PT1853619E - 3-beta-hidroxi-17-(1h-benzimidazol-1-il)androsta-5,16-dieno para utilização no tratamento de uma doença da próstata - Google Patents

Description

ΕΡ 1 853 619/ΡΤ DESCRIÇÃO "3-Beta-hidroxi-17-(lh-benzimidazol-l-il)androsta-5,16-dieno para utilização no tratamento de uma doença da próstata"

Este pedido reivindica o beneficio da data de apresentação do Pedido de Patente Provisória dos E.U.A. com o número de Série 60/657390, apresentado em 2 de Março de 2005. O Governo dos E.U.A. possui uma licença paga sobre esta invenção e o direito em circunstâncias limitadas para requerer ao detentor da patente o licenciamento de outros sob termos razoáveis, conforme providenciado pelos termos da Concessão N° CA27440 concedida pelos instituto Nacional de Saúde ("National Institutes of Health" (NIH)). O presente documento descreve novas entidades químicas, particularmente esteróides C-17 benzoazoles, pirimidinoazoles (azabenzoazoles) e diazinas. São também descritos métodos para a síntese dos benzoazoles, pirimidinoazoles e diazinas. Numa exemplificação, os métodos para síntese dos benzoazoles ou pirimidinoazoles compreendem um passo de reacção de substituição nucleofílica vinílica "adição-eliminação" de 3β-acetoxi-17-cloro-16- formilandrosta-5,16-dieno ou seus análogos e nucleófilos benzoazole ou pirimidinoazole. Noutra exemplificação, os métodos para síntese das diazinas compreendem uma reacção de acoplamento cruzado catalisada por paládio de 17-iodoandrosta-5,16-dien-3p-ol ou seus análogos com tributilestanildiazinas.

Os compostos aqui descritos são inibidores potentes da enzima CYP17 humana, assim como antagonistas potentes de ambos os receptores de androgéneos (RA), tanto do tipo selvagem como mutante. Os inibidores de CYP17 mais potentes são: 3p-hidroxi-17- (lfí-benzimidazole-l-il) androsta-5,16-dieno (5, nome de código VN/124-1), 3p-hidroxi-17-(51-pirimidil) androsta-5,16-dieno (15) e 17-(lfí-benzimidazole-l-il) androsta-4,16-dieno-3-ona (6), com valores de IC50 de 300, 500 e 915 nM, respectivamente. Os compostos 5, 6, 14 e 15 foram eficazes na prevenção da ligação de 3H-R1881 (metiltrienolona, um androgéneo sintético estável) tanto ao RA mutante e a LNCaP e ao RA de tipo selvagem, mas com uma 2 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ eficiência de ligação 2,2 a 5 vezes maior ao último. Os compostos 5 e 6 foi também mostrado serem antagonistas puros potentes de RA. Os estudos de crescimento celular revelaram gue 5 e 6 inibem o crescimento de células de cancro da próstata LNCaP e LAPC4 estimuladas por DHT com valores de iC5o na gama micromolar baixa (i.e., <10 μΜ). As suas potências inibitórias foram comparáveis às de casodex mas notoriamente superiores às de flutamida. A farmacocinética dos compostos 5 e 6 em ratinhos foi investigada. Após a administração s.c. de 50 mg/kg de 5 e 6, ocorreram níveis de pico no plasma de 16,82 e 5,15 ng/mL, respectivamente, após 30 a 60 min, ambos os compostos foram eliminados rapidamente do plasma (meias-vidas terminais de 44,17 e 39,93 min, respectivamente) e nenhum deles era detectável ao fim de 8 h. Notoriamente, o composto 5 foi convertido rapidamente num metabolito identificado por tentativas como 17-(1 Aí— benzimidazol-l-il)androsta-3-ona. Quando ensaiado in vivo, 5 provou ser muito eficaz na inibição do crescimento do xenoenxerto do tumor da próstata humano LAPC4 dependente de androgéneos, enquanto 6 foi ineficaz. O composto 5 (50 mg/kg/duas vezes por dia) resultou numa redução de 93,8% (P = 0,00065) do volume final médio do tumor em comparação com controlos e foi também significativamente mais eficaz do que a castração. Tanto quanto é do nosso conhecimento, este é 0 primeiro exemplo de um agente anti-hormonal (um inibidor da síntese de androgéneos (inibidor de CYP 17)/antiandrogéneo) que é significativamente mais eficaz do que a castração na supressão do crescimento de tumores da próstata dependentes de androgéneos. Face as estas propriedades anti-cancro expressivas, o composto 5 e outros podem ser utilizados para o tratamento do cancro da próstata humano. O cancro da próstata (CP) é a causa maligna e relacionada com a idade mais comum de morte por cancro em todo o mundo. Além do cancro do pulmão, o CP é a forma de cancro mais comum no homem e a segunda causa mais importante de morte dos homens americanos. Nos Estados Unidos da América este ano (2004), estima-se que serão diagnosticados 230000 novos casos de cancro da próstata e cerca de 23000 homens morrerão desta doença (Jemal et al., Câncer Statistics, 2004. CA Câncer J. Clin., 2004, 54, 8-29). Durante o período de 1992 a 1999, a incidência anual média de CP entre os homens 3 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ

Afro-Americanos foi 59% maior do que entre os homens Caucasianos e a taxa de morte anual média foi mais de duas vezes superior à dos homens Caucasianos (American Câncer Society - Câncer Facts and Figures 2003). Os androgéneos desempenham um papel importante no desenvolvimento, crescimento e progressão do CP (McConnell, J. D., "Physiological basis of endocrine therapy for prostatic câncer", Urol. Clin. North Am., 1991, 18: 1-13). Os dois androgéneos mais importantes a este respeito são a testosterona (T) e a dihidrotestosterona (DHT). Os testículos sintetizam cerca de 90% da T e o resto (10%) é sintetizado pelas glândulas adrenais. A T é ainda convertida no androgéneo mais potente DHT pela enzima esteróide 5a-reductase que está localizada principalmente na próstata (Bruchovsky et al., "The conversion of testosterone to 5a-androstan-17p-ol-3-one by rat prostate in vivo and in vitro", J. Biol. Chem., 1968, 243, 2012-2021). Huggins et al. Introduziram a privação de androgéneos como terapia para CP avançado e metastático em 1941 (Huggins et al. "Studies on prostatic câncer: 2. The effects of castration on advanced carcinoma of the prostate gland.", Arch. Surg., 1941, 43, 209-212) . Em seguida, a terapia de ablação de androgéneos foi demonstrado produzir as respostas mais benéficas em situações múltiplas em pacientes com CP (Denmeade et al. "A history of prostate câncer treatment." Nature Rev. Câncer, 2002, 2: 389-396). A orquidectomia (quer cirúrgica quer médica utilizando um agonista de GnRH) continua a ser a opção de tratamento padrão para a maior parte dos pacientes com cancro da próstata. A orquidectomia médica e cirúrgica reduz ou elimina a produção de androgéneos pelos testículos mas não afecta a produção de androgéneos nas glândulas adrenais. Vários estudos referiram que uma terapia de combinação de orquidectomia com antiandrogéneos, para inibir a acção dos androgéneos adrenais, prolonga significativamente a sobrevivência de pacientes com CP (Crawford, et al., "A controlled trial of leuprolide with and without flutamide in protatic carcinoma", N. Engl. J. Med, 1989, 321, 419-424; Crawford, et al., "Treatment of newly diagnosed State D2 prostate câncer with leuprolide and flutamide or leuprolide alone, Phase III: intergroup study 0036", J Urol., 1992, 147: 417A; e Denis, L., "Role of maximal androgen blockade in advanced prostate câncer", Prostate, 1994, 5 (Supl.), 17s- 4

ΕΡ 1 853 619/PT 22s). Num artigo recente de Mohler e colegas (Mohler et al., "The androgen axis in recurrent prostate câncer", Clin. Câncer Res.r 2004, 10, 440-448) foi claramente demonstrado que a T e a DHT ocorrem em tecidos recorrentes de CP a níveis suficientes para activar o receptor de androgéneos. Adicionalmente, utilizando o cálculo de perfis baseados em microarranjos de modelos de xenoenxertos isogénicos de CP, Sawyer e colegas (Chen et al., "Molecular determinants of resistance to antiandrogen therapy." Nat. Med., 2004, 10, 33-39) verificaram que um aumento modesto no ARNm do receptor de androgéneos era a única mudança consistentemente associada com o desenvolvimento de resistência à terapia antiandrogéneos. Compostos potentes e específicos que inibem a síntese de androgéneos nos testículos, adrenais e outros tecidos podem ser mais eficazes para o tratamento do CP. (Njar, V.C.O.; Brodie, A. Μ. H., "Inhibitors of 17[alpha]-hidroxilase- C17j20-lyase (CYP17) : Potential agents for the treatment of prostate câncer", Current Pharm. Design, 1999, 5: 163-180) .

Nos testículos e glândulas adrenais, o últim o passo na biossíntese de T envolve duas reacções chave, que actuam sequencialmente e que são ambas catalisadas por uma única enzima o citocromo P450 monooxigenase 17a-hidroxilase/17,20-liase (CYP 17) (Hall, P. F., "Cytochrome P-450 C2iSCc: one enzyme with two actions: Hydroxylase and lyase", J Steroid Biochem. Molec. Biol, 1991, 40, 527-532). O cetoconazole, como agente anti-fúngico e em virtude de inibir enzimas P450 é também um inibidor modesto de CYP 17 e foi utilizado clinicamente para o tratamento do CP (Trachtenberg et al., "Ketoconazole: A novel and rapid treatment for advanced prostatic câncer", J Urol. 1983, 130, 152-153). Foi relatado que a calendarização cuidadosa do tratamento pode produzir respostas prolongadas em pacientes de cancro da próstata de outra forma resistente ao tratamento com hormonas (Muscato et al., "Optimal dosing of ketoconazole and hydrocortisone leads to long responses in hormone refractory prostate câncer", Proc. Am. Assoe. Câncer Res., 1994, 13: 22 (Resumo)). Por outro lado, o cetoconazole revelou reter actividade em pacientes com CP avançado com progressão apesar da remoção de flutamida (Small et al., "Ketoconazole retains activity in advanced prostate câncer patients with progression despite 5 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ flutamide withdrawal", J Urol, 1997, 157, 1204-1207). Apesar do cetoconazole ter sido agora retirado de utilização devido a toxicidade sobre o fígado e outros efeitos secundários, isto sugere que inibidores de CYP 17 mais potentes e selectivos poderão proporcionar agentes úteis para o tratamento desta doença, mesmo em fases avançadas e em alguns pacientes que possam parecer resistentes ao tratamento com hormonas.

Foi relatada uma variedade de inibidores esteróides e não esteróides potentes de CYP 17 e alguns foram mostrados como sendo inibidores potentes da produção de testosterona em modelos de roedores (Njar e Brodie, acima). Recentemente, Jarman e colegas descreveram o impacte hormonal do seu inibidor de CYP 17 mais potente, abiraterona em pacientes com cancro da póstata (0'Donnell et al., "Hormonal impact of the 17a-hydroxylase/C17,20-lyase inhibitors abiraterone acetate (CB7630) in patients with prostate câncer", Br. J. Câncer, 2004, 90: 2317-2325). Alguns dos nossos inibidores potentes de CYP17 mostraram também inibir a 5a-reductase e/ou são antiandrogéneos potentes com actividade antitumor potente (Njar e Brodie, acima, e Long et al., "Antiandrogenic effects of novel androgen synthesis inhibitors on hormone-dependent prostate câncer." Câncer Res., 2000, 60, 6630-6640). Também ilustrativas dos antecedentes da invenção são as Patentes U.S. Nos. 5 994 335; 6 200 965; e 6 444 683. Foram reveladas tentativas para modelar o farmacóforo tridimensional de inibidores de CYP humana (Clement et al, J. Med. Chem 2003, 46, 2345-2351). Este documento revela uma gama de compostos como inibidores da enzima CYP17 in vitro.

Os presentes inventores desenvolveram uma série de inibidores de CYP 17/antiandrogéneos potentes, os 17-benzoazoles, 17-pirimidinoazoles e 17-diazinas (ver, e.g., Esquemas 1 e 2, para exemplos de preparação de compostos que podem ser aplicados analogamente a outras estruturas, como descrito abaixo). O estímulo para a preparação destes esteróides C-17 heteroarilo teve por base o nosso desejo de incorporar porções benzimidazole, benzotriazole, pirimidinoazole e diazina, as denominadas "subestruturas privilegiadas" (Nicolaou et al., "Natural product-like combinatorial libraries based on privileged structures. 1. 6

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General principies and solid-phase synthesis of benzopyrans", J Am. Chem. Soc, 2000, 122, 9939-9953. "Estruturas privilegiadas", é um termo introduzido originalmente por Evans et al. (J Med. Chem., 1988, 31, 2235-2246) para descrever motivos estruturais capazes de interagir com uma variedade de alvos moleculares não relacionados) nas novas moléculas. Estas matrizes, especialmente a matriz benzimidazole continuam a receber uma grande atenção em química medicinal devido ao seu portfolio diverso de actividades biológicas e também como entidades de uma variedade de drogas úteis (Nicolaou et al., acima). São descritos compostos esteróides C-17 heteroarilo com a seguinte fórmula geral I:

em que - a estrutura de anel ABC são as porções de anel A, B e C de um esteróide ou seu análogo, que estão substituídas opcionalmente; - a ligação ---- na posição 16,17 é uma ligação simples; e - X é um benzimidazole substituído opcionalmente.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis destes compostos são também descritos. A substituição opcional para a estrutura de anel ABC inclui um ou mais de: alquilo e alquilo halogenado (de preferência Ci-ê) ; alcenilo e alcenilo halogenado (de preferência Ci_6) incluindo o caso em que a ligação dupla está ligada directamente à estrutura de anel; halogéneo; amino; aminoalquileno; hidroxiimino; e hidroxi. Ainda opcionalmente, 7 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ os substituintes de hidrogénio em átomos de carbono adjacentes da estrutura de anel ABC podem ser removidos e substituídos por uma ligação adicional entre os átomos de carbono adjacentes para resultar numa ligação dupla entre estes carbonos da estrutura de anel. As substituições opcionais preferidas na estrutura de anel ABC são grupos metilo nas posições 10 e/ou 13 da estrutura de anel. A substituição opcional para a estrutura benzimidazole, inclui halogéneo, amino, aminoalquileno, hidroxi, -SH, -S-alquilo, alquilo e alquilo halogenado (de preferência Ci-δ) . Estes substituintes opcionais estarão em átomos de carbono do benzimidazole. A estrutura benzimidazole tem a fórmula seguinte:

N benzimidazole em que o * indica o ponto de ligação ao resíduo esteróide.

Numa situação, a estrutura de anel ABC tem um anel C que não tem substituição com excepção, de preferência, de substituição com alquilo, particularmente metilo, no carbono partilhado com o anel D que é adjacente à substituição heteroarilo em C-17 i.e., a posição 13.

Noutra situação, os anéis A, B e C da estrutura de anel ABC têm uma estrutura convencional baseada em 3p-hidroxiandrosta-5,16-dieno ou 3-oxo-androsta-5,16-dieno. Mas, noutra situação, os anéis A e B têm uma das estruturas seguintes 1-25:

3 4 5 6 1 2 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ C'

'ST 7 •γ.

HjC 13 19 wjdx ^cty.jcfx jxf 8 9 10 11 12

Λ

V 16 17 18

X

14 15 V X

20 21 22

23

V

X 24 25

Em seguida, é apresentada uma lista dos nomes químicos de compostos que têm os anéis AB como em 1-25 e os anéis C e D convencionais, em que X é benzimidazole.

Composto 1: 3p-Hidroxi-3a-metil-17-(lH-benzimidazol-l-il)-androsta-5,16-dieno

Composto 2: 3p-Fluoro-17-(lH-benzimidazol-l-il)-androsta- 5.16- dieno

Composto 3: 3p-Cloro-17-(l£f-benzimidazol-l-il)-androsta-5,16-dieno

Composto 4: 3β-ΒΓθηιο-17-(Ιϋ-benzimidazol-l-il)-androsta-5,16-dieno

Composto 5: 3p-Iodo-17-(lH-benzimidazol-l-il)-androsta-5,16- dieno

Composto 6: 3β-Απύηο-17-(lH-benzimidazol-l-il)-androsta-5,16-dieno

Composto 7: 17-(lH-benzimidazol-l-il)-androsta-3,5,16-trieno Composto 8: 17-(lfí-benzimidazol-l-il)-androsta-2, 4,16-trieno

Composto 9: 17-(lH-benzimidazol-l-il)-3-metilenoandrosta- 5.16- trieno 9

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Composto 10: 17-(lfí-benzimidazol-l-il)-3-metilenoandrosta- 4.16- trieno

Composto 11: 3,3-Difluoro-17-(ltf-benzimidazol-l-il)-androsta- 5.16- dieno

Composto 12: 3,3-Difluoro-17-(líf-benzimidazol-l-il)-androsta- 4.16- dieno

Composto 13: 17-(líf-benzimidazol-l-il)-3-metilenoandrosta- 2.4.16- trieno

Composto 14: 17-(líf-benzimidazol-l-il)-3-metilenoandrosta- 2.4.6.16- tetraeno

Composto 15: 3,3-Difluoro-17-(líf-benzimidazol-l-il)-androsta- 2.4.16- trieno

Composto 16: 3,3-Difluoro-17-(líf-benzimidazol-l-il)-androsta- 2.4.6.16- tetraeno

Composto 17: 3-Hidroxiimino-17- (líf-benzimidazol-l-il) - androsta-5,16-dieno

Conposto 18: 3-Hidroxiimino-17- (lií-benzimidazol-l-il) - androsta-4,16-dieno

Conposto 19: 3-Hidroxiimino-17- (lií-benzimidazol-l-il) - androsta-2,4,16-trieno

Composto 20: 3-Hidroxiimino-17-(lií-benzimidazol-l-il)- androsta-2,4,6,16-dieno

Composto 21: 3-Hidroxi-17-(lH-benzimidazol-l-il)-estra-1, 3, 5 (10),16-tetraeno

Composto 22: 3-Fluoro-17-(lfí-benzimidazol-l-il)-estra- 1,3,5(10),16-tetraeno

Composto 23: 3-Cloro-17-(lií-benzimidazol-l-il)-estra- 1,3,5(10),16-tetraeno 10

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Composto 24: 3-Bromo-17-(lfí-benzimidazol-l-il)-estra- 1,3,5(10),16-tetraeno

Composto 25: 3-lodo-17-(lfí-benzimidazol-l-il)-estra- 1,3,5(10),16-tetraeno

Exemplos de substituintes adicionais para o anel heteroarilo, X, são representados pelas estruturas seguintes 26-40 em que X é benzimidazole.

E descrito um composto com a estrutura seguinte M5.

As actividades inibitórias deste composto comparadas com CYP17 e 5a-reductases esteróides, a ligação a e a transactivação de receptores de androgéneos e os seus efeitos antiproliferativos contra duas linhas celulares de cancro da próstata humano, LNCaP e LAPC-4 foram estudadas. A farmacocinética dos compostos 5 e 6 foram avaliadas em 11 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ ratinhos e as actividades antitumor in vivo contra carcinoma da próstata LAPC-4 humano foram também avaliadas em ratinhos. Tanto quanto é do nosso conhecimento, todos os compostos aqui descritos, com a excepção do composto 15 representam novas entidades (Haidar et al., "Novel steroidal pyrimidyl inhibitors of P450 17 (17a-hydroxylase/C17-20-lyase)", Arch. Pharm. Med Chem., 2001, 334, 373-374; e Haidar et al., "Effects of novel 17a-hydroxylase/C17,20-lyase (P45017, CYP17) inhibitors on androgen biosynthesis in vitro and in vivo", J Steroid Biochem. Molec. Biol, 2003, 84, 555-562) . A preparação dos novos 17-benzoazoles e 17-diazinas é delineada nos Esquemas 1 e 2, respectivamente. Estes métodos podem ser aplicados analogamente a outros análogos aqui descritos . O intermediário chave na nossa síntese dos 17-benzazoles, 3p-acetoxi-17-cloro-16-formilandrosta-5,16-dieno (2) foi obtido a partir de (1) pelo nosso procedimento de rotina tal como descrito anteriormente (Njar et al., "Nucleophilic vinylic "addition-elimination" substitution reaction of 3p-acetoaxy-17-chloro-16-formylandrosta-5,16-diene: A novel and general route to 17-substituted-A16-steroids. Part 1. Synthesis of novel 17-azolyl-h16 steroids; inhibitors of 17a-hydroxylase/17,20-lyase (Ρ450ι7α)", Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, 6, 2777 - 2782; e "Novel 17-azolyl steroids; potent inhibitors of cytochrome P450 17a-hydroxylase/17,20-lyase (P450i7a) : Potential agents for the treatment of prostate câncer", J Med. Chem., 1998, 41, 902 -912) . O tratamento de 2 com benzimidazole na presença de K2C03 em DMF a aproximadamente 80°C deu o 3p-acetoxi-17-lH-benzimidazole 3 desejado em rendimento quase quantitativo. O composto 3 foi desformilado suavemente com 10% de paládio sobre carvão activado em benzonitrilo sob refluxo para dar 0 composto 4 com um rendimento de 93%, a partir do qual a hidrólise deu o 3p-hidroxi-17-benzimidazole 5 requerido. A oxidação de Oppenauer modificada de 5 originou o análogo Δ4-3-oxo, 6.

Uma amostra representativa dos novos compostos foi então submetida a estudos in vitro e in vivo exaustivos, tal como descrito em detalhe nas secções seguintes. 12 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ

Um método de tratamento de cancro da próstata ou hiperplasia da próstata que compreende a administração a um sujeito necessitado de uma quantidade eficaz de um composto. 0 termo "tratamento" é utilizado como descrito aqui é também revelado convencionalmente, e.g., a gestão ou cuidado de um sujeito com o objectivo de combater, mitigar, reduzir, aliviar, melhorar, etc., um ou mais dos sintomas associados com a doença da próstata. Exemplos de doenças da próstata que podem ser tratadas incluem e.g., hiperplasia prostática (HPB) e cancro da próstata (e.g., adenocarcinoma prostático). 0 nível específico de dose e a frequência de dosagem podem variar, dependendo de uma variedade de factores, incluindo a actividade do composto activo específico, da sua estabilidade metabólica e dimensão de acção, da velocidade de excreção, do modo e tempo de administração, da idade, peso corporal, condição de saúde, do género, dieta, etc., do sujeito e da severidade do cancro ou hiperplasia da próstata. Qualquer quantidade eficaz do composto pode ser administrada, e.g., desde cerca de 1 mg a cerca de 500 mg por dia, mais especificamente cerca de 50 mg a cerca de 150 mg por dia. Os compostos podem ser administrados em qualquer forma por qualquer via eficaz, incluindo e.g., oral, parentérica, entérica, intraperitoneal, tópica, transdérmica (e.g., utilizando qualquer emplastro padrão), oftálmica, nasalmente, local, não oral, tal como um aerossol, spray, inalação, subcutânea, intravenosa, intramuscular, bucal, sublingual, rectal, vaginal, intra-arterial, e intratecal, etc. Um composto da presente invenção pode ser administrado sozinho, ou em combinação com qualquer outro ingrediente(s), activo ou inactivo, por exemplo, com veículos fisiologicamente aceitáveis para fazer composições farmacêuticas adequadas.

Sem mais elaboração, crê-se que um perito na arte pode, utilizando a descrição anterior, utilizar a presente invenção na sua extensão total. As concretizações preferidas que se seguem devem portanto ser entendidas como meramente ilustrativas e não limitativas de forma alguma da divulgação.

Na descrição acima e nos exemplos que se seguem, todas as temperaturas são estabelecidas em graus Celsius não 13

ΕΡ 1 853 619/PT corrigidos e todas as partes e percentagens são em peso, salvo indicação em contrário.

EXEMPLOS

Estudos Biológicos

Estudos de Inibição de CYP 17: Um ensaio de inibição de CYP 17 é realizado de acordo com o nosso procedimento anteriormente referido, no qual E. Coli que expressa citocromo P450cl7 é utilizado como fonte da enzima (Grigoryev et al., "Cytochrome P450cl7-expressing Escherichia coli as a first-step screening system for 17a-hydroxylase-C17,20-lyase inhibitors", Anal. Blochem.; 1999, 26 7, 319-330; e "Effects of new 17a-hydroxylase/C17,20-lyase inhibitors on LNCaP prostate câncer cell growth in vitro and in vivo", Br. J. Câncer, 1999, 81, 622-630. Os valores de IC50 dos compostos são determinados a partir de curvas de dose-resposta e são listados na Tabela 1. Os valores de IC50 para cetoconazole, abiraterona (um inibidor de CYP 17 em ensaios clínicos (0'Donnell, acima), Diagrama 1) e 3p-hidroxi-17-(1H-imidazole-l-il)androsta-5,16-dieno (VN/85-1, composto 16, Diagrama 1, que se crê ser o inibidor de CYP17 mais potente (Njar et al., Current Pharm. Design, 1999, 5: 163-180; e J. Med. Chem., 1998, 41, 902 - 912, acima) são também determinados no mesmo sistema de ensaio para comparação. Alguns dos novos 17-heterociclos exibem uma inibição potente de CYP 17 com valores de IC50 de 300 - 915 nM. Os benzimidazoles, 5 e 6 são 4 a 6 vezes mais potentes do que os benzotriazoles 9 e 10. Este resultado sugere que a natureza electrónica do 17-heterociclo influencia a actividade inibitória. Por outro lado, os compostos com a funcionalidade Δ5-3β-ο1, 5 e 9 são pelo menos 3 vezes mais potentes do que os análogos correspondentes com funcionalidade A4-3-ona, 6 e 10, respectivamente. Estes resultados contrastam com os nossos resultados anteriores para os inibidores de CYP 17, 17-azole simples. Nessa série de inibidores, não há uma diferença marcada nas potências inibitórias entre os azoles Δ5-3β-ο1 e os análogos á4-3-ona correspondentes (Njar et al., J. Med. Chem., 1998, 41, 902 - 912, acima). Uma explicação possível é de que os benzoazoles volumosos se ligam de forma diferente no sítio activo da enzima de tal forma que a(s) 14

ΕΡ 1 853 619/PT interacção(ões) da porção na posição 3 seja importante para a ligação. A ligação do substrato ou ligandos inibitórios ao componente heme de alguns citocromos P450 é investigada utilizando espectroscopia de diferença UV-vis (Jefcoat C. R., "Measurement of substrate and inhibitor binding to microsomal cytochrome P450 by optical difference spectroscopy", Methods Enzymol, 1978, 52, 258-279). Esta abordagem é alargada seguindo um procedimento padrão anteriormente relatado por nós (Njar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, 6, 2777 - 2782; e J Med. Chem., 1998, 41, 902 - 912). Os compostos 5 e 9 induzem, cada um, um espectro de diferença do tipo II, indicando coordenação de azoto esteroidal (N-3 de anel benzimidazole ou benzotriazole) ao ferro heme de CYP 17, com formação de ferro de baixo spin. As posições de pico para o máximo Soret para o complexo de enzima com 5 e 9 (426 nM) estão de acordo com resultados disponíveis para a ligação de ligandos azoto a sistemas CYP e está também de acordo com os nossos resultados com outros inibidores de CYP 17 17-azolilo (Njar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, 6, 2777 - 2782; e J Med. Chem., 1998, 41, 902 - 912). A interacção do azoto do benzoazole com o ferro heme de CYP17 sugere tolerância em termos de volume na posição 17, uma vez que as afinidades de ligação de 5 e 9 são idênticas às de 16 não tão estericamente exigente, com um grupo 17-imidazole.

Das duas 17-diazinas ensaiadas, a 17-pirimidina 15 com um valor de IC50 de 500 nM é cerca de 8 vezes mais potente do que a 17-pirazina 14 (IC50 = 3810 nM) . Tal como com os benzoazoles, este resultado sugere que a natureza electrónica do 17-heterociclo influencia a actividade inibitória. Finalmente, os valores de IC50 no mesmo sistema de ensaio para cetoconazole e abiraterona são avaliados (Tabela 1) . O composto mais potente nesta série, 17-benzimidazole 5, exibe melhoramentos de cerca de 4 e cerca de 3 vezes na inibição de CYP 17 em relação a estes compostos, respectivamente, apesar de ser menos potente do que 16.

Inibição de Isozlmas da 5a-reductase humana tipo 1 e 2 in vitro: Com base em constatações anteriores de que alguns inibidores de CYP 17 são capazes de inibir enzimas 5a- 15

ΕΡ 1 853 619/PT reductase humanas, avaliámos brevemente esta nova série de inibidores de CYP 17. As actividades inibitórias dos compostos 5, 6, 9, 10 e de finasterida como referência são determinadas utilizando a linha de células DU-145 (enzima tipo 1 humana) e homogenados humanos de tecido de HBP (enzima tipo 2 humana) conforme descrito por Hartmann et al., "Synthesis and evaluation of 2'-substituted 4-(4'-carboxy- or 4'-carboxymethylbenzylidene)-N-acylpiperidines: Highly potent and in vivo active steroid 5a-reductase type 2 inhibitors", J. Med. Chem., 2002, 45, 3406-3417. Os valores de IC50 ou os valores de percentagem de inibição a uma concentração de ΙΟμΜ para alguns compostos são apresentados na Tabela 1. Apenas o composto 6 exibe uma inibição potente de ambas as enzimas de tipo 1 e 2 (IC50 = 770 e 480 nM, respectivamente), apesar de ser várias vezes menos potente do que a finasterida (IC50 = 60 e 2 nM, respectivamente).

Ensaios de ligação ao receptor de androgéneos de LNCaP e PC-3AR: Dado que tínhamos demonstrado anteriormente que alguns dos nossos inibidores de CYP 17 são antiandrogéneos potentes para AR de ambos os tipos mutante e selvagem (Long et al.,

Gregoriyev et al. E Njar et al., J. Med. Chem., 1998, 41, 902 - 912, acima) tinha interesse estabelecer a capacidade desta série de inibidores de CYP 17 para se ligarem a estes receptores. A competição para AR é determinada utilizando R1881 marcado ( [3H]—Rl881) nas células LNCaP sensíveis a androgéneos que expressam AR mutante e as células PC-3 independentes de androgéneos transfectadas de forma estável com AR do tipo selvagem (designadas por PC-3 AR). Os compostos 5, 6, 14 e 15, na gama de concentração nanomolar, competem eficazmente com R1881 marcado para ligação a ambos os tipos de ARs de uma maneira dependente da dose (Figura não apresentada). Os compostos 5, 6, 14 e 15, com valores de IC50 de 384, 242, 336 e 374 nM, respectivamente (Tabela 1), versus o AR de tipo selvagem são 29 a 45 vezes mais potentes do que com o antiandrogéneo utilizado clinicamente, flutamida (IC50 = 10,985 nM). Tal como mostrado na Tabela 1, as afinidades de ligação para o AR mutante de 5 e 6 são comparáveis às de casodex, um antiandrogéneo actualmente utilizado, mas novamente superiores às de flutamida. No entanto, a actividade biológica da flutamida deriva principalmente de um 16 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ metabolito, hidroxiflutamida, que é um antagonista de Ar muito mais potente.

Efeitos de agentes sobre a transcrição de LNCaP mediada por AR mutante: Em seguida, averiguámos se os compostos 5 e 6 actuam como agonistas ou antagonistas de AR. Um estudo sobre activação transcricional regulada por androgéneos é realizado em células LNCaP transfectadas de forma transiente com uma construção repórter de probasina luciferase AARZ-Luc (ensaio de actividade de luciferase) (Kim et al., "Synergism of cytoplasmic kinases in lL6-induced ligand-independent activation of androgen receptor in prostate câncer cells", Oncogene, 2004, 23:1838-1844; e Zhang et al., "A Small composite probasin promoter confers high leveis of prostate-specific gene expression through regulation by androgens and glucocorticoids in Vitro and in Vivo", Endocrinology, 2000, 141: 4698- 4710). Os compostos 5, 6 ou casodex, cada um a 0,1 e 10,0 μΜ não têm efeito sobre a actividade da luciferase, enquanto que a expressão da luciferase é aumentada aproximadamente 99,6 vezes após tratamento com 1,0 nM de DHT durante 18 h (Figura 1). Além disso, a expressão da luciferase induzida por exposição a 1,0 nM de DHT é diminuída de uma maneira dependente da concentração por 5, 6, e casodex e de uma forma similar (Figura 1). Em conjunto, estes resultados sugerem que os compostos 5 e 6 tal como casodex não possuem actividade agonista ou agonista parcial de AR e podem ser considerados como antagonistas puros, e fortes, de androgéneos. Apesar de não termos ensaiado os compostos com células PC-3 AR/LU que expressam AR de tipo selvagem, é provável que também se comportem da mesma maneira. Mostrámos anteriormente que alguns dos nossos inibidores de CYP 17 eram mais comparáveis a casodex do que a flutamida (Long et al., acima), e isto parece ser o caso com estes novos compostos. Em geral, os nossos novos compostos interagem fortemente com ambos os tipos de AR, uma indicação de que os compostos podem ser úteis para o tratamento de pacientes com tumores que expressem AR do tipo selvagem ou mutado, ou para pacientes com expressão de AR amplificada.

Efeitos dos benzoazoles sobre o crescimento de células de cancro da próstata LNCaP e LAPC-4 in vitro: As capacidades dos compostos 5 e 6 para inibir a proliferação em células 17

ΕΡ 1 853 619/PT LNCaP mutantes estimuladas por 1 nM de DHT são avaliadas. Esta concentração de DHT estimulou a proliferação de células LNCaP em cerca de 2 vezes em comparação com células tratadas com veiculo (Figura 2A) . Tal como mostrado na Figura 2A, os compostos 5 e 6 inibem, cada um, a proliferação de células LNCaP induzida por DHT de uma forma dependente da dose, com valores de IC50 de 6,0 e 1,8 μΜ, respectivamente. O casodex é utilizado como controlo positivo e exibe uma inibição similar da proliferação de células LNCaP induzida por DHT (Figura 2A, IC50 =8,6 μΜ). O tratamento da linha de células da próstata LAPC4 sensíveis a androgéneo com 10 nM de DHT, surpreendentemente, não induz significativamente proliferação celular (Figura 2B) . Outros investigadores relataram também que a resposta das células LAPC4 a androgéneos não é tão pronunciada como a observada em células LNCaP (Thompson et al., "Androgen antagonist activity by the antioxidant moiety of vitamin E, 2,2,5,7,8-pentamethyl-6-chromanol in human prostate carcinoma cells", Molec. Caner Thera., 2003, 2, 797-803) . No entanto, os compostos 5, 6 e casodex exibem, cada um, uma inibição dependente da dose desta linha celular (Figura 2B), tal como com as células LNCaP. A ordem de potência inibitória da proliferação de células LAPC4 é 6 > 5 > casodex, com valores de IC5o de 1,0, 3,2 e 10 μΜ, respectivamente. Em conjunto, estes resultados sugerem que 5 e 6 podem actuar bloqueando a acção de DHT na estimulação da proliferação celular, em correlação com as suas propriedades de ligação e activação de receptores de androgéneos descritas acima. Os compostos 5 e 6 estão entre os antiandrogéneos mais potentes descritos até à data.

Farmacocinéticas de 5 e 6 e metabolismo de 5: As propriedades farmacocinéticas em ratos SCID macho para os dois compostos protótipo, 5 e 6 são estudadas seguindo o nosso procedimento descrito recentemente para outros inibidores de CYP 17 (Nnane et al., "Pharmacokinetic profile of 3p-hydroxy-17-(1H—123 — triazol-l-yl)androsta-5,16-diene (VN/87-1), a potent androgen synthesis inhibitor in mice", J. Steroid Biochem. Molec. Biol, 2001, 71, 145-152; e Handratta et al., "Potent CYP 17 inhibitors: improved syntheses, pharmacokinetics and antitumor activity in the LNCaP human prostate câncer model", J Steroid Biochem. Molec. Biol, 2004, 92, 155-165. Os resultados estão sumarizados na Tabela 2 e nas Figuras 3-5. 18

ΕΡ 1 853 619/PT

Em HPLC de fase inversa, 5 [tempo de retenção (tr) = 21,6 min] é bem resolvido em relação ao padrão interno (16, tr = 11,5 min), a um metabolito (tr = 17,3 min) e a outros compostos endógenos no plasma de rato (Figura 3). As curvas de calibração derivadas para 5 são lineares e reprodutíveis (resultados não apresentados), a variabilidade inter- e intra-ensaio é inferior a 10% e o seu limite de detecção é de 100 ng/ml. O ensaio de HPLC é validado e utilizado para monitorizar 5 em plasma de ratinho.

Após administração subcutânea, a concentração no plasma de 5 declina exponencialmente com uma meia-vida média de cerca de 44,17 min e uma constante de velocidade de eliminação de 56,5 min-1. O composto 5 é eliminado a uma velocidade de 1986,14 ml/h/kg da circulação sistémica e não foi detectado 6 h após a administração. Os parâmetros farmacocinéticos não compartimentais calculados com base no perfil de concentração no plasma após administração subcutânea de 5 são apresentados na Tabela 2. As curvas de concentração no plasma-tempo após administração s.c. de 5 (50 e 100 mg/kg) a ratinhos SCID macho são também apresentadas na Figura 4. Após administração s.c. de 5, a concentração observada no plasma em ratinhos atinge níveis de pico 30,0 min após a dose. O composto 5 é bem absorvido pelo sítio subcutâneo e os perfis de área sob a curva para a concentração no plasma versus tempo, após administração s.c., aumentam proporcionalmente à dose quando a dose de administração é mudada de 50 para 100 mg/kg. Além disso, a meia-vida de eliminação e o tempo de residência médio são relativamente constantes quando a dose de 5 aumenta de 50 para 100 mg/kg (Tabela 1) . Estes resultados indicam que o perfil farmacocinético de 5 é independente da dose. A Figura 5 mostra que uma quantidade significativa de um metabolito polar [tempo de retenção, 17,3 min, ver Figura 3)] é formado a partir de 5 e está presente no plasma durante os estudos farmacocinéticos in vivo. A quantidade máxima do metabolito é de 67, 72%, alcançada cerca de 2 h após a dose. Este metabolito revela um tempo de retenção idêntico ao do composto 6. Este metabolito é identificado por tentativas por LC-MS; a sua massa molecular (m/z 391 = M + H+) é consistente 19

ΕΡ 1 853 619/PT com a estrutura de 3-oxo-á5,16-tetrahidro composto 5 (i.e., 17-(lH-benzimidazol-l-il)androst-3-ona). O metabolito pode ter sido formado a partir de 5 via oxidação do 3β-0Η -> 3-oxo, seguido por redução (reductases) de ambas as ligações duplas de Δ5 e Δ16. Um metabolito similar foi identificado anteriormente (formado como resultado da oxidação de um 3β-0Η -> 3-oxo, seguido por isomerização da ligação dupla de Δ5) em ratinhos macho de um esteróide 17-imidazole infimamente relacionado (Handratta et al., acima).

Um metabolito principal de 5, i.e., 17—(1H— benzimidiazol-l-il)androst-3-ona, pode ser sintetizado a partir de trans-androsterona; ver Esquema 3. Espera-se também que tenha uma actividade análoga. A farmacocinética in vivo de 6 em ratinhos não é como a do composto 5 devido à Cmax relativamente baixa e à velocidade de eliminação significativamente superior (Figura 4 e Tabela 2). Adicionalmente, não detectámos nenhum metabolismo(s) do composto 6 no plasma, em contraste com a nossa observação com o composto 5.

Efeitos de 5 e 6 sobre Xenoenxertos de LAPC4 crescidos em ratinhos SCID: Com base nas actividades biológicas múltiplas notáveis in vitro, i.e., inibição potente de CYP 17, forte actividade antiproliferativa de células de cancro da próstata e fortes actividades antiandrogénicas, 5 e 6 são seleccionados para estudos de eficácia antitumor in vivo num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata humano LAPC4.

Na primeira experiência, o efeito dos compostos 5 e 6 sobre o crescimento de tumores de cancro da próstata LAPC4 bem estabelecidos em ratinhos SCID é determinado e é utilizada a castração como tratamento de referência. Os ratinhos portadores de tumores (n = 5/grupo) são seleccionados para receber uma de duas doses de 5 ou 6 (0,15 mmol/kg uma vez por dia ou 0,15 mmol/kg duas vezes por dia). Os volumes dos tumores são medidos semanalmente e comparados com controlos que receberam veiculo ou com ratinhos castrados. 20 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ A castração conduz a uma redução de 55% do volume final do tumor, em comparação com o controlo (Figura 6). A administração de 0,15 mmol/kg uma vez por dia e de 0,15 mmol/kg duas vezes por dia de 5 resulta em redução dos volumes finais médios dos tumores de 41% e 86,5%, respectivamente, em comparação com tumores em animais de controlo tratados com veiculo (Figura 6). Em contraste com a excelente inibição do crescimento de tumores para os ratinhos tratados com 5, os ratinhos tratados com o composto 6 revelam ineficácia na dose baixa ou revelam mesmo estimulação do crescimento dos tumores em comparação com o controlo (Figura 6). A incapacidade de 6 para inibir o crescimento de tumores de LAPC4 in vivo é especialmente desapontante porque o composto é muito eficaz na inibição do crescimento de células de CP in vitro e é um antiandrogéneo puro altamente potente (ver Figura 1) . A disparidade altamente significativa na eficácia antitumor in vivo de 5 e 6 não pode ser facilmente atribuível a diferenças nas propriedades farmacocinéticas dos dois compostos. A(s) razão(ões) subjacente(s) para as diferenças dramáticas na eficácia antitumor in vivo destes dois compostos intimamente relacionados é desconhecida nesta altura. No entanto, pode ser atribuível ao facto de 6 ser convertido nos animais em metabolito(s) que possam ser um agonista forte do receptor de androgéneo, provocando assim a estimulação do crescimento de tumores. Durante o estudo, todos os ratinhos foram pesados uma vez por semana. Os pesos corporais de todos os grupos tratados aumentaram ligeiramente e foram semelhantes ao aumento observado com o grupo de controlo. Todos os ratinhos pareciam saudáveis e não foram observados efeitos adversos, sugerindo que os compostos não tinham toxicidade significativa.

A segunda experiência in vivo testa a capacidade de 5 para inibir o crescimento de células de cancro da próstata LAPC4 deixadas crescer em ratinhos SCID e 16 (Diagrama 1), um inibidor de CYP 17/antiandrogéneo potente anteriormente identificado (Gregoriyev et al. e Njar et al., J. Med. Chem., 1998, 41, 902 - 912, acima) e castração são utilizados como tratamentos de referência. Nesta experiência, o tratamento começa no dia em que os ratinhos foram inoculados subcutaneamente com células LAPC4 hormonodependentes e foram castrados ou injectados sc duas vezes por dia com 5 ou 16. A 21 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ

Figura 7 mostra os efeitos dos vários tratamentos sobre a emergência e sobre o tamanho dos tumores durante as 21 semanas de terapia.

Todos os outros grupos desenvolvem tumores palpáveis e mensuráveis na semana 10 de terapia, com excepção do grupo tratado com 16 (0,15 mmol/kg duas vezes por dia) que desenvolve tumores palpáveis e mensuráveis na semana 11. Os volumes totais dos tumores nos ratinhos de controlo aumentam 8 vezes ao longo das 14 semanas de tratamento quando os ratinhos são sacrificados devido aos grandes tumores. Assim, os volumes dos tumores para os outros grupos são comparados com os do grupo de controlo na semana 14 de tratamento. O volume dos tumores nos ratinhos castrados aumenta apenas 4,1 vezes (cerca de 50% de redução em comparação com o controlo) e é semelhante ao aumento de 3,7 vezes (redução de 53,8% em comparação com o controlo) observado nos ratinhos tratados com 16. Nos ratinhos tratados com 5 (0,15 mmol/kg duas vezes por dia), os volumes dos tumores aumentam apenas 0,5 vezes, o que representa uma redução de 93,8% versus ratinhos de controlo (P = 0, 00065). Na semana 16, o volume médio dos tumores nos animais tratados com composto 5 verifica-se ser menor (quase negligenciável e inactivo) do que o seu volume médio de tumores na semana 10 quando emergem tumores mensuráveis. Por outro lado, 5 provoca um efeito inibitório significativo sobre tumores em comparação com 16 ou com a castração, P = 0,005 e 0,05, respectivamente. Em geral, os tumores nos ratinhos de controlo, nos tratados por castração e nos tratados com composto 16 crescem rapidamente, enquanto que o tumor nos ratinhos tratados com 5 cresce muito lentamente e de uma maneira bifásica (Figura 7). O composto 5 é o agente mais eficaz e significativamente é muito mais eficaz do que a castração na inibição do crescimento de tumores. É interessante notar que apesar de 16 ser 6 vezes mais potente do que 5 na inibição de CYP 17, este último exibe uma actividade antitumor superior in vivo. A(s) razão responsável por este fenómeno é(são) desconhecida(s) actualmente, mas pode ser devida em parte a melhores propriedades farmacocinéticas e ou farmacodinâmicas de 5.

Para determinar se os tumores da próstata "inactivos" tratados com composto 5 (ver Figura 7, semana 16) têm a 22

ΕΡ 1 853 619/PT capacidade de crescer com uma dose menor de 5, a sua dose foi reduzida para 0,15 mmol/kg duas vezes por semana (uma redução de 78,6% na dosagem) entre as semanas 16 - 19, e os volumes de tumor foram medidos semanalmente. Durante este período de tratamento com uma dose reduzida do composto os tumores retomaram o crescimento (Figura 7). Após este intervalo de 3 semanas, o tratamento com a droga com a dose usual é retomado e o crescimento dos tumores abranda e atinge um patamar. Estes resultados sugerem uma natureza citostática deste tratamento e inferem a necessidade de administração contínua para alcançar o efeito antitumor.

No final da experiência, os níveis de 5 nos tumores e órgãos dos ratinhos tratados com 5 são determinados. Os níveis de 5 por HPLC nos tumores, testículos e fígado 1 h após a administração da dose final (inserção da Figura 7) são medidos. É interessante notar que uma pequena quantidade (~ 15% relativamente a 5) de metabolito é detectada apenas nos tecidos do fígado. Este metabolito tem o mesmo tempo de retenção que o metabolito observado no plasma (vide supra). A concentração mais elevada de 39,0 ±8,4 pg/mg de tecido de 5 é medida nos tumores s.c. As concentrações no fígado e nos testículos são inferiores mas detectáveis. O nível de 5 em tumores é significativamente superior do que os níveis medidos no plasma, o que pode ser um resultado de acumulação do composto ao longo do período da experiência. Assim, a inibição do crescimento de tumores por 5 pode ser explicada em parte maiores concentrações em xenoenxertos de tumores que podem exercer um efeito citotóxico/citostático directo sobre as células de cancro da próstata. Deve ser sublinhado que não existe evidência que sugira um possível efeito citotóxico directo do cetoconazole (um inibidor modesto de CYP 17) sobre células de cancro da próstata33. Adicionalmente, a acumulação de 5 nos testículos possibilitará a inibição da síntese de testosterona nos animais.

Apesar de estar bem estabelecido que as LAPC4 são androgéneo-dependentes, estas células podem-se tornar androgéneo-independentes e como tal representam um modelo adequado que mimetiza o desenvolvimento de cancro da próstata em pacientes (Chen et al., acima, e Kline et al., "Progression of metastatic human prostate câncer to androgen 23

ΕΡ 1 853 619/PT independence in immunodeficient SCID mice." Nat. Med, 1997, 3, 402-408). Tal como mostrado na Figura 7, conseguimos replicar este fenómeno. Por outro lado, os nossos resultados mostram que o tratamento com 16 ou a castração suprimem eficazmente o crescimento de tumores durante um certo periodo (fase androgéneo-dependente), mas foi ineficaz em seguida (possivelmente como resultado de uma fase androgéneo-independente) uma vez que os tumores crescem rapidamente tal como em ratinhos de controlo intactos. O crescimento dos tumores nos ratinhos tratados com 5 é fortemente suprimido ao longo do período de tratamento. Isto sugere que 5 pode ter efeitos sobre o cancro da próstata androgéneo-independente. No entanto, é também plausível que o tratamento com este composto permita que os tumores LAPC4 permaneçam androgéneo-dependentes durante um período mais longo e portanto respondentes a terapia antiandrogéneo.

Estudos recentes que mostram claramente a sobrerregulação e envolvimento de RA em CP avançado e recorrente (Mohler et al., e Chen et al., acima) renovaram o interesse no receptor de androgéneos como alvo para o desenvolvimento de drogas para tratar o CP (Tindall et al., "Symposium on androgen action in prostate câncer", Câncer Res.r 2004, 64, 7178-7180). Devido às suas propriedades potentes, 5 pode ser um excelente candidato.

Conclusões:

Os resultados reforçam o nosso conceito prévio de modificação do substituinte em C17 de Δ16 esteróides para produzir inibidores potentes de CYP 17 assim como antagonistas potentes de AR. Os 17-benzimidazoles 5 e 6 mostram coordenar o ferro heme de CYP 17, uma propriedade que pode em parte ser responsável pela sua actividade inibitória de enzimas. Os compostos 5 e 6 exibem actividades in vitro quase equipotentes para inibição de CYP 17, antagonismo de AR, e inibição do crescimento de células de cancro da próstata. Surpreendentemente, os compostos são muito diferentes nas suas actividades antitumor, já que 5 provoca uma supressão marcada do crescimento de xenoenxertos de tumor de LAPC4 e, em contraste, 6 (0,15 mmol/kg duas vezes por dia) incrementa o crescimento dos tumores. O presente estudo 24 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ proporciona evidência convincente de que 5 é um inibidor potente do crescimento de tumores da próstata humana e é notoriamente mais eficaz do que a castração. Este é o primeiro exemplo de um inibidor de CYP 17/antiandroqéneo que demonstra actividade antitumor in vivo contra um tumor de cancro da próstata numa extensão que é incrivelmente mais eficaz do que a castração. Estas actividades biolóqicas impressionantes tornam 5 um forte candidato para maior desenvolvimento como uma droga potencial para o tratamento do cancro da próstata em humanos. A excelente actividade antitumor do composto 5 que contém um grupo benzimidazole torna os benzimidazoles um grupo preferido.

Secção Experimental

Química: Os procedimentos e técnicas gerais foram idênticos aos anteriormente relatados (Njar et al., J Med. Chem., 1998, 41, 902 - 912). Os espectros de infra-vermelho são registados num espectrómetro de FTIR Perkin Elmer 1600 utilizando soluções em CHC13. Os espectros de massa de alta resolução (HRMS) são determinados num espectrómetro de massa com TF 3-Tesla Finnigan FTMS-2000, modo ESI (Universidade do Estado de Ohio, Departamento de Química). Como critério de pureza para compostos alvo chave, proporcionámos resultados de espectros de massa de alta resolução com resultados cromatográficos de HPLC indicando homogeneidade dos compostos. Os espectros de massa de baixa resolução (LRMS) são determinados num LCR-MS Finnegan. Os pontos de fusão (pf) são determinados com um dispositivo de medição do ponto de fusão Fischer Johns e são não corrigidos. A desidroepiandrosterona e o acetato de desidroepiandrosterona foram adquiridos da Aldrich, Milwaukee, WI. A 5-tributilestanilpirimidina e a 2-tributilestanilpirazina foram adquiridas de Frontier Scientific, Inc., Logan, UT. 3p-Acetoxi-17-cloro-16-formilandrosta-5,16-dieno (2): Este composto, preparado a partir de 3p-acetoxiandrost-5-en-17-ona (1) como descrito anteriormente, proporcionou resultados espectrais e analíticos conforme descrito (Njar et al., J. Med. Chem., 1998, 41, 902 - 912). 25

ΕΡ 1 853 619/PT 3p-Acetoxi-17-(lH-benzimidazol-l-il)-16-formilandrosta-5,16-dleno (3) : Uma mistura de 3p-acetoxi-17-cloro-16- formilandrosta-5,16-dieno (2, 2,5 g, 6,65 mmol), benzimidazole (2,35 g, 19,9 mmol), e K2C03 (2, 76 g, 23,9 mmol) em DMF seca (20 mL) é agitada a cerca de 80°C sob Ar durante 1,5 h. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura de reacção é vertida sobre água arrefecida com gelo (250 mL) e o precipitado resultante é filtrado, lavado com água e seco para dar um sólido branco sujo bruto (ca. 2,9 g). A purificação por FCC [éter de petróleo/EtOAc/Et3N (6:4:0,3)] dá 2,7 g (88,7%) de composto puro 3: pf 227-230°C; IV (CHC13) 3691, 3024, 2951, 2359, 1725, 1670, 1604, 1491, 1452, 1375, 1253, 1032, 897, 852, 818, 700, 657, 618, 576, 565, 550, 529, 511, 476 cm'1; 1H RMN (300 MHz, CDC13) δ 1,07 (s, 6H, 18- e 19-CH3), 2,04 (s, 3H, 3β-(ΧΗ3), 4,60 (m, 1H, 3a-H), 5,43 (s largo, 1H, 6-H), 7,35 (s largo, 2H, Hs aromáticos), 7,85 (s, 1H, H aromático), 7,98 (s, 1H, H aromático), 7,98 (s, 1H, 21-H) e 9,59 (s, 1H, 16-CHO), HRMS calcul 481,2462 (C29H34O3N2 .Na+), encontrado 481,2454. 3p-Acetoxi-17-(lH-benzimidazol-l-il)androsta-5,16-dieno (4):

Uma solução de 3p-acetoxi-17-(lH-benzimidazol-l-il)-16-formilandrosta-5,16-dieno (3, 2,04 g, 4,45 mmol) em

benzonitrilo seco (10 mL) foi submetida a refluxo na presença de 10% de paládio sobre carvão activado (1,02 g, i.e., 50% em peso de 3) durante 5 h. Após arrefecimento até a temperatura ambiente, o catalisador foi removido por filtração através de uma almofada de Celite. O filtrado foi evaporado, e o residuo foi purificado por FCC [éter de petróleo/EtOAc/Et3N (7,5:3:0,5)] deu 1,41 g (73,8%) de composto puro 4: pf 159-16 00 C; IV (CHC13) 3687, 2947, 2854, 2358, 2340, 1725, 1633, 1609, 1557, 1489, 1454, 1373, 1291, 1253, 1195, 1136, 1031, 985, 910, 839, 735, 665, 590, 544, 533, 513, 502, 488 cm XH RMN (300 MHz, CDC13) δ 1,02 (s , 3H, I8-CH3), 1,07 (s, 3H, 19- CH3), 2,04 (s, 3H, 3β-(ΧΗ3), 4,62 (m, 1H, 3a-H), 5,43 (s largo, 1H, 6-H), 5,98 (s, 1H, 16-H), 7 ,30 (m, 2H, Hs aromáticos), 7,49 (s, 1H, H aromático), 7,81 (s, 1H, H aromático), e 7,95 (s, 1H, 2X-H), HRMS calcul 453,2512 (C28H34O2N2 .Na+), encontrado 453,2511. 3p-Hidroxi-17-(ΙΗ-benzimidazol-l-il)androsta-5,16-dieno (5): O acetato 4 (1,3 g 3,02 mmol) foi dissolvido em metanol (20 26

ΕΡ 1 853 619/PT mL) sob uma atmosfera inerte de Ar e a solução resultante foi tratada com KOH metanólico a 10% (8 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 h, e em seguida concentrada sob pressão reduzida a aprox. 40°C até um volume de 10 mL. Esta solução foi vertida sobre água gelada (300 mL), e o precipitado branco resultante foi filtrado, lavado com água e seco. A cristalização a partir de EtOAc/MeOH deu 5 (1,10 g, 94%), pf 189-190°C; IV (CHC13) 2934, 2339, 1609, 1490, 1453, 1291, 1040, 837, 808, 705, 663, 608, 578, 550, 517 cnf1; RMN (300 MHz, CDC13) δ 1,02 (s, 3H, 18-CH3), 1,07 (s, 3H, 19-CH3), 3,55 (m, 1H, 3a-H), 5,41 (s largo, 1H, 6-H), 5,99 (s, 1H, 16-H), 7,30 (m, 2H, Hs aromáticos), 7,54 (s, 1H, H aromático), 7,80 (s, 1H, H aromático), e 7,96 (s, 1H, 21- H) . HRMS calcul 411,2407 (C26H32ON2.Na+), encontrado 411, 2396.

17-(lH-benzimidazol-l-il)androsta-4,16-dieno-3-ona (6): A partir de uma mistura de composto 5 (660 mg, 1,70 mmol), 1-metil-4-piperidona (2,5 mL), e tolueno (40 mL) removeram-se por destilação cerca de 10 mL. Adicionou-se então isopropóxido de alumínio (521 mg, 2,55 mmol) e a mistura foi submetida a refluxo sob Ar durante 4 h. Após arrefecimento, a mistura foi diluída com EtOAc (50 mL), lavada sucessivamente com NaHC03 aquoso a 5% (x3) e salmoura (x2), e em seguida

seca (Na2S04) . O solvente foi evaporado, e o produto bruto foi purificado por FCC [CH2Cl2/EtOH (25:1)] para dar o composto do título 6 (544 mg, 82%) : pf 201-204°C; IV (CHC13) 2946, 2858, 1622, 1611, 1490, 1453, 1376, 1291, 1270, 1228, 1189, 893, 850, 837, 722, 662, 615, 568, 553, 537, 519 cnf1; 1HRMN (300 MHz, CDC13) δ 1,04 (s, 3H, 18-CH3), 1,24 (s, 3H, 19-CH3), 5,78 (s, 1H, 4-H), 5,99 (s, 1H, 16-H), 7,31 (m, 2H, Hs aromáticos), 7,48 (m, 1H, H aromático), 7,81 (s, 1H, H aromático), e 7,95 (s, 1H, 21-H), HRMS calcul 409,2250 (C26H30ON2 .Na+) , encontrado 409,2250.

Ensaio In Vitro de CYP 17: As actividades inibitórias de CYP 17 in vitro dos compostos são avaliadas utilizando o nosso ensaio rápido de libertação de ácido acético (AARA), utilizando E. Coli intacto que expressa P450cl7 como fonte de enzima (Grigoryev, acima). Envolve a utilização de [21—3H] — 17a-hidroxipregnenolona como substrato e a actividade de CYP 17 é medida pela quantidade de ácido acético tritiado formado durante a clivagem da cadeia lateral C-21 do substrato. Isto 27

ΕΡ 1 853 619/PT estabelece que o método é comparável em termos de exactidão e fiabilidade ao procedimento de análise por HPLC utilizado pelos investigadores neste campo (Grigoryev, acima). Os valores de IC50 são obtidos directamente dos gráficos que relacionam a percentagem de inibição versus concentração de inibidor nos intervalos apropriados. Cada composto é ensaiado a um mínimo de cinco concentrações diferentes. Os ensaios são realizados em triplicado e os valores de IC5o reportados são a média das experiências em triplicado. Os desvios padrão foram ± 5% dos valores médios.

Ensaio de 5<x-Reductase Humana Tipo 1 e 2: As actividades inibitórias dos compostos e de finasterida como referência são determinadas utilizando a linha de células DU 145 (para a enzima humana de tipo 1) e homogenado de próstata humana (tecido de HBP para a enzima de tipo 2) de acordo com o procedimento descrito por Hartmann e colegas (Picard et al., "Synthesis and evaluation of 2'- substituted 4-(4'-carboxy-or 4'-carboxymethylbenzylidene)-N-acylpiperidines: Highly potent and in vivo active steroid 5a-reductase type 2 inhibitors", J Med. Chem.r 2002, 45, 3406-3417). Os valores de percentagem de inibição a uma concentração de 10 μΜ ou, no caso de compostos mais potentes, os valores de IC50 são determinados.

Ligação competitiva ao receptor de androgéneos (RA) e ensaios de luciferase:

Ensaio de Ligação/Competição com RA: Os poços em placas multipoço de 24 poços são revestidos com poli-l-lisina (0,05 mg/ml) durante 5 minutos, secos, enxaguados com água destilada esterilizada e secos durante 2 horas. Para determinar a cinética da ligação de R1881 ao RA de LNCaP e ao RA de tipo selvagem, as células LNCaP e PC3AR são plaqueadas (2-3 x 105) em placas multipoço de 24 poços em meio isento de esteróides e deixadas ligar. No dia seguinte o meio é substituído com RPMI isento de soro e isento de esteróides, suplementado com 0,1% de ASB e contendo [3H]R1881 (0,01-10 nM) na presença ou ausência de um excesso de 200 vezes de DHT frio, para determinar a ligação não específica, e de 1 μΜ de triamcinolona acetonida para saturar a progesterona e os receptores de glucocorticóides. Após um período de incubação 28 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ de 2 horas a 37°C, as células são lavadas duas vezes com DPBS arrefecido com gelo e solubilizadas em DPBS contendo 0,5% de SDS e 20% de glicerol. Os extractos são removidos e a radioactividade associada às células contada num contador de cintilação. Os resultados são analisados, incluindo determinação de Kd e de Bmax, por regressão não linear utilizando software Graphpad Prism. Quando a concentração requerida para quase saturar os RA em ambas as linhas celulares é estabelecida, a capacidade dos compostos em ensaio (0,1 nM-10 μΜ) para deslocar [3H]R1881 (5,0 nM) dos receptores é determinada como descrito acima. O IC50 de cada composto é determinado por regressão não linear com software Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA).

Ensaio de Transactivação de Luciferase: O ensaio de activação transcricional é realizado como descrito anteriormente por Kim et al, acima, com modificações mínimas. A construção repórter de probasina luciferase ARR2-Luc é gerada por inserção do promotor minimal de probasina ARR2, gentilmente proporcionado por Dr R Matusik de Vanderbilt University Medicai Center {Endocrinology, 2000, 141: 4698-4710) na região ligante policlonal de vector promotor de PGL3 (Promega). O pRL-null (Promega) é utilizado como controlo interno. Resumidamente, as células LNCaP crescidas em placas de 24 poços revestidos com poli-L-lisina foram transfectadas com ARR2-Luc no meio RPMI 16 40 isento de vermelho de fenol contendo 5% de SBF pré-tratado com carvão (Hyclone). 24 h após a transfecção, as células são incubadas com meio RPMI 1640 fresco isento de vermelho de fenol isento de soro com ou sem DHT e inibidores durante 18 horas. As actividades da luciferase são medidas em triplicado utilizando o sistema dual de ensaio de luciferase de acordo com as instruções do fabricante (Promega). Os resultados são apresentados como a indução de dobra, isto é a actividade relativa da luciferase das células tratadas dividida pela do controlo.

Ensaio de Cultura e Viabilidade Celular: Células LNCaP são crescidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de SBF e 1% de solução de penicilina/estreptomicina. Para determinar o efeito dos compostos novos sobre a proliferação celular, as células são transferidas para meio isento de esteróides três dias antes do início das experiências. O meio isento de 29 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ esteróides consistia em RPMI isento de vermelho de fenol suplementado com 5% de soro tratado com carvão revestido com dextrano e 1% de solução de penicilina/estreptomicina. São então realizados estudos de crescimento plaqueando as células (3 x 104) em placas multipoço de 24 poços (Corning, Inc. Corning, Ni). Após um periodo de ligação de 24 horas, o meio é aspirado e substituído com veículo contendo meio isento de esteróides ou a concentração indicada de DHT (1 nM) e compostos (0,1 μΜ-10 μΜ) . Os poços de controlo são tratados com veículo (etanol). Este meio é mudado a cada três dias e o número de células viáveis é comparado por ensaio WST-1 [dissulfonato de 4-[3-(4-iodofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzeno] no sétimo dia. Após incubação das células durante o tempo acima mencionado, adiciona-se solução de WST-1 a 10% a cada poço e incuba-se a 37°C durante três horas. Após a incubação, as placas são ligeiramente agitadas e lidas imediatamente a 450 nm com um espectrofotómetro de varrimento multi-poço. Todos os resultados representam a média de um mínimo de três poços. O controlo adicional consiste em meio sozinho sem células.

Estudos Farmacocinéticos: Todos os estudos animais são realizados de acordo com as orientações e aprovação da Comissão de Cuidados Animais da Escola de Medicina da Universidade de Maryland, Baltimore. Ratinhos SCID macho com um peso de 20-22 g (8-10 semanas de idade) obtidos de NCI, Frederick, MD, EUA são mantidos num ambiente controlado de cerca de 25°C, 50% de humidade relativa e ciclos de 12 h de luz e 12 h de escuridão e com livre acesso a comida e água. Os compostos 5 e 6 são formulados em β-ciclodextrina a 40% em água e é administrada uma única dose subcutânea aos ratinhos. Os animais são sacrificados a vários tempos, até 6 h após a administração da droga e o sangue foi obtido por punção cardíaca sob leve anestesia com halotano (Ayerst, Nova Iorque, NI, EUA).

Análise por HPLC: As separações cromatográficas e quantificação dos esteróides e do padrão interno apropriado são obtidas por um método de HPLC de fase inversa numa coluna Novapak® C18 da Waters® (3,9 x 150 mm) protegida por um cartucho de protecção da Waters® empacotado com película C18 como descrito anteriormente. Resumidamente, o sistema de HPLC 30 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ utilizado neste estudo consistia num sistema de fornecimento de solvente da Waters®, num controlador da Waters® (Milford, MA), acoplado a um auto-amostrador da Waters® 717plus e a um detector de fotodiodos da Waters® 996 operado a 242,7 nm. A composição da fase móvel é água/MeOH/CH3CN (35:35:30, v/v/v + 200 pL de Et3N e 0,77 g de NH4OAc por 1000 mL de fase móvel) a um caudal de 1,0 mL/min. A análise por HPLC é realizada à temperatura ambiente e a aquisição e gestão de dados é obtida com um processador cromatográfico millennium da Waters®.

Preparação da Amostra: Tubos de ensaio contendo plasma de rato (200 pL), 5 ou 6 e VN/85-1 (padrão interno, 10 pL de 100 pg/mL), são extraídos com éter dietilico (2x2 mL) utilizando um misturador vortex durante 3 minutos e centrifugados a 3000 g durante 5 min. As camadas orgânicas são evaporadas até à secura sob uma corrente de ar suave. O resíduo é reconstituído numa alíquota da fase móvel (100 pL) e filtrado utilizando filtros de Teflon de 0,2 p antes da análise por HPLC.

Curva de Calibração e Validação do Ensaio de HPLC: As curvas de calibração para 5 em plasma e tecido e para 6 em plasma são construídas por adição de quantidades variáveis dos compostos a tubos de extracção (duplicado) contendo plasma (200 pL) e preparações de tecido (200 pL) de animais não tratados para dar concentrações finais de 0,1 - 100,0 pg/mL. São também preparados tubos de extracção com branco apropriados e uma alíquota do padrão interno é adicionada a cada tubo de extracção para dar uma concentração final de 5 pg/ml. As amostras de calibração são utilizadas no procedimento de preparação de amostras tal como descrito acima. Uma alíquota do extracto reconstituído (50 pl) é injectada no sistema de HPLC e as razões das áreas dos picos para cada um dos analitos em relação à do padrão interno são representadas contra as concentrações de 5 ou 6. A precisão e exactidão dos ensaios são determinadas a partir de uma série de concentrações conhecidas dos inibidores num branco de plasma e utilizadas no procedimento de HPLC. O estudo é repetido em três ocasiões separadas.

Análise dos Resultados: Os cálculos farmacocinéticos são realizados como descrito anteriormente. Os cálculos 31

ΕΡ 1 853 619/PT farmacocinéticos não compartimentais são realizados utilizando WinNOnlin (Scientific Consulting Inc.). A análise de variância de uma via (ANOVA) em SigmaStat para Windows versão 1.0 é utilizada para comparar grupos de tratamento diferentes no nivel de confiança de 95%. O teste post-hoc de Bonferroni é utilizado para determinação da significância. Um valor P de menos do que 0,5 é considerado como estatisticamente significativo.

Estudos Antitumor In Vivo (Xenoenxertos de Cancro da Próstata LAPC-4): Todos os estudos animais são realizados de acordo com as orientações e aprovação da Comissão de Cuidados Animais da Escola de Medicina da Universidade de Maryland, Baltimore. Ratinhos macho com imunodeficiência combinada severa (SCID) de 4-6 semanas de idade adquiridos do National Câncer Institute-Frederick Câncer Research and Development Center (Fredrick, MD) são alojados num ambiente isento de patogénicos sob condições controladas de luz e humidade e deixados com livre acesso a comida e água. Os tumores são desenvolvidos a partir de células LAPC4 inoculadas subcutaneamente (s.c.) nos ratinhos, essencialmente como descrito anteriormente (21). As células LAPC4 são crescidas em IMEM com 15% de SFB mais 1% de PS e 10 nm de DHT até 80% de confluência. As células são raspadas para dpbs, recolhidas por centrifugação e ressuspensas em Matrigel (10 mg/ml) a 3 x 107 células/ml. Os ratinhos são injectados s.c. com 100 μΐ da suspensão de células num sitio em cada flanco. Os tumores são medidos semanalmente com um compasso e os volumes dos tumores são calculados pela fórmula: 4/3π x ri2 x r2 (ri < r2) .

Na primeira experiência, os tumores de LAPC4 são deixados crescer durante 8-10 semanas após a inoculação. Grupos de 5 ratinhos com volumes totais de tumores comparáveis são castrados ou então tratados com 5 e 6 (0,15 mmol/kg uma vez por dia e 0,15 mmol/kg duas vezes por dia, 9 da manhã e 5 da tarde) . Os ratinhos são castrados sob anestesia com nietoxifluorano. Os compostos 5 e 6 foram preparados a 17,2 mg/ml numa solução a 0,3% de hidroxipropilcelulose em solução salina, e os ratinhos receberam injecções s.c. diariamente. Os ratinhos de controlo e castrados são tratados apenas com veiculo. Os tumores são medidos semanalmente durante as 4 semanas de tratamento e os 32 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ volumes dos tumores são calculados. No final do período de tratamento, os animais são sacrificados sob anestesia com halotano; os tumores são excisados, pesados e armazenados a -80°C. Os animais são também pesados semanalmente e monitorizados em relação ao estado geral de saúde e a sinais de possível toxicidade devida ao tratamento.

Na segunda experiência, os ratinhos são inoculados com células LAPC4 e são divididos para quatro grupos de 5 ratinhos cada um. 0 grupo de controlo e castrado recebeu veículo, enquanto os outros dois grupos receberam vn/85-1 (0,15 mmol/kg duas vezes por dia, 9 da manhã e 5 da tarde) ou 5 (0,15 mmol/kg duas vezes por dia, 9 da manhã e 5 da tarde.). Estes tratamentos são iniciados um dia após a inoculação com as células LAPC4; continuados durante 14 semanas para o grupo de controlo, 19 semanas (para os grupos de VN/85-1 e de castração) e durante 21 semanas para o grupo tratado com 5 e os tumores são medidos e processados como descrito acima.

Medição dos níveis de 5 (VN/124-1) no tumor, fígado e testículos: Os animais no grupo tratado com VN/ 124-1 são sacrificados 1 h após a última administração de VN/124-1 e o tumor, fígado e testículos são recolhidos e sujeitos a congelação rápida em azoto líquido. As amostras de tecido são homogeneizadas em tampão fosfato (pH = 7,4, 0,5 ml/mg de tecido). O tecido homogeneizado (200 μΐ) recebe a adição de padrão interno, VN/85-1 (10 pL de solução padrão de 100 pg/mL e em seguida é extraído com Et20 (2x2 mL) por sujeição a vortex durante 3 min, seguido por centrifugação a 3000g durante 5 min. O extracto de Et2<3 é separado e evaporado até à secura sob uma corrente de ar suave. O resíduo é reconstituído em 100 pL da fase móvel de HPLC, filtrado através de filtros de Teflon de 0,2 pm e em seguida analisado por HPLC como descrito acima.

Os exemplos anteriores podem ser repetidos com sucesso semelhante por substituição dos reagentes e/ou condições de operação desta invenção genericamente ou especificamente descritos utilizados nos exemplos anteriores. 33

ΕΡ 1 853 619/PT

Tabela 1: Actividades de CYP17 e de 5a-reductase e ligação ao receptor de androgéneos dos novos compostos 17-heteroarilo.

Composto* CYP 17 ic50 (nM) 5<x-Reductase b % de inibição a 10 μΜ [IC50 (nM)]b Ligação a ic50 (nM)c AR tipo ld tipo 2e LNCaP PC3-AR 5 300,0 4 53 845 384 6 915,0 [770] [480] 1200 242 9 1250,0 aif 17 - - 10 5817,4 21 56 - - 14 3810,0 - - - 3 66 15 Para comparação 500,0 - — — 374 VN/85-1 50, 0 - - - - Abiraterona 800,0 - - - - Cetoconazole 1100,0 - - - - Finasterida - [60,0] [2,0] - - Casodex - - - 940 - Flutamida - - - 11600 10985 aRelatámos anteriormente a síntese de VN/85-1 (Njar et al ., acima) A

Abiraterona foi sintetizada como descrito por Potter et al (Uma síntese conveniente em grande escala de acetato de abiraterona [3p-acetoxi-17(3-piridil)androsta-5,16-dieno], uma nova droga potencial para o tratamento do cancro da próstata. Org. Prep. Proc. Int., 1997, 29, 123-128) . bIC50 é a concentração de inibidor requerida para inibir a actividade enzimática em 50%, cada um em duplicado para CYP 17, triplicado para 5a-reductase e ligação a AR. cIC50 é a concentração de composto requerida para um deslocamento de 50% de [3H]R1881 do receptor de androgéneo. dLinha celular de tumor da Próstata (DU-145) que expressa enzima tipo 1; substrato: 5 nM de [ 1β-3Η] androstenodiona. eEnzima de tecido BPH (enzima tipo 2), 125 pg de proteína, substrato: 210 nM de [1β,2β- 3H]testosterona. £ai = ausência de inibição até 10 μΜ. - = não determinado.

Tabela 2: Parâmetros farmacocinéticos para 5 (50 e 100 mg/kg) e 6 (50 mg/kg) após administração s.c..

Parâmetro3 5 6 50 mg/kg 100 mg/kg 50 mg/kg ti/2 (min) 44,17 ± 1,15 36,6 ± 1,6 37,93 ± 1,15 kel (min-1) 56,5 ± 0,94 68,49 ± 1,26 0,0183 ± 0,004 AUC (min.pg/mL) Tmax (min) Cmax (pg/mL) 1440.00 ± 60,23 30.00 ± 0,0 1813,94 ± 10,94 30,00 ± 0,0 647,10 ± 20,23 60,00 ± 0,00 MRT (min) 16,82 ± 0,37 32,23 ± 0,34 5,15 ± 0,09 Vd(mL/kg) 65,40 ± 0,60 2098,99 ± 4,11 60,46 ± 1,54 3276,39 ± 26,71 79,95 ± 0,01 4207,24 ± 6,25 n=5. 'Os valores são expressos como média ± D.P., 34 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ

Breve Descrição dos Esquemas e Figuras

Diagrama 1 Esquema 1: Esquema 3 Figura 1: : Estruturas de abiraterona e VN/85-1 (16). Síntese de compostos 17-benzoazole (5, 6, 9 e 10) .

Esquema 2: Síntese de compostos 17-diazina (14 e 15) . : Síntese de metabolitos de trans-androsterona, incluindo VNLG/81.

Efeitos de 5, 6 e casodex sobre a actividade de transcrição de luciferase mediada por LNCaP-AR em células de cancro da próstata LNCaP-ARR2-lu. As células em meio isento de esteróides foram tratadas com veículo, ou com concentrações crescentes de 5 ou de casodex com e sem 1 nM de DHT durante 18h. As células foram então analisadas em relação à actividade de luciferase como descrito em "Materiais e Métodos". As barras representam as unidades médias de luz [contagens por segundo (cps)/unidade de proteína, i.e., actividade relativa da luciferase] em poços em triplicado de três experiências separadas.

Figura 2:

Efeitos de 5, 6 e casodex sobre o crescimento de células de cancro (a) LNCaP e (b) LAPC4. As células foram crescidas em meio isento de esteróides antes de serem plaqueadas. Poços triplicados foram então co-tratados com concentrações crescentes de 5, 6 ou casodex e DHT como descrito em "Materiais e Métodos." A percentagem (comparada com o controlo) de inibição do crescimento após 7 dias de tratamento foi determinada utilizando um ensaio WST-I. Os resultados representam a média e desvio padrão de três experiências realizadas em triplicado.

Figura 3:

Cromatograma de HPLC típico de 5, 16 (padrão interno) e metabolito extraído de plasma de 35

ΕΡ 1 853 619/PT 35 ΕΡ 1 853 619/PT Figura 4:

Figura 5:

Figura 6:

Figura 7: rato. Os tempos de retenção para 16, metabolito, e 5 foram de 11,5, 17,3 e 21,6 min, respectivamente.

Perfis farmacocinéticos de 5 e 6 após administração de uma dose singular de bolus subcutâneo a ratinhos SCID macho. Cada ponto de resultados representa as concentrações médias no plasma obtidas a partir de três ratinhos. Os desvios padrão (não apresentados) foram ± 5-8% dos valores médios.

Perfis farmacocinéticos de 5 e metabolito após uma dose singular de bolus subcutâneo (100 mg/kg.pc) de 5 a ratinhos macho.

Actividade antitumor in vivo de 5, 6 e orquidectomia sobre o crescimento de tumores da próstata LAPC4 em ratinhos SCID macho. Grupos de ratinhos com tumores LAPC-4 foram tratados com 5 (0,15 mmol/kg/dia ou 0,30 mmol/kg/dia. Os volumes dos tumores foram medidos semanalmente e a percentagem de variação no volume do tumor foi determinada após 28 dias de tratamento. Os desvios padrão dos volumes dos tumores (não apresentados) foram de ± 10-12 % dos valores médios.

Efeitos de 5, 16, e orquidectomia sobre a formação e crescimento de tumores da próstata LAPC4 em ratinhos SCID macho. 3 x 107 células LAPC-4 foram injectadas s.c. no flanco dorsal de ratinhos SCID. Um grupo de ratinhos foi castrado. Os outros grupos de ratinhos receberam veiculo ou 5 (0,15 mmol/kg duas vezes por dia) ou 16 (0,15 mmol/kg duas vezes por dia). O tratamento diário com 5 ou 16 foi iniciado 1 dia após a inoculação das células. Os volumes dos tumores foram medidos semanalmente e a percentagem de variação no volume do tumor foi determinada após 16 semanas de tratamento. * Indica diferença significativa de 5 versus 36

ΕΡ 1 853 619/PT controlo, castração e 16 na semana 14 (P = 0, 00065, 0, 05 e 0,0097, respectivamente) . **

Indica diferença significativa de 5 versus castração e 16 na semana 16 (P = 0,047 e 0,0047, respectivamente). i - u: Período de dose administrada reduzida de 5.

Diagrama 1. Estruturas de Abiraterona e VN/85-1

Esquema 1. (i) P0C13-DMF, CHC13, Ar, refluxo; (ii) benzimidazole, K2C03, DMF, Ar, 80°C; (iii) 10% de Pd sobre carvão activado, PhCN, refluxo; (iv) KOH metanólico a 10%, Ar, ta.; (v) Al(i-PrO)3, l-metil-4-piperidona, tolueno, refluxo; (vi) benzo-lA-1,2,3-triazole, K2C03, DMF, Ar, 80°C; (vii) (PPh3) 2RhCOCl-Ph2 (CH2) 3PPh2, xileno, Ar, refluxo. 37

ΕΡ 1 853 619/PT

Esquema 2: i) N2H41H20, N2H4-H2S04, EtOH; ii) I2/THF, TG; iii) (2-tributilestanilpirazina/Pd(PPh3) 4; iv) (5tributilestanil)pirimidina/Pd(PPh3) 4

Esquema 3: Síntese de Metabolitos de trans-androsterona, incluindo VNLG/81

VNLG/81 VNLG/82

Lisboa, 2010-12-27

Claims (2)

1. 00 ο

   EP 1 853 619/PT 5/8 Concentração (μςι/ιηΙ)

   FIG, 4 ΕΡ 1 853 619/PT 6/8

   Tempo (horas) FIG.5 EP 1 853 619/PT 7/8 % de variação no volume médio do tumor

   FIG.6 EP 1 853 619/PT 8/8 % de variação no volume médio do tumor

   Duração do tratamento (semanas) FIG. 7

   ΕΡ 1 853 619/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1 - Composto de fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável para utilização no tratamento de uma doença da próstata

   2 - Composto de acordo com a reivindicação 1 para utilização no tratamento de uma doença da próstata, em que a doença da próstata é cancro da próstata ou hiperplasia prostática.

   3 - Composição farmacêutica que compreende um composto de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 2 e um veiculo fisiologicamente aceitável para utilização no tratamento de uma doença da próstata.

   4 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 para utilização no tratamento de uma doença da próstata, em que a doença da próstata é cancro da próstata ou hiperplasia prostática.

   5 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 formulada para administração oral.

   6 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, formulada para administração por uma via seleccionada de entre parentérica, entérica, intraperitoneal, tópica, transdérmica, oftálmica, nasal, local, não oral, tal como aerossol, spray, inalação, subcutânea, intravenosa, intramuscular, bucal, sublingual, rectal, vaginal, intra-arterial ou intratecal.

   7 - Composto, utilização ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização no ΕΡ 1 853 619/PT 2/2 tratamento de uma doença da próstata, em que o composto de fórmula 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável está em combinação com qualquer(quaisquer) outro(s) ingrediente (s) activo(s). Lisboa, 2010-12-27 EP 1 853 619/PT 1/8 Actividade Relativa da Luciferase

   X

   1nM DHT w/o DHT

   FIG.1 EP 1 853 619/PT 2/8 % do Controlo

   Casodex 5 6 FIG, 2a EP 1 853 619/PT 3/8 % do Controlo 130-. 120- 110- 100- 90- 80- 70- 60- 50- 40- 30- 20- 10-0A . _ 1T J 5;;;: M:' ‘ jjÍj|ÍÍÍ| Άj|i|;;· I

   2 2 ââ r~ (T) T O 2 2 2 2 2 2 2
2. 2 O 0 k. c ^11¾ ·*Λ -¾ r*" θ’ O íj 4- ê 4 4 2 c o o d ^ λ ó d ** d d *” Casodex 5 2 Λ. d ΙΟ.Ομ,Μ FIG. 2b 6 ΕΡ 1 853 619/ΡΤ 4/8 γ600Ό Γ