EA019560B1 - Способ лечения простаты (варианты) - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний простаты, в том числе рака простаты и гиперплазии простаты. В одном из вариантов настоящего изобретения способ лечения включает введение нуждающемуся субъекту эффективного количества соединенияили его фармацевтически приемлемой соли. В еще одном варианте настоящего изобретения способ лечения заболеваний простаты включает введение нуждающемуся субъекту композиции, которая содержит эффективное количество вышеуказанного соединения или его фармацевтически приемлемой соли и физиологически приемлемый наполнитель.

Description

Область техники к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний простаты, в том числе рака и гиперплазии простаты, посредством стероидных С-17 гетероарильных ингибиторов человеческого фермента СУР 17 и антагонистов природных (дикого типа) и мутантных андрогеновых рецепторов (ЛК).

Предшествующий уровень техники

Рак простаты (РСА) является наиболее распространенной злокачественной опухолью и причиной смертности от рака в пожилом возрасте в мире. Если не считать рака легких, РСА является наиболее распространенной формой рака у мужчин и находится на втором месте среди причин смертности среди мужчин в Америке. Предполагается, что в Соединенных Штатах в этом году (2004) будет диагностировано 230000 новых случаев рака простаты и около 23000 мужчин умрут от этого заболевания (1ета1 с1 а1., Сапсег ЗГайзйсз, 2004. СА Сапсег 1. С1ш., 2004, 54, 8-29). За период с 1992 по 1999 г. среднее количество случаев РСА среди афроамериканцев было на 59% выше, чем среди европейцев (Атепсап Сапсег 8ос1е1у - Сапсег ЕасГз апб Идитез 2003), а средная доля смертности - более чем в два раза выше, чем у европейцев. Андрогены играют важную роль в развитии, росте и прогрессировании РСА (МсСоппе11, 1. Ό., Рйузю1одюа1 Ьаз1з о! епбосппе Гйегару Гог ртоз!айс сапсег, Ито1. Сйп. Ыойй Ат., 1991, 18: 1-13). Наиболее важная роль при этом принадлежит тестостерону (Т) и дигидротестостерону (ΌΗΤ). Около 90% тестостерона синтезируется в яичках, а остальной тестостерон (10%) - в надпочечниках. Далее Т превращается в более эффективный андроген ΌΗΤ с помощью фермента стероидной 5а-редуктазы, локализованной главным образом в простате (Втисйоузку еГ а1., Тйе сопуетзюп оГ ГезГозГетопе Го 5а-апбгозГап-17в-о1-3-опе Ьу гаГ ргозГаГе ш νίνο и ш уйто, 1. Вю1. Сйет., 1968, 243, 2012-2021). Ниддшз с соавторами предложили андрогеновую депривацию в качестве терапии при развивающемся и метастазирующем РСА в 1941 г. (Ниддшз еГ а1. 8Гиб1ез оп ртозГайс сапсег: 2. Тйе еГГесГз оГ сазГтаГюп оп абуапсеб сатсшота оГ Гйе ргозГаГе дкапб., Агсй. 8итд., 1941, 43, 209-212). Впоследствии было показано, что наилучшие результаты на множественных выборках больных РСА демонстрирует терапия, направленная на удаление андрогенов. №1Шге Кеу. Сапсег, 2002, 2: 389-396). Орхидектомия (хирургическая или медикаментозная (с помощью ОпКН антагонистов)) остается стандартным способом лечения большинства пациентов с раком простаты. Хирургическая или медикаментозная орхидектомия снижает или полностью подавляет продукцию андрогена яичками, но не действует на синтез андрогена надпочечниками. В нескольких исследованиях сообщалось, что комбинация орхидектомии с лечением антиандрогенами, чтобы подавить действие андрогенов надпочечников, существенно увеличивает выживаемость пациентов с РСА (СтатеГотб, еГ а1., А сопГго11еб Гпа1 оГ 1еиргойбе \\йй апб АГйоиГ ПиГатГбе ш ртоГайс сатсшота, N. Епд1. 1. Меб, 1989, 321, 419424; СтаМотб, еГ а1., ТтеаГтепГ оГ пе\\'1у б1адпозеб зГаГе Ό2 ргозГаГе сапсег \\йй 1еиргойбе и ПиГат1бе ог 1еиргойбе а1опе, Рйазе III: шГегдгоир зГибу 0036, I Итой, 1992, 147: 417А; апб Оешз, Ь, Ко1е оГ тах1та1 апбгодеп Ь1оскабе ш абуапсеб ргозГаГе сапсег, РгозГаГе, 1994, 5 (8иррЬ), 17з-22з). В недавней статье Мой1ег с соавторами (Мой1ег еГ а1., Тйе апбгодеп ах1з ш гесиггепГ ртоз!аГе сапсег, СНп. Сапсег Кез., 2004, 10, 440-448) было четко продемонстрировано, что Т и ΌΗΤ обнаруживаются в тканях с рецидивирующим РСА в концентрациях, достаточных для активации андрогеновых рецепторов. Кроме того, Задует с соавторами (Сйеп еГ а1., Мо1еси1аг бе1епшпап1з оГ гез1зГапсе Го апйапбтодеп Гйегару. №11. Меб., 2004, 10, 3339) способом тютоатгау-Ьазеб ртоййпд на модели изогенных ксенотрасплантантов с РСА обнаружили, что умеренное увеличение уровня тКNА андрогеновых рецепторов было единственным изменением связанным с развитием резистентности к антиандрогенной терапии. Специфичные соединения, сильно ингибирующие синтез андрогена в яичках, надпочечниках и других тканях, могут быть более эффективными при лечении РСА (Ц)ат, У.С.О.; Вгоб1е, А. М. Н., 1п1пЬйогз оГ 17а-йубгоху1азе-С1₇,₂₀-1уазе (СУР17): РоГепйа1 адепГз Гог Гйе ГгеаГтепГ оГ ртоз!аГе сапсег, СиттепГ Рйагт. Оезщп, 1999, 5: 163-180).

В яичках и надпочечниках последняя стадия биосинтеза Т включает две ключевые реакции, которые происходят последовательно и катализируются одним ферментом - цитохром Р450 монооксигеназой 17а-гидроксилазой/17,20-лиазой (СУР 17) (На11 Р. Е., СуГосйготе Р-450 С21зсс: опе епхуте \\йй 1\\ό асйопз: Нубгоху1азе и 1уазе, I 8Гего1б Вюсйет. Мо1ес. Вю1, 1991, 40, 527-532). Кетоконазол - противогрибковый агент и хорошо действующий ингибитор ферментов Р450 является также умеренным ингибитором СУР 17 и используется в клинике при лечении РСА (ТгасйГепЬегд еГ а1., 1<е1осопахо1е: А поуе1 апб гар1б Гтеа1шепГ Гог абуапсеб ртозГайс сапсег, I Ито1. 1983, 130, 152-153). Сообщается, что тщательное планирование лечения может приводить к пролонгированным ответам у пациентов, в других случаях устойчивых к гормональной терапии (МизсаГо еГ а1., Орйта1 бозшд оГ ке1осопахо1е апб йубтосойзопе 1еабз Го 1опд гезропзез ш йогтопе геГгасГогу ргозГаГе сапсег, Ргос. Ат. Аззос. Сапсег Кез., 1994, 13: 22 (АЬзГгасГ)). Кроме того, показано, что кетоконазол сохраняет активность у пациентов с РСА на поздней стадии, даже в случае прерывания приема флутамида. (Зта11 еГ а1., 1<е1осопахо1е ге1ашз асйуйу ш абуапсеб ртоз!аГе сапсег райепГз \\йй ртодтеззюп безрйе Йи1ат1бе МГйбта^аГ', I Иго1, 1997, 157, 1204-1207). Хотя кетоконазол сейчас изъят из использования из-за его гепатотоксичности и других побочных эффектов, перечисленные факты позволяют предположить, что более эффективные и селективные ингибиторы СУР 17 могли бы стать полезными агентами для лечения этого заболевания, в том числе прогрессирующего и у пациентов, которые могут быть гормонорезистентными.

- 1 019560

Известно множество стероидных и нестероидных ингибиторов СУР 17 и показано, что некоторые являются эффективными ингибиторами продукции тестостерона на модели грызунов (И)ат аий Втой1е, см. выше). 1агшаи и соавторы описали гормональное воздействие своего наиболее эффективного ингибитора СУР 17 абиратерона (аЫта1егоие) у пациентов с раком простаты (О' Иоилей е1 а1., Ногтопа1 ипрас1 оГ 1йе 17а-йуйгоху1а§е/С 17,20-1уа§е тЫЬйоге аЫта1етопе асе1а1е (СВ7630) ίη ра(1еп1к \\ίΐ1ι ргоЧа1е сапсег, Вг. 1. Сапсег, 2004, 90: 2317-2325). Показано, что некоторые из эффективных ингибиторов СУР17 также ингибируют 5а-редуктазу и/или являются эффективными антиандрогенами с мощной противоопухолевой активностью. (Ν);·ιγ и Вгой1е, см. выше, и Ьопд е1 а1., Апйапйтодешс еГГссЕ оГ поуе1 апйгодеп купШеык шЫЬйотк оп йогтопе- йерепйеШ ргоЧа1е сапсег. Сапсег Век., 2000, 60, 6630-6640). Другие аналоги ингибиторов человеческого фермента СУР 17 и антагонистов природных (дикого типа) и мутантных андрогеновых рецепторов (АВ) приведены в патентах И.8. Ра1еп1 Ыок. 5994335; 6200965 и 6444683.

Сущность изобретения

Стероидные С-17 бензоазолы, пиримидиноазолы (азабензоазолы) и диазины являются эффективными ингибиторами человеческого фермента СУР 17, а также эффективными антагонистами природных (дикого типа) и мутантных андрогеновых рецепторов (АВ).

Способы синтеза стероидных С-17 бензоазолов и пиримидиноазолов включают этап нуклеофильного винилового замещения по типу присоединения-элиминирования с участием 3в-ацетокси-17-хлоро16-формиландроста-5,16-диена или его аналогов и бензоазольных или пиримидиноазольных нуклеофилов.

Способы синтеза стероидных С-17 диазинов включают этап катализируемой палладием реакции кросс-сочетания с участием 17-иодоандроста-5,16-диен-3в-ола или его аналогов и трибутилстаннилдиазинов.

Наиболее эффективными ингибиторами СУР 17 были: 3в-гидрокси-17-(1Н-бензимидазол-1ил)андроста-5,16-диен (5, кодовое название ΥΝ/124-1), 3в-гидрокси-17-(5^|-пиримидил)андроста-5.16диен (15) и 17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-4,16-диен-3-он (6), для которых значения 1С50 были 300, 500 и 915 нМ соответственно. Соединения 5, 6, 14 и 15 эффективно предотвращали связывание ³Н-В1881 (метилтриенолон, стабильный синтетический андроген) как с мутантными и ЬЫСаР АВ, так и с АВ дикого типа, причем в последнем случае эффективность связывания была в 2.2 - 5 раз выше. Было показано также, что соединения 5 и 6 являлись эффективными полными антагонистами АВ. Исследования на клетках показали, что соединения 5 и 6 ингибировали рост стимулированных ИНТ клеток рака простаты ЕЫСаР и ЬАРС4, при этом значения 1С50 находились в низком микромолярном диапазоне (т.е. < 10 мкМ). Их эффективность в качестве ингибиторов была сравнима с касодексом, но заметно выше флутамида. Фармакокинетика соединений 5 и 6 была исследована на мышах. Через 30 и 60 мин после введения соединений 5 и 6 подкожно из расчета 50 мг/кг, их содержание в плазме составляло соответственно 16,82 и 5,15 нг/мл. Оба соединения быстро выводились из плазмы (время полужизни соответственно 44,17 и 39,93 м) и через 8 ч там не обнаруживались. Следует отметить, что соединение 5 быстро превращалось в метаболит, предположительно идентифицированный как 17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-3-он. В тестах ш νί\Ό соединение 5 оказалось очень эффективным ингибитором роста андрогензависимых человеческих ксенотрансплантатов опухоли простаты ЬАРС4, в то время как соединение 6 в этих же условиях было неэффективным. Соединение 5 (50 мг/кг, дважды в день) вызывало 93,8% уменьшение (Р = 0,00065) среднего конечного объема опухоли по сравнению с контролем и было значительно эффективнее, чем кастрация. Согласно нашим данным, это первый пример анти-гормонального агента (ингибитора синтеза андрогенов (ингибитор СУР 17)/антиандроген), который подавлял андроген-зависимый рост опухоли простаты значительно эффективнее, чем кастрация. Учитывая эти впечатляющие противораковые свойства, соединение 5 и другие могут быть использованы при лечении рака простаты.

Впервые раскрываются эффективные ингибиторы СУР 17/антиандрогенов - это 17-бензоазолы, 17пиримидиноазолы и 17-диазины (см., например, схемы 1 и 2, где приведены примеры получения соединений и которые могут быть по аналогии применены к другим структурам, как описано ниже). Побудительным мотивом для получения этих С-17 гетероарильных стероидов было стремление включить структурные фрагменты бензимидазола, бензотриазола, пиримидиноазола и диазина, также называемые привелигированными субструктурами (№со1аои е1 а1., №11ига1 ртойис1-11ке сотЬта1опа1 йЬтапек Ьакей оп рпуйедей ЧгисШгек 1. Сепета1 рппс1р1е5 и койй-рйаке купШеык оГ Ьеп/оругапк, 1 Ат. Сйет. 8ос, 2000, 122, 9939-9953) в новые молекулы. Термин привелигированные структуры был первоначально введен Еуапк е1 а1. (1 Мей. Сйет., 1988, 31, 2235-2246), чтобы описать структурные мотивы, способные взаимодействовать с рядом непохожих мишеней. Эти темплаты, особенно темплат бензимидазола, продолжают привлекать широкое внимание в медицинской химии из-за многообразия их биологической активности и их присутствия в большинстве используемых лекарств (№со1аои е1 а1., аЬоуе).

Различные стероидные С-17 бензоазолы, пиримидиноазолы (азабензоазолы) и диазины, которые являются эффективными ингибиторами человеческого фермента СУР 17/антиандрогенами предтавлены общей формулой I

- 2 019560

где циклическая структура АВС состоит из фрагментов А, В и С стероида или его аналогов, которые могут содержать заместители;

------является двойной связью или, если соединение представляет собой 17-(1Н-бензимидазол-1ил)андрост-3-он, одинарной связью; и

X - необязательно содержащий заместители бензимидазол, бензотриазол, пиримидиноимидазол (пурин), пиримидинотриазол или диазин, при этом структурные фрагменты бензимидазола, бензотриазола и пиримидиноимидазола связаны со стероидным остатком через атом азота пятичленного цикла, а диазиновые группы связаны со стероидным остатком через атом углерода диазинового цикла.

Фармацевтически приемлемые соли стероидных С-17 бензоазолов, пиримидиноазолов (азабензоазолов) и диазинов, представленных общей формулой I, также являются эффективными ингибиторами человеческого фермента СУР 17/антиандрогенами.

Дополнительные заместители циклической структуры АВС включают один или больше следующих групп: алкил и галогенированный алкил (предпочтительно С1_-6); алкенил и галогенированный алкенил (предпочтительно С_1-6), включая и такие остатки, когда двойная связь непосредственно соединена с циклической структурой; галоген; амино; аминоалкилен; гидроксиимино и гидрокси. Кроме того, атомы водорода на соседних атомах углерода циклической структуры АВС могут быть удалены и заменены на дополнительную связь между соседними атомами углерода с образованием двойной связи между этими атомами в циклической структуре.

Предпочтительными дополнительными заместителями в циклической структуре АВС являются метильные группы в 10 и/или 13 положениях структуры.

Дополнительные заместители остатков бензимидазола, бензотриазола, пиримидиноимидазола, пиримидинотриазола или диазина включают галоген, амино, аминоалкилен, гидрокси, -8Н, -8-алкил, алкил и галогенированный алкил (предпочтительно С1_-6). Эти дополнительные заместители будут прикрепляться к атомам углерода, принадлежащим структурным единицам бензимидазола, бензотриазола, пиримидиноимидазола, пиримидинотриазола или диазина.

Далее показаны структурные формулы бензимидазола, бензотриазола, пиримидиноимидазола, пиримидинотриазола и диазина

где * означает точку присоединения стероидного остатка.

В циклической структуре АВС цикл С обычно не содержит заместителей за исключением, предпочтительно, алкила, в особенности метила, связанного с углеродом, общим для колец С и Ό и расположенным рядом с гетероарильным заместителем С-17, т.е. в позиции 13.

Кольца А, В и С циклической группы АВС имеют традиционную структуру, основанную на 3βгидроксиандроста-5,16-диене или 3-оксоандроста-5,16-диене. Циклы А и В характеризуются одной из следующих структур 1-25:

- 3 019560

Далее приведены химические названия соединений, структура циклов АВ которых соответствует 1-25, а циклы С и Ό являются традиционными, где X - это бензамидазол. В вышеописанных соединениях X может также представлять собой бензотриазол, пиримидиноимидазол, пиримидинотриазол, пиразин или пиримидин.

Соединение 1: 3 β -Г идрокси-3а-метил-17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)андроста-5, 16-диен

Соединение 2: 3в-Фторо-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-5,16-диен

Соединение 3: 3в-Хлоро-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-5,16-диен

Соединение 4: 3в-Бромо-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-5,16-диен

Соединение 5: 3в-Иодо-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-5,16-диен

Соединение 6: 3в-Амино-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-5,16-диен

Соединение 7: 17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-3,5,16-триен

Соединение 8: 17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-2,4,16-триен

Соединение 9: 17-(1Н-бензимидазол-1 -ил) -3 -метиленандроста-5,16-триен

Соединение 10:17-(1Н-бензимидазол-1-ил)-3-метиленандроста-4,16-триен

Соединение 11: 3,3-Дифторо-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-5,16-диен

Соединение 12: 3,3-Дифторо-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-4,16-диен

Соединение 13: 17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)-3 -метиленандроста-2,4,16-триен

Соединение 14: 17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)-3 -метиленандроста-2,4,6,16-тетраен

Соединение 15: 3,3-Дифторо-17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)андроста-2,4,16-триен

Соединение 16: 3,3-Дифторо-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-2,4,6,16-тетраен

Соединение 17: 3-Г идроксиимино-17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)андроста-5,16-диен

Соединение 18: 3-Г идроксиимино-17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)андроста-4,16-диен

Соединение 19: 3-Г идроксиимино-17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)андроста-2,4,16-триен

Соединение 20: 3-Г идроксиимино-17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)андроста-2,4,6,16-диен

Соединение 21: 3-Г идрокси-17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)эстра-1,3,5(10), 16-тетраен

Соединение 22: 3-Фторо-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)эстра-1,3,5(10),16-тетраен

Соединение 23: 3-Хлоро-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)эстра-1,3,5(10),16-тетраен

Соединение 24: 3-Бромо-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)эстра-1,3,5(10),16-тетраен

Соединение 25: 3-Иодо-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)эстра-1,3,5(10),16-тетраен

Примеры дополнительных заместителей гетероарильного цикла X, показаны на следующих далее структурах 26-40, где X - это бензимидазол. Кроме того, X может представлять собой замещенный бензотриазол, пиримидиноимидазол, пиримидинотриазол, пиразин или пиримидин.

- 4 019560

Другие примеры дополнительных заместителей для гетероарильного цикла X показаны в структурах 41-46, где X представляет собой замещенный С-17-азабензимидазол (т.е. пиримидиноимидазол или пурин). Обычно X представляет собой замещенный бензимидазол, бензотриазол, пиримидинотриазол, пиразин или пиримидин.

42

Особенно эффективными ингибиторами человеческого фермента СУР 17/антиандрогенами являются соединения М5, М6, М9 и М10, структуры которых приведены ниже.

Настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний простаты, включающий введение нуждающемуся в таком лечении пациенту эффективного количества соединения

или его фармацевтически приемлемой соли.

Термин лечение следует понимать в традиционном смысле, то есть, это обслуживание или забота о пациенте с целью борьбы с уменьшением, ослаблением, облегечением, улучшением и т.д. одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием простаты. Примеры заболеваний простаты, которые можно лечить, включают, например, гиперплазию простаты (ВРН) и рак простаты (например, аденокарцинома простаты).

Конкретные дозировки и частота приема препарата могут зависеть от множества факторов, включая активность специфических активных соединений, их метаболическую стабильность и продолжительность действия, скорость выведения, режим и время введения, возраст, вес тела, состояние здоровья, пол, режим питания и т.д. пациента, а также интенсивность рака или гиперплазии простаты. Можно назначать любое эффективное количество соединения, например, приблизительно, от 1 до 500 мг в день, более конкретно, приблизительно, от 50 до 150 мг в день. Соединение может вводиться в любой форме и любым эффективным способом, включая, например, оральный, парентеральный, энтеральный, внутрибрюшинный, топический, трансдермальный (например, с помощью стандартных пластырей), глазной, назальный, местный, неоральный (например, с помощью аэрозолей, спреев, ингаляций), подкожный, внутривенный, внутримышечный, буккальный, сублингвальный, ректальный, вагинальный, внутриартери- 5 019560 альный, интратекальный и т.д. маршруты введения. Соединение формулы

может вводиться по одиночке или совместно с любыми другими ингредиентами, активными или неактивными, например с физиологически приемлемыми носителями, используемыми для приготовления фармацевтических композиций.

В еще одном варианте настоящего изобретения способ лечения заболеваний простаты включает введение нуждающемуся субъекту композиции, которая содержит эффективное количество соединения формулы

или его фармацевтически приемлемой соли и физиологически приемлемый наполнитель.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Показывает влияние соединений 5, 6 и касодекса на транскрипциональную активность люциферазы, опосредуемую ЬНСаР-АР. на примере клеток рака простаты ЬНСаР-АКВ2-1и. Находящиеся в культуральной среде без стероидов клетки обработали либо только средой, либо возрастающими концентрациями соединения 5 или касодекса совместно с 1 нМ ΌΗΤ или без него в течение 18 ч. Клетки протестировали на люциферазную активность, как будет описано ниже. Столбики соответствуют среднему значению световых единиц (отсчет за одну секунду/единицу протеина, то есть, относительная люциферазная активность) по результату из трех ячеек трех различных экспериментов.

Фиг. 2 и 3. Показывают эффекты соединения 5, 6 и касодекса на рост клеток рака простаты (а) ЬЫСаР и (Ь) ЬАРС-4. Клетки были выращены в среде без стероидов, после чего помещены в платы. Ячейки (по три на каждое измерение) обработали возрастающими концентрациями соединения 5, 6 или касодекса и ΌΗΤ, как будет описано ниже. Процент ингибирования роста через 7 дней обработки (по сравнению с контролем) определяли с помощью опыта ^8Τ-1. Результаты представляют собой средние значения и стандартные отклонения для трех экспериментов, выполненных в трех повторах.

Фиг. 4. Показывает типичную хроматограмму НРЬС для соединений 5, 16 (внутренний стандарт) и метаболита из мышиной плазмы. Времена удержания для соединения 16, метаболита и соединения 5 составляли 11,5, 17,3 и 21,6 мин соответственно.

Фиг. 5. Показывает фармакокинетические профили соединений 5 и 6 после введения подкожно одной болюсной дозы самцам мышей 8СШ. Каждая точка соответствует среднему значению концентрации в плазме, полученной для трех мышей. Стандартные отклонения (не показано) соответствуют ± 5-8% от средних значений.

Фиг. 6. Показывает фармакокинетические профили соединения 5 и метаболита после введения подкожно одной болюсной дозы (100 мг/кг.ЬА) соединения 5 самцам мышей.

Фиг. 7. Показывает противораковую активность ίη νίνο соединений 5, 6 и орхидектомии на рост опухолей простаты ЬАРС-4 у самцов мышей 8СШ. Группы по пять мышей с опухолями ЬАРС-4 принимали соединение 5 (0,15 или 0,30 ммоль/кг/день). Объемы опухолей измеряли еженедельно, процент изменения объема опухоли был определен через 28 дней после начала лечения. Стандартные отклонения объема опухолей (не показано) составляли ± 10-12% от средних значений.

Фиг. 8. Показывает эффекты соединения 5, 16 и орхидектомии на образование и рост опухолей простаты ЬАРС4 у самцов мышей 8СШ. 3 х 10⁷ клеток ЬАРС-4 ввели подкожно в дорсальный бок мышам 8СШ. Одну группу мышей кастрировали. Другая группа получала либо только среду, либо соединения 5 (0,15 ммоль/кг дважды в день) или 16 (0,15 м моль/кг дважды в день). Ежедневное лечение соединениями 5 или 16 начали в первый день после инокуляции клеток. Объемы опухолей измеряли еженедельно, через 16 недель лечения определили процент изменения объема опухолей. * на фиг. 8 означает значимое отличие соединения 5 от контроля, кастрации и соединения 16 на 14-й неделе (Р = 0,00065, 0,05 и 0,0097, соответственно). ** означает значимое отличие соединения 5 от кастрации и соединения 16 на 16-й неделе (Р = 0,047 и 0,0047, соответственно), 4-4 4: Стрелками показаны периоды уменьшения вводимой дозы соединения 5.

- 6 019560

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Были исследованы следующие параметры вышепредставленных соединений: ингибиторная активность по сравнению с СУР 17 и стероидной 5а-редуктазами; связывание с андрогеновыми рецепторами и трансактивация андрогеновых рецепторов; антипролиферативный эффект в опытах с двумя линиями клеток рака простаты ЬЫСаР и ЬАРС-4. Исследование фармакокинетики соединений 5 и 6 было проведено на мышах, исследование противоопухолевой активности против клеток карциномы простаты ЬЛРС-4 ίη νίνο было также проведено на мышах. Все описанные здесь соединения, за исключением соединения 15, относятся к группам соединений, описанным в работах На1баг е! а1., Nονе1 81егснба1 рупплб11 ингибиторов οί Р450 17 (17а-йубгоху1а8е/С17-20-1уа8е, АгсН. РИагт. Меб СНет.. 2001, 334, 373-374; апб На1баг е! а1., и ЕПссй οί ηονе1 17а-йубгоху1а8е/С17,20-1уа8е (Р45017, СУР17) ингибиторов биосинтеза андрогенов ίη νίΐτο и ίη νίνο, 1 81егснб ВюсИет. ΜοΚε. Βίο1, 2003, 84, 555-562.

Способы получения 17-бензоазолов и 17-диазинов приведены на схемах 1 и 2 соответственно. Эти способы могут быть применены и к другим описанным здесь аналогам.

Схема 1.(1) РОСЕ-ЭМЕ, СНС1₃, Аг, кипячение; (ίί) бензимидазол, К₂СО₃, ЭМР, Аг, 80°С; (ίίί) 10% Рб на активированном древесном угле, РИСЫ, кипячение; (ίν) 10% метанольного КОН, Аг, г!.; (ν) А1(1-РгО)₃, 1-метил-4-пиперидон, толуол, кипячение; (νί) бензо-1Н-1,2,3-триазол, К₂СО₃, ЭМР, Аг, 80°С; (νίί) ксилен, Аг, кипячение.

Схема 2: ί) Ы₂Н₄.Н₂О, Ы₂Н₄.Н₂8О₄, Е!ОН; ίί) 1₂/ТНР, ТС; ίίί) (2-трибутилстаннил пиразин/Рб(РРИ₃)₄; ίν) (5 -трибутилстаннил)пиримидин/Рб(РРй₃)₄

Ключевой интермедиат для синтеза 17-бензазолов, а именно 3в-ацетокси-17-хлоро-16формиландроста-5,16-диена (2) был получен из соединения (1) с помощию стандартной процедуры, описанной ранее в статьях Ы]ат е! а1., Νικ:Εορ1ιί1Κ νίην1ίο аббйюп-е1ишпа1юп δίΛδΙίΙιιΙίοη геас!юп οί 3βасеΐοаxу-17-сЫο^ο-16-ίο^ту1аηб^ο8ίа-5,16-б^еηе: А ηονе1 и депега1 гои1е ίο 17-5иЬ5Ши1еб-А^|6-51его1б5. Рай 1. 8уп1Ье818 οί ηονе1 17-аζο1у1-Δ¹⁶ 8ΐе^ο^б8; ингибиторов οί 17α-йуб^οxν1а8е/17,20-1уа8е (Р45017?), Βίοοτ§. Меб. СНет. Ьей., 1996, 6, 2777 - 2782; и Nονе1 Π^ζο^ 8ΐе^ο^б8; рοΐеηΐ ингибиторов οί суЮсйготе Р450 17α-йуб^οxν1а8е/17,20-1уа8е (Р450₁₇а): Рοΐеηί^а1 адепй ίοτ !Не 1геа1теп1 οί ргойШе сапсег, 1 Меб. СНет., 1998, 41, 902 - 912). Обработка соединения 2 бензимидазолом в присутствии К₂СО₃ в ЭМР при температуре около 80°С позволила получить ожидаемый 3в-ацетокси-17-1Н-бензимидазол 3 с практически ко

- 7 019560 личественным выходом. Соединение 3 хорошо деформилируется в присутствии 10% палладия на активированном угле в кипящем бензонитриле, давая соединение 4 с 93% выходом. Гидролиз полученного соединения позволяет получить требуемый 3в-гидрокси-17-бензимидазол 5. Модифицированное окисление соединения 5 по реакции Опеннауэра позволяет получить соответствующий Д⁴-3-оксоаналог, 6.

Реакция соединения 2 с бензотриазолом в присутствии К₂СО₃ в ΌΜΕ при температуре около 80°С позволила получить ожидаемый 3в-ацетокси-17-бензо-1Н-1,2,3-триазол 7Ь с очень хорошим выходом, побочным продуктом был региостереомер 7а 2Н-1,2,3-триазол, его выход примерно 5%. Эти два региостереомера были легко разделены с помощью флэш-хроматографии (йазй со1итп сйготаГодгарйу (РСС)) на силикагеле и легко идентифицированы с помощью спектров ΝΜΡ. Так, четыре ароматических протона симметричного 2Н-1,2,3-триазола 7а дают сигнал в виде двух пар дублетов при δ 7.43, 7.45, 7.88 и 7.90, в то время как четыре ароматических протона несимметричного 1Н-1,2,3-триазола 7Ь дают мультиплет при δ 7.46 (2Н) и дублеты при δ 7.57 (1Н) и 8.15 (1Н), соответственно. Кроме того, сигнал протона 16-СНО в соединении 7а значительно сдвинут вниз по сравнению с сигналом этого протона в соединении 7Ь [δ 10,66 и δ 9,59 соответственно). Деформилирование соединения 7Ь с генерацией катализатора КЬ(1,3-бис(дифенилфосфино)пропан)₂ ⁺СГ [Яй(бррр)₂ ⁺С1^-] ίη зйи в кипящем ксилене дает соединение 8, последующий гидролиз 3β-ацетоксигруппы позволяет получить целевое соединение 3в-гидрокси-17(бензо-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)андроста-5,16-диен (9) с 90% выходом. Окисление 9 дает соединение 10 с хорошим выходом.

Синтез 17-диазинов, (17-диазина 14 апб 17-пиримидина 15) был начат с легко доступного дегидроэпиандростерона (11, схема 2). Его превратили в соответствующий 17 гидразон 12 обработкой гидразин гидратом и гидразин сульфатом, как было ранее описанов статье РоИсг с соавторами А сопусшсШ. 1агде-зса1е зуШ11ез1з о! аЫпИегопе асс1а1с [3в-асе1оху-17(3-руг1бу1)апбго81а-5,16-б1еп], а ро!епба1 пе\у бгид Гог 1Не 1геа1теЩ о! ргойаГе сапсег. Огд Ргер. Ргос. Ιηΐ., 1997, 29, 123-128. Обработка соединения 12 иодом в присутствии 1,1,3,3-тетраметилгуанидина позволила получить винил 17-иодид 13 с очень хорошим выходом. Катализируемые палладием реакции кросс-сочетания (СйозЫ еГ а1., То1а1 зуп1Нез1з оГ Сгоззи1агшез-1 и -2. 1 Огд С1ет., 1995, 60, 5899-5904) соединения 13 с (2-трибутилстаннил)пиразином или (5трибутилстаннил)пиримидином шли с образованием 3в-гидрокси-17-(2-пиразил)андроста-5,16-диена (14, 15%), и 3в-гидрокси-17-(5-пиримидил)андроста-5,16-диена (15, 10%), соответственно. Низкие выходы этих двух кросс-реакций вероятнее всего связаны с нестабильностью станнилдиазиновых реагентов в условиях происходящей реакции. Структуры целевых соединений 14 и 15 легко идентифицировать методом ΝΜΚ: три неэквивалентных протона 17-пиразина в соединении 14 дают сигнал в виде трех синглетов при δ 8,35, 8,48 и 8,70, в то время как эти же протоны 17-пиримидина в соединении 15 дают следующие сигналы: два неэквивалентных протона выглядят как синглет δ 8,73, и один протон дает сигнал при δ 9,07. Более того, влияние 17-диазиновых групп в соединениях 14 и 15 является причиной различий в химических сдвигах соответствующих 16-олефиновых протонов по сравнению с 16-ым протоном в исходном А16-17-иодиде 13: сигнал 16-Н в соединении 14 выглядит как синглет при δ 6,77, который значительно менее экранирован по сравнению с 16-Н в соединении 13 (δ 6,14); 16-Н в соединении 15 обнаруживается при δ 6,11, также как в соединении 13. Как указано выше, о соединении 15 ранее было указано в вышеупомянутой работе На1баг и соавторы, однако его способ синтеза отличается от описанного здесь.

Репрезентативные образцы новых соединений были затем подвергнуты расширенному тестированию ίη уйго и ίη у1уо, как подробно описано в следующих далее разделах.

Без дополнительных разъяснений предполагается, что компетентный специалист сможет с помощью представленного описания реализовать настоящее изобретение в максимальной степени. Следующие далее предпочтительные конкретные примеры реализации изобретения, таким образом, приведены исключительно для иллюстративных целей и ни коим образом не ограничивают остальную часть описания.

Далее и во всех примерах все температуры выражены в градусах по Цельсию, все доли и проценты по весу, если не указано иначе.

Примеры Биологические эксперименты

Изучение ингибирования СУР 17:

Анализ ингибирования СУР 17 проводился в соответствии с ранее описанной методикой, согласно которой в качестве источника фермента использовали Е. сой, экспрессирующие интактный цитохром Р450с17 (Спдогуеу е1 а1., СМосйготе Р450с17-ехргеззшд ЕзсйепсЫа сой аз а Пгз1-з1ер зсгеепшд зузГет Гог 17αЬубгоху1азе-С17,20-1уазе 1пй1Ь11огз, Апа1. Вюсйет.; 1999, 267, 319-330; и ЕГГесГз оГ пе\у 17αЬубгоху1азе/С17,20-1уазе шЫЬйогз оп БЖ'.’аР ргоз1а1е сапсег се11 дго\\П1 ίη уйго апб ίη У1уо, Вг. 1. Сапсег, 1999, 81, 622-630). Значения 1С₅₀ соединений были определены из кривых доза-ответ и представлены в табл. 1.

- 8 019560

Таблица 1. Ингибирующая активность по отношению к СУР17 и 5а-редуктазе и связывание рецепторов андрогена новыми 17-гетероарильными соединениями

Соединение9	СУР17 1^50 (нМ)ь	5а-редуктаза, % ингибирования при 10 мкМ [1С50 (нМ)]ь	АЯ-связывание, 1С50 (нМ)ь
		Тип 1й	Тип 2е	ЬЫСаРР	СЗ-АП
5	300.0	4	53	845	384
6	915.0	[770]	[480]	1200	242
9	1250.0	ηί	17	-	-
10	5817.4	21	56	-	-
14	3810.0	-		-	366
15	500.0	-	-	-	374
Для сравнения
Соединение9	СУР17	5а-редуктаза, %	АН-связывание, 1СМ
	1С50	ингибирования при	(нМ)ь
	(нМ)ь	10 мкМ [1С50 (нМ)]ь
		Тип Р	Тип 2е	1_П1СаРР	СЗ-АА
νΝ/85-1	50.0	-	-	-	-
Абиратерон	800.0	-	-	-	-
Кетоконазол	1100.0	-	[2.0]	-	-
Финастерид	-	[60.0]	-	940	-
Касодекс	-	-	-	11600	10985
Флутамид	-	-

^аСинтез ΥΝ/85-1 был описан ранее (Ц)аг с1 а1., см. выше)

Абиратерон синтезировали по методике РоИег с1 а1 (А сопусшсШ. 1агде-§са1е зупФезк οί аЫга1егопе ацетат [3в-ацетокси-17(3-руг1йу1)апйго81а-5,16-й1епе], а ро1епИа1 пе\у Фид ίοτ Фе (геаИпеШ οί рго81а1е сапсег. Огд. Ргер. Ргос. Ιηί, 1997, 29, 123-128).

^ь1С₅о представляет собой концентрацию ингибитора, требуемую, чтобы заингибировать активность фермента на 50%, по результатам двух повторов при определении ингибирования СУР 17, трех повторов для 5а-редуктазы и для определения связывания АК.

^с1С₅₀ представляет собой концентрацию соединения, требуемую, чтобы вытеснить 50% [³Н]К1881 из андрогенового рецептора.

^Клеточная линия рака простаты (Όυ-145), экспрессирующая фермент типа 1; субстрат: 5 нМ [1β3Н]андростенедиона.

^еФермент из ткани ВРН (фермент типа 2), 125 мкг протеина, субстрат: 210 нМ [1β,2β³Н]тестостерона.

^ίηί = нет ингибирования до концентрации 10 мкМ. - = не определено.

В той же аналитической системе для сравнения определили 1С₅₀ кетоконазола, абиратерона (проходящего клинические испытания ингибитора СУР 17 (ОНоппеИ выше), диаграмма 1).

- 9 019560

Диаграмма 1. Структуры абиратерона и νΝ/85-1 и 3в-гидрокси-17-(1Н-имидазол-1-ил)андроста5,16-диена (νΝ/85-1, соединение 16, диаграмма 1, считается наиболее сильным ингибитором СУР 17 (И)аг е! а1., Сштеп! Рйагт. Иек1дп, 1999, 5: 163-180; и I. Меб. Сйет., 1998, 41, 902-912, выше)). Некоторые новые 17-гетероциклические соединения демонстрируют мощное ингибирование СУР 17 с 1С₅₀ 300-915 нМ. Бензимидазолы 5 и 6 ингибируют фермент в 4-6 раз сильнее, чем бензотриазолы 9 и 10. Результат позволяет предположить, что на ингибиторную активность влияет электронная структура 17гетероциклов. Более того, соединения с Д⁵-33-ольной функциональностью, 5 и 9, являются по меньшей мере в три раза более сильными ингибиторами, чем соответствующие аналоги с функциональной группой Д⁴-3-она, то есть, соединения 6 и 10 соответственно. Эти результаты противоречат нашим предыдущим данным по простым 17-азольным ингибиторам СУР 17. В той серии экспериментов не было обнаружено заметного различия в ингибирующей способности между Д⁵-33-ольными азолами и соответствующими Д⁴-3-оновыми аналогами (И)аг е! а1., 1. Меб. Сйет., 1998, 41, 902 - 912, выше). Возможное объяснение этого связано с тем, что более объемные бензоазолы по-другому связываются с активным сайтом фермента, так что становится важным эффект (эффекты) группы в третьем положении. Связывание субстрата или ингибитора с гемовым компонентом некоторых цитохромов Р450 изучено методом υν-νίκ дифференциальной спектроскопии (1еГсоа! С. К., Меакигетеп! оГ киЬк1га!е апб ίηΗίόίΙΟΓ Ыпбтд ΐο т1сгокота1 су!осйготе Р450 Ьу орбса1 бГГегепсе крес!гоксору, Ме1йобк Епхуто1. 1978, 52, 258-279). Данный метод был расширен с помощью стандартной процедуры, ранее описанной авторами изобретения (И)аг е! а1., Вюогд. Меб. Сйет. Ье!!., 1996, 6, 2777-2782; и I Меб. Сйет., 1998, 41, 902-912). Соединения 5 и 9 индуцируют дифференциальный спектр типа II, что означает координацию стероидного азота (Ν-3 бензоимидазолового или бензотриазолового цикла) к гемовому железу СУР 17 с образованием низкоспинового железа. Пиковые положения максимума Соре комплекса фермента с 5 и 9 (426 нм) соответствуют имеющейся информации по связыванию азот-содержащих лигандов с системами СУР, а также соответствуют данным авторов изобретения для других 17-азолильных ингибиторов СУР 17 (И)аг е! а1., Вюогд. Меб. Сйет. Ьей., 1996, 6, 2777-2782; и I Меб. Сйет., 1998, 41, 902-912). Взаимодействие бензоазольного азота с гемовым железом СУР17 позволяет предположить объемную толерантность по 17 положению, так как сродство связывания 5 и 9 идентично сродству для менее стерически требовательного соединения 16, содержащего 17-имидазольную группу.

Из двух изученных 17-диазинов, 17-пиримидин 15 (1С₅₀ = 500 нМ), приблизительно, в 8 раз сильнее 17-пиразина 14 (1С₅₀ = 3810 нМ). Что касается бензоазолов, настоящий результат показывает, что электронная природа 17-гетероциклов влияет на ингибирующую активность. Наконец, получены значения 1С₅₀ для кетоконазола и абиратерона в той же системе (табл. 1). Самое сильное соединение изученной серии, 17-бензимидазол 5, показывает, приблизительно, в 4 и в 3 раза более сильное ингибирование, по сравнению с указанными соединениями, соответственно, хотя оно и слабее, чем 16.

Ингибирование изозимов 5а-редуктазы человека типа 1 и 2 ΐη νΐΐΓθ

На основании предыдущих данных, что некоторые ингибиторы СУР17 способны ингибировать ферменты 5а-редуктазу человека, авторы изобретения кратко изучили эту способность рассматриваемой новой серии ингибиторов СУР17. Ингибирующую активность соединений 5, 6, 9, 10 и финастерида (для контроля) определяли на клеточной линии Ии-145 (человеческий фермент типа 1) и гомогенатах ткани ВРН человека (человеческий фермент типа 2), как описано в работе Найтапп е! а1., 8уп!йек1к апб еνа1иа!юп оГ 2 ’-киЬййЩеб 4-(4'-сагЬоху- ог 4'-сагЬохуте1йу1Ьеп/у1|бепе)^-асу1р|репбтек: Нщй1у ро!еп! апб т νί\Ό асЩ'е Чегсаб 5а-гебис!аке 1уре 2 й11пЬйог5, I. Меб. Сйет., 2002, 45, 3406-3417. Значения 1С₅₀ и процента ингибирования в концентрации 10 мкМ для некоторых соединений представлены в табл. 1. Сильное ингибирование ферментов типа 1 и 2 демонстрирует только соединение 6 (1С₅₀ = 770 и 480 нМ, соответственно), хотя оно и в несколько раз слабее финастерида (1С₅₀ = 60 и 2 нМ, соответственно).

Анализы связывания с ЬХСаР и РС-3АК андрогеновыми рецепторами

Ранее авторы изобретения уже показали, что некоторые из ингибиторов СУР17 являются сильными антиандрогенами для мутантных АК и АК дикого типа (Ьопд е! а1., 6^едο^^уеν е! а1. апб И)аг е! а1., I. Меб. Сйет., 1998, 41, 902-912, выше). В связи с этим интересно было оценить способность серии вышеописанных ингибиторов СУР17 связываться с указанными рецепторами. Конкуренция с АК определялась с использованием меченого К1881 ([³Н]-К1881) в андроген-чувствительных клетках й-Ж'.'аР, экспрессирующих мутантные АК, и андроген-нечувствительных клетках РС-3, стабильно трансфецированных АК дикого типа (называются РС-3 АК). Соединения 5, 6, 14 и 15 в наномолярном диапазоне концентраций эффективно конкурируют с меченым К1881 за связывание с АК обоих типов, причем это связывание доза-зависимо (фигуры не показаны). Соединения 5, 6, 14 и 15 демонстрируют значения 1С₅₀ 384, 242, 336 и

- 10 019560

374 нМ, соответственно (табл. 1) с ЛК дикого типа, они от 29 до 45 раз более эффективны в этом отношении, чем клинически используемый антиандроген флутамид (1С₅₀= 10,985 нМ). Как видно из табл. 1, сродство связывания соединений 5 и 6 с мутантными АК сравнимо с касодексом, используемым в настоящее время антиандрогеном, но снова превосходит данные для флутамида. Однако известно, что биологическая активность флутамида вызвана, в основном, его метаболитом, гидроксифлутамидом, который является значительной более эффективным антагонистом АК.

Влияние агентов на опосредуемую АК транскрипцию мутанта ЫЧСаР

Далее авторы изобретения попытались выяснить, могут ли соединения 5 и 6 функционировать как агонисты или антагонисты АК. Исследуемое регулируемой андрогенами активации транскрипции выполняли на клетках ЬИСаР, временно трансфецированных репортерным конструктом пробазин люциферазы ΑΑΚΖ-Ьис (анализ активности люциферазы) (К1т е( а1., 8упегд1кт оГ су!ор1акт1с кшакек ίη 1Ь6шбисеб йдапб-тберепбеп! асйуайоп оГ апбгодеп гесерЮг ίη ргок1а1е сапсег се11к, Опсодепе, 2004, 25:18381844; и Ζΐιηπβ е1а1., А 8та11 сотрокйе ргоЬакт ргото1ег сопГегк 1ιί§1ι 1ехе1к оГ ргок1а1е-крес1йс депе ехргеккюп 1йгоидй геди1айоп Ьу апбгодепк апб д1исосогйсо1бк т Уйго и т УКо. Епбосппо1оду, 2000, 141: 46984710). Соединения 5, 6 или касодекс в концентрациях 0,1 и 10 мкМ каждое не влияли на люциферазную активность, однако экспрессия люциферазы увеличивалась, приблизительно в 99,6 раза после обработки 1.0 нМ ΌΗΤ в течение 18 ч (фиг. 1). Более того, экспрессия люциферазы, индуцированная экспозицией 1.0 нМ ΌΗΤ, снижалась концентрационно-зависимым образом и приблизительно одинаково под действием 5, 6 и касодекса, причем это снижение проходило приблизительно одинаково (фиг. 1). Совместно приведенные результаты позволяют предположить, что соединения 5 и 6, как и касодекс, не явлются полными или частичными агонистами АК и могут считаться сильными и чистыми андрогеновыми антагонистами. Хотя авторы изобретения не тестировали соединения на клетках РС-3 АК/ЬИ, экспрессирующих АК дикого типа, они с большой вероятностью будут вести себя там сходным образом. Ранее авторы изобретения показали, что некоторые ингибиторы СУР17 более сопоставимы с касодексом, чем флутамид (Ьопд е( а1., выше), и это, судя по всему, относится к рассматриваемым здесь новым соединениям. В целом, вышепредставленные соединения сильно взаимодействуют с АК обоих типов. Это может быть полезно при лечении пациентов с опухолями, экспрессирующими АК дикого или мутантного типа, или пациентов с усиленной экспрессией АК.

Эффекты бензоазолов на рост клеток рака простаты ЬХСаР и ЬАРС-4 ΐη νΐΐΓθ

Исследована способность соединений 5 и 6 ингибировать пролиферацию мутантных клеток ЬИСаР, стимулированных 1 нМ ΌΗΤ. Интенсивность пролиферации ΌΗΤ-стимулированных клеток ЬИСаР, приблизительно, в 2 раза превосходит контроль без ΌΗΤ (фиг. 2). Как видно из фиг. 2, соединения 5 и 6 ингибируют ΌΗΤ-индуцированную пролиферацию клеток ЬИСаР доза-зависимым образом, значения 1С₅₀ составляют 6.0 и 1.8 мкМ, соответственно. В качестве положительного контроля использовали касодекс, он показывает похожее ингибирование ΌΗΤ-индуцированной пролиферации клеток ЬИСаР (фиг. 2, 1С₅₀ = 8,6 мкМ). Обработка андроген-чувствительной линии клеток простаты ЬАРС4 10 нМ ΌΗΤ не привела к значимой индукции пролиферации клеток (фиг. 3). Другие исследователи также сообщают, что ответ клеток ЬАРС4 на андрогены выражен не в такой степени, как ответ клеток ЬИСаР 0йотркоп е( а1., Апбгодеп агИадопМ асйхйу Ьу (йе апЬох|бап1 то1е1у оГ уйатше Е, 2,2,5,7,8-реп1ате1йу1-6-сйготапо1 т йитап ргокЕйе сагстоша се11к, МоИс. Сайег ΤΙ^ιη., 2003, 2, 797-803). Однако соединения 5, 6 и касодекс демонстрируют доза-зависимое ингибирование на этой клеточной линии (фиг. 3), как и в случае клеток ЬИСаР. По своей способности ингибировать пролиферацию клеток БАРС4 соединения образуют следующий ряд: 6 > 5 > касодекс, значения 1С₅₀ составляют 1,0, 3,2 и 10 мкМ, соответственно. Совместно полученные данные позволяют предположить, что соединения 5 и 6 могут блокировать способность ΌΗΤ стимулировать пролиферацию клеток, что коррелирует с описанным выше связыванием с андрогеновыми рецепторами и их активацией. Соединения 5 и 6 относятся к числу наиболее эффективных антиандрогенов, известных в настоящее время.

Фармакокинетика соединений 5 и 6 и метаболизм соединения 5

Фармакокинетика двух ведущих соединений 5 и 6 была изучена на самцах мышей линии 8СШ в соответствии с ранее описанной нами процедурой для других ингибиторов СУР 17 (Ипапе е( а1., Рйагтасокшейс ргоГ11е оГ 3в-йубгоху-17-(Ш-123-1г1а7о1-1-у1)апбгок1а-5,16-б1епе (УИ/87-1), а ро1еп1 апбгодеп куп1йек1к 1пй1Ьйог т тюе, 1. 81егснб Вюсйет. Мо1ес. Вю1, 2001, 71, 145-152; и Иапбгайа е( а1., Ро1еп1 СУР 17 1пй1Ьйогк: тргоуеб купШекек, рйагтасокшейск апб ап11- (итог асЬхйу т (йе ЬИСаР йитап ргокЕИе сапсег тобе1, 1 81егснб Вюсйет. Мо1ес. Вю1, 2004, 92,155-165). Результаты показаны в табл. 2 и на фиг. 4-6.

- 11 019560

Таблица 2. Фармакокинетические характеристики 5 (50 и 100 мг/кг) и 6 (50 мг/кг) после введения подкожно

- Параметра	5		6
	50 мг/кг	100 мг/кг	50 мг/кг
-
Т1/2(мин)	44.17 ± 1.15	36.6 ± 1.6	37.93 + 1.15
Κβ, (мин'1)	56.5 + 0.94	68.49 + 1.26	0.0183 ± 0.004
дис	1440.00 ± 60.23	1813.94 + 10.94	647.10 + 20.23
(мин.мкг/мл)
ттах(мин)	30.00 ± 0.0	30.00 ± 0.0	60.00 + 0.00
Стах (МКГ/МЛ)	16.82 + 0.37	32.23 + 0.34	5.15 + 0.09
МНТ (мин)	65.40 ± 0.60	60.46 ± 1.54	79.95 + 0.01
νό(мл/кг)	2098.99 + 4.11	3276.39 ± 26.71	4207.24 ± 6.25

^аЗначения представляют собой среднее ± 8.Е., η = 5.

При исследовании методом НРЬС в обращенной фазе соединения 5 (время удержания (й) = 21,6 мин) хорошо разрешалось от внутреннего стандарта (16, г( = 11,5 мин), метаболита (й = 17,3 мин) и других эндогенных соединений из мышиной плазмы (фиг. 4). Полученные для соединения 5 кривые калибровки линейны и репродуцибельны (данные не показаны), вариабельность в одном анализе и между анализами составляет менее 10%, и предел детекции - 100 нг/мл. Метод НРЬС был валидирован и использовался для мониторинга соединения 5 в мышиной плазме.

Сразу после введения подкожно концентрация соединения 5 в плазме экспоненциально начинала уменьшаться, период полужизни составлял около 44.17 минут, скорость элиминирования достигала 56,5 мин^-1. Клиренс соединения 5 из системной циркуляции составлял 1986.14 мл/ч/кг, оно не обнаруживалось спустя 6 ч после введения. В табл. 2 показаны расчетные параметры фармакокинетики для бесчастевой модели после подкожного введения соединения 5, основанные на концентрации вещества в плазме. На фиг. 5 показана кривая зависимости концентрации соединения 5 от времени после введения подкожно (50 и 100 мг/кг). Наблюдаемая плазматическая концентрация соединения 5 у мышей достигала пика через 30.0 минут после введения. Соединение 5 хорошо абсорбировалось из подкожной области, площадь под кривой зависимости его плазматической концентрации от времени после введения подкожно возрастала пропорционально дозе в интервале доз от 50 до 100 мг/кг. Более того, период полужизни элиминации и среднее время резидентности оставалось относительно постоянным при увеличении дозы от 50 до 100 мг/кг (табл. 1). Результаты показывают, что фармакокинетический профиль соединения 5 не зависит от дозы.

Как показано на фиг. 6, из соединения 5 образуется значительное количество полярного метаболита (время удержания 17,3 мин, см. фиг. 4), он присутствовал в плазме на протяжении всех фармакокинетических исследований. Максимальное количество метаболита составляло 67,72%, оно достигалось через 2 ч после введения. Время удержания этого метаболита идентично соединению 6. Предварительно его идентифицировали методом БС-М8; его молекулярная масса (т/ζ 391 = М + Н⁺) соответствовала структуре З-оксо-Δ^5,16тетрагидросоединения 5 (то есть, 17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андрост-3-ону). Метаболит образовывался из соединения 5 путем окисления 3β-0Η -> 3-оксо с последующим восстановлением (под действием редуктаз) обоих двойных связей Δ⁵ и Δ¹⁶. Похожий метаболит ранее был идентифицирован у самцов мышей и образовывался из близко-родственного стероидного 17-имидазола (в результате окисления 3β-0Η -> 3-оксо с последующей изомеризацией двойной связи Δ5, Напбгайа с( а1., выше).

Основной метаболит соединения 5, то есть 17-(1Н-бензимидиазол-1-ил)андрост-3-он, может быть синтезирован из транс-андростерона; см. Схему 3. Ожидается, что у него будет также и аналогичная активность.

- 12 019560

Схема 3: Синтез метаболитов транс-андростерона, включая ΥΝΣΟ/δΙ

Уксусный ангидрид

1-андростерон

Пиридин,

ΤΡΑΡ/ΝΜΟ

0¾¾ комнатная температура, 3 часа

уыьо/кг

Фармакокинетика соединения 6 ίη νίνο у мышей не похожа на соединение 5 из-за относительно низкой С_тах и относительно более высокой скорости элиминирования (фиг. 5 и табл. 2). Кроме того, авторы изобретения не обнаружили метаболизма соединения 6 в плазме, что также отличает его от соединения 5.

Эффекты соединений 5 и 6 на ксенотрансплантанты, выращенные в мышах 8СГ0

На основании впечатляющих результатов многочисленных биологических экспериментов ίη νίίτο, то есть, сильного ингибирования СУР 17, сильной антипролиферативной активности на клетках рака простаты и антиандрогенной активности, соединения 5 и 6 были отобраны для исследования противораковой эффективности ίη νίνο на модели ксенотрансплантантов рака простаты человека БАРС4.

В первом эксперименте определяли эффекты соединений 5 и 6 на рост хорошо установленных опухолей рака простаты БАРС4 у мышей 8СШ. В качестве эксперимента сравнения использовали кастрацию. Мыши с опухолями получали (η = 5/группа) одну или две дозы 5 или 6 (0,15 ммоль/кг раз в день или 0,15 ммоль/кг дважды в день). Объем опухолей измеряли еженедельно и сравнивали с контролем, получавшим только среду, или кастрированными мышами.

Кастрация привела к 55% снижению финального объема опухоли, по сравнению с контролем (фиг. 7). Введение вещества 5 по 0,15 ммоль/кг раз в день и 0,15 ммоль/кг два раза в день привело к снижению среднего финального объема опухоли на 41 и 86,5%, соответственно, по сравнению с опухолями у контрольных животных, получавших среду (фиг. 7). В отличие от превосходного эффекта соединения 5 на ингибирование роста опухоли у мышей соединение 6 было либо неэффективно в низких дозах, либо даже стимулировало рост опухоли, по сравнению с контролем (фиг. 7). Неспособность соединения 5 ингибировать рост опухоли ЬАРС4 ίη νίνο особенно огорчает, так как это соединение очень эффективно ингибирует рост клеток РСА ίη νίίτο и является высоко эффективным полным антиандрогеном (см. фиг. 1). Значимое различие противораковой эффективности соединения 5 и 6 ίη νίνο нельзя объяснить просто различием фармакокинетических свойств двух соединений. В настоящее время причины столь драматических различий противораковой активности соединений неизвестны. Однако можно предположить, что соединение 6 превращается в организме животных в метаболит(ы), являющиеся сильными агонистами андрогеновых рецепторов, вызывающими сильную стимуляцию роста опухоли. В ходе эксперимента мышей раз в неделю взвешивали. Вес тела животных всех групп слегка увеличился, что совпадает с увеличением для контрольной группы. Все мыши выглядели здоровыми, побочных эффектов не наблюдалось, что позволяет предположить отсутствие у соединений значимой токсичности.

Во втором эксперименте ίη νίνο исследовалась способность соединений 5 ингибировать рост клеток рака простаты БАРС4 в мышах 8СШ, в качестве контроля использовали соединение 16 (Диаграмма 1), ранее идентифицированный сильный ингибитор СУР 17/антиадроген (ΟΐΌβοπνον с1 а1. и Ν];·ιγ с1 а1., 1. Меб. С’11сш.. 1998, 41, 902-912, выше) и кастрация. Лечение в этом эксперименте начиналось в день, когда мышей подкожно инокулировали гормон-зависимыми клетками БАРС4. Их в ходе лечения кастрировали или им вводили подкожно два раза в день соединения 5 или 16. Фиг. 8 показывает эффекты различных видов лечения на возникновение и размер опухолей в течение 21 недели терапии.

- 13 019560

Пальпируемая измеряемая опухоль развилась на 10-й неделе терапии у всех групп, кроме той, которую лечили веществом 16 (0.15 ммоль/кг дважды в день), у них пальпируемая измеряемая опухоль возникла на 11-й неделе. У контрольных мышей за 14 недель лечения общий объем опухолей увеличился в 8 раз, после чего мышей пришлось забить из-за слишком больших опухолей. Таким образом, объемы опухолей у всех остальных групп сравнивали с объемами опухоли у мышей контрольной группы на 14 неделе лечения. У кастрированных мышей объем опухоли увеличился только в 4,1 раза (приблизительно, на 50% меньше, по сравнению с контролем), что похоже на 3,7-кратное увеличение (на 53,8% меньше, по сравнению с контролем) у мышей, принимавших соединение 16. У мышей, принимавших соединение 5 (0,15 ммоль/кг дважды в день), объем опухоли увеличился только в полтора раза, что соответствует 93,8% уменьшению, по сравнению с контрольными мышами (Р = 0,00065). На 16-й неделе средний объем опухоли у мышей, принимавших соединение 5, оказался меньше (почти незаметная опухоль в латентном состоянии), чем на 10-й неделе, когда измеряемая опухоль только возникла. Более того, соединение 5 оказывало значимое ингибирующее действие на опухоли, по сравнению с 16 или кастрацией, Р = 0,005 и 0,05, соответственно. В общем случае, опухоли у контрольных, кастрированных мышей и мышей, принимавших соединение 16, росли быстро, а у мышей, принимавших соединение 5, росли медленно, причем их рост носил двухфазный характер (фиг. 8). Соединение 5 является наиболее эффективным агентом, и оно ингибирует рост опухолей значительно эффективнее кастрации. Интересно отметить, что, хотя соединение 16 в 6 раз сильнее ингибирует СУР 17, чем соединение 5, последнее соединение демонстрирует более высокую противораковую активность ίη νίνο. Причины этого в настоящее время неизвестны, однако они могут быть частично обусловлены лучшими фармакокинетическими и фармакодинамическими характеристиками соединения 5.

Чтобы определить, способна ли латентная опухоль простаты, образовавшаяся после лечения мышей соединением 5 (см. фиг. 8, неделя 16) расти при более низкой дозе соединения 5, эту дозу уменьшили до 0,15 ммоль/кг три раза в неделю (снижение дозы на 78,6%). Такое лечение проводили на неделях 16-19, объемы опухолей измеряли еженедельно. В этот период лечения при уменьшенной дозировке соединения опухоли восстановили свой рост (фиг. 8). По окончании указанного трехнедельного интервала стали снова давать обычную дозу препарата, и рост опухолей замедлился и вышел на плато. Приведенные данные позволяют сделать вывод о цитостатической природе лечения и приводят к необходимости непрерывно вводить лекарство для достижения противоракового эффекта.

В конце эксперимента определили содержание соединения 5 в опухоли и органах мышей. Методом НРЬС определяли содержание соединения 5 в опухоли, яичках и печени через 1 ч после введения заключительной дозы (вставка в фиг. 8). Интересно, что небольшое количество метаболита (приблизительно 15% по сравнению с содержанием соединения 5) обнаружено только в тканях печени. Этот метаболит характеризуется тем же временем удержания, что и метаболит, обнаруженный в плазме (см. выше). Наибольшая концентрация соединения 5 (39,0 ± 8,4 мкг/мг) определена в подкожных опухолях. Содержание в печени и яичках ниже, но регистрируется. Содержание соединения 5 в опухоли значительно выше, чем в плазме, что может быть результатом накопления соединения за период эксперимента. Таким образом, ингибирование роста опухоли соединением 5 может отчасти объясняться более высоким его содержанием в ксенотрансплантантах, где оно может оказывать прямой цитотоксический/цитостатический эффект на клетки рака простаты. Следует упомянуть, что существует свидетельство возможного прямого цитотоксического эффекта кетоконазола (умеренного ингибитора СУР 17) на клетки рака простаты. Кроме того, накопление соединения 5 в яичках должно активизировать ингибирование синтеза тестостерона у животных.

Хотя хорошо известно, что БАРС4 андроген-зависима, эти клетки могут стать андрогеннезависимыми. В таком случае они могут представлять удобную модель, имитирующую развитие рака простаты у пациентов (СНеп с! а1., выше, и К1те с! а1., Ртодгеззюп о£ тсЕ-Мабс Нитап рго81а1с сапсег ίο апбгодеп тберепбепсе ίη ппишпобсПс1сп1 8СЮ тюе. Ыа!. Меб, 1997, 3, 402-408). Как видно из фиг. 8, авторы изобретения смогли воспроизвести это явление. Кроме того, результаты показывают, что лечение соединением 16 или кастрация эффективно подавляет рост опухоли на некоторое время (андргензависимая фаза), но неэффективно затем (это может являться результатам начала андроген-независимой фазы), так как опухоль начинает расти так же быстро, как и у интактных контрольных животных. Рост опухоли у мышей, принимавших соединение 5, сильно подавлялся на протяжении всего периода лечения. Это позволяет предположить, что соединение 5 влияет также и на андроген-независимый рак простаты. Однако возможно, что лечение этим соединением заставляет опухоли БАРС4 оставаться андроген-зависимыми на протяжении более длительного периода и тем самым они дольше реагируют на терапию антиандрогенами.

Последние исследования показывают, что активизация АК и его участие в прогрессирующей и рецидивной РСА (МоЫет с! а1., и СНеп с! а1., выше) снова вызвало повышенный интерес к андрогеновым рецепторам как мишени для новых лекарств, позволяющих лечить РСА (Тшба11 с! а1., 8утрозшт оп апбгодеп асбоп ш рго51а1е сапсег, Сапсег Кез., 2004, 64, 7178-7180). Из-за своих противораковых свойств, соединение 5 может стать прекрасным кандидатом на эту роль.

- 14 019560

Заключение

Полученные данные усиливают разработанную авторами изобретения ранее концепцию о том, что модификация С17-заместителя А16 стероидов позволяет получить сильные ингибиторы СУР 17 и мощные антагонисты АК. Показано, что 17-бензимидазолы 5 и 6 координируют гемовое железо СУР 17, это свойство может частично обуславливать их ингибиторную активность. Соединения 5 и 6 демонстрируют почти эквипотенциальную активность ίη νίίτο как ингибиторов СУР 17, антагонистов АК и ингибиторов роста клеток рака простаты. Удивительно, что эти соединения чрезвычайно различаются по своей противораковой активности. Соединение 5 вызывает заметное подавление роста ксенотрансплантантов опухоли ЬАРС4, а соединение 6 (0,15 ммоль/кг дважды в день) усиливает рост опухоли. Полученные в настоящем исследовании результаты четко показывают, что соединение 5 является мощным ингибитором роста опухоли простаты человека, причем он заметно эффективнее кастрации. Это первый пример ингибитора СУР 17/антиандрогена, демонстрирующего ίη νίνο противораковую активность против опухоли рака простаты, превосходящую эффективность кастрации.

Полученные впечатляющие биологические данные делают соединение 5 кандидатом для дальнейшей разработки как потенциального лекарства против рака простаты у людей. Прекрасная противораковая активность соединения 5, содержащего бензимидазольную группу, делает бензимидазолы предпочтительной группой. Однако ожидается, что описанные выше аналоги соединения 5 проявляют схожую активность и, тем самым, также включены в изобретение.

Экспериментальная часть

Химия:

Общие процедуры и методы идентичны описанным ранее в статье Щаг с1 а1., 1 Меб. С1ет., 1998, 41, 902 - 912). Инфракрасные спектры получены на спектрометре Реткш Е1тег 1600 ЕТ1К с использованием растворов в СНС1₃. Масс-спектры высокого разрешения (НКМ8) получены на масс-спектрометре 3-Те81а Ρίηηί§;·ιη ЕТМ8-2000 ЕТ, режим Е81 (ОЬю 8(а1е Ишуегайу, Эерайтей οί С11е1Ш81гу). Для подтверждения чистоты ключевых целевых соединений приводятся масс-спектры высокого разрешения, а также данные НРЬС, подтверждающие гомогенность соединений. Масс-спектры низкого разрешения (ЬКМ8) получены на спектрометре Етпедап ЬСК-М8. Температуры плавления (тр) определяли с помощью прибора Е18сйег Ιοίιηδ и не скорректированы. Дегидроэпиандростерон и ацетат дегидроэпиандростерона были куплены у фирмы А1бпс1г Мйгаикее, ^1. 5-Трибутилстаннилпиримидин и 2-трибутилстаннилпиразин приобрели у фирмы Егопбег 8с1епбйс, 1пс., Εοβπη, ИТ.

β - Ацетокси-17-хлоро-16-формиландроста-5, 16-диен (2):

Это соединение получено из 3в-ацетоксиандрост-5-ен-17-она (1), как описано ранее, его спектральные и аналитические данные соответствуют описанным в статье Щаг е1 а1., 1. Меб. С1ет., 1998, 41, 902912.

β - Ацетокси-17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)-16-формиландроста-5,16-диен (3):

Смесь 3в-ацетокси-17-хлоро-16-формиландроста-5,16-диена (2, 2,5 г, 6,65 ммоль), бензимидазола (2.35 г, 19,9 ммоль), и К₂СО₃ (2.76 г, 23,9 ммоль) в сухом ЭМЕ (20 мл) перемешивали при 80°С в инертной атмосфере аргона в течение 1,5 ч. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь вылили в ледяную воду (250 мл), полученный осадок отфильтровали, промыли водой и высушили, получив сырой продукт в виде твердого вещества грязно-белого цвета (приблизительно 2,9 г). Очистка методом ЕСС [петролейный эфир/ЕЮАс/Е13Ы (6:4:0.3)] позволила получить 2,7 г (88,7%) чистого вещества 3: тр 227-230°С; 1К (СНС1₃) 3691, 3024, 2951, 2359, 1725, 1670, 1604, 1491, 1452, 1375, 1253, 1032, 897, 852, 818, 700, 657, 618, 576, 565, 550, 529, 511, 476 ст^-1;

Ή ИМК (300 МН/, СИСЕ) δ 1.07 (8, 6Н, 18- и 19-СН3), 2.04 (8, 3Н, 3в-ОСН₃), 4.60 (т, 1Н, 3а-Н),

5.43 (Ьг 8, 1Н, 6-Н), 7.35 (Ьг. 8, 2Н, ароматические-Нк), 7.85 (8, 1Н, ароматический-Н), 7.98 (8, 1Н, ароматический-Н), 7.98 (8, 1Н, 21-Н) и 9.59 (8, 1Н, 16-СНО). НКМ8 расчетный 481.2462 (С₂₉Н₃₄О₃Ы₂.Ма⁺), экспериментальный 481.2454.

3в-Ацетокси-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)андроста-5,16-диен (4):

Раствор 3в-ацетокси-17-(1Н-бензимидазол-1-ил)-16-формиландроста-5,16-диена (соединение 3, 2,04 г, 4,45 ммоль) в сухом бензонитриле (10 мл) кипятили в присутствии 10% палладия на активированном угле (1.02 г, т.е, 50 вес.% соединения 3) в течение 5 ч. После охлаждения до комнатной температуры катализатор удалили фильтрацией через слой целита. Фильтрат упарили, остаток очистили с помощью ЕСС [петролейный эфир/ЕЮАс/Е1₃Ы (7.5:3:0.5)], получив 1.41 г (73,8%) чистого вещества 4: тр 159-160°С; 1К (СНС13) 3687, 2947, 2854, 2358, 2340, 1725, 1633, 1609, 1557, 1489, 1454, 1373, 1291, 1253, 1195, 1136, 1031,985,910, 839,735,665, 590,544, 533,513, 502, 488 ст^-1;

Ή ИМК (300 МН/, СИСЕ) δ 1.02 (8, 3Н, 18-СН₃), 1.07 (8, 3Н, 19-СН₃), 2.04 (8, 3Н, 3в-ОСН₃), 4.62 (т, 1Н, 3а-Н), 5.43 (Ьг 8, 1Н, 6-Н), 5.98 (8, 1Н, 16-Н), 7.30 (т, 2Н, ароматические-Н8), 7.49 (8, 1Н, ароматический-Н), 7.81 (8, 1Н, ароматический-Н), и 7.95 (8, 1Н, 21-Н). НКМ8 расчетный 453.2512 (С₂₈Н₃₄О₂М₂.Ма⁺), экспериментальный 453.2511.

β -Г идрокси-17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)андроста-5,16-диен (5):

Ацетат 4 (1,3 д 3,02 ммоль) растворили в метаноле (20 мл) в атмосфере аргона. К полученному рас

- 15 019560 твору добавили 10% раствор КОН в метаноле (8 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1.5 ч и сконцентрировали при пониженном давлении при температуре примерно 40°С до объема 10 мл. Этот раствор вылили в ледяную воду (300 мл), полученный белый осадок отфильтровали, промыли водой и высушили. Кристаллизация из Е1ОЛс/МеОН позволила получить соединение 5 (1.10 г, 94%), тр 189-190°С; ΙΕ (СНС1₃) 2934, 2339, 1609, 1490, 1453, 1291, 1040, 837, 808, 705, 663, 608, 578, 550, 517 ст^-1;

Ή ΝΜΕ (300 ΜΗζ, СБС1₃) δ 1.02 (§, 3Н, 18-СН₃), 1.07 (8,3Н, 19-СН₃), 3.55(т, 1Н, 3а-Н), 5.41 (Ьг 8, 1Н, 6-Н), 5.99 (8, 1Н, 16-Н), 7.30 (т, 2Н, ароматические-Н8), 7.54 (8, 1Н, ароматический -Н), 7.80 (8, 1Н, ароматический -Н), и 7.96 (8, 1Н, 21-Н). НВМ8 расчетный 411.2407 (С₂₆Н₃₂О^.№⁺), экспериментальный 411.2396.

17-(1Н-бензимидазол-1 -ил)андроста-4,16-диен-3 -он (6):

Из смеси соединения 5 (660 мг, 1.70 ммоль), 1-метил-4-пиперидона (2,5 мл), и толуола (40 мл) отогнали приблизительно 10 мл. Затем добавили изопропоксид алюминия (521 мг, 2,55 ммоль) и кипятили смесь в атмосфере аргона в течение 4 ч. После охлаждения смесь перегнали с Е1ОЛс (50 мл), последовательно промыли 5% водным раствором NаΗСО₃ (х3) и соляным раствором (х2), а затем высушили (№₂8О₄). Растворитель упарили, и сырой продукт очистили с помощью ЕСС [СН₂С1₂/Е1ОН (25:1)] получив заявленное соединение 6 (544 мг, 82%): тр 201-204°С; ΙΕ (СНС1₃) 2946, 2858, 1622, 1611, 1490, 1453, 1376, 1291, 1270, 1228, 1189, 893, 850, 837, 722, 662, 615, 568, 553,537, 519 ст^-1;

ΉΝΜΚ. (300 НН/, СБС1₃) δ 1.04 (8, 3Н, 18-СН₃), 1.24 (8, 3Н, 19-СН₃), 5.78 (8, 1Н, 4-Н), 5.99 (8, 1Н, 16-Н), 7.31 (т, 2Н, ароматические-Н8), 7.48 (т, 1Н, ароматический -Н), 7.81 (8, 1Н, ароматический-Н), и 7.95 (8, 1Н, 21-Н). НКМ8 расчетный 409.2250 (С₂₆Н₃₀ОЖ№1'). экспериментальный 409.2250.

Реакция 3в-ацетокси-17-хлоро-16-формиландроста-5,16-диена (2) с бензо-1Н-1,2,3-триазолом и К₂ СО₃: 3в-Ацетокси-17-(бензо-2Н-1,2,3-триазол-2-ил)-16-формиландроста-5,16-диен (7а) и 3β-ацетокси-17(бензо-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)-16-формиландроста-5,16-диен (7Ь):

Смесь соединения 2 (2,5 г, 6,65 ммоль), бензотриазола (2,35 г, 19,9 ммоль), и К₂СО₃ (2,76 г, 23,9 ммоль) в сухом ΌΜΕ (20 мл) перемешивали при температуре приблизительно 80°С в атмосфере аргона в течение 45 мин. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь вылили в ледяную воду (250 мл), полученный осадок отфильтровали, промыли водой и высушили, получив сырой продукт в виде грязно-белого твердого вещества. Очистка с помощью ЕСС [петролейный эфир/Е1ОАс, (4:1)] в начале в качестве дополнительного продукта позволила получить 3в-ацетокси-17-(бензо-2Н-1,2,3триазол-2-ил)-16-формиландроста-5,16-диен (7а, 0,3 г, 9,8%); тр 248-250°С; ΙΕ (СНС1₃) 3023, 2945, 2358, 1725, 1657, 1600, 1375, 1257, 1032, 728, 656, 584, 564, 540, 526, 506, 498 ст^-1; Ή ΝΜΕ (300 МШ, СБС1₃) δ 1.11 (8, 3Н, 18-СН₃), 1.37 (8, 3Н, 19-СН₃), 2.04 (8, 3Н, 3 β-ОСНз), 4.62 (т, 1Н, 3а-Н), 5.43 (Ьг 8, 1Н, 6-Н),

7.43 (б, 1Н, 1= 2.4 Πζ, ароматические-Н8), 7.45 (б, 1Н, 1= 2.7 Πζ, ароматический-Н), 7.88 (б, 1Н, 1= 2.7 Πζ, ароматический-Н), 7.90 (б, 1Н, 1= 2.4 Ш, ароматический-Н) и 10.66 (8, 1Н, 16-СНО). НРМ8 расчетный 482.2414(С₂₈Н₃₃О₃^.№⁺), экспериментальный 482.2413. Дальнейшее элюирование тем же растворителем позволила получить в качестве основного продукта 3в-ацетокси-17-(бензо-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)16-формиландроста-5,16-диен (7Ь, 2.3 г, 75.4%); тр: 186-188°С; ΙΕ (СНС1₃) 3023, 2948, 1725, 1670, 1604, 1488, 1450, 1374, 1253, 1196, 1032, 846, 824, 720, 658, 619, 548, 527, 504, 497 ст^-1;

Ή ΝΜΕ (300 МШ, СБС1₃) δ 1.07 (8, 6Н, 18- и 19-СН₃), 2.04 (8, 3Н, 3в-ОСН₃), 4.60 (т, 1Н, 3а-Н),

5.43 (Ьг 8, 1Н, 6-Н), 7.46 (т, 2Н, ароматические-Н8), 7.57 (б, 1Н, 1 = 6.9 Κζ, ароматический-Н), 8.15 (б, 1Н, 1 = 8.4 Ш), ароматический-Н), и 9,59 (8, 1Н, 16-СНО). ΗЕΜ8 расчетный 482.2414 (С₂₈Н₃₃О^₃.№⁺), экспериментальный 482.2416.

3в-Ацетокси-17-(бензо-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)андроста-5,16-диен (8)

Смесь бис(трифенилфосфин)родий(1) карбонил хлорида (303 мг, 0,438 ммоль) и 1,3-бис(дифенилфосфино)пропана (394 мг, 0,954 ммоль) в сухом ксилене (40 мл) перемешивали при 80°С в атмосфере аргона в течение 15 мин, при этом образовался мелкодисперсный желтый осадок. Затем добавили соединение 7Ь (1,71 г, 3,72 ммоль) и смесь кипятили в атмосфере аргона в течение 18 ч, после чего сконцентрировали при пониженном давлении. Сырой продукт очистили с помощью ЕСС [петролейный эфир/ЕЮЛс/ЕьМ (8.9:1 :0.1)], получив 1.2 г (74.7 %) чистого вещества 8; тр 184-186°С. ΙΕ (СНС1₃) 3063, 2918, 2389, 2358, 1725, 1458, 1373, 1254, 1069, 1031, 843, 809, 786, 692, 646, 560, 535, 528, 512, 494 ст^-1; Ή ΝΜΕ (300 \^;(В, СБС1₃) δ 1.10 (8, 3Н, 18-СН₃), 1.25 (8, 3Н, 19-СН₃), 2.04 (8, 3Н, 3в-ОСН₃), 4.64 (т, 1Н, 3а-Н), 5.43 (Ьг 8, 1Н, 6-Н), 6.01 (8, 1Н, 16-Н), 7.40 (1, 1Н, 1 = 7.8 Н, ароматический-Н), 7.51 (1, 1Н, 1= 7.8 Ш, ароматический-Н), 7.67 (б, 1Н, 1= 8.1 Ш, ароматический-Н), и 8.10 (б, 1Н, 1 = 8.1 Ш, ароматическийН). НЕ^ПЗ расчетный 454.2465 (С₂₇Н₃₃О^₃.№⁺), экспериментальный 454.2469.

β -Г идрокси-17-(бензо -1Н-1,2,3 -триазол-1 -ил)андроста-5, 16-диен (9):

Указанное соединение получили по методике, описанной для соединения 5, используя в качестве исходного соединения 3в-ацетокси-17-(бензо-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)андроста-5,16-диен (8; 700 мг, 1.62 ммоль). Перекристаллизация из ЕЮАс^еОН позволила получить заявленное соединение 9 (600 мг, 95%); тр 241-244°С; ΙΕ (СНС1₃) 3603, 2937, 2859, 1609, 1488, 1451, 1373, 1287, 1243, 1069, 1040, 1007, 953, 845, 805, 715, 665, 618, 570, 553, 517 ст^-1; Ή ΝΜΕ (300 Μ^ СБС1₃) δ 1.09 (8, 3Н, 18-СН₃), 1.24 (8,

- 16 019560

3Н, 19-СН₃), 3.55 (т, 1Н, 3а-Н), 5.41 (Ьг к, 1Н, 6-Н), 6.06 (к, 1Н, 16-Н), 7.40 (ΐ, 1Н, 1 = 7.8 Ηζ, ароматический-Н), 7.52 (1, 1Н, 1 = 7.8 Ш, ароматический-Н), 7.67 (б, 1Н, 1= 8.1 Ш, ароматический-Н), и 8.10 (б, 1Н, = 8.1 Ш, ароматический-Н). НВМ8 расчетный 412.2359 (С₂₅Н₃1ОЫ₃.Ма⁺), экспериментальный 412.2365.

17-(Бензо-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)андроста-4,16-диен-3-он (10):

Указанное соединение получали по методике, описанной для соединения 6, используя в качестве исходного соединения в-гидрокси-17-(бензо-1НТ-1,2,3-триазол-1-ил)андроста-5,16-диен (9; 500 мг, 1.28 ммоль). Очистка сырого продукта методом ЕСС [СН₂С1₂/Е1ОН, (50:1)] позволила получить заявленное соединение 10 (420 мг, 84.4%); тр: 280-283°С; ΙΚ. (СНС1₃) 2944,1658, 1450, 1070, 8444, 825, 721, 624, 589, 564, 554, 541, 521 ст^-1;

’Н ΝΜΚ. (300 МВ, СЭС1₃) δ 1.26 (к, 3Н, 18-СН₃), 1.27 (к, 3Н, 19-СН₃), 5.77 (к, 1Н, 4-Н), 6.01 (к, 1Н, 16-Н), 7.40 (1, 1Н, 1 = 7.8 Ш, ароматический-Н), 7.52 (1, 1Н, 1 = 7.8 Ш, ароматический-Н), 7.67 (б, 1Н, 1 = 7.8 Ш, ароматический-Н) и 8.10 (б, 1Н, 1 = 8.1 Ш, ароматический-Н). НВМ8 расчетный 410.2203 (С₂₅Н₂₉О^.№⁺), экспериментальный 410.2185.

Дегидроэпиандростерон-17 гидрозон (12):

Дегидроэпиандростерон (11, 3.5 г, 12.2ммоль) растворили в этаноле (60 мл) и полученный раствор обработали гидразин гидратом (2.37 мл, 0.049 моль), а затем раствором гидразин сульфата (7,9 мг, 0,061 ммоль) в 0,25 мл воды. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч и затем вылили в ледяную воду. Полученный осадок отфильтровали, промыли водой и высушили, получив белые кристаллы заявленного соединения 12; тр: 242-244°С (лит. 204-206°С);²² ’Н ΝΜΚ. (300 МВ, СЭС1₃): δ 0.76 (к, 3Н, 18-СН₃), 1.05 (к, 3Н, 19-СН₃), 3.74 (Ьг к, 1Н, 3-Н) и 5.35 (к, 1Н, 6-Н).

-Йодоандроста-5, 16-диен-3 β-ол (13):

Раствор йода (12,16 г, 0,0203 моль) в сухом ТНЕ(144 мл) и сухом Е1₂О (72 мл) при перемешивании охладили на ледяной бане до 0°С и затем обработали 1,1,3,3-тетраметилгуанидином (6,72 мл, 6,24 г, 0,054 моль). Затем по каплям добавили раствор соединения 12 (3,0 г, 9,9 ммоль) в ТНЕ (81 мл), в течение ч поддерживая температуру реакционной смеси около 0°С. Реакционную смесь затем сконцентрировали в вакууме, охладили в ледяной бане и высушили в вакууме при комнатной температуре, получив твердое вещество желтого цвета (13, 3,65 г, 92,4%). тр: 169-171°С. (лит. 175-176°С);²² ΙΚ. (СНС13) 2935, 1371, 1039, 862, 843, 799, 715, 665, 582, и 566 ст^-’; ’Н ΝΜΚ. (300 МШ, СЭС13): δ 0,76 (к, 3Н, 18-СН₃), 1,05 (к, 3Н, 19-СН₃), 3.50 (Ьг к, 1Н, 3а-Н), 5,35 (к, 1Н, 6-Н) и 6,14 (к, 1Н, 16-Н).

β -Г идрокси-17-(2-пиразил)андроста-5,16-диен (14):

Смесь 17-иодоандроста-5,16-диен-3в-ола (13; 0,5 г, 1,257 ммоль) в растворе сухого диметилформамида (ОМЕ, 10 мл) с тетракис(трифенилфосфатом) палладия (Рб(РРй₃)₄) (71,6 мг, 0,062 ммоль) и (2трибутилстаннил) пиразином (774,6 мг, 2,099 ммоль) нагревали при 120°С в течение 20 ч. После охлаждения смесь перегнали с холодной водой (50 мл) и проэкстрагировали Е1ОАс (30 мл х 3). Объединенные экстракты промыли соляным раствором и водой, высушили над №ь8О₄ и затем сконцентрировали, получив коричневатое твердое вещество. Этот сырой продукт очистили с помощью флэш-хроматографии [ЕСС, петролейный эфир/ЕЮАс/ЕьХ (3:2:0,15)] получив соединение 14 (66 мг, 15%); тр: 199-201°С.

’Н ММК. (300 МВ, СЭС1₃): δ 0.94 (к, 3Н, 18-СН₃), 1.08 (к, 3Н, 19-СН₃), 3,52 (Ьг к, 1Н, 3а-Н), 5,40 (к, 1Н, 6-Н), 6,77 (к, 1Н, 16-Н), 8,35 (к, 1Н, пиразин-Н), 8,48 (к, 1Н, пиразин-Н), 8,70 (к, 1Н, пиразин-Н). НВМ8 расчетный 350.2358 (С₂₃Н₃₀О^), экспериментальный 350.2354.

β -Г идрокси-17-(5 -пиримидил)андроста-5,16-диен (15):

Вещество получали, используя в качестве исходного соединение 13 (0,645 г, 1,623 ммоль), согласно процедуре, описанной для соединения 14, но используя (5-трибутилстаннил)пиримидин (1,0 г, 2,710 ммоль), растворенный в 10 мл сухого ЭМЕ, содержащего (Рб(РРй₃)₄) (92,88 мг, 0,0804 ммоль) и (5трибутилстаннил)пиримидин (1,0 г, 2,710 ммоль). Очистка с помощью ЕСС [петролейный эфир/ЕЮАс/Е1₃Х (3:2:0,15)] позволила получить 3в-гидрокси-17-(5-пиримидил)андроста-5,16-диен 15 (44 мг, 10%); тр: 231-233°С (лит. 240-242°С);’⁹ ’Н ММК. (300 МШ, СЭС1₃): δ 1,05 (к, 3Н, 18-СН₃), 1,08 (к, 3Н, 19-СН₃), 3,83 (Ьг к, 1Н, 3а-Н), 5,39 (к, 1Н, 6-Н), 7,26 (к, 1Н, 16-Н), 8,73 (к, 2Н, 4’-Н и 6’-Н) и 9,07 (к, 1Н, 2’-Н). НВМ8 расчетный 350,2358 (С₂₃Н₃₀О^), экспериментальный 350,2348.

Анализ ингибиторной активности СУР'17 ΐη νΐΐΓθ

Активность соединений как ингибиторов СУР 17 ίη νίίτο определялась с помощью разработанного авторами изобретения быстрого опыта по высвобождению уксусной кислоты (ААРА.), в качестве источника фермента использовались интактные Е. со1к экспрессирующие Р450с17 (Опдогуеу, выше). В качестве субстрата использовали [21-³Н]-17а-гидроксипрегненолон, и активность по отношению к СУР 17 определялась по количеству тритиированной уксусной кислоты, формирующейся при расщеплении боковой цепи субстрата в положении С-21. Утверждается, что данный метод по точности и надежности сопоставим с процедурой анализа НРЬС, используемой другими исследователями в этой области (Опдо^βν, выше). Значения 1С₅₀ были получены непосредственно из графиков процента ингибирования как функции от концентрации ингибитора в соответствующем интервале. Каждое соединение тестировалось, как минимум, в пяти различных концентрациях. Опыты выполнялись в трех повторах, приводимые здесь

- 17 019560 значения 1С₅₀ представляют собой среднее по результатам трех экспериментов. Стандартные отклонения составляли ±5% от средних значений.

Анализ активности по отношению к 5а-редуктазе типа 1 и 2

Ингибиторная активность соединений и финастерида (как контроль) определялась с использованием клеточной линии Όυ 145 (для человеческого фермента 1 типа) и гомогената простаты человека (ткань ВРН для фермента 2 типа) по способу, описанному в работе Найшапп и коллег (Рюагб с! а1., Еуп111с818 апб суа1и;Шоп ой 2'-8иЬ8Й!и!сб 4-(4'-сагЬоху-ог 4'-саЛохутс111у1Ьсп/уНбспс)А-асу1р|рспб1пс5: Н1дЫу ро1сп1 апб ίη νίνο асбус Лсгснб 5а-гсбис1а8с !урс 2 шЫЬйогз, ί Мсб. Сйст., 2002, 45, 3406-3417). Значения процента ингибирования определялись для концентрации 10 мкМ, а в случае более активных соединений, определялись 1С₅₀.

Анализ конкурентного связывания с андрогеновыми рецепторами и люциферазный опыт Анализ конкурентного связывания с АК

Ячейки 24-луночных планшет 5 мин обрабатывали раствором поли-1-лизина (0.05 мг/мл), затем высушили, промыли стерилизованной дистиллированной водой и сушили 2 ч. Чтобы определить кинетику связывания К1881 с ЬЫСаР ЛК и ЛК дикого типа, клетки ЬЫСаР и РС3АК перенесли в 24-луночные планшеты (2-3 х 10⁵) в среде, не содержащей стероиды, и позволили им прикрепиться. На следующий день среду заменили на не содержащий сыворотку и стероиды раствор КРМ1 с 0.1% ВЕА, содержащий [³Н]К1881 (0.01-10 пМ) в присутствии или отсутствии 200-кратного избытка холодного ОНТ для определения неспецифического связывания, а также 1 мкМ триамцинолон ацетонида для насыщения рецепторов прогестерона и глюкокортикоидов. Ячейки 2 ч ингибировали при 37°С, а затем дважды промыли ледяным ЭРВЕ и солюбилизировали в ЭРВЕ с 0,5% ЕЭЕ и 20% глицерина. Экстракты удалили и ассоциированную с ячейками радиоактивность измерили в сцинтилляционном счетчике. Данные проанализировали, включая определение Кб и Втах, методом нелинейной регрессии с помощью программного обеспечения Сгарйраб Рйзт. Когда удалось определить концентрацию, требующуюся, чтобы почти полностью насытить АК в клетках обеих линий, описанным выше методом определили способность тестируемых соединений (0.1 нМ - 10 мкМ) вытеснять из рецепторов [³Н]К1881 (5.0 нМ). Значения 1С50 каждого соединения определялось методом нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения Сгарйраб Рйзт (СгарйРаб Еойтагс, 1пс, Еап Эшдо, СА).

Анализ трансактивации люциферазы

Анализ транскрипционной активации выполнили, как описано в работе К1т с! а1., выше, с незначительными изменениями. Пробазин люциферазный репортерный конструкт АКК2-Ьис генерировали включением минимального пробазинового промотера АКК2, любезно предоставленного доктором К. Ма!и81к из Университетского медицинского центра в Вандербилте (Епбосгшо1о§у, 2000, 141: 4698-4710), в поликлональную линкерную область вектора РСБ3-спйапссг (Рготсда). В качестве внутреннего контроля использовали рКЕ-пиП (Рготсда). Кратко, клетки ЬЫСаР, выращенные в 24-луночных планшетах, которые были предварительно покрыты поли-Ь-лизином, трансфецировали АКК2-Еис в среде КРМ1 1640 без фенолового красного, содержащей 5% ЕВЕ (сйагсоаЕзйтррсб ЕВЕ) (Нус1опс). Через 24 ч после трансфекции клетки в течение 18 ч инкубировали со свежей средой КРМ1 1640 без сыворотки и без фенолового красного, содержащей или не содержащей ЭНТ и ингибиторы. Люциферазную активность измеряли в трех повторах с использованием двойной системы люциферазного анализа в соответствии с инструкциями производителя (Рготсда). Результаты представлены в виде индукции складки, то есть, относительной люциферазной активности обработанных клеток, деленной на активность контроля.

Анализ роста и жизнеспособности культуры клеток

Клетки ЬЫСаР вырастили в среде КРМ1 1640 с 10% ЕВЕ и 1% раствора пенициллина/стрептомицина. Чтобы определить эффект новых соединений на пролиферацию клеток, последние перенесли в свободную от стероидов среду за три дня до начала экспериментов. Свободная от стероидов среда представляла собой КРМ1 без фенолового красного, содержащая 5% сыворотки, обработанной декстраном и древесным углем и 1% раствор пенициллина/стрептомицина. Для определения роста клеток последние поместили (3х10⁴) в 24-луночные планшеты (Согпшд, 1пс. Согшпд, ΝΥ). Через 24 ч, отведенные на прикрепление клеток, среду удалили и заменили на другую среду без стероидов, содержащую негативный контроль или указанную концентрацию ЭНТ (1 нМ) и соединения (0,1-10 мкМ). Контрольные ячейки обрабатывали этанолом. Эту среду заменяли каждые три дня, количество живых клеток определяли и сравнивали методом анализа №ЕТ-1 [4-[3-(4-иодофенил)-2-(4-нитрофенил)-2Н-5-тетразолио]1,3-бензолдисульфонат] на седьмой день. После инкубации клеток в течение указанного времени 10% раствор №ЕТ-1 добавили в каждую лунку и три часа инкубировали при температуре 37°С. После инкубации планшеты слегка встряхнули и сразу же определили поглощение при длине волны 450 нм с помощью сканирующего планшетного спектрофотометра. Все представленные результаты представляют собой средние значения как минимум для трех лунок. Дополнительный контроль представлял собой одну среду без клеток.

- 18 019560

Фармакокинетические исследования

Все эксперименты на животных выполняли в соответствии с требованиями и с одобрения комитета заботы о животных (Ашша1 Саге СоттШее) Университа школы медицины в Мэриленде, Балтимор. Самцы мышей 8СШ весом 20-22 г (8-10 недельные) были получены из Национального института рака, Фридрих, ΜΌ, США, их держали в контролируемой среде при температуре, приблизительно, 25°С, 50% относительной влажности, цикле 12 ч света/12 ч темноты и при свободном доступе к пище и воде.

Соединения 5 и 6 смешивали с 40% β-циклодекстрином в воде и мыши делали одну подкожную инъекцию. Животных затем убивали в разное время вплоть до 6 ч после введения препарата, кровь получали из сердца под легкой галотановым анестезией (Луегй. Нью Йорк, ΝΥ, США).

Анализ НРЬС

Хроматографическое разделение и количественный анализ стероидов и соответствующих внутренних стандартов определяли методом НРЬС в обращенной фазе на колонке \Уа1ег5(г) Nονаρак® С18 со1ишп (3.9 х 150 мм), защищенной защитным картриджем \Уа1ег5® и набитой пленочным С18 (реШс1е С18), как описано ранее. Кратко, использовавшаяся в этом эксперименте система НРЬС состояла из системы доставки растворителя \Уа1ег5®®, контроллера \Уа1ег5®® (Милфорд, МА), подключенного к автосэмплеру \Уа1ег5®® 717р1и8, и детектора из массива фотодиодов \Уа1ег5®® 996, работающего при длине волны 242.7 нм. Состав мобильной фазы был следующим: вода/ΜеΟΗ/СΗзСN (35:35:30, ν/ν/ν + 200 мкл Εΐ₃Ν и 0.77 г NΗ₄ΟЛс на 1000 мл мобильной фазы), скорость потока 1 мл/мин. Анализ НРЬС проводили при температуре окружающей среды, обработку и получение данных осуществляли с помощью обработчика \Уа1ег5®® шШепшиш сНготаЮдгарНу тападег.

Пробоподготовка

Тестовые пробирки, содержащие мышиную плазму (200 мкл), вещества 5 или 6 и νΝ/85-1 (внутренний стандарт, 10 мкл раствора концентрации 100 мкг/мл), проэкстрагировали диэтиловым эфиром (2х2 мл) каждый раз в течение 3 мин на миксере уоПех и центрифугировали 5 мин при 3000 д. Органические слои упарили досуха в слабом потоке воздуха. Остаток реконституировали в аликвоту мобильной фазы (100 мкл) и профильтровали с использованием 0,2 мкм тефлоновых фильтров, после чего провели анализ НРЬС.

Кривые калибровки и валидация анализа НРЬС

Кривые калибровки соединения 5 в плазме и ткани и соединения 6 в плазме получены путем добавления различных количество соединения в экстракционные пробирки (в двух повторах), содержащие плазму (200 мкл) и тканевые препараты (200 мкл) от нелеченных животных, финальная концентрация составляла 0.1-100.0 мкг/мл. Были приготовлены также соответствующие бланки (пустые экстракционные пробирки), и в каждую пробирку добавили аликвоту внутреннего стандарта, финальная концентрация 5 мкг/мл. Калибровочные образцы прошли такую же процедуру пробоподготовки, которая была описана выше. Аликвоту реконституированного субстрата (50 мкл) ввели в систему НРЬС и построили график отношений площадей пиков для каждого аналита к соответствующим площадям для внутреннего стандарта как функции от концентраций соединений 5 или 6. Точность и воспроизводимость анализов определена в диапазоне известных концентраций ингибиторов в чистой плазме и использовалась на протяжении всей процедуры НРЬС. Это измерение повторили в трех отдельных экспериментах.

Анализ данных

Фармакокинетические расчеты выполняли, как описано ранее. Расчеты для бесчастевой (некомпартментальной) модели выполняли с использованием программы \νίηΝϋη1ίη (8с1епйЕс СопзиШпд 1пс.). Для сравнения различных групп с 95% доверительным интервалом выполнили односторонний дисперсионный анализ (ЛNΟVЛ) на программном обеспечении 81дша81а1 £ог ν^άο^δ хеШоп 1,0. Значимость определяли с помощью апостериального теста Бонферрони. Статистически значимыми считались значения Р<0,05.

Противораковые эксперименты ΐη νίνο (ксенотрансплантанты рака простаты ЬАРС-4)

Все эксперименты на животных выполнялись в соответствии с руководством и с одобрения Комитета заботы о животных Университета школы медицины в Мэриленде, Балтимор. Самцы мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (хетеге сошЬшеб пппшпобеПаеЩ (8СШ)) в возрасте 4-6 недель были приобретены в центре раковых исследований и разработок Национального института рака во Фридрихе (ΜΌ) и содержались в свободной от патогенов среде в контролируемых условиях по свету и влажности; им обеспечивали свободный доступ к пище и воде. Опухоли из клеток ЬАРС4 инокулировали мышам подкожно, в основном, так, как было описано ранее (21). Клетки ЬАРС4 вырастили в среде ΙΜΕΜ с 15% ЕВ8 + 1% В8 и 10 нМ ЭНТ до конфлюенции 80%. Затем клетки счистили в среду ЭРВ8, собрали там центрифугированием и ресуспендировали в среде Μаΐ^^де1 (10 мг/мл) в концентрации 3 х 10⁷ клеток/мл. Мышам подкожно вводили по 100 мкл суспензии клеток с каждого бока. Опухоли еженедельно измеряли штангенциркулем, объем опухолей вычисляли по формуле 4/3π х η² х г₂ (η <г₂).

В первом эксперименте опухоли ЬАРС4 росли 8-10 недель после инокуляции. Группы по 5 мышей со сравнимыми общими объемами опухолей либо кастрировали, либо лечили соединениями 5 и 6 (0,15 ммоль/кг раз в день и 0,15 ммоль/кг дважды в день, 9 ч утра и 5 ч вечера). Кастрировали мышей под ме

- 19 019560 токсифторановой анестезией. Соединения 5 и 6 растворили в концентрации 17,2 мг/мл в физиологическом растворе, содержащем 0,3% гидроксипропилцеллюлозы, этот раствор ежедневно вводили мышам подкожно. Контрольные и кастрированные мыши получали только пустую среду. Опухоли измеряли еженедельно в течение 4 недель лечения, вычисляли объемы опухолей. В конце периода лечения животных забили под галотановой анестезией, опухоли вырезали, взвесили и заморозили при температуре -80°С. Животных также еженедельно взвешивали и в ходе эксперимента отслеживали их общее состояние здоровья и признаки возможной токсичности, вызванной лечением.

Во втором эксперименте животных инокулировани клетками ЬЛРС4 и разделили на четыре группы по пять мышей в каждой. Контрольная группа и группа кастрированных мышей получала только среду, остальные две группы получали либо νΝ/85-1 (0,15 ммоль/кг дважды в день, 9 ч утра и 5 ч вечера) либо 5 (0.15 ммоль/кг дважды в день, 9 ч утра и 5 ч вечера). Лечение начинали в день после инокуляции ЬЛРС4 и продолжали 14 недель для контрольной группы, 19 недель для групп νΝ/85-1 и кастрированной и 21 неделю для группы, принимавшей соединение 5. Опухоли измеряли и обрабатывали, как описано выше.

Измерение содержания соединения 5 (νΝ/124-Ι) в опухоли, печени и яичках

Животных из группы, принимавшей νΝ/124-1, забили через час после последнего введения препарата, выделили у них опухоли, печень и яички и заморозили их в жидком азоте. Образцы тканей гомогенизировали в фосфатном буфере (рН = 7,4, 0,5 мл/мг ткани). Гомогенизированную ткань (200 мкл) смешали с внутренним стандартом, νΝ/85-1 (10 мкл 100 мкг/мл маточного раствора) и проэкстрагировали ЕьО (2x2 мл), перемешивая на мешалке уойех по 3 мин и затем центрифугируя по 5 мин при 3000 д Экстракты ЕьО выделили и упарили досуха в слабом потоке воздуха. Остаток реконституировали в 100 мкл мобильной фазы НРЬС, профильтровали через 0,2 мкм тефлоновые фильтры и проанализировали методом НРЬС, как описано выше.

Предыдущие примеры можно повторить с тем же успехом, заменив общие или специфические реагенты и/или операционные условия настоящего изобретения на те, которые были использованы в предыдущих примерах.

Исходя из приведенного выше описания, опытный специалист может легко определить существенные характеристики настоящего изобретения и, не отступая от его духа и области, может внести в него различные изменения и модификации, чтобы адаптировать его к разнообразным условиям и возможностям применения.

Claims (6)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения заболевания простаты, включающий введение нуждающемуся в лечении субъек- или его фармацевтически приемлемой соли.
2. 2. Способ по п.1, в котором указанным заболеванием простаты является рак простаты или гиперплазия простаты.
3. 3. Способ лечения заболевания простаты, включающий введение нуждающемуся в лечении субъекту композиции, содержащей эффективное количество соединения со структурной формулой или его фармацевтически приемлемой соли и физиологически приемлемый наполнитель.
4. 4. Способ по п.3, в котором указанным заболеванием простаты является рак простаты или гиперплазия простаты.
5. 5. Способ по п.3, в котором композицию вводят перорально.
6. 6. Способ по п.3, в котором композицию вводят пероральным введением или введением, отличным от перорального, выбранным из группы, включающей парэнтеральное, энтеральное, внутрибрюшинное, наружное, чрескожное, конъюнктивное, назальное, местное, аэрозольное, ингаляционное, внутривенное, внутримышечное, защечное, подъязычное, ректальное, внутриартериальное и интратекальное введение.