PT1954288E

PT1954288E - Derivados de amidina e suas utilizações como medicamento

Info

Publication number: PT1954288E
Application number: PT06820232T
Authority: PT
Inventors: Serge Auvin; Dennis Bigg; Bernadette Pignol; Pierre-Etienne Chabrier De Lassauniere
Original assignee: Ipsen Pharma
Priority date: 2005-10-21
Filing date: 2006-10-18
Publication date: 2012-10-03
Also published as: DK1954288T3; HK1124780A1; CA2626591A1; WO2007045761A1; US20090018120A1; US7659266B2; JP5280850B2; PL1954288T3; ES2390134T3; JP2009513577A; EP1954288A1; EP1954288B1

Description

DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE AMIDINA E SUAS UTILIZAÇÕES COMO MEDICAMENTO" A presente invenção tem como objecto derivados de amidina apresentando uma actividade inibidora das calpainas e/ou uma actividade de aprisionamento de formas reactivas de oxigénio (ROS para "reactive oxigen species"). A invenção refere-se igualmente aos seus métodos de preparação, às composições farmacêuticas que os contêm e às suas utilizações com fins terapêuticos, em particular como inibidores das calpainas e/ou captadores de formas reactivas de oxigénio de uma forma selectiva ou não.

Tendo em consideração o papel potencial das calpainas e dos ROS na fisiopatologia, os novos derivados de acordo com a invenção podem produzir efeitos benéficos ou favoráveis no tratamento da patologia em que estão envolvidas estas enzimas e/ou estas espécies radicalares e, nomeadamente: doenças inflamatórias e imunológicas como por exemplo artrite reumatóide, pancreatite, esclerose múltipla, inflamação do sistema gastrointestinal (por exemplo, colite ulcerativa ou não, doença de Crohn), - as doenças cardiovasculares e/ou cerebro-vasculares compreendendo, por exemplo, hipertensão arterial, choque séptico, enfartes cardíacos ou cerebrais de origem isquémica ou hemorrágica, isquemias, assim como os distúrbios relacionados com a agregação plaquetária, 1 distúrbios do sistema nervoso central ou periférico como, por exemplo, as doenças neurodegenerativas em que se pode referir nomeadamente traumatismos cerebrais ou da medula espinal, hemorragia subaracnóide, epilepsia, envelhecimento, demências senis, incluindo doença de

Alzheimer, coreia de Huntington, doença de Parkinson, neuropatias periféricas, caquexia, sarcopenia, perda de audição, em particular a perda de audição provocada por presbiacusia, traumatismo acústico ou por administração de um medicamento, tal como antibióticos como, por exemplo gentamicina, anti-cancerígenos como por exemplo cisplatina, agentes anti-inflamatórios não esteróides como, por exemplo, os derivados do ácido salicílico ou ibuprofeno, diuréticos, tais como, por exemplo, furosemida, anti-ulcerosos, tais como, por exemplo, cimetidina ou omeprazole, anticonvulsivos, tais como, por exemplo, carbamazepina ou ácido valpróico, osteoporose, distrofias musculares como, por exemplo, em particular distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular miotónica ou doença de Steiner, distrofia muscular congénita, distrofia muscular das cinturas e distrofia muscular facio-escapulo-humeral, 2 doenças proliferativas nao-cancerígenas como, por exemplo, aterosclerose ou restenose, cataratas, transplantes de órgãos, doenças autoimunitárias ou virais como, por exemplo, lupus, SIDA, infecções parasiticas ou virais, diabetes e as suas complicações, cancro e doenças proliferativas cancerígenas, quaisquer patologias caracterizadas por uma produção excessiva de ROS e/ou uma activação das calpaínas.

No conjunto destas patologias, existem indícios experimentais demonstrando o envolvimento dos ROS (Free Radie. Biol. Med. (1996) 20, 675-705; Antioxid. Health. Dis. (199 7) 4 (Handbook of Synthetic Antioxidants) , 1-52), assim como o envolvimento de calpaínas (Trends Pharmacol. Sei. (1994) 15, 412419; Drug News Perspect (1999) 12, 73-82). A título de exemplo, as lesões cerebrais associadas ao enfarte cerebral ou ao traumatismo craniano experimental são reduzidas por agentes antioxidantes (Acta. Physiol. Scand. (1994) 152, 349-350; J.

Cereb. Blood Flow Metabol. (1995) 15, 948-952; J Pharmacol Exp

Ther (1997) 2, 895-904) assim como por inibidores de calpaínas (Proc Natl Acad Sei USA (1996) 93, 3428-33; Stroke, (1998) 29, 152-158; Stroke (1994) 25, 2265-2270).

Para responder às exigências dos industriais, tornou-se necessário encontrar outros compostos tendo uma actividade 3 inibidora das calpaínas e/ou uma actividade de captação de formas reactivas de oxigénio. 0 problema que a invenção também se propõe resolver é proporcionar novos compostos tendo uma actividade inibidora das calpainas e/ou uma actividade de aprisionamento de formas reactivas de oxigénio.

De um modo inesperado, a requerente verificou que os compostos de fórmula geral (I) descritos abaixo ou os seus sais, sob a forma racémica, de diastereoisómeros ou quaisquer combinações destas formas apresentam uma actividade inibidora das calpainas e/ou uma actividade de captação de formas reactivas de oxigénio. A invenção tem como vantagem poder ser realizada em quaisquer indústrias, nomeadamente na indústria farmacêutica, veterinária, cosmética, alimentar, assim como nos domínios da agricultura.

Os compostos de acordo com a invenção ou os seus sais apresentam uma solubilidade aumentada nos meios biológicos, em particular nos meios aquosos.

Outras vantagens e caracteristicas da invenção serão evidentes com a leitura da descrição e dos exemplos proporcionados a titulo unicamente ilustrativo e não limitativo que se vão seguir. A presente invenção tem consequentemente como objecto um composto de fórmula geral (I) ou um seu sal, 4

d) sob a forma racémica, de diastereoisómeros ou quaisquer combinações destas formas em que: R1, R2, R4, R5 e R6 representam, independentemente, um átomo de hidrogénio, um átomo de halogéneo, grupo OH, um radical alquilo, alcoxilo, ciano, nitro, amino, alquilamino ou ácido carboxílico; R3 representa um átomo de hidrogénio, um radical alquilo ou um grupo -COR10; R10 representa um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo, alcoxilo, arilo ou um radical heterocíclico; W representa um átomo de enxofre; R7 representa um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo; R8 representa um átomo de hidrogénio, um radical halogenoalquilo ou alcenilo, um radical cicloalquilo, um radical alquilo linear ou ramificado, substituído ou não que quando é substituído contém uma função química, tais como ácido carboxílico, amina, álcool, guanidina, amidina, tiol, tioéter, tioéster, alcoxilo, heterocíclico ou carboxamida; 5 R9 representa um átomo de hidrogénio, um radical alquilo, arilo, arilalquilo, bisarilalquilo, um radical heterocíclico, um radical alquilo heterocíclico ou um grupo -COR10; sendo entendido que:

significa

N .Nk

H I N

H I N ISk H^N^r7 ou H^^R7 ou

ou N / R7

De um modo preferido, o composto de acordo com a invenção possui um radical R1 que é um átomo de hidrogénio.

De um modo preferido, o composto de acordo com a invenção possui um radical R2 que é um átomo de hidrogénio.

De um modo preferido, o composto de acordo com a invenção possui um radical R3 que é um átomo de hidrogénio.

De um modo preferido, o possui um radical R4 que é um composto de acordo átomo de hidrogénio. com a invenção

De um modo preferido, o possui um radical R5 que é um composto de acordo átomo de hidrogénio. com a invenção 6

De um modo preferido, o composto de acordo com a invenção possui um radical R6 que é um átomo de hidrogénio.

De um modo preferido, o composto de acordo com a invenção possui um radical R7 que é um átomo de hidrogénio.

De um modo preferido, o composto de acordo com a invenção possui um radical R8 que é um radical isobutilo.

De um modo preferido, o composto de acordo com a invenção possui um radical R9 que é um átomo de hidrogénio.

De um modo preferido, o composto de acordo com a invenção possui um radical R9 que é um radical acetilo.

De um modo preferido, o composto de acordo com a invenção possui um radical R9 que é um radical metilo.

De um modo preferido, o composto de acordo com a invenção possui um radical R9 que é um radical benzilo.

De um modo preferido, o composto de acordo com a invenção possui um radical R9 que é um radical naftilmetilo.

Por alquilo, quando não são proporcionados mais detalhes, entende-se um radical alquilo linear ou ramificado contendo de 1 a 12 átomos de carbono e de um modo preferido de 1 a 6 átomos de carbono, de um modo ainda mais preferido de 1 a 4 átomos de carbono. Por alquilo linear ou ramificado tendo de 1 a 6 átomos de carbono, entende-se em particular radicais metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo e 7 terc-butilo, pentilo, neopentilo, isopentilo, hexilo, isso-hexilo.

Por halogenoalquilo, entende-se que um radical alquilo em que, pelo menos, um dos átomos de hidrogénio é substituído por um átomo de halogéneo. Por halogenoalquilo, entende-se por exemplo o radical -CF3, -CHF2 ou -CH2CI.

Por alcenilo, quando não são proporcionados mais detalhes, entende-se um radical alcenilo linear ou ramificado contendo pelo menos 1 insaturação e contendo de 2 a 12 átomos de carbono e de um modo preferido de 2 a 6 átomos de carbono.

Por alcoxilo, quando não são proporcionados mais detalhes, entende-se um radical R-0- cuja cadeia carbonada R é linear ou ramificada e contém de 1 a 6 átomos de carbono.

Por cicloalquilo, quando não são proporcionados mais detalhes, entende-se um radical carbocíclico saturado contendo de 3 a 7 átomos de carbono. Por cicloalquilo contendo de 3 a 7 átomos de carbono, entende-se em particular um radical ciclo-hexilo.

Por arilo, quando não são proporcionados mais detalhes, entende-se um radical carbocíclico aromático, contendo de um modo preferido de 1 a 3 anéis fundidos. Por arilo, entende-se nomeadamente os radicais fenilo, naftilo e fenantrilo, de um modo preferido os radicais fenilo e naftilo e de um modo mais preferido o radical fenilo.

Por radicais arilalquilo, entende-se radicais arilalquilo em que respectivamente os radicais alquilo e arilo que os 8 compõem têm os significados indicados anteriormente sendo entendido que o radical arilo está ligado à molécula (I) ou (IS) via um radical alquilo.

Por bisarilalquilo entende-se no âmbito da presente invenção radical carbocíclico aromático compreendendo pelo menos 2 anéis, em que pelo menos um é aromático e compreendendo mais de 14 átomos de carbono, de um modo preferido mais de 10 átomos de carbono, sendo entendido que o radical bisarilalquilo está ligado à molécula (I) ou (IS) via um radical alquilo.

Por heterocíclico, entende-se no âmbito da presente invenção um radical cíclico aromático ou não compreendendo de 1 a 14 átomos, sendo estes átomos seleccionados de carbono, azoto, oxigénio ou enxofre ou uma das suas combinações. É entendido que o radical heterocíclico pode ser parcialmente insaturado. Por heterocíclico, entende-se por exemplo um radical heteroarilo ou um radical heterocicloalquilo.

Por alquilo heterocíclico, entende-se no âmbito da presente invenção um radical alquilo heterocíclico em que os radicais heterocíclicos e alquilo que os compõem têm os significados indicados anteriormente e em que o radical heterocíclico está ligado à molécula (I) ou (IS) via um radical alquilo.

Por átomo de halogéneo, entende-se um átomo seleccionado de átomos de flúor, cloro, bromo ou iodo.

Por amino, entende-se no âmbito da presente invenção um radical -NH2. 9

Por alquilamino, entende-se no âmbito da presente invenção um radical -NRH ou -N(R)2 com R sendo um radical alquilo tal como anteriormente definido.

Os exemplos seguintes indicam grupos protectores podendo proteger funções contidas pelo radical R8: ésteres de metilo, etilo, terc-butilo ou de benzilo podem proteger funções ácidas; carbamatos de terc-butilo, benzilo ou fluorenilmetilo podem proteger funções amina; acetamidas podem proteger funções amina; e éteres de terc-butilo, benzilo, tetra-hidropirano ou sililo podem proteger funções álcool; e acetilos podem proteger funções álcool; e tioéteres de metilo ou tioésteres de metilo podem proteger funções tiol.

Em particular, a invenção refere-se a um composto de fórmula geral (I) seleccionado dos compostos seguintes ou o seu sal: N2-[imino(10H-fenotiazin-2-il) metil]-N1-[(3S)-2-metoxitetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida; N1-[(3S)-2-(benziloxi)tetra-hidrofuran-3-il]-N2-[imino(10H-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucinamida; 10 Ν2-[imino(10H-fenotiazin-2-il)metil]-N1-[(3S)-2-(2-naftilmetoxi)tetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida; acetato de (3S)-3-({N-[imino(lOH-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucil}amino)tetra-hidrofuran-2-ilo; N1-[(3S)-2-hidroxitetra-hidrofuran-3-il]-N2-[imino(10H-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucinamida. A terminologia utilizada para a nomenclatura dos compostos acima é a terminologia inglesa IUPAC. A presente invenção tem igualmente como objecto um composto de fórmula geral (I) ou um seu sal, tal como definida acima, para a sua utilização como substância terapeuticamente activa.

Mais particularmente os compostos de acordo com a invenção ou os seus sais podem ser utilizados como substância terapeuticamente activa para o tratamento da patologias caracterizadas por uma produção excessiva de ROS e/ou uma activação das calpaínas.

Ainda mais particularmente os compostos de acordo com a invenção ou os seus sais podem ser utilizados como substância terapeuticamente activa para tratar as doenças e os distúrbios seleccionados de doenças inflamatórias ou imunológicas, doenças cardiovasculares, doenças cerebro-vasculares, distúrbios do sistema nervoso central ou periférico, caquexia, sarcopenia, perda de audição, osteoporose, distrofias musculares, doenças proliferativas cancerígenas ou não, cataratas, reacções de 11 rejeição após transplante de órgãos, doenças autoimunitárias, doenças virais ou cancro.

De um modo preferido a invenção tem como objecto um composto de fórmula geral (I) ou o seu sal, tal como definida acima, para a sua utilização como substância terapeuticamente activa para tratar a perda de audição ou as distrofias musculares. A presente invenção tem igualmente como objecto um medicamento compreendendo pelo menos um composto de fórmula geral (I) tal como definida anteriormente ou um dos seus sais. De um modo preferido tratam-se de sais farmaceuticamente aceitáveis desses compostos. A presente invenção tem igualmente como objecto como medicamentos, compostos de fórmula geral (I) tal como definida anteriormente ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. A invenção refere-se igualmente às composições farmacêuticas contendo pelo menos um composto de fórmula geral (I) tal como definida anteriormente ou pelo menos um sal farmaceuticamente aceitável desse composto. De um modo preferido a composição farmacêutica compreende pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. De um modo preferido o composto de fórmula geral (I) tal como definida anteriormente ou o seu sal está contido na composição farmacêutica como princípio activo.

Por sal farmaceuticamente aceitável, entende-se nomeadamente sais de adição a ácidos inorgânicos, tais como por exemplo cloridrato, bromidrato, iodidrato, sulfato, fosfato, difosfato ou nitrato ou de ácidos orgânicos, tais como por 12 exemplo acetato, maleato, fumarato, tartarato, succinato, citrato, lactato, metanossulfonato, p-toluenossulfonato, benzenosulfonato, pamoato ou estearato. Para outros exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis, pode-se referir "Salt selection for basic drugs.", Int. J. Pharm. (1986), 33, 201-217. O composto de fórmula geral (I) ou um seu sal, utilizado de acordo com a invenção, pode estar sob a forma de um sólido, por exemplo pós, grânulos, comprimidos, cápsulas, lipossomas ou supositórios. Os suportes sólidos adequados podem ser, por exemplo, fosfato de cálcio, estearato de magnésio, talco, açúcar, lactose, dextrina, amido, gelatina, celulose, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, polivinilpirrolidina ou cera. O composto de fórmula geral (I) de acordo com a invenção ou o seu sal pode também se apresentar sob a forma líquida, por exemplo, soluções, emulsões em sentido lato, géis, suspensões, vaporizações ou xaropes. Os suportes líquidos adequados podem ser, por exemplo, água, solventes orgânicos, tais como glicerol ou glicóis, assim como as suas misturas, em proporções variadas, em água. A invenção refere-se para além disso à utilização de um composto de fórmula geral (I) tal como definida anteriormente ou de um sal farmaceuticamente aceitável desse composto, para preparar um medicamento destinado a tratar quaisquer patologias caracterizadas por uma produção excessiva de ROS e/ou uma activação das calpaínas e em particular as doenças e os distúrbios seleccionados de doenças inflamatórias ou imunológicas, doenças cardiovasculares, doenças cérebro-vasculares, distúrbios do sistema nervoso central ou 13 periférico, caquexia, sarcopenia, perda de audição, osteoporose, distrofias musculares, doenças proliferativas cancerígenas ou não, cataratas, reacções de rejeição após transplante de órgãos, doenças autoimunitárias, doenças virais ou cancro. A administração de um composto de fórmula geral (I) de acordo com a invenção ou o seu sal pode ser realizada pela via tópica, oral, parentérica, por injecção intramuscular, subcutânea, etc. A dose de um produto de acordo com a presente invenção, a prever para o tratamento das doenças ou distúrbios referidos acima, varia de acordo com o modo de administração, a idade e o peso corporal do indivíduo a ser tratado, assim como o estado deste último e esta será decidida em definitivo pelo médico ou veterinário assistente. Essa quantidade determinada pelo médico ou veterinário assistente é aqui designada "quantidade terapeuticamente activa". A presente invenção tem igualmente como objecto um composto de fórmula geral (IS) ou o seu sal, 6

(IS) sob a forma de estereoisómeros ou suas combinações em que: 14 W, R1, R2, R3, R4, R5, R6 e R7 têm o mesmo significado que para os compostos de fórmula I) e R11 representa um radical alquilo, arilo, arilalquilo, bisarilalquilo, um radical heterociclico ou um radical alquilo heterociclico. A presente invenção tem igualmente como objecto compostos ou seus sais, que são intermediários de síntese obtidos no decorrer da síntese de compostos de fórmula geral (I), seleccionados dos compostos seguintes: 10H-fenotiazina-2-carbimidotioato de metilo; N2-[imino(10H-fenotiazin-2-il)metil]-N1-[(3S) -2-metoxitetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida; N' - [ (3S) -2- (benziloxi) tetra-hidrofuran-3-il] -N2-[imino (10H-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucinamida; N2-[imino (10H-fenotiazin-2-il) metil] -N1- [ (3S) -2- (2-naftilmetoxi)tetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida;

Acetato de (3S)-3-({N-[imino(10OH-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucilJamino)tetra-hidrofuran-2-ilo; N-etil-10H-fenotiazina-2-carboxamida; N-etil-1OH-fenotiazina-2-carbotioamida; N-etil-10H-fenotiazina-2-carbimidotioato de metilo. 15 A terminologia utilizada para a nomenclatura dos compostos acima é a terminologia inglesa IUPAC. A presente invenção tem igualmente como objecto um composto ou o seu sal, que é um dos intermediários da síntese (IS) descrito acima, para a sua utilização como substância terapeuticamente activa. Mais particularmente estes compostos de acordo com a invenção ou os seus sais podem ser utilizados como substância terapeuticamente activa para o tratamento de patologias caracterizadas por uma produção excessiva de ROS e/ou por uma activação das calpaínas.

Ainda mais particularmente estes compostos de acordo com a invenção ou os seus sais, o qual são intermediários da síntese (IS) descrito acima, podem ser utilizados como substância terapeuticamente activa para tratar as doenças e distúrbios seleccionados de doenças inflamatórias ou imunológicas, doenças cardiovasculares, doenças cerebro-vasculares, distúrbios do sistema nervoso central ou periférico, caquexia, sarcopenia, perda de audição, osteoporose, distrofias musculares, doenças proliferativas cancerígenas ou não, cataratas, reacções de rejeição após transplante de órgãos, doenças autoimunitárias, doenças virais ou cancro. A presente invenção tem igualmente como objectivo um medicamento compreendendo pelo menos um composto ou o seu sal, que é um dos intermediários da síntese (IS) descritos acima. De um modo preferido tratam-se de sais farmaceuticamente aceitáveis desses compostos. 16 A presente invenção tem igualmente como objecto, como medicamentos, pelo menos um composto ou o seu sal farmaceuticamente aceitável, que é um dos intermediários da síntese (IS) descritos acima. A invenção refere-se igualmente às composições farmacêuticas contendo pelo menos um composto ou o seu sal, que é um dos intermediários da síntese (IS) descritos acima ou pelo menos um sal farmaceuticamente aceitável desse composto. De um modo preferido, a composição farmacêutica compreende pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. De um modo preferido, o composto ou o seu sal, que é um dos intermediários da síntese (IS) descritos acima, está contido na composição farmacêutica como princípio activo.

Preparação compostos de fórmula geral (I):

Os compostos de fórmula geral (I) de acordo com a invenção podem ser preparados de acordo com a via de síntese representada no esquema 1 abaixo. Os compostos de fórmula geral (I) em que R9 representa um radical alquilo, arilo, arilalquilo, bisarilalquilo, um radical heterocíclico, um radical alquilo heterocíclico ou um grupo -COR10 com R10 representando um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo, alcoxilo, arilo ou um radical heterocíclico são designado compostos de fórmula geral (I)i. Os compostos de fórmula geral (I) em que R9 representa um átomo de hidrogénio sendo designados compostos de fórmula geral (1)2 no seguimento da descrição. No esquema 1 abaixo, assim como no esquema 2, o significado de W, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 e R11 nos compostos de fórmulas gerais (II), (III), (I)i e (1)2, é tal como descrito acima na descrição: 17

S-R 11

ο R8 H OR 'Ν3

Os compostos de fórmulas gerais (I)i e (1)2 são obtidos de acordo com o esquema 1 por condensação de derivados tioimidato de fórmula geral (II) em amino-lactóis de fórmula geral (III), de um modo preferido por aquecimento entre 25 e 60 °C, de um modo preferido num solvente polar, tais como por exemplo isopropanol, DMF ou então THF, durante um período de 4 a 20 horas. A função hemiacetálica dos compostos de fórmula geral (I)i pode ser de seguida desprotegida para originar o composto de fórmula geral (I)2, Por exemplo em meio ácido, utilizando um 18 ácido mineral tal como HC1 ou HBr ou então um ácido orgânico, tal como por exemplo ácido benzenossulfónico, em solução num solvente orgânico, tais como, por exemplo, acetona, THF, dioxano, acetonitrilo ou etanol. A reacção realiza-se geralmente a cerca de 20 °C e durante um tempo que pode variar de 4 a 20 horas de acordo com a natureza de R9.

Preparação dos intermediários de fórmula geral (II):

Os tioimidatos de fórmula geral (II) não-comerciais, em que W, R1, R2, R3, R4, R5, R6 e R7 são descritos tal como acima na descrição, podem ser preparados de acordo com a via sintética detalhada no esquema 2.

Esquema 2

Os tioimidatos fenotiazina (W = S), ácidos carboxilicos de fórmula geral (II), derivados de podem ser obtidos em 3 etapas a partir de de fórmula geral (11.1) correspondentes. 19

Estes ácidos carboxílicos são acessíveis a partir de métodos descritos na literatura tal como, por exemplo, Pharmazie 1984, 39(1), 22-3; Buli. Soc. Chim. 1968, (7), 2832-42, Pharmazie 1966, 21(11), 645-9, Synthesis 1988, (3), 215-17, J. Med. Chem. 1992, 35(4), 716-24, J. Org. Chem. (1960), 25, 747-53,

Heterocycles (1994), 39(2), 833-45; J. Indian Chem. Soc. (1985),

62(1), 534-6; J. Chem. Soc. Chem. Comm. (1985), (2), 86-7. A formação de carboxamidas de fórmula geral (11.2) é realizada na presença de uma solução aquosa concentrada de amónia (R7 = H) ou então de uma amina (R7 = alquilo) , utilizando um reagente de ligação peptídica, tais como por exemplo DCC ou HBTU, num solvente tal como, por exemplo, DMF. As tiocarboxamidas de fórmula geral (11.3) podem ser obtidas por acção do reagente de Lawesson em solução em 1,4-dioxano. A alquilação de tiocarboxamidas para produzir tioimidatos de fórmula geral (II) pode ser realizada utilizando R71-X, sendo X um grupo abandonante tal como por exemplo um átomo de halogéneo, um grupo sulfato ou triflato. A mistura de reacção é agitada, por exemplo, em acetona durante 15 horas. São obtidos tioimidatos (II) sob a forma de sais, por exemplo, iodidrato se for utilizado iodometano (R71-X) e podendo ser eventualmente dessalifiçados utilizando uma base tal como, por exemplo, carbonato de sódio.

Preparação dos intermediários de fórmula geral (III):

Os derivados amino-lactóis de fórmula geral (III), em que R8 e R9 são tais como são descritos acima, com Gp sendo um grupo protector de um modo preferido do tipo carbamato, são acessíveis utilizando por exemplo as vias de preparação representadas no esquema 3 abaixo. 20

Esquema 3

Os derivados de amino-butirolactona de fórmula geral (III.2) podem ser obtidos por condensação de aminoácidos protegidos de fórmula geral (III.1), em que R8 é um radical de aminoácido tal como definido anteriormente na fórmula geral (I) e Gp é um grupo protector, tais como, por exemplo, carbamato de 21 benzilo, terc-butilo ou fluorenilmetilo, na

(S)-α-aminobutirolactona nas condições convencionais da síntese peptídica para originar as carboxamidas intermediárias de fórmula geral (III.2). A lactona (III.2) é, em seguida, reduzida em lactol utilizando um agente redutor tal como, por exemplo, hidreto de diisobutilalumínio (DIBAL), num solvente inerte tais como, por exemplo, THF ou CH2CI2, a uma temperatura de um modo preferido inferior a -50 °C, por exemplo a cerca de -78 °C. A função hemiacetálica dos derivados lactóis de fórmula geral (111.3) é, em seguida, protegida em meio alcoólico, por exemplo em metanol ou álcool benzílico, utilizando um ácido forte tal como, por exemplo, ácido trifluoroacético ou ácido canf orsulf ónico, ou na presença de um anidrido de ácido carboxílico, por exemplo anidrido acético, na presença de 4-dimetilaminopiridina num solvente inerte, tal como diclorometano, para originar acetais de fórmula geral (III.4).

Alternativamente, os amino-lactóis de fórmula geral (III), podem ser preparados em 5 etapas a partir de (S)-α-aminobutirolactona protegida comercial. As etapas sucessivas de redução de lactona e de protecção do hemi-acetal para originar os intermediários (III.5) e (III.6) são idênticas às descritas para a preparação de intermediários (III.3) e (111.4) . A preparação de intermediários (III.7) é realizada de um modo preferido por hidrogenólise, na presença de Pd/C, do grupo benziloxicarbonilo principalmente utilizado nesta estratégia. Os intermediários de fórmula geral (III.4) podem ser, em seguida, obtidos por condensação peptídica nas condições descritas anteriormente para (III.2), entre os intermediários (III.7) e os aminoácidos de fórmula geral (III.1). A função amina dos intermediários de fórmula geral (III.4) é, em seguida, desprotegida de acordo com os métodos descritos na literatura 22 (T. W. Greene e P. g. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Segunda edição (Wiley-Interscience, 1991)). A menos que estes sejam definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um comum especialista no campo a que esta invenção pertence. Do mesmo modo, todas as publicações, pedidos de patentes, todas as patentes e todas as outras referências aqui referidas são incorporadas por referência.

Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar os processos acima e não devem em caso algum ser considerados como limitativos ao âmbito da invenção.

EXEMPLOS A terminologia utilizada para a nomenclatura dos exemplos abaixo é a terminologia inglesa IUPAC.

Nos exemplos seguintes, os pontos de fusão foram medidos através de um capilar utilizando um aparelho da marca Buchi, modelo B-545. 23

Exemplo 1: Iodidrato de N2-[imino(10H-fenotiazin-2-il)metil]-Ν'-[(3S)-2-metoxitetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida 1.1) N2-[(benziloxi)carbonil]-N1-[(3S) -2-oxotetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida:

Dissolvem-se 3,51 g (13,25 mmol) de Cbz-L-Leucina, 2,41 g (1 eq.) de bromidrato de (S)-2-amino-4-butirolactona, 1,97 g de HOBT (1,1 eq.) e 5,59 g (2,2 eq.) de cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) em 60 mL de DMF anidro, depois adicionam-se 7,64 mL (3,3 eq.) de N,N-diisopropiletilamina. A mistura de reacção é agitada durante 15 horas a 20 °C antes de ser vertida em 200 mL de uma mistura 1/1 de acetato de etilo/água. Após agitação e decantação, a solução orgânica é lavada sucessivamente com 100 mL de uma solução saturada de NaHCCq, 50 mL de água, 100 mL da solução ácido cítrico 1 M e finalmente 100 mL de uma solução salina. A fase orgânica é seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada até à secura sob vácuo. O óleo obtido é lavado utilizando isopentano e cristalizado, em seguida, numa mistura de diclorometano/isopentano. Obtém-se um sólido branco com um rendimento de 68%.

Ponto de fusão: 130-131 °C. 1.2) N2-[(benziloxi)carbonil]-N1-[(3S)-2-hidroxitetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida:

Dissolvem-se 1,24 g (3,56 mmol) de intermediário 1.1, sob árgon, num balão de três entradas contendo 60 mL de diclorometano anidro. O conjunto é arrefecido a -60 °C antes da adição, gota a gota, de 10,7 mL (3 eq.) da solução de DIBAL 1 M em diclorometano. No final da adição, o banho de arrefecimento é removido e a agitação é mantida durante 15 minutos adicionais. O meio de reacção é então vertido, com cuidado, em 100 mL de uma solução de sal de Rochelle a 20%. Após 2 horas de agitação vigorosa, são adicionados 100 mL de diclorometano e o total é vertido numa ampola de decantação. A fase orgânica é recuperada e lavada com 50 mL de água e 50 mL de solução salina. Após secagem sobre sulfato de sódio e filtração, a solução orgânica é concentrada até à secura sob vácuo. O resíduo da evaporação é purificado numa coluna de sílica (eluente: heptano/AcOEt: 1/1 até 2/8) . Obtém-se um sólido branco com um rendimento de 72%. Ponto de fusão: 48-49 °C. 1.3) N2- [ (benziloxi) carbonil] -N1 - [ (3S) -2-metoxitetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida:

Adiciona-se, gota a gota a 20 °C, um excesso de ácido trifluoroacético (5 mL) a uma solução de 0,82 g (2,34 mmol) do intermediário 1.2 em 50 mL de metanol. A agitação é mantida durante 15 horas a 20 °C. A mistura de reacção é de seguida concentrada parcialmente sob vácuo e redissolvida em 50 mL de diclorometano. A solução orgânica é lavada sucessivamente com 50 mL de uma solução saturada de NaHC03, 50 mL de água e 50 mL de solução salina. Após secagem sobre sulfato de sódio, filtração e concentração sob vácuo, o resíduo da evaporação é purificado numa coluna de sílica (eluente: heptano/AcOEt: 1/1 até 3/7). Obtém-se um sólido branco com um rendimento de 80%. Ponto de fusão: 112-113 °C. 25 1.4) Ν' -[(3S)-2-metoxitetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida:

Introduzem-se 2 g (5,5 mmol) de intermediário 1.3 e 600 mg de Pd/C a 10% num reactor em inox contendo 60 mL de metanol. A mistura é agitada sob 2 atm. de pressão de hidrogénio durante 1 hora. Após a filtração do catalisador, o metanol é evaporado sob vácuo. O resíduo oleoso obtido (1,20 g; 94%) é utilizado como tal na etapa seguinte. 1.5) 10H-fenotiazina-2-carbotioamida: É aquecida uma mistura de reacção constituída por 3,4 g (14 mmoles) de 10U-fenotiazina-2-carboxamida (J. Org. Chem. 1961, 26, 1138-1143) e 3,4 g (8,4 mmoles) de reagente de

Lawesson em solução em 40 mL de 1,4-dioxano adicionados de 20 mL de piridina, a 110 °C durante 1 h 30. A solução castanha é de seguida concentrada sob vácuo e o resíduo é diluído em 200 mL de AcOEt e 100 mL de H20. Após agitação e decantação, a fase orgânica é lavada sucessivamente com 100 mL de uma solução aquosa de HC1 1 N e 100 mL de solução salina. Após secagem sobre sulfato de sódio, filtração e evaporação do solvente sob vácuo obtém-se um pó cor de laranja. Este pó é lavado com Et20, o filtrado é eliminado e extraído com acetona. O filtrado acetónico é então concentrado sob vácuo e o resíduo da evaporação é então purificado numa coluna de sílica (eluente: Heptano/AcOEt: 1/1 até 4/6). Pó cor de laranja. Ponto de fusão: 208-209 °C. 26 1.6) Iodidrato de lOH-fenotiazina-2-carbimidotioato de me tilo:

Adicionam-se 0,3 mL (1,2 eq.) de iodometano a 23 °C a uma solução de 1,05 g (4,1 mmoles) do intermediário 1.5 em 10 mL de acetona. A mistura de reacção é agitada durante 15 horas. O precipitado formado é filtrado e lavado sucessivamente com acetona e isopentano. Obtém-se um sólido castanho violeta com um rendimento de 85%. Ponto de fusão: 207-208 °C. 1.7) Iodidrato de N2-[imino(10H-fenotiazin-2-il)metil]-N1-[(3S)-2-metoxitetra-hidrofuran-3-il)-L-leucinamida:

Adicionam-se 1,18 g (1 eq.) intermediário 1.6 a uma solução de 0,68 g (2,95 mmoles) do intermediário 1.4 em 20 mL de isopropanol. A mistura de reacção é agitada a 60 °C durante 15 horas. O metanotiol libertado durante a reacção é aprisionado sucessivamente utilizando uma solução de carbonato de sódio e uma solução de permanganato de potássio. O sólido formado é isolado por filtração e lavado com Et20 antes de ser purificado numa coluna de sílica (eluente: heptano/AcOEt: 1/1 a 0/1). Obtém-se um sólido cor de laranja com um rendimento de 70%. Ponto de fusão: 155-165 °C. 27

Exemplo 2: Iodidrato de Νλ-[(3S)-2-(benziloxi)tetra-hidrofuran-3-il] -N2- [imino (10.ff-fenotiazin-2-il)metil] —L— leucinamida 2.1) N2-[ (9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N1-[ (3S) -2-oxotetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida: 0 protocolo experimental utilizado é o mesmo que o descrito para a síntese do intermediário 1.1, a Fmoc-L-Leucina substituindo a Cbz-L-Leucina. Obtêm-se 3,15 g de um sólido branco por cristalização em AcOEt com um rendimento de 72%. Ponto de fusão: 175-176 °C. 2.2) N2-[ (9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N1-[ (3S)-2-hidroxitetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida: 0 protocolo experimental utilizado é o mesmo que o descrito para a síntese do intermediário 1.2, o intermediário 2.1 substituindo o intermediário 1.1. Após purificação em coluna de sílica (heptano/AcOEt: 1/1), obtêm-se 2,16 g de um sólido branco com um rendimento de 68%. Ponto de fusão: 155-156 °C. 2.3) N2-[ (3S)-2- (benziloxi)tetra-hidrofuran-3-il]-N2-[ (9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-leucinamida:

Adicionam-se 0,41 mL (1,1 eq.) de álcool benzílico e 0,11 g (0,13 eq.) de ácido canforsulfónico a uma suspensão de 1,57 g (3,58 mmoles) de intermediário 2.2 em 7 mL de diclorometano. Progressivamente com o avanço da reacção, o meio de reacção fica homogéneo. Após 24 horas de agitação, o conjunto é diluído com 28 25 mL de água e 25 mL de diclorometano, agitado e decantado. A solução orgânica é seca sobre sulfato de sódio, é filtrada e concentrada até à secura. 0 resíduo é purificado numa coluna de sílica (heptano/AcOEt: 1/0 até 1/1). Obtêm-se, após evaporação, 1,43 g de um sólido branco com um rendimento de 76%. Ponto de fusão: 116-117 °C. 2.4) N1-[(35)-2-(benziloxi)tetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida:

Adicionam-se gota a gota 0,2 mL (5 eq. ) de dietilamina a uma solução de 0,2 g (0,38 mmole) do intermediário 2.3 em solução em 3,5 mL de diclorometano. A mistura de reacção é agitada a 23 °C durante 5 h 30 antes de ser concentrada até á secura sob vácuo. 0 resíduo é parcialmente redissolvido com Et2<0 e armazenado a 4 °C durante algumas horas. O precipitado branco formado é eliminado por filtração e o filtrado é concentrado até á secura. O resíduo da evaporação é utilizado como tal na etapa seguinte. 2.5) Iodidrato de N1 [ (3S)-2- (benziloxi)tetra-hidrofuran-3-il] -N2-[imino(10H-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucinamida: 0 protocolo experimental utilizado é o mesmo que o descrito para a síntese do intermediário 1.7, por reacção do intermediário 1.6 com o intermediário 2.4 que é utilizado em lugar do intermediário 1.4. O produto da reacção é purificado numa coluna de sílica (heptano/AcOEt: 1/1 até 0/1). Após evaporação das fracções mais puras, o resíduo é misturado em isopentano/AcOEt para originar um precipitado cor laranja 29 pálido. Obtém-se 430 mg do produto esperado com um rendimento de 53%. Ponto de fusão: 140-145 °C.

Exemplo 3: Iodidrato de ^-[imino (10H-fenotiazin-2-il) metil J-tf-í (3S) -2- (2-naftilmetoxi) tetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida 3.1) N2 - [ (9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-N1-[ (3S) -2- (2-naftilmetoxi)tetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida: O protocolo experimental utilizado é o mesmo que o descrito para a síntese do intermediário 2.3 a partir do intermediário 2.2 e 2-hidroximetilnaftaleno utilizado em lugar de álcool benzílico. Após purificação numa coluna de sílica (heptano/AcOEt: 7/3) obtêm-se 1,38 g de um sólido branco com um rendimento de 66%.

Ponto de fusão: 79-80 °C. 3.2) N1-(3S)-2-(2-naftilmetoxi)tetra-hidrofuran-3-il)-L-leucinamida: O protocolo experimental utilizado é o mesmo que o descrito para a síntese do intermediário 2.4, o intermediário 3.1 substituindo o intermediário 2.3. O produto é obtido após eliminação dos derivados dibenzofulveno e é utilizado como tal na etapa seguinte. 30 3.3) Iodidrato de N2-imino(10H-fenotiazin-2-il)metil] -N1-[(3S)-2-(2-naftilmetoxi)tetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida: 0 protocolo experimental utilizado é o mesmo que o descrito para a sintese do intermediário 1.7, a partir do intermediário 1.6 e o intermediário 3.2 utilizado em lugar do intermediário 1.4. 0 produto da reacção de condensação é purificado numa coluna de silica (heptano/AcOEt: 1/1 até 0/1). Após evaporação das fracções mais puras, o resíduo é misturado em isopentano/AcOEt para originar um precipitado cor de laranja. Obtém-se 530 mg do produto esperado com um rendimento de 64%. Ponto de fusão: 145-148 °C.

Exemplo 4: Iodidrato de acetato de (3S)-3-({W-[imino(10fí-fenotiazin-2-il)metil]-L-teucil}amino)tetra-hidrofuran-2-ilo 4.1) Acetato de (3S)-3- ({N- [ (benziloxi)carbonil]-L-leucil}amino)tetra-hidrofuran-2-ilo: São dissolvidas sob atmosfera de árgon 2 g (5,73 imoles) do intermediário 1.2 e 0,14 g (0,2 eq.) de 4-dimetilaminopiridina em 13 mL de diclorometano anidro. Adicionam-se, gota a gota, a esta solução, 5,4 mL (10 eq.) de anidrido acético. Após 5 horas de agitação a 23 °C, a mistura de reacção é diluída com 50 mL de diclorometano e 50 mL de água. A fase orgânica é, em seguida, lavada sucessivamente com 50 mL de uma solução saturada de NaHC03, 50 mL de água e finalmente solução salina. A solução de diclorometano é seca sobre Na2S04, filtrada e concentrada até à secura sob vácuo. O resíduo obtido é misturado com Et30, é filtrado e lavado com isopentano. Obtêm-se 1,14 g de um sólido branco com um rendimento de 50%. Ponto de fusão: 158-159 °C. 31 4.2) Acetato de (3S)-3- (L-leucilamino)tetra-hidrofuran-2 ilo:

Introduzem-se 1,14 g (2,89 mmoles) intermediário 4.1 e 227 mg de Pd/C a 10% num reactor em inox contendo 30 mL de ácido acético. A mistura é agitada sob 2 atm. De pressão de hidrogénio durante 4 h 30. Após a filtração do catalisador, o ácido acético é evaporado sob vácuo. O residuo oleoso obtido é repartido entre 50 mL de diclorometano e 50 mL de uma solução saturada de NaHC03. A agitação e decantação são seguidas por uma lavagem da fase orgânica com água e solução salina. Após secagem sobre Na2S04, filtração e concentração até à secura o óleo incolor obtido cristaliza espontaneamente para originar 0,45 g de um sólido branco com um rendimento de 60%. Ponto de fusão: 75-80 °C. 4.3) Iodidrato de acetato de {3S)-3-({N-[imino(10H-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucil}amino)tetra-hidrofuran-2-ilo: 0 protocolo experimental utilizado é o mesmo que o descrito para a síntese do intermediário 1.7, a partir do intermediário 1.6 e do intermediário 4.2, excepto por solvente de reacção ter sido neste caso THF e o tempo de aquecimento estar limitado a 4 horas. A mistura de reacção é adsorvida directamente em sílica e depositada no topo de uma coluna do cromatografia (heptano/AcOEt: 3/7 até 0/1) para purificação. Após recolha e evaporação das fracções puras, obtêm-se 0,27 g de um sólido cor de laranja com um rendimento de 18%. Ponto de fusão: 130-131 °C. 32

Exemplo 5: Iodidrato de N1 [(3S)-2-hidroxitetra-hidrofuran-3-il] -N2-[imino(lO.ff-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucinamida

Adicionam-se, a 23 °C, 12 mg (0,1 eq.) de ácido benzenossulfónico a uma solução de 0,42 g (0,69 mmole) do intermediário 4.3 em 42 mL de THF. Após 5 h 30 de agitação a 23 °C. Adicionam-se 137 pL de uma solução de NaHCCp 0,5 M (0,1 eq.). A agitação é mantida durante 5 minutos adicionais antes da filtração do precipitado formado. O filtrado é concentrado até á secura e o resíduo purificado numa coluna de sílica (diclorometano/EtOH: 95/5 até 90/10). As fracções puras são reunidas e evaporadas para originar 171 mg de um sólido cor de laranja com um rendimento de 43%. Ponto de fusão: 148-150 °C.

Exemplo 6: 6.1) N-etil-1OH-fenotiazina-2-carboxamida:

Adicionam-se gota a gota 5,8 mL (3,3 eq.) de DIEA a uma solução de 2,43 g (10 mmoles) de ácido 10ií-fenotiazina-2-carboxílico, 1,79 g (2,2 eq.) de cloridrato de etilamina e 4,17 g (1,1 eq.) de HBTU em 50 mL de DMF, arrefecido a 0 °C. A mistura de reacção é agitada durante 15 horas, a 23 °C e vertida de seguida numa mistura de 100 mL de uma solução saturada de

NaHC03 e 100 mL de AcOEt. Após alguns minutos de agitação, o precipitado formado é eliminado por filtração e o filtrado é decantado. A fase orgânica é lavada sucessivamente com água, solução de ácido cítrico 1 M e solução salina. A solução orgânica é seca sobre sulfato de sódio, é filtrada, concentrada até à secura sob vácuo. O sólido obtido é suspenso em Et20, 33 triturado e filtrado. Obtém-se um sólido bege com um rendimento quantitativo. Ponto de fusão: 150-151 °C. 6.2) N-etil-10H-fenotiazina-2-carbotioamida: O protocolo experimental utilizado é o mesmo que o descrito para o intermediário 1.5, o intermediário 6.1 substituindo a 10f/-fenotiazina-2-carboxamida. Obtêm-se 2,17 g de um sólido amarelo com um rendimento de 60%. Ponto de fusão: 155-156 °C. 6.3) Cloridrato de N-etil-10H-fenotiazina-2-carbimidotioato de metilo: 0 protocolo experimental utilizado é o mesmo que o descrito para o intermediária 1.6 utilizando iodometano, o intermediário 6.2 substituindo o intermediário 1.5. O composto obtido salificado, sob a forma iodidrato é, em seguida, repartido entre uma solução saturada de NaHCC>3 e AcOEt. Após decantação, a fase orgânica é lavada com água e solução salina, é seca sobre sulfato de sódio e filtrada. Adicionam-se em seguida 1,1 eq. De uma solução titulada de HC1 1 N em Et20 anidro a esta solução orgânica arrefecida a 0 °C. Após uma hora de agitação a 23 °C, a mistura de reacção é concentrada até à secura sob vácuo. O resíduo da evaporação é finalmente suspenso em Et20 e é filtrado. Obtém-se um sólido vermelho escuro. Ponto de fusão: 142-143 °C. 34

Estudo farmacológico dos compostos da invenção:

Todas as percentagens sao indicadas em volume.

Efeito in situ dos compostos de acordo com a invenção sobre a actividade enzimática calpaína de células esqueléticas humanas (SKM) 0 principio do teste é o seguinte: a maitotoxina é uma toxina que causa a abertura dos canais de cálcio das células. 0 fluxo de cálcio intracelular que dai resulta está na origem da morte da célula. Ao longo deste processo de morte celular, é activada uma protease dependente da cisteina, a calpaína. 0 teste consiste em incubar células na presença de maitotoxina, para activar a enzima calpaína e adicionar um substrato da calpaína que se torna fluorescente quando a enzima quebra este substrato. Finalmente, são testados inibidores da calpaína. São inoculados mioblastos a 2500 células por poço em placas de 96 poços num meio de cultura DMEM FBS (soro de vitelo fetal) a 10% suplementado com anfotericina B, factor epidérmico de crescimento recombinante humano e dexametasona. Três dias após a inoculação, as células aderiram ao fundo do poço, a diferenciação das células em miotubos é induzida pela adição de 100 pL de meio DMEM F12 contendo de soro de cavalo a 2%. Após três dias adicionais, são depositados 100 pL do composto a ser testado no fundo dos poços. Após uma hora de incubação a 37 °C sob de uma atmosfera de C02 a 5%, são adicionados o substrato fluorescente da calpaína (Suc-Leu-Tyr-AMC) e maitotoxina (MTX) (Sigma, ref: M-9159). São preparados na placa, poços de controlo sem compostos a serem testados (100 pL de DMSO diluído à 100a 35 adicionado de 10 μί de MTX e substrato) para determinar a actividade total da enzima celular. Os ruídos de fundo são determinados preparando os poços suplementares de controlo sem MTX. Cada concentração dos produtos é testada em triplicado. As placas são agitadas, a fluorescência é lida a 380/460 nm utilizando um aparelho denominado Vitor no tempo zero. A incubação ocorre durante três horas a 30 °C no escuro.

Os valores da fluorescência permitem calcular um efeito-concentração para cada um dos compostos. A IC5o (concentração da substância a testar que inibe 50% da actividade da enzima) é calculada a partir deste efeito-concentração. 0 composto do exemplo 5 apresenta uma IC50 inferior a 20 μΜ neste teste.

Estudo dos efeitos sobre a peroxidaçao lipídica do córtex cerebral de rato A actividade inibidora dos produtos da invenção é determinada pela medição dos seus efeitos sobre 0 grau de peroxidação lipídica, determinado pela concentração em malondialdeído (MDA). O MDA produzido por peroxidação dos ácidos gordos insaturados é um bom índice da peroxidação lipídica (H Esterbauer e KH Cheeseman, Met. Enzymo/. (1990), 186, 407-421). Foram sacrificados por decapitação, ratos Sprague Dawley do sexo masculino com 200 a 250 g (Charles River) . O córtex cerebral é recolhido, depois homogeneizado em potter de Thomas em tampão Tris-HCl 20 mM, pH = 7,4. O homogeneizado é centrifugado duas vezes a 50000 g durante 10 minutos a 4 °C. O sedimento é conservado a -80 °C. No dia da experiência, o 36 sedimento é ressuspenso à concentração de 1 g/15 mL e centrifugado a 515 g durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante é utilizado imediatamente para a determinação da peroxidação lipidica. O homogeneizado de córtex cerebral de rato (500 pL) é incubado a 37 °C durante 15 minutos na presença dos compostos a testar ou de solvente (10 pL) . A reacção de peroxidação lipidica é iniciada pela adição de 50 pL de FeCl2 1 mM, EDTA 1 mM e ácido ascórbico 4 mM. Após 30 minutos da incubação a 37 °C, a reacção é parada pela adição de 50 pL de uma solução de di-terc-butiltolueno hidroxilado (BHT, 0,2%). O MDA é quantificado utilizando um teste calorimétrico, fazendo reagir um reagente cromogénico (R) o N-metil-2-fenilindole (650 pL) com 200 pL do homogeneizado durante 1 hora a 45 °C. A condensação de uma molécula de MDA com duas moléculas do reagente R produz um cromóforo estável cujo comprimento onda da absorvência máxima é igual a 586 nm. (Caldwell et al., European J. Pharmacol. (1995), 285, 203-206) .

Os compostos dos exemplos 1 a 5 apresentam uma IC50 inferior a 5 pM neste teste.

Efeito protector dos compostos de acordo com a invenção na morte celular induzida pela maitotoxina em células esqueléticas humanas (SKM) O principio do teste é o seguinte: a maitotoxina é uma toxina que causa a abertura dos canais de cálcio das células. O fluxo de cálcio intracelular que dai resulta está na origem da morte da célula. Ao longo este processo de morte celular, é activada uma protease dependente de cisteina, a calpaina e são abundantemente produzidos radicais livres. O teste consiste em 37 incubar células na presença de moléculas a testar, para retardar ou inactivar a morte celular e deste modo determinar o seu efeito protector.

Os mioblastos são inoculados com 2500 células por poço em placas com 96 poços num meio de cultura DMEM FBS (soro de vitelo fetal) a 10% suplementado com anfotericina B, factor epidérmico de crescimento recombinante humano e dexametasona. Três dias após a inoculação, as células aderiram ao fundo do poço, a diferenciação das células em miotubos é induzida pela adição de 100 pL de meio DMEM F12 contendo de soro de cavalo a 2%. Após três dias adicionais, são depositados 100 pL do composto a ser testado no fundo dos poços. Após uma hora de incubação a 37 °C sob de uma atmosfera de CO2 a 5%, é adicionada maitotoxina (MTX) (Wako, ref: 131-10731) para avaliar o efeito protector (efeito-concentração) sobre a morte celular do composto a ser testado.

Após um tempo de incubação de 3 h ou 96 h, o meio de cultura é substituído por um meio DMEM FBS a 10% suplementado com WST-1 a 10%. O WST-1 (Roche, referência 1644807) é um reagente corante de células metabolicamente activas ou sejam células vivas. As células são incubadas durante a 1 hora na presença de WST-1. Depois o número de células vivas é determinado utilizando um aparelho Perkin Elmer Wallac Envision 2101 por leitura da absorvência a 450 nm. É em seguida calculado o efeito-concentração dos produtos sobre a proporção de sobrevivência de células. A CE50 (concentração da substância a testar que protege 50% das células da morte celular) é calculada a partir deste efeito-concentração . 38 0 composto do exemplo 5 apresenta, neste teste, uma EC50 inferior de 16,4 μΜ após 3 horas de incubação na presença de maitotoxina e 18,3 μΜ após 96 horas de incubação na presença de maitotoxina. É realizado um teste comparativo com a-metilprednisolona que é um composto utilizado para o tratamento da distrofia muscular de Duchenne. Em comparação com o mesmo teste e nas mesmas condições, a α-metilprednisolona apresenta uma EC50 de 354, 3 μΜ após 3 horas de incubação na presença de maitotoxina e 195,7 μΜ após 96 horas de incubação na presença de maitotoxina.

Otoxicidade induzida após um tratamento com gentamicina: Efeito protector de compostos de acordo com a invenção

Demonstração do efeito protector de compostos de acordo com a invenção, administrados em co-tratamento, no que respeita à perda de células ciliadas induzida pela gentamicina.

Principio do teste: a gentamicina e outros aminoglicósidos causam um dano nas células ciliadas e uma perda de audição em humanos. Os peixes Zebra (Zebrafish) apresentam órgãos sensoriais na superfície do seu corpo, designados neuromastos. Estas células ciliadas neuromastos são estruturalmente e funcionalmente semelhantes às células ciliadas internas do ouvido humano. Nestes peixes, as células ciliadas neuromastos podem ser marcadas com DASPEI (idodeto de 2,4-dimetil-aminoestiril-N-etilpiridínio) e esta marcação reflecte o número de células ciliadas funcionais. 39 São induzidos danos nas células ciliadas internas dos peixe Zebra pelo tratamento com gentamicina. Para testar o efeito protector do composto a ser testado em células ciliadas danificadas pela gentamicina, o composto foi administrado em co-tratamento com gentamicina. As células ciliadas internas são em seguida marcadas e quantificadas. 0 estudo é realizado em peixes com aproximadamente 5 dias de idade incubados com gentamicina 1 pg/mL durante 24 horas na presença ou na ausência do composto. São realizados controlos em paralelo; veiculo apenas (DMSO a 1%; controlo positivo). Os controlos negativos são peixes tratados com gentamicina apenas. A CE50 (concentração da substância a testar que protege 50% das células da morte celular) é calculado a partir deste efeito-concentração . É realizada coloraçao DASPEI para visualizar as células ciliadas in vivo (N = 6 por grupo). É utilizada a análise morfométrica para quantificar o sinal de marcação das células ciliadas. O sinal de coloraçao DASPEI dos controlos positivos foi definido como 100%.

Os resultados da tabela 1 mostram que: O sinal de coloração do controlo negativo representa 20% + /- 0,6 do sinal de controlo ou seja uma perda de 80% das células ciliadas após tratamento com gentamicina. O sinal de coloração dos animais tratados com gentamicina e o composto do exemplo 5 testado a 50 μΜ representa 52% +/-10 do sinal de controlo ou seja uma protecção altamente 40 significativa de 40% das células ciliadas danificadas pelo tratamento com gentamicina. Numa gama de concentrações indo de 25 μΜ a 100 μΜ, a CE50 que corresponde à concentração eficaz que permite visualizar 50% das células ciliadas marcadas é de 32 μΜ. O sinal de coloração dos animais tratados com gentamicina e o composto do exemplo 4 a 50 μΜ representa 49% +/- 5 do sinal de controlo ou seja uma protecção altamente significativa de 36,2% das células ciliadas danificadas pelo tratamento com gentamicina. Numa gama de concentrações indo de 2 5 μΜ a 100 μΜ, a EC50 que corresponde à concentração eficaz que permite visualizar 50% das células ciliadas marcadas é de 51 μΜ.

Tabela 1:

Composto [C] % de controlos (% de sinal de coloração de células ciliadas) Significado Estatístico (Valor P) EC50 μΜ (sobrevivência de células ciliadas em % do controlo) (0, 25, 50, 100 μΜ) Controlo 100 Gentamicina 1 pg/m) 20 ± 0,6 Composto do exemplo 5 50 μΜ 52 ± 10 <0,0005* 32 μΜ Composto do exemplo 4 5 0 μΜ 49 + 5 <0,0005* 51 μΜ

Tabela 1: Percentagem de células ciliadas marcadas pelo DASPEI. controlo e efeito

Controlo positivo (zebrafish - DMSO a 1%) ; negativo (Zebrafish - DMSO a 1%-gentamicina 1 pg/mL) 41 dos Expe produtos (Zebrafish - DMSO a 1%-gentamicina-composto) . riência realizada em 6 animais por grupo.

Lisboa, 26 de Setembro de 2012 42

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula geral (I) ou o seu sal

sob a forma racémica, de diastereoisómeros ou quaisquer combinações destas formas em que: R1, R2, R4, R5 e R6 representam, independentemente, um átomo de hidrogénio, um átomo de halogéneo, grupo OH, um radical alquilo, alcoxilo, ciano, nitro, amino, alquilamino ou ácido carboxílico; R3 representa um átomo de hidrogénio, um radical alquilo ou um grupo -COR10; R10 representa um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo, alcoxilo, arilo ou um radical heterocíclico; W representa um átomo de enxofre; R7 representa um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo; 1 R8 representa um átomo de hidrogénio, um radical halogenoalquilo ou alcenilo, um radical cicloalquilo, um radical alquilo linear ou ramificado, substituído ou não que quando é substituído contém uma função química, tais como ácido carboxílico, amina, álcool, guanidina, amidina, tiol, tioéter, tioéster, alcoxilo, heterocíclico ou carboxamida; R9 representa um átomo de hidrogénio, um radical alquilo, arilo, arilalquilo, bisarilalquilo, um radical heterocíclico, um radical alquilo heterocíclico ou um grupo -COR10; sendo entendido que: Ns N R7 significa | H H -f V" κΤ%7 ou hT%7 ou %7 ou ,N R7 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R1 ser um átomo de hidrogénio. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por 2 R ser um átomo de hidrogénio. 2 4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R3 ser um átomo de hidrogénio.
5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R4 ser um átomo de hidrogénio.
6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R5 ser um átomo de hidrogénio.
7. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R6 ser um átomo de hidrogénio.
8. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R7 ser um átomo de hidrogénio.
9. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R8 ser um radical isobutilo.
10. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R9 ser um átomo de hidrogénio.
11. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R9 ser um radical acetilo.
12. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R9 ser um radical metilo.
13. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R9 ser um radical benzilo.
14. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R9 ser um radical naftilmetilo. 3
15. Composto de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizadas em que é seleccionado dos compostos seguintes ou os seus sais: N2-[imino(10H-fenotiazin-2-il)metil]-N1-[(3S)-2-metoxitetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida; N1-[(3S)-2-(benziloxi)tetra-hidrofuran-3-il]-N2-[imino(lOH-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucinamida; N2-[imino(lOH-fenotiazin-2-il)metil]-N1-[(3S)-2-(2-naftilmetoxi)tetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida; Acetato de (3S)-3-({N-[imino(10H-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucil}amino)tetra-hidrofuran-2-ilo; N1-[(3S)-2-hidroxitetra-hidrofuran-3-il]-N2-[imino(10H-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucinamida.
16. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, para utilização como substância terapeuticamente activa.
17. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, para utilização como substância terapeuticamente activa para o tratamento da patologias caracterizadas por uma produção excessiva de ROS e/ou uma activação das calpainas.
18. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, para utilização como substância terapeuticamente activa para tratar as doenças e distúrbios seleccionados de doenças inflamatórias ou imunológicas, doenças cardiovasculares, 4 doenças cerebro-vasculares, distúrbios do sistema nervoso central ou periférico, caquexia, sarcopenia, perda de audição, osteoporose, distrofias musculares, doenças proliferativas cancerígenas ou não, cataratas, reacções de rejeição após transplante de órgãos, doenças autoimunitárias, doenças virais ou cancro.
19. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, para utilização como substância terapeuticamente activa para tratar perda de audição, em particular a perda de audição causada por presbiacusia, por um traumatismo acústico ou pela administração de um medicamento, tais como antibióticos, anti-cancerígenos, agentes anti-inflamatórios não esteróides, diuréticos, anti-ulcerosos, agentes anticonvulsivos.
20. Composto de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, para utilização como substância terapeuticamente activa para tratar as distrofias musculares em particular distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular miotónica ou doença de Steiner, distrofia muscular congénita, distrofia muscular das cinturas e a distrofia muscular facio-escapulo-humeral.
21. Medicamento compreendendo pelo menos um composto de fórmula geral (I), tal como definido nas reivindicações 1 a 15 ou um dos seus sais.
22. Compostos de fórmula geral (I), tais como definidos nas reivindicações 1 a 15 ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, como medicamento. 5
23. Composições farmacêuticas contendo pelo menos um composto de fórmula geral (I) tal como definido nas reivindicações 1 a 15 ou pelo menos um sal farmaceuticamente aceitável desse composto.
24. Composto ou seu sal seleccionado dos compostos seguintes: 10H-fenotiazina-2-carbimidotioato de metilo; N1-[imino(1OH-fenotiazin-2-il)metil]-N1-[(3 S)-2-metoxitetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida; N1-[(3 S)-2-(benziloxi)tetra-hidrofuran-3-il]-N2-(imino (1OH-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucinamida; N2-[imino(10H-fenotiazin-2-il) metil]-N1-[ (3S)-2-(2- naftilmetoxi)tetra-hidrofuran-3-il]-L-leucinamida; acetato de (3S)-3-({N-[imino(1OH-fenotiazin-2-il)metil]-L-leucil}amino)tetra-hidrofuran-2-ilo; N-eti1-1OH-fenotiazina-2-carboxamida; N-eti1-1OH-fenotiazina-2-carbotioamida; N-etil-10H-fenotiazina-2-carbimidotioato de metilo.
25. Composto de fórmula geral (IS) ou um seu sal, 6

sob a forma de estereoisómeros ou as suas combinações, em que: W, R1, R2, R3, R4, R5, R6 e R7 têm o mesmo significado que para os compostos de fórmula (I) da reivindicação 1, e R11 representa um radical alquilo, arilo, arilalquilo, bisarilalquilo, um radical heterocíclico ou um radical alquilo heterocíclico. Lisboa, 26 de Setembro de 2012 7