estabilidade aumentada e eficácia aumentada na absorção de UV e eliminação de ROS. Como tal, num aspecto, a presente invenção refere-se a uma nova composição química que é surpreendentemente e inesperadamente eficaz na prevenção das lesões fotooxidativas induzidas por UV. Numa forma de realização preferida, a invenção é um novo composto químico compreendendo uma combinação de um metoxicinamato ligado a um nitróxido cíclico que demonstra actividade sinérgica inesperada (i. e., superior à actividade dos componentes respectivos na mistura) relativamente ao bloqueio dos UV e eliminação de ROS.

Outro objectivo da presente invenção é proporcionar um método para sintetizar um composto que demonstra estabilidade aumentada, absorvência de UV superior e melhor eficiência na eliminação das ROS. Um aspecto do objectivo da invenção refere-se a um método de síntese de um composto que demonstra estabilidade, absorção de UV e actividade de eliminação de ROS aumentada, que pode ser utilizado em aplicações de cosmética ou dermatológicas para o tratamento da pele. Em algumas das formas de realização referidas, os métodos compreendem ligação covalente de uma porção de absorção de UV, por exemplo, OMC (Figura 1) a uma porção de nitróxido cíclico ou fenólico, capaz de eliminar os radicais livres. Em certos aspectos, os métodos 5 da presente invenção compreendem um passo em que um grupo alquilo é removido de um metoxicinamato e substituído por uma porção nitróxido cílcico ou fenólico de eliminação das ROS.

Ainda outro objectivo da presente invenção é proporcionar um método de utilização da composição numa aplicação dermatológica ou cosmética para o tratamento da pele, por exemplo, para tratar ou prevenir lesões foto-oxidativas induzidas por UV na pele, células ou componentes celulares, por exemplo, lípidos, proteínas e ácidos nucleicos de um organismo, por exemplo, um humano. Um aspecto deste objectivo, compreende administrar uma quantidade eficaz da composição da invenção numa forma farmaceuticamente aceitável a um organismo com essa necessidade.

Em determinados aspectos, a composição da invenção pode ser administrada em conjunto com quaisquer veículos, excipientes e/ou ingredientes biologicamente activos ou inactivos farmaceuticamente aceitáveis. A administração da composição da invenção pode ser feita através de qualquer forma de dosagem adequada, incluindo, por exemplo, cremes, loções, pós, vaporizadores, géis, unguentos, uma suspensão ou emulsão, mousses, aerossóis ou qualquer outra variedade de dispositivos transdérmicos para utilização na administração contínua de fármacos sistemicamente activos, por absorção através da pele.

Os excipientes farmaceuticamente adequados incluem, por exemplo, aqueles que melhoram ou prolongam a distribuição, biodisponibilidade, absorção ou reabsorção, estabilidade em armazenamento, estabilidade, solubilidade, eficácia, viscosidade, toxicidade reduzida, melhoram o sabor ou cheiro e suas combinações. Em qualquer uma das formas de realização 6 preferidas, a composição da invenção pode, opcionalmente, incluir, por exemplo, agentes de composição farmacêutica, tais como um ou mais agentes espessantes, tais como óleos de parafina, ésteres, tais como miristato de isopropilo, etanol, óleos de silicone e óleos vegetais, agentes espessantes celulósicos, etilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, povidona, ácidos poliacrilicos, tais como carbopol, Sepigel® (poliacrilamida/isoparafina/lauret-7), as séries Gantrez® de copolímeros de éter polimetilvinilico/anidrido maleico, tais com os ésteres butilicos do copolimero PVM/MA Gantrez® A-425 e qualquer agente espessante conhecido na técnica que apresenta boa compatibilidade com líquidos voláteis; um conservante, por exemplo, ésteres de hidroxibenzoato; um glicol; água; um tensioactivo, tal com, álcoois de ácido gordo etoxilado, monoestearato de glicerol, ésteres de fosfato e outros emulsionantes e tensioactivos normalmente utilizados; um potenciador de penetração dérmica, por exemplo, salicilato de octilo ou DMSO; um agente reductor; um emulsionante; um solvente orgânico, por exemplo, um éter, um éster, um álcool ou um alcano; um triglicérido; um lípido ou fosfolípido; um óleo; uma gordura; um hidrato de carbono ou sacárido; uma proteína; um nucleótido; um lipossoma; um sal ou mineral; um extracto vegetal e semelhantes. Além disso, é também contemplado, que em qualquer uma das presentes formas de realização, a composição da invenção pode ser opcionalmente combinada com, pelo menos, um outro agente activo, incluindo outro composto de absorção de UV, um fármaco, por exemplo, uma hormona, um composto antimicrobiano, um anti-inflamatório, um antioxidante e semelhantes.

Outro objectivo da presente invenção é proporcionar um método para sintetizar uma composição cosmética e/ou 7 dermatológica que inclui, pelo menos, uma porção de absorção de UV e, pelo menos, uma porção capaz de eliminar ou reduzir uma espécie reactiva de radical livre, por exemplo, uma ROS, tal como superóxido, hidroxilo, óxido nítrico e suas combinações.

Estes, bem como outros benefícios e objectivos da presente invenção irão ser compreendidos pelos especialistas na técnica a partir da seguinte descrição detalhada e exemplos das formas de realização preferidas.

Descrição das Figuras da Invenção

Figura 1. Fórmula química dos compostos. 2-etil-hexil-4-metoxicinamato (OMC); 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-3- hidroxi-l-oxilo (TEMPOL); 2,2,6,6-tetrametil-piperidina-4- il-p-metoxicinamiloxi-l-oxilo (MC-NO). ESQUEMA 1: Exemplo do método de uma forma de realização preferida para produzir o novo composto de absorção de UV e eliminação das ROS da invenção.

Figura 2. Espectro de absorção de compostos a 50 μΜ em acetonitrilo. Como pode ser observado, o MC-NO tem o mesmo perfil espectral e coeficiente de extinção que o OMC.

Figura 3 Espectro de absorção de compostos a 100 μΜ antes (linhas grossas) e depois (linhas finas) da exposição a UVA a 275 KJ/m2. Ver Descrição Detalhada para detalhes experimentais.

Figura 4. Absorvânica de TBARS determinada em lipossomas multilamelares de PC (3,5 mM) em PBS, EDTA 0,1 mM, após exposição a UVA a 275 KJ/m2. Barra a branco = sem exposição a UVA, barra a preto = exposição a UVA, restantes barras = exposição a UVA na presença de compostos a 100 μΜ e as várias combinações na concentração mencionada acima.

Figura 5. Absorvância de TBARS determinada nos lipossomas multilamelares de PC (3,5 mM) em PBS, EDTA 0,1 mM, após exposição a UVA a 275 KJ/m2. Barra a branco = sem exposição a UVA, barra a preto = exposição a UVA, restantes barras = exposição a UVA na presença de compostos a 100 μΜ e as várias combinações na concentração mencionada acima.

Descrição das Formas de Realização Preferidas A composição da presente invenção compreende um composto eficaz para absorver energia de UV e eliminar espécies reactivas do oxigénio para a prevenção de lesões foto-oxidativas induzidas por UV na pele, células, componentes celulares, por exemplo, proteínas, lípidos, ácidos nucleicos e suas combinações. O singular composto antioxidante de absorção dos UV é surpreendentemente mais eficaz na redução de efeitos prejudiciais da radiação UV e radicais livres de oxigénio do que os seus componentes respectivos na mistura simples. Numa forma de realização preferida, a presente invenção é uma composição cosmética ou dermatológica compreendendo um composto de metoxicinamato da seguinte fórmula geral (I): 9 (I)

Grupo X

MeO em que, o grupo X compreende uma porção na categoria de um nitróxido fenólico ou cíclico, por exemplo, uma piperidina.

Numa forma de realização, o grupo X compreende uma porção de fórmula (II):

na qual Ri, R2, R3 e R4 podem ser idênticos ou diferentes, cada, independentemente, representa hidrogénio, alquilo, alcenilo, arilo, alcoxilo ou -COOR5 com R5 representando um resíduo alquilo, alcenilo, arilo ou arilalquilo; n = 0, 1; n' = 0-2; e z = -O, -C(0)0, -NH ou —C(O)NH.

Noutras formas de realização, o grupo X compreendo uma porção de fórmula (III) :

10 na qual R4, R2, R3 e R4 podem ser idênticos ou diferente, cada um independentemente, representam hidrogénio, alquilo, alcenilo, arilo, aralquilo, alcoxilo ou -COOR5 com R5 representando um resíduo alquilo, alcenilo, arilo ou arilalquilo; n = 0, 1; n' = 0-2; e z = -O, -C(0)0, -NH ou -C(0)NH.

Numa forma de realização o grupo X compreende uma porção da fórmula (IV):

na qual Ri, R2, R3 e R4 podem ser idênticos ou diferentes, cada, independentemente, representa hidrogénio, alquilo, alcenilo, arilo, aralquilo, alcoxilo ou -COOR5, com R5 representando um resíduo alquilo, alcenilo, arilo ou arilalquilo; n = 0, 1; n' é um número inteiro superior a ou igual a 1; e z = -O, -C(0)0, - NH, ou -C(0)NH.

Noutra forma de realização, o grupo X compreende uma porção da fórmula (V):

11 na qual Ri, R2, R3 e R4 podem ser idênticos ou diferentes, cada um, independentemente, representa hidrogénio, alquilo, alcenilo, arilo, aralquilo, alcoxilo ou -COOR5, com R5 representando um resíduo alquilo, alcenilo, arilo ou arilalquilo; n = 0, 1; n' é um número inteiro superior a ou igual a 1; e z = -O, -C(0)0, - NH, ou -C(O)NH.

Noutra forma de realização, o grupo X compreende uma porção da fórmula (VI):

(VI) na qual Ri, R2, R3 e R4 podem ser idênticos ou diferentes, cada, independentemente, representa hidrogénio, alquilo, alcenilo, arilo, aralquilo, alcoxilo ou -COOR5, com R5 representando um residuo alquilo, alcenilo, arilo ou arilalquilo; n = 0, 1; n' é um número inteiro superior a ou igual a 1; e z = -O, -C(0)0, - NH, ou -C(O)NH.

Noutra forma de realização, o grupo X compreende uma porção da fórmula (VII):

12 na qual R4, R2, R3 e R4 podem ser idênticos ou diferentes, cada, independentemente, representa hidrogénio, alquilo, alcenilo, arilo, aralquilo, alcoxilo ou -COOR5, com R5 representando um resíduo alquilo, alcenilo, arilo ou arilalquilo; n = 0, 1; n' é um número inteiro superior a ou igual a 1; e z = -O, -C(0)0, - NH, ou —C(O)NH.

Noutra forma de realização, o grupo X compreende uma porção da fórmula:

(VIII) na qual Ri, R2, R3 e R4 podem ser iguais ou diferentes, cada representando, independentemente, hidrogénio, alquilo, alcenilo, arilo, arilalquilo, alcoxilo ou -COOR5, com R5 representando um resíduo alquilo, alcenilo, arilo ou aralquilo.

Ainda noutra forma de realização, o grupo X compreende uma porção de fórmula (IX):

(IX) na qual Ri, R2, R3 e R4 podem ser iguais ou diferentes, cada representando, independentemente, hidrogénio, alquilo, alcenilo, 13 arilo, arilalquilo, alcoxilo ou -COOR5, com R5 representando um resíduo alquilo, alcenilo, arilo ou aralquilo.

Noutra forma de realização, o grupo X compreende uma porção da fórmula (X):

na qual Ri representa um oxigénio ou um NR2 com R2 representando um grupo alquilo, alcoxilo, arilo ou fenilo; n =1, 2, 3; e z = -0,-C(0)0, -NH ou -C(0)NH.

Noutra forma de realização, o grupo X compreende uma porção da fórmula (XI):

na qual R representa um resíduo alquilo, um fenilo ou um benzeno substituído, um resíduo benzílico ou um benzílico substituído, ou um resíduo alílico.

Noutra forma de realização, o grupo X compreende uma porção da fórmula (XII) ou (XIII): 14 Η(

Ο-

ΟΗ (Χΐιΐ) (XII) nas quais Ri ou R2 podem ser um grupo hidroxilo, um hidrogénio, um resíduo alquilo ou um alcoxilo; e n é 1.

Noutra forma de realização, o grupo X compreende uma porção da fórmula (XIV):

(XIV) na qual Ri ou R2 podem ser um grupo hidroxilo, um hidrogénio, um resíduo alquilo ou um alcoxilo; e n é um número inteiro superior a ou igual a 1.

Noutra forma de realização, o grupo X compreende uma porção da fórmula (XV):

(XV) na qual Ri ou R2 podem ser um grupo hidroxilo, um hidrogénio, um resíduo alquilo ou um alcoxilo. 15

Noutra das formas de realização preferidas, a presente invenção inclui uma composição cosmética ou dermatológica compreendendo o antioxidante de absorção de UV de qualquer uma das formas de realização preferidas da invenção com, pelo menos, um outro ingrediente activo ou inactivo.

Numa forma de realização particularmente preferida, a composição da invenção compreende uma combinação de um composto de absorção de UV, por exemplo, 2-etil-hexil-4-metoxicinamato (OMC) e um composto antioxidante, por exemplo, TEMPOL (4-hidroxi TEMPO). (Esquema 1; Figura 1). A composição resultante da invenção, 2,2,6,6-tetrametil-piperidin-4-il-p-metoxicinamiloxi-1-oxilo (MC-NO), retém o grupo 4-metoxicinamato responsável pela capacidade de absorção dos UV enquanto o grupo 2-etil-hexilo responsável pela sua viscosidade foi substituído por um nitróxido de piperidina, que tem propriedades de eliminação do radical livre. 0 novo composto pode ser considerado como um nitróxido de absorção de UV: um novo antioxidadente-protector solar. A presente invenção inclui também métodos para sintetizar um absorvente de UV-antioxidante, compreendendo os passos de combinar, pelo menos, uma porção de absorção de UV com, pelo menos, uma porção capaz de eliminar ou reduzir uma espécie reactiva do oxigénio, por exemplo uma ROS, tal como superóxido, hidroxilo, óxido nítrico e peroxilo. 0 Esquema I resume uma forma de realização dos métodos da invenção para sintetizar o absorvente de UV-antioxidante. Resumidamente, o método compreende os passos de proporcionar uma quantidade adequada de um metoxicinamato, dissolvendo-o em metanol na presença de uma quantidade catalítica de mono-hidrato de ácido 16 p-toluenossulfónico. 0 metoximetilcinamato resultante é dissolvido com quantidades estoiquiométricas de um nitróxido, por exemplo, TEMPOL, em tolueno com uma solução metanólica (8%) de metóxido de sódio. 0 produto resultante compreende uma porção metoxicinamato de absorção de UV e uma porção nitróxido antioxidante que, como aqui demonstrado, tem uma estabilidade melhorada e maior absorção de UV e eficiência na eliminação da ROS .

Em qualquer uma das formas de realização preferidas, a composição da invenção pode ser administrada em qualquer forma adequada, em conjunto com quaisquer veículos farmaceuticamente adequados, excipientes ou outros ingredientes biologicamente activos ou inactivos. As formas de dosagem adequadas incluem por exemplo, cremes, loções, pós, vaporizadores, géis, unguentos, suspensões ou emulsões, mousses, aerossóis ou qualquer um dos vários dispositivos transdérmicos para utilização na administração contínua dos agentes activos por absorção através da pele.

Os excipientes farmaceuticamente adequados incluem, por exemplo, aqueles que melhoram a distribuição, biodisponibilidade, absorção ou reabsorção, tempo de armazenamento, estabilidade, solubilidade, eficácia, viscosidade, toxicidade reduzida, melhoram o sabor ou cheiro e suas combinações. Em qualquer uma das formas de realização preferidas, a composição da invenção pode, opcionalmente, incluir, por exemplo, agentes de composição farmacêutica, tais como um ou mais agentes espessantes, tais como óleos de agentes espessantes hidroxipropilcelulose, parafina, ésteres, tais como miristato de isopropilo, etanol, óleos de silicone e óleos vegetais, celulósicos, etilcelulose, 17 hidroxipropilmetilcelulose, povidona, ácidos poliacrílicos, tais como carbopol, Sepigel® (poliacrilamida/isoparafina/lauret-7) , as séries Gantrez® dos copolímeros éter polimetilvinílico/anidrido maleico, tal como o éster butílico do copolímero PVM/MA Gantrez® A-: 425 e qualquer agente espessante conhecido na técnica que tenha boa compatibilidade com líquidos voláteis; um conservante, por exemplo, ésteres de hidroxibenzoato; um glicol; água; um tensioactivo, tal como, álcoois gordos etoxilados, monoestearato de glicerol, ésteres de fosfato e outros emulsionantes e tensioactivos normalmente utilizados; um potenciador de penetração dérmica, por exemplo, octilsalicilato; um agente de redução; um emulsionante; um solvente orgânico, por exemplo, um éter, um éster, um álcool ou um alcano; um triglicérido; um lípido ou fosfolípido; um óleo; uma gordura; um hidrato de carbono ou sacárido; uma proteína; um nucleótido; um lipossoma; um sal ou mineral; um extracto de plantas e semelhantes.

Em qualquer uma das formas de realização preferidas, o composto da invenção pode ser distribuído numa composição de cosmética ou dermatológica, em combinação com, pelo menos, outro agente activo incluindo outro composto de absorção de UV, um fármaco, por exemplo, uma hormona, um agente antimicrobiano, um anti-inflamatório, um antioxidante e semelhantes.

Entende-se que os exemplos e formas de realização aqui descritos são apenas para objectivos de ilustração e que as várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas por especialistas na técnica e estão incluídas no espírito e limite deste pedido e são consideradas como estando incluídas as reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados e na lista de 18 referências proporcionada, estão aqui incorporados por referência na sua totalidade para todos os objectivos.

Em exemplos das formas de realização preferidas, é descrita a síntese útil e vantajosa de um absorvente de UV-antioxidante. Os seguintes exemplos detalhados são apresentados a título de exemplo das formas de realização preferidas e não são, de modo algum, considerados como limitantes da invenção Por exemplo, as quantidades relativas dos ingredientes podem ser variadas, podem ser adicionados ingredientes adicionais e/ou ingredientes semelhantes podem ser substituídos por um ou mais dos ingredientes descritos.

As características e funcionalidades adicionais vantajosas associadas com os sistemas, métodos e processos da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue. As publicações e outros materiais aqui utilizados para iluminar os antecedentes da invenção e, em casos particulares, para proporcionar detalhes adicionais relativamente à prática da invenção, estão incorporados por referência e para conveniência estão listados na bibliografia em anexo.

Exemplo Ns 1 Síntese de 2,2, 6, 6-tetrametil-piperidin-4-il-p- metoxicinamiloxi-l-oxilo (MC-NO). 0 Esquema I mostra, na forma simplificada, um exemplo de uma forma de realização para os métodos da invenção para sintetizar um dos antioxidantes fotoabsorventes da invenção. Neste exemplo, são dissolvidas 0,4 mmoles de 4-metoxicinamato de 19 2-etil-hexilo (OMC) em 10 mL de metanol, na presença de uma quantidade catalítica de mono-hidrato do ácido p-toluenossulfónico. A mistura reaccional é submetida a refluxo durante cerca de 9 h, neutralizada com NaHC03 0,5 M, lavada com água e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica é seca sob Na2S04 anidro e o solvente foi removido sob pressão reduzida. É obtido um óleo branco, consistindo de p-metoximetilcinamato cristalizado após repouso. No exemplo acima, 4 mmol de OMC proporcionam cerca de 0,5 g (2,5 mmoles) de p-metoximetilcinamato.

De seguida, quantidades estoiquiométricas de TEMPOL, por exemplo, 1 mmol (172 mg) e p-metoximetilcinamato (1 mmol, 204 mg) foram dissolvidas em 5 mL de tolueno em conjunto com 0,1 mL de uma solução metanólica (8%) de metóxido de sódio. A mistura reaccional foi submetida a refluxo durante 5 h e, repetidamente lavada com água de modo a remover o TEMPOL parcialmente solúvel em água que não reagiu. A purificação por cromatografia (Si02, éter de petróleo/éter dietílico 80:20), proporcionou cerca de 230 mg (70%) de MC-NO. A Figura 2 mostra o perfil espectral das soluções a 50 μΜ de OMC e MC-NO em acetonitrilo. Como pode ser observado, o novo composto tem o mesmo perfil espectral e coeficiente de extinção que o OMC. A Figura 3 mostra o espectro de MC-NO e OMC antes e depois da exposição a UVA a 2 75 kJ/m2 em tampão e após extracção com solvente. A razão para utilizar tampão foi para manter o mesmo meio que as experiências de peroxidação, para que a comparação entre as experiencias de absorção óptica e peroxidação lipídica possam ser ter significado. 20

Como pode ser observado, existe uma forte diminuição na absorção espectral para OMC após exposição a UV. Na realidade, este filtro UVB tem demonstrado ser sensível à luz e tem sido referida uma diminuição na eficiência de absorção de UV após exposição à luz que resulta da foto-isomerização cis/trans e, possivelmente, [2 + 2] ciloadição a comprimentos de onda superiores a 300 nm. O isómero cis resultante absorve ao mesmo comprimento de onda, mas tem uma extinção reduzida, proporcionando assim valores espectrofotométricos mais baixos que podem justificar os resultados aqui observados. De um modo surpreendente, como pode ser observado na Figura 3, a diminuição na absorvância do MC-NO não é tão acentuada como a de OMC isolado, implicando que o novo composto retenha a maioria da sua absorvância original após irradiação com UVA. Parece que a presença do grupo nitróxido, inesperadamente, mas vantajosamente, estabiliza o filtro solar.

No teste descrito, a presente requerente investigou as propriedades espectrais de um novo filtro solar-antioxidante, a sua capacidade para prevenir a geração de ROS induzidos por UVA, medida como uma lesão foto-oxidativa reduzida para os lípidos e seus efeitos na presença do filtro de UVA comum, Parsol 1789.

Os resultados na peroxidação dos lípidos induzida por UVA foram obtidos por avaliação da extensão da formação de TBARS (substâncias reactivas do ácido tiobarbitúrico) que surgem, principalmente, da reacção dos produtos de clivagem dos peróxidos lipídicos, principalmente malondialdeídos (MDA) com TBA (ácido tiobarbitúrico). O MDA é, muitas vezes, o aldeído individual mais abundante cuja produção tem sugerido envolver a formação de peróxidos cíclicos e endoperóxidos que sofrem 21 fragmentação durante a peróxidação lipídica. Vários outros compostos (e. g., desoxirribose, metionina, prolina, adenosina, ADN) sob condições apropriadas, formam também complexos cor-de-rosa de TBA, no entanto, neste sistema lipossomal isolado, os TBARS podem derivar apenas da clivagem de peróxidos formados durante a peroxidação.

Sabe-se que, comparado com os UVB, os UVA geram mais stress oxidativo e a níveis observados na luz do sol, são dez vezes mais eficientes do que os UVB a provocar peroxidação lipídica que conduz a lesão da membrana plasmática. Deste modo, os efeitos do MC-NO, OMC, TEMPOL e os últimos dois combinados neste acontecimento oxidativo foi estudado in vitro utilizando lipossomas como modelos membranares. A extensão do processo oxidativo foi determinada através do método popular de avaliação dos produtos da clivagem aldeidica (TBARS) produzidos durante a peroxidação lipídica que absorvem a 535 nm, utilizando o ensaio de TBA. A Figura 4 mostra o nível de absorvância de TBARS determinada em suspensões lipossomais antes e depois da exposição aos UVA a 275 kJ/m2, na ausência e presença dos compostos testados.

Os UVA induzem um aumento 3 superior na peroxidação lipídica neste sistema experimental. 0 OMC parece proteger a peroxidação lipídica induzida por UVA, embora não absorva nos UVA, excepto para uma fracção muito pequena entre 320 e 330 nm. O seu comportamento espectral (Figura 3) mostra que existe uma diminuição na sua absorvância que não implica, necessariamente, fotoinstabilidade. O OMC sofre uma isomerização cis/trans que pode ser considerado um meio muito eficiente de dispersar a energia absorvida e isto pode explicar a protecção observada aqui: parte da energia dos UVA é atenuada por OMC, então, deste 22 modo, menos lípidos são oxidados. A presença do TEMPOL isolado inibe a peroxidação lipidica induzida por UVA em quase 60%. Isto não é devido à sua capacidade de filtração, uma vez que não absorve na gama dos UVA mas, em vez disso, a sua capacidade para reagir com ROS induzida pela exposição aos UVA. Com a combinação OMC/TEMPOL, a redução no nivel de TBARS é a mesma que a observada com TEMPOL. No entanto, nas amostras contendo o novo composto MC-NO, o nivel de peroxidação lipidica é muito reduzido, quase para níveis de controlo (controlo não iluminado) e isto pode ser devido ao facto de que o composto é mais fotoestável, como observado na Figura 2, deste modo, a sua capacidade protectora será aumentada em adição ao facto de que elimina os radicais livres induzidos pelos UVA. É de salientar o facto de que 100 μΜ de MC-NO são mais eficazes do que a combinação de 100 μΜ de OMC com 100 μΜ de TEMPOL.

Uma vez que o espectro de protecção dos UV de uma formulação de filtro solar é, normalmente, atingida através de uma mistura de filtros UV, é importante a compatibilidade entre diferentes filtros UV. Deste modo, foi realizado um estudo semelhante ao descrito acima, utilizando o filtro UVA mais comum presente no mercado, o 4-terc-butil-4'-metoxidibenzoilmetano (comercialmente conhecido como Parsol 1789 ou Avobenzone) que tem uma capacidade de absorção elevada sobre quase toda a gama de UVA. No entanto, este composto tem uma desvantagem importante porque produz radicais livres quando activado por UVA que conduz a uma redução no poder foto-protector e a um potencial aumentado para danificar as moléculas biologicamente relevantes, tais como proteínas, ADN de plasmídeo e, mais recentemente, queratinócitos cultivados. A foto-decomposição dos filtros solares pode, deste modo, afectar a sua protecção contra lesão na pele induzida por UV, uma vez que a sua clivagem diminui a capacidade de absorção 23 dos UVA, resultando num aumento da lesão na pele induzida por UVA directos. Como pode ser observado na Figura 5, a presença de Parsol 1789 conduz a um aumento significativo no nivel de absorvância de TBARS, comparado com o controlo iluminado e este resultado, confirma, mais uma vez, que os radicais livres são produzidos durante a iluminação com UVA deste filtro, que contribui para a exacerbação da reacção em cadeia do radical livre da peroxidação lipídica. Nos lipossomas contendo Parsol/OMC, verificou-se uma diferença significativa nos níveis de peroxidação lipídica relativamente ao Parsol isolado.

Com a combinação Parsol/TEMPOL, o nível de peroxidação comparado com o Parsol 1789 isolado é ligeiramente reduzido, no entanto, o nível de TBARS atingido é superior comparando quando está apenas presente o TEMPOL (Figura 4). Isto significa, possivelmente, que são produzidos mais radicais quando está presente o Parsol, conduzindo a mais oxidação de lípidos, deste modo, o TEMPOL tem que eliminar não só os radicais gerados pela exposição aos UVA, como também aqueles induzidos pela foto-decomposição do Parsol 1789. 0 resultado mais surpreendente é o obtido com a combinação Parsol/MC-NO. A presença de 100 μΜ do novo composto é capaz de reduzir em muito a peroxidação lipídica, quase para níveis de controlo, quando estão presentes 100 μΜ do filtro UVA Parsol 1789. Acredita-se que este resultado seja devido às propriedades de filtro solar-antioxidante do novo composto. A lesão principal e imediata infligida pela luz UVA nas células é produzida a partir de radicais livres e outras espécies oxidativas que podem, directamente ou indirectamente, ser também responsáveis pela reacção eritemal. Compreender os efeitos dos absorventes UVA/UVB e antioxidantes perante o nível de ROS induzidas por UV gerados sob exposição a UVA e na luz do sol natural, é útil para compreender a eficácia das formulações cosméticas de cuidado da pele e pode conduzir a uma melhor fotoprotecção. Isto é especialmente importante considerando os vários relatórios na literatura que mostram que os espectros de absorção de UV dos agentes de filtro solar após irradiação com UVA são alterados em muitas caracteristicas devido à fotoinstabilidade. Nem a combinação de vários filtros orgânicos, nem a adição de filtros inorgânicos parece garantir a fotoestabilidade. Estudos recentes por Haywood et al. (2003), indicam também que os utilizadores de filtros solares são pouco protegidos contra a produção de radicais livres pelos UVA e efeitos lesivos dos UVA.

Conclusões O novo composto nitróxido de absorção de UVB conduz a uma redução significativa na peroxidação lipidica (Figura 4) . Isto deve-se principalmente às excelentes propriedades de eliminação dos radicais nitróxido. Estes são um grupo de compostos cujos efeitos protectores em vários sistemas biológicos a níveis moleculares, celulares, órgãos e corpo inteiro contra o stress oxidativo, têm sido amplamente estabelecidos. As razões subjacentes ao seu sucesso é que os nitróxidos são moduladores extremamente eficazes dos processos mediados pelas espécies paramagnéticas (radicais e metais de transição) o que os torna úteis para reacções de sondas e processos associados com radicais livres. Na presente descrição, mostrou-se que estes compostos são também extremamente eficientes na redução das lesões foto-oxidativas mesmo em combinação com absorventes de UV fotoinstáveis. É importante relembrar que os nitróxidos são 25 derivados dos estabilizadores de luz de amina impedida (HAL). Estes HAL são amplamente empregues em polímeros de modo a prevenir a foto-oxidação, e o seu efeito estabilizador é atribuído à actividade do radical nitróxido derivado da amina correspondente, como descrito anteriormente pelos investigadores. Bernstein et al., demonstraram também que o nitróxido Tempol proporciona protecção contra a radiação UV num modelo de cultura de fibroblastos de murinos transgénicos de fotoenvelhecimento cutâneo e, recentemente, também em fibroblastos dérmicos humanos. Deste modo, estes resultados suportam a noção de que os antioxidantes, tal com os nitróxidos, podem proporcionar um suplemento útil à protecção dos filtros solares contra a fotocarcinogénese e fotoenvelhecimento na pele. No entanto, a descoberta dos novos nitróxidos aqui descritos é que possuem também fortes propriedades de absorção dos UVB.

Este composto é particularmente útil uma vez que a protecção dos UVA/radicais livres actualmente proporcionada pelos filtros solares parece ser inadequada. Continua a existir uma necessidade contínua de composições de cosmética e dermatológicas melhoradas e composições dermatológicas que sejam bloqueadores de UV eficientes e antioxidantes eficientes. Isto é especialmente verdade dado que a exposição humana aos UV está a aumentar devido à destruição da camada do ozono e devido à utilização de equipamentos de bronzeamento modernos (solários e lâmpadas solares). Os novos filtros solares-antioxidantes aqui descritos são ideais para reduzir os problemas associados com as lesões foto-induzidas na pele. 26 Métodos Detalhados A L-a-fosfatidilcolina (P2772: Tipo XI-E), TEMPOL, 2-etil-hexil-4-metoxicinamato (octilmetoxicinamato; aqui abreviado como OMC), bem como outros reagentes e solventes, foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical Co. (Milão, Itália). 0 4-terc-butil-4'-metoxidibenzoilmetano (aqui abreviado como Parsol) foi obtido na forma de Eusolex 9020 da Merck (Darmstadt, Alemanha) e a sua identidade foi confirmada por RMN.

Os espectros de RMN de foram registados à temperatura ambiente numa solução de CDCI3 num espectrómetro Varian Gemini 200 (õ em ppm em relação ao tetrametilsilano). Os espectros de ESR foram registados num espectrómetro Burker EMX ESR equipado com um contador de frequência de microondas XL, Modelo 3120 para a determinação de factores g.

Como fonte de irradiação de UVA, foi utilizada uma lâmpada de sol comercial, Philips Original Home Solarium (modelo HB 406/A; Philips, Groningen, Holanda) equipada com uma lâmpada de 400 watt livre de ozono Philips HPA, UV tipo 3, distribuindo um fluxo de 23 mW/cm2 entre 300 e 400 nm, a uma distância de 20 cm. Foi sempre efectuado durante 15 min para permitir que a entrada estabilizasse. A dose de UVA foi medida com um Radiómetro de UV Power Pack (EIT Inc.). RMN de 1H (200 MHz, CDCI3, 25 °C, após redução com fenil-hidrazina): δ = 1,34 (s, 6H), 1, 41 (s, 6H), 1,75- 1,91 (m, 2H), 2,00-2,12 (m, 2H), 5,14-5,28 (m, 1H), 6,27 (d, 1H, J = 16 Hz) , 6,91 7,63 (d, 1H, J = (d, 2H, J 16 Hz) . = 8,8 Hz), 7, 48 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 27

Espectro de ESR registado em acetato de etilo (Esquema 1): tripleto com aN = 15,47 G, g = 2,0062δ.

Espectro de absorçao óptico

Foram preparadas soluções stock 10 mM de TEMPOL e dos ingredientes fotoactivos em acetonitrilo. Foram depois adicionadas quantidades apropriadas de tampão de fosfatos 5 mM, NaCl a 0,9%, EDTA 0,1 mM, pH 7,4 (acetonitrilo < 2% v/v) e foram bem misturados de modo a atingir concentrações finais de 100 μΜ, num volume final de 3 mL. As soluções foram depois transferidas para uma placa de 24 multi-poços para culturas celulares (Orange Scientific, Cambrex BioScience, Walkerville, Inc.) que foi colocada num bloco de latão embebido em gelo a uma distância de 20 cm da fonte de luz. A placa de multi-poços foi coberta com uma placa de quartzo com 2 mm de espessura para prevenir qualquer evaporação. A doce incidente de UVA recebida de cima pelas amostras foi de 275 kJ/m2. Após iluminação, foram recolhidos 2,4 mL de amostra de cada poço e extraídos com o mesmo volume de acetato de etilo. A fase orgânica foi separada e o seu espectro de absorção foi depois corrido num espectrofotómetro UV Kontron 941. Para as amostras não iluminadas, foi seguido o mesmo processo para o mesmo comprimento de tempo excepto que as amostras foram expostas a luz de trabalho artificial no laboratório. 28

Peroxidação de lipossomas multilamelares de

fosfatidilcolina (PC) induzida por UVA

Os lipossomas multilamelares de PC foram preparados como se segue. Foi adicionada a quantidade desejada de PC de ovo em clorofórmio a um tubo de ensaio de vidro e mantida num banho de gelo e o solvente foi cuidadosamente removido sob um fluxo de azoto. Quando chegou a altura de os compostos serem testados, quer sozinhos quer em combinação, foi introduzida a quantidade desejada de uma solução do(s) composto(s) em acetonitrilo noutro tubo de ensaio de vidro e após evaporação do solvente, a PC de ovo foi adicionada e submetida ao mesmo processo como descrito acima. Os filmes lipidicos preparados foram, cada um, dispersos com 1,5 mL de tampão de fosfatos 5 mM, NaCl a 0,9%, EDTA 0,1 mM, pH 7,4 e vortexado durante 2 min até ser obtida uma suspensão branca, homogénea e opalescente. A concentração final da PC na dispersão lipossoma multilamelar resultante foi de 3,5 mM. Cada amostra foi depois dividida em aliquotas em 2 partes (700 pL cada uma) e transferidas para uma placa de multi-poço, coberta com uma placa de quartzo com 2 mm de espessura para prevenir qualquer evaporação e exposta aos UVA como descrito acima. A dose incidente de UVA recebida de cima, pelas amostras foi de 275 kJ/m2. No final da exposição aos UVA, a extensão da peroxidação lipídica foi avaliada utilizando um método modificado do ensaio do ácido tiobarbitúrico (TBA). [14] Neste processo, foram adicionados 2 mL de TBA-TCA-HC1 (TBA a 0,375% p/v, TCA a 15% p/v, HC1 0,2 M) a 600 pL da amostra contendo BHT 0,3 mM para prevenir uma possível peroxidação dos lipossomas durante o ensaio com TBA. As amostras foram aquecidas durante 15 min a 95 °C seguido por arrefecimento e centrifugação. A absorvância do crómoforo rosa do sobrenadante que se desenvolveu após aquecimento, foi medida a 535 nm. 29 Ο 2,2,6,6-tetrametil-piperidin-4-il-p-metoxicinamiloxi-l-oxilo (aqui abreviado com MC-NO), foi sintetizado a partir de 4-hidroxi-2,2,6,6,-tetrametil-piperidina-l-oxilo comercial (TEMPOL) e o éster metilico do ácido p-metoxicinâmico. 0 processo tipico (Esquema 1) requer que os reagentes sejam submetidos a refluxo em tolueno durante 4-5 h na presença de metóxido de sódio como catalisador, como apresentado na literatura (I. Dragutan, Free Rad. Res. Comms. 1990, 9, 379-382)

Ao longo de todas as experiências descritas acima foram efectuados os controlos apropriados e os resultados apresentados são uma média de, pelo menos, três experiências independentes, cada uma efectuada em duplicado.

Nos exemplos das formas de realização preferidas, é descrito um método para a produção de um novo e útil composto de absorção de UV e eliminação de ROS. Os exemplos detalhados são dados a título de exemplo das formas de realização preferidas e não são para serem considerados, de modo algum, como limitadores da invenção. Por exemplo, as quantidades relativas dos ingredientes pode ser variada de modo a optimizar os efeitos desejados, podem ser adicionados ingredientes adicionais e/ou ingredientes semelhantes podem ser substituídos por um ou mais dos ingredientes descritos. As características e funcionalidades vantajosas adicionais associadas com os sistemas, métodos e processos da presente invenção, serão evidentes a partir da descrição detalhada.

Lisboa, 17 de Maio de 2010 30

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição química compreendendo um composto de metoxicinamato da fórmula geral (1)

   em que o grupo X compreende (i) uma porção da fórmula (II) ou (III)

   em que R1, R2, R3 e R4 podem ser idênticos ou diferentes, cada seleccionado do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo, alcenilo, arilo, aralquilo, alcoxilo ou -COOR5, em que R5 é seleccionado do grupo consistindo de um resíduo alquilo, alcenilo, arilo ou arilalquilo; e em que n é 0 ou 1; n' é 0, 1 ou 2; e z é um membro do grupo consistindo de -0, -C(0)0, -NH e -C(0)NH; ou (ii) uma porção da fórmula (IV) ou (V) 1

   (V), em que R1, R2, R3 e R4 podem ser idênticos ou diferentes, cada seleccionado do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo, alcenilo, arilo, aralquilo, alcoxilo ou -COOR5, em que R5 é seleccionado do grupo consistindo de um residuo alquilo, alcenilo, arilo ou arilalquilo; e em que n é 0 ou 1; n' é um número inteiro superior ou igual a 0; e z é um membro do grupo consistindo de -O, -C(0)0, -NH e -C(0)NH; ou (iii) uma porção da fórmula(VI) ou (VII):

   em que R1, R2, R3 e R4 podem ser idênticos ou diferentes, cada seleccionado do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo, alcenilo, arilo, aralquilo, alcoxilo ou -COOR5, 2 em que R5 é seleccionado do grupo consistindo de um residuo alquilo, alcenilo, arilo ou arilalquilo; e em que n é 0 ou 1; n' é um número inteiro superior ou igual a 1; e z é um membro seleccionado do grupo consistindo de -0, -C(0)0, - NH, e -C(0)NH; ou (iv) uma porção da fórmula(VIII) ou (IX):

   \ (VIII)

   (IX) em que R1, R2, R3 e R4 podem ser idênticos ou diferentes e seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo, alcenilo, arilo, aralquilo, alcoxilo e -C00R5, em que R5 é seleccionado do grupo consistindo de um residuo alquilo, alcenilo, arilo ou arilalquilo; ou (v) uma porção da fórmula(X):

   em que R1 representa um oxigénio ou um NR2; e R2 representa um membro seleccionado do grupo consistindo de um grupo alquilo, um alcoxilo, um arilo e um fenilo; e n 3 é 1, 2 ou 3; e Z é um membro seleccionado do grupo consistindo de -0, -C(0)0, -NH, e -C(0)NH; ou (vi) uma porção da fórmula(XI)

   em que R representa um membro seleccionado do grupo consistindo de um alquilo, um fenilo, um resíduo benzeno substituído, um resíduo benzílico ou um benzílico substituído e um resíduo alílico; ou (vii) uma porção da fórmula(XII) ou (XIII)

   em que R1 e R2 podem ser idênticos ou diferentes, cada seleccionado do grupo consistindo de um grupo hidroxilo, um hidrogénio, um alquilo e um resíduo alcoxilo; e n é 1; ou 4 (XIV) (viii) uma porção da fórmula(XIV)

   em que R1 e R1 podem ser idênticos ou diferentes, cada um seleccionado do grupo consistindo de um grupo hidroxilo, um hidrogénio, um alquilo e um resíduo alcoxilo; e n é um número inteiro superior a ou igual a 1; ou

   em que R1 e R1 podem ser idênticos ou diferentes, cada seleccionado do grupo consistindo de um grupo hidroxilo, um hidrogénio, um alquilo e um resíduo alcoxilo. 5 1 Composição da reivindicação 1, em que a composição inclui também, pelo menos, um outro ingrediente seleccionado do grupo consistindo de um excipiente farmaceuticamente aceitável, um agente de composição farmacêutica, um conservante, um glicol, água, um tensioactivo, um emulsionante, um potenciador de penetração dérmica, uma agente redutor, um solvente orgânico, um antioxidante, um uma triglicérido, um lípido ou fosfolípido, um óleo, gordura, um hidrato de carbono ou sacárido, uma proteína, um nucleótido, um lipossoma, um sal ou mineral, um extracto vegetal, um agente activo e suas combinações.
2. 3. Composição da reivindicação 2, em que a composição compreende uma forma farmaceuticamente adequada seleccionada do grupo consistindo de um creme, uma loção, um pó, um vaporizador, um gel, um unguento, uma suspensão ou emulsão, uma mousse, um aerossol e um dispositivo transdérmico. Lisboa, 17 de Maio de 2010 6 1/3 Figura 1 OH

   2,2,6,6-tetrametil-piperidin-4-il-p-metoxicinamiloxi-1-oxilo (MC-NO) Esquema 1

   2/3 Figura 2 Absorvância

   250 300 350 400 nm Figura 3.

   Absorvancia a 535 nm q H· Φ P H Absorvancia a 535 nm O O O O 0 0 fj Ò W U A 01 o o p o o o p o^bw^bib^j

   \ \ \ % \ α \ o, H

   '••'H u \ u