PT1929001E - Novas desidrogenases, derivações a partir delas e método de produção de alcanóis opticamente activos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "NOVAS DESIDROGENASES, DERIVAÇÕES A PARTIR DELAS E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ALCANÓIS OPTICAMENTE ACTIVOS" A presente invenção compreende proteínas, as quais possuem actividade enzimática de redução de alcanóis substituídos. A invenção compreende adicionalmente ácidos nucleicos, os quais codificam estas proteínas, construções de ácidos nucleicos, vectores, microorganismos geneticamente modificados bem como procedimento para o fabrico de alcanóis substituídos opticamente activos, especialmente (S)-alcanóis como por exemplo (S)-3-metilamino-l-(2-tioenilo)-(S)-propanol.

Estado da Técnica:

Desidrogenases são catalizadores versáteis usados na redução enantiosselectiva de aldeídos ou cetonas nos seus correspondentes alcoóis. A escolha das desidrogenases faz-se entre desidrogenases (R)-específicas ou (S)-específicas. Estes catalizadores são em grande medida aplicados na síntese industrial de álcoois opticamente activos. A actividade óptica é o requisito para a actividade selectiva de muitos princípios activos farmacêuticos ou agrários. Assim, pode obter-se um enantiómero com o efeito desejado, enquanto que o outro enantiómero obtido possui um efeito genotóxico. Por esta razão, catalisadores geradores de alcoóis opticamente activos são aplicados no processo de síntese de princípios activos farmacêuticos ou agrários, os quais possuem necessariamente uma especificidade estereoscópica.

Na literatura (como por exemplo EP-A-0 273 658) estão 2 descritas vias de síntese de duloxetinealcoól e duloxetin. A desvantagem desta via de síntese é o facto de esta síntese conduzir a uma mistura racémica de alcoóis e subsequentemente uma separação do racemato é conseguida através da conversão do racemato numa mistura de diasterómeros através de salinização com um ião de sinal contrário opticamente activo. Subsequentemente é realizada uma separação física dos diastereómeros. Desta resultam os elevados custos do procedimento, devido à repetitiva separação sólido-líquido e um mais elevado custo de matérias primas resultante do adicional passo de separação do sal opticamente activo.

Uma abordagem mais económica ao fabrico de duloxetinealcoól pode ser obtida através da redução esteroespecífica de 3-metilo-amino-1-(2-tioenilo)-propanona. EP1152054 descreve uma nova carbonilo-reductase e a sua aplicação no fabrico de tert. butilo-(3R,5S)-6-cloro-3,5 dihidroxihexanoato. W004/90094 descreve desidrogenases de camitina e a sua aplicação no fabrico de alcanóis opticamente activos.

Breve Descrição da Invenção: A invenção tem como objecto a descoberta de uma via para a redução estereoespecifica de alcanóis substituídos.

Este objectivo é atingido através da preparação de novas desidrogenases, as quais são capazes de realizar a supra referida catálise estereoespecifica.

Um primeiro objecto da presente invenção é caracterizado 3

por um procedimento microbiológico, especialmente para o fabrico enantiosselectivo de alcanóis substituídos de fórmula I

Cyc^P4^R1 (i)

; ' n ÒH

Na qual N significa um número inteiro de valor de 0 a 5, particularmente 0, 1, ou 2;

Cyc significa um substituinte apropriado, caracterizado por aneis carbocíclicos, com um ou mais aneis, saturados ou insaturados, particularmente um anel heterocíclico em forma de pente, insaturado e substituído, e R1 significa um halogeneto, SH, OH, NO2, NR2R3 ou NR2R3R4+X“, especialmente um halogeneto ou NR2R3, no qual R2, R3 e R4 significam, independentemente uns dos outros, um H, ou um alquilo- curto ou um radical alquilóxi- curto e X“ significa um anião,

O qual pode ser convertido na alcanona de fórmula II

O

Na qual n, Cyc e R1 significam o mesmo que supra mencionado, contendo o meio,

a) uma desidrogenase com a sequência polipeptídica SEQ 4 ID NO:2 ou NO:4, ou com uma sequência polipeptídica, na qual até 25% dos resíduos de aminoácidos fornecidos na SEQ ID NO: 2 ou NO: 4 são alterados através de delecção, inserção, substituição uma combinação das anteriores, produzida pelos microorganismos nele cultivados, ou b) uma desidrogenase como a descrita em a) , nele incubado.

Pela qual a redução da ligação da fórmula II na ligação da fórmula I é realizada enzimaticamente e podem-se isolar produtos finais numa forma essencialmente enantiomericamente pura.

Preferencialmente usar-se-à neste procedimento uma enzima com uma sequência polipeptídica de acordo com SEQ ID NO: 2 ou NO:4.

Tais enzimas podem por exemplo ser isoladas de microorganismos do género Candída.

Numa das formas especiais deste procedimento particular, a enzima é escolhida de entre enzimas, caracterizada por conter a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 ou 4, ou por conter a sequência de ácidos nucleicos que codifique tal enzima; e na qual até 25% dos resíduos de aminoácidos possam ser alterados através de delecções, inserções, substituições ou uma combinação destas, mantendo a actividade desidrogenásica e catalisando a síntese enantiosselectiva da associação de fórmula I. A título de exemplo poderá a enzima com a actividade 5 desidrogenásica compreender uma sequência de ácidos nucleicos descrita na SEQ ID NO: 9 ou NO: 3 ou enzimas nas quais 25% dos resíduos de aminoácidos são substituídos através de delecções, inserções, substituições ou uma combinação destas.

De acordo com a presente invenção, o procedimento é caracterizado por preferencialmente serem adicionados equivalentes-redutores (NADH ou NADPH) ou pela conversão regenerativa dos requeridos equivalentes redutores consumidos (bioquímicos ou electroquímicos).

Adicionalmente é preferível que a execução da associação da fórmula geral II seja conseguida na presença de microorganismos, seleccionados das bactérias das Famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae e Nocardiaceae. 0 microorganismo pode ser especialmente um microorganismo recombinante, o qual está transformado com uma construção de ácidos nucleicos, a qual, de acordo com a presente invenção, codifica uma enzima com actividade desidrogenásica como definido anteriormente. 0 objecto da presente invenção é especialmente um procedimento como descrito anteriormente, pelo qual: a) É usado um microorganismo produtor de uma enzima com actividade desidrogenásica obtido de uma fonte natural ou recombinante. b) Este microorganismo é multiplicado. c) A enzima com actividade desidrogenásica é isolada apropriadamente a partir do referido microorganismo ou a partir de uma fracção proteica contendo a referida enzima 6 d) 0 microorganismo de acordo com a alínea b) ou a enzima de acordo com a alínea c) são adicionados a um meio, o qual contém a associação de fórmula I.

A presente invenção compreende adicionalmente um procedimento para o fabrico de uma associação de fórmula III cyc'v>·'4^/R1 (»o • s n ÕAr na qual, n, Cyc e R1 significam o já supra referido e Ar significa um resíduo arilo apropriadamente substituído, com um ou mais aneis e pelo qual, a) em primeiro lugar, é criada a via microbiológica descrita na definição de uma das reivindicações anteriores contendo uma associação de fórmula I, e

b) a associação de fórmula I é associada a uma associação de fórmula IV

Ar-Y (IV) onde Ar tem o significado já referido anteriormente e Y significa um grupo de cadeia longa, e c) a associação de fórmula III é isolada e é adicionada a um ácido salino apropriado farmaceuticamente sem efeitos secundários, como por exemplo oxalato.

Preferencialmente a associação de fórmula III é assim produzida, onde Ar é 1-naftilo, Cyc é 2-tioenilo e R1 é monometilamino e n é igual a 1. 7

Um outro objecto da presente invenção consiste em polipéptidos, os quais compreendem uma sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 2 ou 4, ou a sequência de ácidos nucleicos codificantes derivada a partir dela; e na qual até 25% dos resíduos de aminoácidos podem ser alterados, através de delecções, inserções, substituições ou uma combinação destas, a qual possua actividade desidrogenásica e catalise a síntese enantiosselectiva das associações de fórmula I. 0 objecto da presente invenção, para além da sequência de ácidos nucleicos codificante, compreende também a sequência codificante de um polipéptido de acordo com supra definição.

Adicionalmente, a presente invenção é caracterizada por conter também as cassetes de expressão, compreendendo a combinação de pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos regulatória com a sequência de ácidos nucleicos codificante descrita na definição supra.

Um adicional objecto da presente invenção são os vectores recombinantes, compreendendo pelo menos uma tal cassete de expressão referida. A presente invenção compreende também hospedeiros eucariotas e procariotas, os quais estejam transformados com pelo menos um dos vectores de acordo com a presente invenção.

Descrição detalhada da Invenção: A. Conceitos gerais e definições 8

Quando não indicado em contrário, assim serão entendidos os seguintes termos gerais: "halogeneto" significa Flúor, Cloro, Bromo ou Iodo, preferencialmente Flúor ou Cloro. "alquilo curto" significa radical alquilo de cadeia simples ou ramificada, de 1 a 6 átomos de carbono, tais como metilo, etilo, i- ou n-propilo, n-, i-, sec.-, ou tert.- butilo, n-pentilo ou 2-metilbutilo, n-hexilo, 2-metil-pentilo, 3-metil-pentilo, 2-etil-butilo. "alquenilos curtos" significa análogos acima nomeados como radicais alquilo, com 2 a 6 átomos de carbono, mono- ou poliinsaturados, preferencialmente mono- ou bi-insaturados, nos quais a ligação dupla se pode encontrar em qualquer posição da cadeia de carbono. "alquiloxi curtos" significa análogos dos radicais alquilo acima mencionados com um oxigénio terminal. "arilo" significa um resíduo aromático apropriadamente substituído, com um ou mais aneis, preferencialmente com um ou dois aneis, especialmente um fenilo ou um naftilo ligado em qualquer posição do anel, como 1- ou 2-naftilo. Estes radicais arilo podem ter 1 ou 2 substituintes, diferentes ou iguais, escolhidos entre halogenetos, alquilos curtos, alquiloxi curtos descritos na definição anterior ou trifluorometilo. B. Alcanonas substituídas, (S)-alcanonas e derivados a partir delas

De acordo com a presente invenção através de catálise enzimática dos alcanóis disponíveis de fórmula (I), onde na qual n tem um valor inteiro de 0 a 5;

Cyc significa um anel carbocíclico apropriadamente 9 substituído, com um ou mais aneis, saturado ou insaturado, e RI é um halogeneto, SH, OH, NO2, NR2R3 ou NR2R3R4+X“, onde R2, R3 e R4 são independentemente uns dos outros, H ou um radical alquilo curto ou um radical alquiloxi curto e X- é um anião. A utilização dos alcanóis para a síntese enzimática de fórmula II é por si só já conhecida e de acordo com a aplicação geral conhecida dos procedimentos disponíveis de síntese orgânica (como por exemplo EP-A- 0 273 658).

Nas associações supra mencionadas o n é preferencialmente 0, 1 ou 2, especialmente 1.

Como exemplo de grupos Cyc carbocíclicos temos de nomear especialmente grupos com um ou mais aneis, preferencialmente com um anel:

Estes aneis carbocíclicos contêm especialmente entre 3 a 12, preferentemente 4,5 ou 6 aneis de átomos de carbono. Como exemplo podemos nomear ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, os seus análogos mono- ou poli-insaturados, como ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclohexadienilo, cicloheptadienilo.

Os radicais Cyc podem estar ligados em qualquer posição do anel a uma alcanona, do alcanol respectivo.

Os radicais Cyc podem adicionalmente ser mono- ou poli- substituídos, como por exemplo mono- ou bi-substituídos.

Preferencialmente, os substituintes encontram-se ligados a umm átomo de carbono do anel. Exemplos de substituintes 10 definidos incluem halogenetos, alquilos curtos, alquenis curtos, alquiloxi curtos, -OH, -SH, -N02 ou NR2R3, onde R2 e R3 têm o significado já supra mencionado, preferencialmente Halogenetos ou alquilos curtos. RI é um halogeneto, NR2R3 ou NR2R3R4+X~, onde R2, R3 e, respectivamente, R2, R3 e R4 são, independentemente uns dos outros um H ou um radical alquilo- curto, ou um radical alquiloxi curto e X~ é um anião, no qual preferencialmente um dos radicais R2, R3 e R4 é um H. Aniões definidos são por exemplo aniões salinos, os quais permitam o fabrico de uma salinização ácidica. Exemplos disto estão descritos por exemplo na EP-A-0 273 658, de onde estes dados foram retirados. Exemplos preferenciais de radicais R1 são especialmente flúor ou cloro, tais que NR2R3 onde R2 e R3 podem ser iguais ou diferentes, desde que sejam H ou metilo, etilo ou n-propilo. R1 ser cloro ou -NHmetilo é especialmente preferido. C. Enzimas com actividade desidroqenásica

As enzimas com actividade desidrogenásica de acordo com a presente invenção são encontradas nos microorganismos do género Candida. A enzima relativamente a outras enzimas possuem uma elevada actividade enzimática na redução de alcanonas de fórmula II. Outros substratos, como por exemplo os derivados dimetilicos das cetonas são convertidos em ligações monometilicas pela acção da desidrogenase.

Sem ser qualquer limitação, tais enzimas existem preferencialmente nos microorganismos do género Candida, especialmente na espécie C. magnoliae. 11

De preferência, as enzimas com actividade desidrogenásica possuem uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 2 ou 4 ou uma sequência de aminoácidos, a qual poderá ser substituída em até 25%, preferencialmente até 20%, especialmente preferível até 10%, preferentemente até 8, 6, 5, 4, 3, 2, e 1% dos resíduos de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2 ou NO:4, através de delecções, inserções, substituições ou uma combinação destas.

Especialmente preferível nas enzimas desidrogenásicas acima descritas, estas possuírem na posição 2 um resíduo de treonina e ou um resíduo de glicina na posição 12.

Homólogos das proteínas ou polipéptidos, de acordo com a presente invenção, podem ser obtidos através de mutagénese, por exemplo através de mutações pontuais ou proteínas truncadas.

Homólogos das proteínas de acordo com a presente invenção podem ser identificadas através de rastreios de bancos combinatórios de mutantes, como por exemplo mutantes de proteínas truncadas. Por exemplo, pode ser produzido um banco variegado de variantes de proteínas através de mutagénese combinatória ao nível dos ácidos nucleicos, como por exemplo através da ligação enzimática de uma mistura de oligonucleótidos sintéticos. Existe um grande número de procedimentos, os quais podem ser usados no fabrico de bancos de potenciais homólogos com uma sequência oligonucleotídica degenerada. A síntese química de uma sequência química degenerada pode ser executada num síntetizador automático de DNA e o gene sintético pode então ser ligado ao vector de expressão definido. 12 A aplicação de bancos de genes degenerados possibilita a preparação de todas as sequências numa mistura, as quais conterão o código para as potenciais sequências proteicas desejadas. 0 processo de síntese de oligonucleótidos degenerados é conhecido dos especialistas (por exemplo Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem, 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

De acordo com o estado da técnica são conhecidas mais técnicas para o rastreio de bancos combinatórios de produtos génicos, os quais se baseiam em mutações pontuais ou proteínas truncadas, e para o rastreio de bancos de cDNA de produtos génicos em busca de algum com uma característica escolhida. Estas técnicas baseiam-se na rapidez do rastreio dos bancos génicos, os quais através de mutagénese combinatória permitirão o fabrico de homólogos de acordo com a presente invenção. Os procedimentos técnicos mais comumente para o rastreio de bancos génicos de grande dimensão, baseiam-se numa análise de elevado débito, compreendem a clonagem do banco génico em vectores de expressão replicáveis, a transformação de células definidas com o banco dos vectores resultantes e a expressão dos genes combinatórios requeridos, no qual a prova da actividade desejada é facilitada após o isolamento do vector, o qual codifica o gene, o produto do qual terá essa actividade. Uma técnica, mutagénese por montagem recursiva (REM), na qual os mutantes funcionais mais comuns são mais abundantes no banco génico, pode ser usada em combinação com os testes de rastreio, para a identificação de homólogos (Arkin e Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delagrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331). 13 D. Sequências de ácidos nucleicos codificantes 0 termo "expressão" ou "sobreexpressão" significam no contexto da presente invenção a produção por exemplo um aumento da actividade intracelular de uma ou mais enzimas dentro de um microorganismo, a qual é codificada pelo referido DNA. Assim consegue-se por exemplo colocar um gene num organismo, controlar um gene através de outro, aumentar o número de cópias do gene por exemplo, usar um promotor mais forte ou usar um outro gene, o qual codifique uma enzima supra referida com uma mais elevada actividade e pode-se também combinar estas medidas apropriadamente.

Objecto da presnte invenção são também especialmente as sequências de ácidos nucleicos, as quais codificam uma enzima com actividade desidrogenásica. Preferencialmente as sequências de ácidos nucleicos contêm uma sequência descrita SEQ ID N0:1 ou NO:3. Todas as sequências de ácidos nucleicos aqui apresentadas (sequências de DNA de cadeia simples ou cadeia dupla e sequências de RNA, como por exemplo cDNA e mRNA) são, na sua forma mais conhecida, obtidos por síntese química a partir de monómeros de nucleótidos, como por exemplo através da condensação do fragmento de unidades redundantes, monómeros de aminoácidos complementares da dupla hélice. A síntese química dos oligonucleótidos pode, por exemplo, na sua forma mais conhecida, ser feita usando o método de fosfoamiditil (Voet, Voet, 2a Edição, Wiley Press New York, p 896-897). Os protocolos para armazenamento dos oligonucleótidos sintéticos e o preenchimento dos buracos com ajuda do fragmento de Klenow da DNA Polimerase e reacções de ligação tais como o procedimento de clonagem geral estão descritos no Sambrook et al., (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press. 14

Objecto da presente invenção são também as sequências de ácidos nucleicos (sequências de DNA e RN A, de cadeia simples e dupla, como por exemplo CDNA e mRNA), codificantes de um dos polipéptidos supra descritos e os seus equivalentes funcionais, os quais foram, por exemplo, descritos na aplicação de análogos nucleotídicos artificiais apropriados. A presente invenção compreende também moléculas de ácidos nucleicos, os quais de acordo com a presente invenção, codificam polipéptidos, preferencialmente proteínas ou fragmentos biologicamente activos seus derivados, como também fragmentos de ácidos nucleicos, os quais podem ser usados, por exemplo, como sondas de hibridização ou oligonucleótidos de iniciação para a identificação ou amplificação de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.

As moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, podem conter associadas as sequências não traduzidas da extremidade 3' e/ou a extremidade 5' da região genética dos genes codificantes. A invenção compreende ainda para além das sequências de nucleótidas concretamente descritas, também as moléculas de ácidos nucleicos complementares ou um fragmento seu derivado.

As sequências nucleotidicas de acordo com a presente invenção possibilitam a criação de sondas e oligonucleótidos de iniciação, os quais podem ser usados na identificação e/ou clonagem de sequências homólogas noutros tipos celulares e organismos. Tais sondas, 15 preferencialmente oligonucleótidos de iniciação compreendem usualmente um intervalo de uma sequência de nucleótidos, os quais sob condições restritivas (ver abaixo), híbrida com pelo menos cerca de 12, preferencialmente cerca de 25, como por exemplo cerca de 40, 50 ou 75 nucleótidos sucessivos de uma cadeia sense de uma das sequências de nucleótidos definidas de acordo com a presente invenção, ou de uma cadeia antisense como as previamente referidas.

Uma molécula de ácido nucleico isolada é separada de outras moléculas de ácidos nucleicos, os quais se encontram nas fontes naturais de ácidos nucleicos e pode assim adicionalmente ser essencialmente livre de outros materiais celulares ou meio de cultura, quando esta fôr usada através de técnicas recombinantes ou livre de químicos precursores, ou outros químicos, quando fôr sintetizado quimicamente.

Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser isolada através de técnicas normalizadas de biologia molecular e a informação da sua sequência pode ser obtida. A título de exemplo pode o cDNA ser isolado de um banco de cDNA definido, no qual existe uma das sequências concretas completas aqui reveladas ou um fragmento das mesmas ser usado como sonda de hibridização e técnicas de hibridzação normalizadas (como por exemplo descritas em Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Adicionalmente, é isolada, por uma reacção de polimerase em cadeia, onde os oligonucleótidos de iniciação usados estão na base da preparação desta sequência, uma molécula de ácidos nucleicos, a qual compreende uma das sequências aqui 16 descritas ou um fragmento seu derivado. Os ácidos nucleicos assim amplificados podem ser clonados num vector definido e caracterizados através de análise de sequenciação de DNA. Os oligonucleótidos de acordo com a presente invenção podem também ser fabricados nos procedimentos normalizados de síntese, por exemplo com um aparelho de síntese de DNA automático.

As sequências de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser identificadas e isoladas, por princípio, a partir de todos os organismos. As sequências de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção descritas em SEQ ID NO:1 ou NO:3 podem ser convenientemente isoladas do género Candida.

Sequências de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, como a SEQ ID NO: 1 ou NO:3 ou derivados a partir deles ou partes das referidas sequências, podem ser isolados, por exemplo, com procedimentos adequados de hibridização ou técnica de PCR a partir de outros fungos ou bactérias, por exemplo, através de bancos genómicos ou de cDNA. Estas sequências de DNA hibridam sob condições normalizadas com as sequências de acordo com a presente invenção. É benéfico para ocorrer hibridação, serem usados na hibridação oligonucleótidos curtos num intervalo conservado, por exemplo, do centro activo, o qual pode ser comparado com a L-camitina desidrogenase, a qual pode ser determinada pelo especialista. Podem também ser usados na hibridização fragmentos mais longos dos ácidos nucleicos descritos na presente invenção ou a sequência completa. De acordo com os ácidos nucleicos usados (oligonucleótidos, fragmentos mais longos ou a sequência completa) ou de acordo com que tipo de ácido nucleico - DNA ou RNA é usado 17 para a hibridização, variam as condições normalizadas para a mesma, localizando-se por exemplo a temperatura de desnaturação para os híbridos DNA:DNA cerca de 10°C mais baixa que a mesma para híbridos DNA: RNA de igual comprimento.

Exemplos de condições normalizadas para hibridização de ácidos nucleicos a temperaturas entre 42 e 58°C são uma solução tampão aquosa com uma concentração entre 0,1 a 5 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM de citrato de sódio, pH 7,2) ou adicionalmente a presença de 50% formamida, como por exemplo 42°C em 5 x SSC, 50% formamida. As condições de hibridização vantajosas para híbridos DNA:DNA são 0,1 x SSCe a temperaturas entre cerca de 20°C e 45°C, preferencialmente entre cercad e 30°C e 45°C. As condições de hibridização benéficas para híbridos DNA:RNA são 0,1 x SSCe a temperaturas entre cerca de 30°C e 55°C, preferencialmente entre cerca de 45°C e 55°C. As temperaturas referidas para a hibridização são exemplos calculados a partir das temperaturas de desnaturação para um ácido nucleico com cerca de 100 nucleótidos de comprimento e um conteúdo G+C de 50%, na ausência de formamida. As condições experimentais para a hibridação de DNA estão descritas em qualquer compêndio de estudo sobre Genética, como por exemplo Sambrook et al. , "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, e podem ser calculadas pelos especialistas através de fórmulas conhecidas, sendo dependentes do comprimento dos ácidos nucleicos, do tipo de híbridos ou do conteúdo G+C. Mais informações sobre a hibridização podem ser obtidas a partir dos seguintes livros para especialistas: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, 18

Nucleic Acids Hybridization: Press at Oxford University Pre Essential Molecular Biology: Press at Oxford University Pre a practical approach, IRL ss, Oxford; Brown (ed), 1981, A practical approach, IRL ss, Oxford. São também objecto da presente invenção derivados das sequências de aminoácidos concretamente apresentadas ou derivadas delas.

Sequências de ácidos nucleicos adicionais, de acordo com a presente invenção, podem ser derivadas por exemplo a partir de SEQ ID N0:1 ou NO:3, através de adições, substituições, inserções ou delecções de um ou mais nucleótidos e escolhidas, desde que codifiquem polipéptidos com o perfil de caracteristicas desejado. A presente invenção compreende também sequências de ácidos nucleicos que por comparação a uma sequência concretamente definida, contenham alterações que sejam as denominadas mutações mudas ou digam respeito ao código genético de um organismo hospedeiro ou organismo original, e também naturalmente as variantes originadas, como por exemplo variantes de junção ou variantes alélicas. São igualmente objectos da presente invenção sequências obtidas através de substituições nucleotidicas conservativas (i. e. o referido aminoácido é substituído por um outro aminoácido com a mesma carga, tamanho, polaridade e/ou solubilidade). São também objecto da presente invenção as moléculas de ácidos nucleicos derivadas através de polimorfismos de sequência a partir das sequências de ácidos nucleicos aqui 19 descritas. Estes polimorfismos genéticos podem existir entre dois indivíduos de uma população tendo por base a variabilidade natural. Estas variações naturais traduzem-se normalmente numa variância de 1 a 6% da sequência nucleotídica de um gene.

Entendem-se por derivados das sequências de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção a partir da sequência SEQ ID N0:1 ou NO:3, por exemplo, variações alélicas, as quais possuem pelo menos 40% de homologia ao nível dos aminoácidos, preferencialmente pelo menos 60% de homologia, particularmente em especial pelo menos 80% de homologia em todo o intervalo da sequência (relativamente a homologia ao nível dos aminoácidos é direccionado para os comenários constantes da supra secção dos polipéptidos). É favorável que partes da sequência possam ter homologias mais elevadas.

Adicionalmente, entendem-se também por derivados homólogos das sequências de ácidos nucleicos descritas na presente invenção, especialmente da SEQ ID N0:1 ou N0:3, por exemplo, homólogos bacterianos ou fúngicos, sequências truncadas, DNA de cadeia simples ou RNA codificante e não codificante derivado da sequência de DNA. Por exemplo homólogos da SEQ ID N0:1 podem evidenciar ao nível do DNA uma homologia de pelo menos 40%, preferencialmente uma homologia de pelo menos 60%, especialmente preferível de pelo menos 70%, realmente especialmente preferível de pelo menos 80% ao longo de toda a SEQ ID NO: 1 em todo o intervalo de DNA definido.

Adicionalmente, entendem-se como derivados por exemplo fusões com promotores. Os promotores, os quais estão a 20 montante da sequência de nucleótidos fornecida, podem ser alterados através de uma ou mais substituições de nucleótidos, inserções, inversões e/ou delecções, sem que seja afectada a funcionalidade, preferencialmente a eficiência dos promotores. Os promotores podem através de alterações na sua sequência, aumentar a sua eficiência ou substitui-los completamente por outros promotores mais eficientes provenientes de outros organismos.

Entendem-se também por derivados variantes, nas quais foi alterada a sequência de nucleótidos na região de -1 a -1000 bases a montante do codão de iniciação ou 0 a 1000 bases a jusante do codão stop, de forma a que a expressão génica e/ou a expressão proteica, esteja preferencialmente aumentada.

Adicionalmente, a invenção compreende também sequências de ácidos nucleicos, as quais supra mencionadas como sequências codificantes que hibridizam em condições restritivas. Estes polinucleótidos podem ser encontrados através de pesquisas profundas a partir de bancos genómicos ou de cDNA e podem ser apropriadamente aumentadas através de PCR com oligonucleótidos de iniciação definidos e subsequentemente por exemplo isolados com sondas definidas. Adicionalmente, os polinucleótidos de acordo com a presente invenção podem também ser sintetizados por vias químicas. Entende-se por este termo a capacidade de um poli- ou oligonucleótido sob condições restritivas se ligar a uma sequência quase complementar, e enquanto sob estas condições as ligações inespecíficas entre bases não complementares permanecem. Para isso as sequências devem ser 70-100% complementares, preferencialmente 90-100%. As sequências complementares características, que se podem 21 ligar umas às outras, podem ser utilizadas na técnica de Northern- ou Southern-Blot ou na ligação dos oligonucleótidos de iniciação no PCR ou em RT-PCR. Normalmente estes oligonucleótidos têm um comprimento superior a 30 pares de bases. Entende-se por condições restritivas por exemplo na técnica de Northern-Blot o utilização de uma solução de lavagem quente entre 50 a 70°C, preferencialmente 60-65°C, por exemplo 0,1 x SSC -tampão com 0,1% SDS (20x SSC: 3M NaCl, 0,3M de citrato de sódio, pH 7,0) para eluir hibridações inespecificas de sondas de cDNA ou oligonucleótidos. Assim permanecem ligados apenas os ácidos nucleicos com maior teor de complementariedade uns com os outros, como acima mencionado. A composição das condições restritivas é conhecida dos especialistas e está descrita por exemplo em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. E. Construções de acordo com a presente invenção São objecto da presente invenção para além das construções de expressão, contendo sequências de ácidos nucleicos codificando um polipéptido de acordo com a presente invenção sob o controlo genético de sequências de ácidos nucleicos regulatórias, como também vectores, contendo pelo menos uma destas construções de expressão.

Construções de acordo com a presente invenção coném preferencialmente a montante 5' das referidas sequências codificantes um promotor e a jusante 3' uma sequência terminadora bem como se aplicável elementos regulatórios comuns, os quais estão operativamente ligados à sequência codificante. 22

Entende-se por ligação operativa a ordenação sequencial de promotor, sequência codificante, terminador e quando necessário outros elementos regulatórios adicionais tais, que cada elemento possa cumprir a sua função na expressão pretendida da sequência codificante. Exemplos de sequências operativamente ligadas são sequências direccionadores, como enhancers, sinais de poliadenilação e semelhantes. Elementos regulatórios adicionais contém marcadores selectivos, sinais de amplificação, origens de replicação e similares. As sequências regulatórias definidas são por exemplo descritas em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Entendem-se por construções de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, especialmente os que contenham o gene da Desidrogenase com a sequência SEQ ID NO:1 e NO : 3 e os seus derivados e homólogos, os quais com um ou mais sinais regulatórios, benéficos para o rendimento, por exemplo aumento, e que estão operativamente ou funcionalmente ligados â expressão génica. A regulação natural destas sequências, adicionalmente a estas sequências regulatórias, pode alterar a própria estrutura génica e quando apropriado pode ser geneticamente modificada, de forma a que a regulação natural seja desligada e a expressão do gene possa ser aumentada. As construções de ácidos nucleicos podem ser construídas mais facilmente, o que quer dizer que não seriam inseridos quaisquer sinais reguladores adicionais a montante da sequência codificante (como e.g. SEQ ID NO:l ou NO:3 ou seus homólogos) e o promotor natural com as suas sequências regulatórias não estaria funcional. Em vez disso, as 23 sequências regulatórias naturais são assim mutadas, de forma a que nenhuma regulação tenha lugar e que a expressão do gene possa subir.

Uma construção de ácidos nucleicos preferencial, contém beneficamente uma ou mais já definidas sequências de enhancers, ligadosoperativamente ao promotor, as quais permitem uma mais elevada expressão da sequência de ácidos nucleicos. Também na região a jusante, na extremidade 3' da sequência de DNA podem existir sequências inseridas adicionais, benéficas, tais como elementos reguladores adicionais ou terminadores. As construções contendo os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem conter uma ou mais cópias desses ácidos nucleicos. Nas construções podem existir ainda marcadores adicionais, como genes que conferem resistência a antibióticos ou genes complementares auxotróficos, apropriados para a selecção das construções.

Sequências regulatórias benéficas para as aplicações de acordo com a presente invenção incluem por exemplo promotores como cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5, T3, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPsAD) SP6-, lambda-PR- ou lambda-PL-, os quais são benéficos para aplicações em bactérias gram-negativas. Outras sequências regulatórias, por exemplo promotores para bactérias gram-positivas incluem amy e SP02, promotores para leveduras ou fungos incluem ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Neste grupo incluem-se também os promotores da piruvatodescarboxilase e da metanooxidase, por exemplo de Hansenula. Podem também ser usados promotores artificiais para a regulação. 24

As construções de ácidos nucleicos são inseridas num organismo hospedeiro para expressão, de preferência num vector, como por exemplo um plasmideo ou um fago, o qual possibilita a expressão óptima do gene no hospedeiro. Entende-se por vectores para além de plasmideos e fagos, todos os outros vectores conhecidos dos especialistas, como por exemplo virus, como SV40, CMV, baculovirus e adenovirus, transposões, elementos de inserção, fagemideos, cosmideos e DNA circular ou linear. Estes vectores podem replicar-se autonomamente nos organismos hospedeiro ou replicarem-se com o DNA cromossomal. Estes vectores representam uma reivindicação adicional da presente invenção. Os plasmideos definidos são por exemplo em E. coli pLG33 8, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pRep4, pHSl, pKK223-3, pDHEl9.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-81, lambdagtll ou pBdCI, em Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 ou pIJ361, em Bacillus pUBUO, pC194 ou pBD214, em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667, em fungos pALSl, pIL2 ou pBB116, em levedura 2alphaM, pAG-1, YEp6, YEpl3 ou pEMBLYe23 ou em plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ou ph51. Os plasmideos nomeados são uma escolha mais pequena dos plasmideos possíveis. Podem ser usados outros plasmideos, os quais são conhecidos dos especialistas e podem ser tirados por exemplo do livro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. , Elsevier, Amesterdão-Nova Iorque-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

As construções de ácidos nucleicos para expressão contêm benéficamente o gene bem como sequências regulatórias adicionais terminais 3'- e/ou 5'-terminais para o aumento da expressão, as quais são apropriadas para a expressão óptima do gene ou genes no organismo hospedeiro escolhido. 25

Estas sequências regulatórias devem possibilitar a expressão desejada do gene e a expressão proteica. Isto pode significar que de acordo com o organismo hospedeiro, o gene possa ser expresso primeiro por indução ou sobreexpressão, ou que possa ser expresso e/ou sobreexpresso directamente.

As sequências regulatórias podem, de preferência, influenciar positivamente a expressão génica, aumentando-a. Pode-se conseguir um fortalecimento benéfico por parte dos elementos regulatórios ao nivel da transcrição, pelo uso de sinais de transcrição fortes, provenientes de promotores e/ou enhancers. Do mesmo modo, é igualmente possível um aumento da tradução, no qual é melhorada a estabilidade do mRNA.

Numa outra forma de apresentação dos vectores, as construções de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção ou vectores contendo os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser integrados, por introdução do DNA numa forma linear nos microorganismos o qual é integrado por recombinação homóloga ou heteróloga no genoma dos organismos hospedeiro. Este DNA linear pode ser originado a partir de um vector linearizado como de um plasmídeo contendo as contruções génicas ou a sequência de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.

Para se obter a expressão óptima de um gene heterólogo nos organismos, é benéfico que as referidas sequências sejam adequadas ao código genético dos organimos onde são aplicadas. 0 código genético pode ser avaliado ao computador, no qual genes conhecidos dos organismos referidos são facilmente determinados. 26 0 fabrico de uma cassete de expressão de acordo com a presente invenção permite, através de uma fusão de promotores definidos com uma sequência nucleotidica codificante definida bem como um terminador ou um sinal de poliadenilação. Para isso utilizam-se técnicas de recombinação e de clonagem, como por exemplo as descritas em T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), bem como T. J. Silhavy, M. L. Berman e L.W. Enquist, Experiments with gene fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1964) e em Ausubel, F. M. Et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe. and Wiley Interscience (1987).

As construções recombinantes de ácidos nucleicos, preferencialmente construções génicas para expressão num organismo hospedeiro definido, preferencialmente inserido num vector especifico do hospedeiro, o qual permite uma expressão óptima do gene no hospedeiro. Os vectores são conhecidos pelos especialistas e podem ser escolhidos de "Cloning Vectors" (Pouwels P. H et al., Hrsg, Elsevier, Amesterdão-Nova Iorque-Oxford, 1985). F. Hospedeiros utilizáveis de acordo com a presente invenção

Microorganismos recombinantes são produzidos com o auxilio dos vectores de acordo com a presente invenção, os quais contêm por exemplo um vector de acordo com a presente invenção e podem ser usados para produzir polipéptidos de acordo com a presente invenção. É vantajoso introduzir e exprimir as construções recombinantes de acordo com a presente invenção acima descritas num sistema hospedeiro 27 definido. Para isso são conhecidos dos especialistas métodos de clonagem e de transfecção, como por exemplo co-precipitação, fusão de protoplastos, electroporação, transfecção retroviral e procedimentos semelhantes para obter a expressão dos mencionados ácidos nucleicos nos sistemas de expressão actuais. Sistemas definidos de expressão estão descritos por exemplo em Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, ou em Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual. 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Podem ser usados também microorganismos homologamente recombinados, de acordo com a presente invenção. Para isso é preparado um vector, o qual contém uma porção de um gene de acordo com a presente invenção, ou uma sequência codificante, na qual teve lugar pelo menos uma delecção, adição ou substituição de aminoácidos apropriada, de forma a alterar a sequência de acordo com a presente invenção, por exemplo, para disrupção da sua função (vector de perda de função). As sequências usadas podem por exemplo ser um homólogo de um outro microorganismo usado ou de uma origem mamífera, de levedura ou entomológica. 0 vector usado para a recombinação homóloga pode alternativamente ser preparado, de forma a que o gene endógeno seja mutado por recombinação homóloga ou alterado de outra maneira, de forma a que ainda codifique uma proteína funcional (e. g. as sequências regulatórias a montante podem induzir alterações, de forma a alterar a expressão das proteínas endógenas) . 0 fragmento alterado do gene de acordo com a presente invenção está presente no vector recombinante homólogo. A construção dos vectores definidos para 28 recombinação homóloga está descrita em Thomas, K. R. E Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503.

Como organismos recombinantes hospedeiros dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção ou construções de ácidos nucleicos temos em primeiro lugar todos os organismos procariotas e eucariotas. Organismos hospedeiros como bactérias, fungos e leveduras são preferencialmente usados. De preferência são usadas bactérias gram- positivas ou gram-negativas, preferentemente bactérias das famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Phizobiaceae, Streptomycetaceae ou Nocardiaceae, especialmente preferível bactérias do género Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium ou Rhodococcus. Especialmente preferível é o género e tipo Escherichia coli. Outras bactérias apropriadas podem ser seleccionadas do grupo alpha-Proteobactérias, beta-proteobactérias ou gamma-proteobactérias. O organismo hospedeiro ou os organismos hospedeiros de acordo com a presente invenção contêm preferencialmente pelo menos uma das sequências de ácidos nucleicos, construções de ácidos nucleicos ou vectores, descritos na presente invenção, os quais codificam para uma enzima com actividade desidrogenásica de L-Camitina (Kleber HP (1997) FEMS Microbiology, 147, 1-9).

Os organismos usados nos procedimentos de acordo com a presente invenção, conhecidos como organismos hospedeiros pelos especialistas, foram incubados, preferencialmente crescidos. Os microorganismos foram por regra incubados em meio líquido, o qual contém uma fonte de carbono, maioritariamente em forma de açúcar, uma fonte de azoto, 29 maioritariamente em forma de fontes de azoto orgânico como extracto de levedura ou sais como sulfato de amónia, elementos vestigiais como sais de ferro, manganês, magnésio e vitaminas apropriadas, a uma temperatura entre 0°C e 100°C, preferentemente entre 10°C e 60°C sob uma atmosfera de oxigénio. Desse modo o valor de pH do liquido rico em nutrientes pode ser mantido a um valor fixo, durante a inoculação ou não. A inoculação pode ser feita em "batch", "semi-batch" ou de forma continua. Os nutrientes podem ser administrados no inicio da fermentação ou semicontinuamente ou continuamente adicionados. A cetona pode ser adicionada directamente ao inoculo ou de preferência após a inoculação. As enzimas podem, de acordo com os procedimentos descritos nos exemplos, ser isoladas a partir dos organismos ou usadas como extractos crus da reacção.

Os organimos hospedeiros contêm preferentemente 1U/L de actividade enzimática, como por exemplo de actividade L-camitinadesidrogenásica preferentemente 100U/L, especialmente preferível mais de 1000U/L. G. Fabrico recombinante do polipéptido

Objecto da presente invenção são também os procedimentos para o fabrico recombinante de de polipéptidos de acordo com a presente invenção ou fragmentos deles derivados funcionalmente e biologicamente activos, pelos quais um microorganismo produtor de polipéptidos é cultivado, induzido apropriadamente para a expressão do polipéptido e este é isolado da cultura. Os polipéptidos podem também ser produzidos em larga escala, desde que desejado. 0 microorganismo recombinante pode de acordo com procedimentos conhecidos ser cultivado e fermentado. 30

Bactérias podem ser por exemplo cultivadas em meio TB ou LB, a uma temperatura de 20 a 40°C e a um valor de pH de 6 a 9. As condições de cultivo em geral podem ser encontradas por exemplo em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

As células, desde que não secretem as proteínas para o meio de cultura, são recolhidas e o produto é isolado por métodos de isolamento de proteínas conhecidos e recuperadas do lisado. As células podem ser lisadas através de ultrassons de alta frequência, através de alta pressão, como p. e. numa prensa francesa, através de osmólise, através da acção de detergentes, enzimas liticas ou solventes orgânicos, através de homogeneizadores ou através de uma combinação de mais do que um destes procedimentos.

Uma purificação do polipéptido pode ser conseguida através de procedimentos conhecidos de cromatografia, como cromatograf ia de filtração em gel, tal como com outros procedimentos comuns como ultrafiltração, cristalização, dessalinização, diálise e electroforese nativa em gel. Procedimentos específicos podem ser encontrados em Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlim, Nova Iorque ou em Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, Nova Iorque, Heidelberg, Berlim.

Pode suceder que os sistemas de vectores de proteínas recombinantes ou oligonucleótidos utilizados, cujo cDNA engloba uma sequência de nucleótidos definida alargada e por isso codifica polipéptidos diferentes ou proteínas de fusão, as quais p. e. podem traduzir-se em mais facilmente 31 purificáveis. As modificações definidas são por exemplo a adição de sequências chamadas "Tags" com função de âncoras, como por exemplo a conhecida modificação pela adição de uma âncora de hexa-histidina ou epitopos, os quais são antigénios reconhecidos por anticorpos (descrtio por exemplo em Harlow, E. e Lane, D., 1988 Antibodies, . A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (NY, Press). Estas âncoras podem ser usadas como auxiliares da adesão das proteínas a um suporte sólido, como p. e. uma matriz de polímero, a qual, por exemplo pode ser ser usada no enchimento de uma coluna de cromatografia, ou numa microplaca ou num outro suporte qualquer.

Ao mesmo tempo, estas âncoras podem usadas para o reconhecimento das proteínas. Para o reconhecimento podem ser usados, para além dos normais marcadores, como corantes fluorescentes, marcadores enzimáticos, os quais através da reacção com um substrato produzem um produto de reacção detectável, ou marcadores radioactivos, sozinhos ou em combinação com as âncoras usadas nas derivações das proteínas. H. Execução do procedimento para o fabrico de (S)-alcanóis de acordo com a presente invenção

As enzimas com actividade desidrogenásica podem ser usadas no procedimento descrito na presente invenção como enzimas livres ou imobilizadas. 0 procedimento da presente invenção é executado a uma temperatura ente 0°C e 95°C, preferentemente entre 10°C e 85°C, especialmente preferível entre 15°C e 75°C. 0 valor de pH do procedimento descrito na presente invenção 32 situa-se de preferência entre pH 4 e 12, preferentemente entre pH 4,5 e pH 9, especialmente preferível entre pH 5 e

Por purificação de enantiómeros entende-se preferencialmente um procedimento de acordo com a presente invenção para a purificação de produtos quirais, enantiómeros, que evidencia um enriquecimento dos mesmos. Os procedimentos de purificação dos enantiómeros devem atingir uma pureza de preferência de pelo menos 70%ee, preferencialmente de pelo menos 80%ee, especialmente preferível de pelo menos 90%ee, especialmente de pelo menos 98%.

No procedimento de acordo com a presente invenção podem ser usadas células crescidas, as quais contêm os ácidos nucleicos, construções de ácidos nucleicos ou vectores de acordo com a presente invenção. Também podem ser usadas células dormentes ou já lisadas. Entendem-se por células já lisadas por exemplo as células que foram tornadas permeáveis através de manuseamento de por exemplo solventes, ou células que foram lisadas através da acção de uma enzima, de uma acção mecânica (p. e. prensa francesa ou ultrassons) ou por um outro método.

Os extractos crus assim obtidos são, de acordo com a presente invenção, preferencialmente definidos. Podem ser usadas enzimas purificadas e não purificadas, para o procedimento agora descrito. Está também definida a utilização de microorganismos imobilizados ou enzimas, a qual depende das aplicações das reacções. 0 procedimento de acordo com a presente invenção inclui o 33 uso de organismos livres ou enzimas, os quais são, antes da extracção, separados expedientemente, por por exemplo uma filtração ou centrifugação.

Os produtos do procedimento de acordo com a presente invenção, podem ser benéficamente extraídos ou destilados da fracção aquosa. A extracção pode ter de ser repetida mais vezes devido ao aumento da expressão. Exemplos para meios de extracção definidos temos solventes, como toluol, metilenocloreto, butiloacetato, benzóis, MTBE ou éster acético, sem que com isso estejam a ser limitados a estes.

Após a restrição da análise à fase orgânica, os produtos resultantes podem por regra ter uma elevada taxa de pureza química, o que quer dizer acima de 80% de pureza química. Após a extracção, a fase orgânica com o produto, restrita a uma parte, vai ser usada para cristalização. Por isso, a solução deve ser arrefecido a uma temperatura ideal de 0°C a 10°C. A cristalização pode ter lugar directamente a partir do solvente orgânico ou a partir de uma solução aquosa. O produto cristalizado pode ser novamente cristalizado, no mesmo solvente ou noutro, após ser retirado e recristalizado. Através da subsequente execução do procedimento de cristalização, pelo menos uma vez, a pureza dos enantiómeros dos produtos possivelmente aumentará. A partir da mencionada capacidade de processamento, o produto derivado do procedimento de acordo com a presente invenção corresponde a 60 a 100%, preferencialmente de 80% a 100%, especialmente entre 90 e 100%, podendo ser isolado e subsequentemente aplicado das reacções a partir de um substrato definido, como por exemplo de 3-metilamino-l-(2- 34 tioenilo)-propano-l-ona. 0 produto isolado caracteriza-se por uma pureza química de >90% preferencialmente, de preferência >96% e especialmente >98%. Adicionalmente, os produtos têm uma elevada pureza enantiomérica, apesar de com o recurso a cristalização, a pureza poder ainda ser aumentada. O procedimento de acordo com a presente invenção pode ser executado em batch, em semi-batch ou continuadamente. A execução do procedimento pode ser feita em biorreactores, como por exemplo o descrito em Biotechnology, Band 3, 2a edição, Rehm et al., Hrsg., (1993), especialmente no capítulo II. A descrição supra e os exemplos seguintes servem apenas para clarificar a invenção. As inúmeras variações possíveis estão apropriadamente compreendidas na presente invenção.

Parte Experimental Exemplo 1

Actividade relativa das desidrogenases de acordo com a presente invenção, de acordo com diferentes substratos (entre parêntesis é dada a pureza óptica em %ee)

Substrato Enzima ADH-3 Enzima ADH-4 Enzima comparadora EP SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4 1152054 SEQ ID NO: 1 Acetofenona 16,08 (>99%) 3,14 (70%) 0,84 (>99%) m-DICAP 100 (>99%) 56,38 (12%) 2,3 (>99%) CMAP 34,46 (90%) 24,89 (88%) 29,44 (98%) A reacção é realizada sem recurso a regeneração com um co- factor. 35

Composição da reacção: 180pL de Tampão Kpi 50mM, contendo 1 mM MgC12 20pL de solução enzimática 200pL de NADPH 10M solução stock 100pL Substrato 1M solução stock 500pL Hexano A mistura de reacção é incubada durante 20 horas a 37°C a lOOOU/min. Subsequentemente é centrifugada a 20°C e o sobrenadante transparente removido e analisado através de cromatografia gasosa quiral.

Exemplo 2:

Actividade relativa das desidrogenases de acordo com a presente invenção na utilização de diferentes substratos com regeneração com uso de co-factor (entre parêntesis é dada a pureza óptica em %ee).

Reacção executada de forma análoga ao exemplo 1. A regeneração com o uso de co-factor é executada através da adição de glucose e glucosedesidrogenase num sistema liquido monofásico.

Substrato Enzima ADH-3 SEQ ID NO: 2 Enzima ADH-4 SEQ ID NO: 4 Enzima comparadora EP 1152054 SEQ ID NO: 1 Acetofenona 8,9 (>99% S) Não executado 0, 7 (>99% S) m-DICAP 100 (>99% R) 55,8 (25% S) 47, 1 (83% R) p-DICAP 18,9 (>99% R) 62,1 (44% S) 62,5 (>99% R) CMAP 99,5 (>99% R) 53,6 (44% S) 50,4 (>99% R)

Exemplo 3:

Actividade relativa das desidrogenases de acordo com a presente invenção na utilização de diferentes substratos com recurso a regeneração por co-factor num sistema de duas 36 fases (entre parêntesis é dada a pureza óptica em %ee). Reacção executada de forma análoga ao exemplo 2. A regeneração com o uso de co-factor é executada através da adição de glucose e glucosedesidrogenase num sistema liquido bifásico (MTBE:aquoso).

Substrato Enzima ADH-3 Enzima ADH-4 Enz ima comparadora EP SEQ ID NO : 2 SEQ ID NO 4 1152054 SEQ ID NO: 1 Acetofenona 71,2 (>99 % S) 0,4 (70% S) 0, 2 (>99% S) m-DICAP 100 (>99% R) 24,6 (6% S) 14 (>99% R) p-DICAP 30, 4 (>99 % R) 27,6 (42% S) 24, 2 (>99% R) FCA 99, 5 (>99 % R) 15, 3 (46% S) 12, 6 (>99% R) CMAP 100 (>99% R) 77,1 (97% S) 46, 8 (>99% R)

Abreviaturas: m-DICAP: 2,3'-dicloro-acetofenona p-DICAP: 2,4'-dicloro-acetofenona FCA: 4'-fluoro-2-cloro-acetofenona CMAP: 4-cloro-metoxi-acetofenona

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110><BASF Aktiengesellschaft <120> Novas desidrogenases, seus derivados e método de produção de alcanóis opticamente activos <130> PF 57135 <160> 4 <170> Patentln Verson 3.1

<210> 1 <211> 723 <212> ADN <213> Cândida magnoliae <22 0>

<221>CDS <222> (1).. (723) 37 <400> : 1 atg acg act act tea aat gcg etc gtc act gga ggc age ege ggc att 48 ttet Thr Thr Thr Ser Aan Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly ile 1 $ 10 15 930 get get CCC gee att aag ctg get cag gag ggc tac agt gtt acg 96 Gly Ala Ala Ser Ala Ile Lys Leu Ala Gin Glu Gly Tyr Ser val Thr 20 25 30 ctg gee tet ege agt gtt gat aaa ctg aat gaa gta aag gcg aaa etc 144 Leu Ala Ser Arg Ser Val Asp Lys Leu Aan Glu Val Lys Ala Lys Leu 35 40 45 cca att gta cag gee 999 cag aag cac tac att tgg gaa etc gat ctg 192 Pro Ile Vai Gin Asp Gly Gin Lys His Tyr Ile Trp Glu Leu Asp Leu 5C 55 60 get gat gtg gaa get get teg teg ttc aag ggt get cct ttg cct get 240 Ala Asp Vai Giu Ala Ala Ser Ser Fhe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala 65 70 75 80 age age tac gac gtc etc gtt teg aac gcg ggc gtc get gcg ttc teg 288 Ser Ser Tyr Asp vai Phe Val Ser Asn Ala Gly Val Ala Ala Phe Ser 85 90 95 ccc aca gee gac cac gat gat. aag gag tgg cag aac ttg etc gee gtg 336 Pro Thr Ala Asp Bis Asp Asp Lys Giu Trp Gin Asn Leu Leu Ala val 100 105 110 aac ttg fccg. teg ccc att gee etc acg aag gee etc ttg aag gac gtc 384 Asn Leu Ser Ser Pre Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu. Leu Lys Asp vai 115 120 125 ccc gaa agg cct gcg gac aat ccg ttg cag att ate tac att teg teg 432 Ser Glu Arg Pro Ala Asp Asn Pro teu Gin Ile Ile Tyr lie Ser Ser 130 135 140 9*9 gee 99« ttg eat ggc gee gcg cag gtc gee gtg tac agt gea tet 480 Vai Ala Gly leu Hàs Gly Ala Ala Gin Val Ala Val Tyr Ser Ala Ser 145 150 155 160 aag gee ggt cct gac ggt ttt atg ege tcc gtc gee cgt gag gtg ggc 528 Lys Ala Gly Leu Asp Gly Pbe Met Arg Ser Val Ala Arg Glu Val Gly 165 170 175 ccn aag ggc ate eat gtg aac tec ate aac ccc gga tac aec aag act 576 Pro Lys «ly Ile Bis Val Asn Ser Ue Asn Pro Gly Tyr Thr Lys Thr 180 185 190 gaa atg aec gcg 93« att gaa gee ctg cct gat ttg cct ate .aag ggg 624 Gla Met Thr Ala Gly 1 la Giu Ala hevi Pro Asp Leu Pro Ile Lys Gly 195 200 205 tgg ate gag ccc gag gea att get gac gcg gtt ctg ttt. ctg gea aag €72 Trp He Giu Pro Giu Ala Ile Àla Asp Ala Val Leu Phe 1«« Ala Lys 210 215 22C ccc aag aat ate aec ggc a ca aac att Stg gtc gac aat ggc ttg att 72 C Ser Lys Asn ne Thr Gly Thr Asn Ile val Val Asp Asn Gly Leu I 225 230 235 240 get 723 Ála 38

<210> 2 <211> 241 <212> PRT <213> Cancida magnoliae <400> 2

Ket Thr Thr Thr Ser Asn Ala Leu Vai Thr Gly Gly Ser Arg Gly lie

1 5 10 IS

Gly Ala AXa Ser Ala lie lys Leu Ala Gin Glu Gly Tyr Ser Vai Thr 20 25 30

Leu Ala Ser Are Ser Vai Asp Lys Leu Asn Gly Vai Lys Ala Lys Leu 35 40 45

Trp Glu Leu Asp Leu 60 Ala Pro Leu Pro Ala 80

Vai Ala Ala Phe Ser 35

Pro Ile Vai Gin Asp Gly Gin Lys His Tyr Ile 50 55

Ala Asp Vai Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Gly 65 j 70 75

Ser Ser Tyr Asp Vai Phe Vai Ser Asn Aia Gly : 85 30

Pro Thr Ala Asp His Asp Asp Lys Glu Trp Gin Aân Leu Leu Aia Vai 100 ’ 105 110

Asn Leu Ser Ser Pro ile Aia Leu Thr Lys Ala Leu Leu Lys Asp Vai 115 120 125

Ser Glu Arg Pro Ala Asp Asn Pro Leu Gin Ile Ile Tyr Ile Ser Ser 130 135 140

Vai Ala Gly Leu His Gly Ala Ala Gin Vai Ala Vai Tyr Ser Ala Ser 145 ISO 155 160

Lys Ala Gly Leu Asp Gly Phe Met Arg Ser Vai Ala Arg Glu Vai Gly 16S 170 175 39

Pro Lys Gly Ile His Vai Asn. Ser lie Asn. Pro Gly Tyr Thr Lys Thr 180 185 ISO

Gly Met Thr Ala Gly lie Glu Ala Leu Pro Asp Leu Fro Ile Lys Gly 195 200 205

Trp Ile Glu Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Vai Leu Phe Leu Ala Lys 210 215 220

Ser Lys Asn Ile Thr Gly Thr Asn Ile Vai Vai Asp Asn Gly Leu lie 225 230 235 240

Ala <210> 3 <211> 723 <212> ADN <213> Cancida magnoliae <22 0>

<221> CDS <222> (1) .. (723) <213> <400> 3 atg a ca tet aca cct aat gcc ctt gte acg gga ggc age ege ggc att Met Thr Ser Thr Fro Asn Ala Leu Vai Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile I S 10 15 ggc gct tcc gcc gcc ate aag ctg gct caa gaa ggg tac age gte acg Gly Ala Ser Ala Ala 11« Lys Leu Ala Gin Glu Gly Tyr Ser val Thr 20 25 30 ctg g«g tcc ege gac ctt gag asa ctt aac gag gte gac aag ctg Leu Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys Leu Asn Glu. Val Lys Asp Lys Leu 35 4C 45 CCS ate gtg agg ggt gga cag aaa eae tac gtt tgg caa ctc gat ctt Fro lie Vai Arg Gly Gly Gin Lys His Tyr Vai Trp Gin Leu Asp Leu 50 55 €0 gcc gafc gta ttg gct gea teg tet ttc aag gcg gct cct ctg ccg gcc Ala Asp Vai Leu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Ala Ala Fro Leu Pro Ala 65 70 75 80 48 96 144 192 240 40 age açc tac gat ttg ttt gtt teg aac gee gga att gee cag ttc teg Ser Ser Tyr Asp Lee Phe Vai Ser Asa Ala Gly Ile Ala Gin Phe Ser 85 90 95 ccc a cg 9 ca gag tat act aat agt gag teg ctg aac att atg acc att Pro Thr Ala Glu Tyr Thr Asn Ser Glu Trp Leu Asn lie Het. Thr Ile 100 105 110 aac tta gtg tcc ccg att gee ctg acg aag gct ctt ttg cag gee gtt Asn Leu Vai Ser Prc Ile Ala Leu thr Lys Ala Leu Leu Gin Ala Val 115 120 .125 tet 999 agg tcc age gag aae ccg ttt cag ate gta ttc ate teg teg Ser Gly Arg Ser Ser Glu Ase Pro Phe Glu Ile Vai Phe XI® Ser Ser 130 135 140 gtt 9 ca oca cta egt ggc gtt gea caa acg gee gtc tac agt gcg teg Vai Alã Ala Lee Arç Gly Vai Ala Gin Thr Ala Val Tyr Ser Ala Ser .145 ISO 155 160 aag gct ggt act gat 99« ttc gea ege tea ctt gct ege gaa cta ggt lys Ala Gly thr Asp Gly Fhe Ala Arg Ser Leu Ala Krg Glu Leu Gly 165 170 175 cct ca a ggc gtc cat 9tg aac gtg Ctg aac cct ggc tgg act aag aca Pro Gin Gly vai Hi® vai. Asn Vai Vai Asn Pro Gly Trp Thr Lys Thr 180 185 190 gae atg acg gaa gga gtc gaa acc cca aag gac atg ccc att aag ggc Asp Ket Thr Glu Gly vai Glu thr Pro Lys Asp mt Pro Ile Lys Gly 195 200 205 tgg ate ! ;ag ^ cct gag gea att gtt gat gct gta gta ttc ctt gcg age Trp Ile Gin pro i Glu Ala ΙΙφ Ala Asp Ala Vai Val Phê Léu Ala Arg 210 215 220 teg aaa . aac att àcC ggc 9C9 âat att gta gtg gae »st 93* ttc teg Ser Ly® ASft lie Thr Gly Ala ASfi Ile Vai Vai Asp Asn Gly Ph® Ser 225 230 235 240 acg Thr 288 336 384 432 480 528 376 624 672 720 723

<210> 4 <211> 241 <212> PRT <213> Cancida magnoliae <400> 4

Gly He X5 Vai Thr fêet Thr Ser Thr Pro Asn Ala Leu Vai Thr Gly Gly Sar Arq 1.5 10

Gly Ala Ser Ala Ala He Lys Leu Alá Gin Glu Gly Tyr Ser 20 25 30 41

Leu Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys Leu Asn Glu Val Lys Asp Lys Leu 35 40 45 Pro lie Vai Arg Gly Gly Gin Lys His Tyr Val Trp Gin Leu Asp Leu 50 55 60 Ala Asp Val Leu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Alã Ala Pro Leu Pro Ala 65 70 75 80 Ser Ser Tyr Asp Leu Phe Vai Ser Asn Ala Gly Ile Ala Gin Phe Ser 85 90 95 Pro Thr Ala Glu Tyr Thr Asn Ser Glu Trp Leu Asn ile Met Thr Ile 100 105 110 Asn Leu Vai Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Gin Ala Val 115 120 125 'Ser Gly Arg Ser Ser Glu Asn Pro Phe Gin Ile val Phe Ile Ser Ser 130 135 140 Vai Ala Ala Leu Arg Gly Vai Ala Gin Thr Ala val Tyr Ser Ala Ser 145 150 155 160 Sys Ala Gly Thr Asp Gly Phe Ala Arg Ser Leu Ala Arg Glu Leu Gly 165 170 175 Pro Gin Gly Vai His Vai Asn Vai Val Asn Pro Gly Trp Thr Lys Thr 180 185 ISO Asp Met Thr Glu Gly Vai Glu Thr Pro Lys Asp Met Pro Xle Lys Giy 195 200 205 Trp Xle Gin Pro Ile Ala Asp Ala Val Val Phe Leu Ala Arg 210 215 220 Ser Lys Asn Ile Thr Gly Ala Asn ile Val- val Asp Asn Gly Phe Ser 225 230 235 240

Thr

Lisboa, 18 de Maio de 2010

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1 - Procedimento para a preparação microbiológica de alcanóis substituídos de fórmula I Cyc-N^^/R1 (I) ÕH nos quais n é um número inteiro de 0 a 5; Cyc é um anel carbocíclico substituído ou não substituído, mono- ou polinuclear, saturado ou insaturado e R1 é um halogeneto, SH, OH, NO2, NR1R2 ou NR1R2R4+X~, no qual R1, R2 e R3 são, independentemente uns dos outros, um H ou radical alquilo de cadeiar reduzida ou um radical alquiloxi de cadeia reduzida e X~ é um anião.

No qual, num meio contendo uma alcanona de fórmula II,

O nos quais n, Cyc e R1 são definidos como seguidamente: a) - é cultivado um microorganismo produzindo uma desidrogenase contendo um polipétido de sequência SEQ ID NO: 2 ou NO: 4. b) - é incubada uma desidrogenase como a descrita em a) 1 - Método, de acordo com a reivindicação anterior, 2 caracterizado por a enzima com actividade desidrogenásica 3 ser seleccionada de entre enzimas constituídas por uma 2 sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2 ou 4, na qual até 25% dos resíduos de aminoácidos foram alterados por delecção, inserção, substituição ou uma combinação destas, e a qual tem actividade desidrogenase e cataliza a síntese enantioselectiva do composto de fórmula I.

3 - Método, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a enzima que contem a actividade desidrogenásica é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com a SEQ NO: 1 ou 3, na qual até 25% dos resíduos de aminoácidos foram alterados por delecção, inserção, substituição ou uma combinação destas.

4 - Método, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a reacção ser levada a cabo com a adição de equivalentes redutores ou sob condições nas quais os equivalentes redutores consumidos são regenerados.

5 - Método, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o composto de fórmula II reagir na presença de um microorganismo seleccionado de entre as bactérias das famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae e Nocardiaceae.

6 - Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o microorganismo ser um microorganismo recombinante que foi transformado com uma construção de ácido nucleico codificando uma enzima que possui actividade desidrogenásica como definido em qualquer das reivindicações 2 a 5.

7 - Um polipéptido caracterizado por conter a sequência de 3 aminoácidos de acordo com a SEQ NO: 2 ou 4, no qual até 25% dos resíduos de aminoácidos foram alterados por delecção, inserção, substituição ou uma combinação destas, e a qual possui actividade desidrogenásica e cataliza a síntese enantiosselectiva do composto de fórmula I.

8 - Sequência de ácidos nucleicos contendo a sequência codificadora do polipéptido descrito de acordo com a reivindicação 7.

9 - Uma cassete de expressão, compreendendo a sequência de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 8, a qual está operativamente controlada por pelo menos uma sequência regulatória de ácidos nucleicos.

10 - Um vector recombinante, contendo pelo menos uma cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 9.

11 - Um hospedeiro procariota ou eucariota, transformado com pelo menos um vector de acordo com a reivindicação 10.

12-0 uso de uma enzima com actividade desidrogenásica de acordo com a reivindicação 7 para a preparação de compostos de fórmula I. Lisboa, 18 de Maio de 2010