PT1809321E

PT1809321E - Imunoterapia adotiva com sobrevivência aumentada de linfócitos

Info

Publication number: PT1809321E
Application number: PT05858553T
Authority: PT
Inventors: Steven A Rosenberg; Richard A Morgan; Cary Hsu
Original assignee: Us Gov Health & Human Serv
Priority date: 2004-10-08
Filing date: 2005-10-07
Publication date: 2012-05-17
Also published as: ATE549398T1; AU2005336093A1; WO2007037780A2; AU2005336093A8; AU2005336093B2; US7998736B2; ES2382775T3; CA2590401A1; EP1809321A2; WO2007037780A3; DK1809321T3; US20080050341A1; EP1809321B1; CA2590401C

Description

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DESCRIÇÃO

" IMUNOTERAPIA ADOTIVA COM SOBREVIVÊNCIA AUMENTADA DE LINFÓCITOS T"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito à modificação de linfócitos T para terapia, investigação e outras utilizações. As modificações de células T aumentam a sobrevivência de linfócitos T. A transferência adotiva de linfócitos T (imunoterapia adotiva) consiste na transferência de linfócitos T para um sujeito para a terapia de doença. Tem grande potencial para a terapia de uma grande variedade de doenças, incluindo cancro e doenças infeciosas. A imunoterapia adotiva tira partido da resposta imunológica, na qual o linfócito T desempenha um papel central.

Pensa-se muitas vezes que a resposta imunológica tem fases distintas. Estas fases foram referidas como fases de iniciação, expansão, contração e manutenção ou memória (Schuluns & Lefrancois, Nature Rev. 3: 269-79 (2003)). Após o reconhecimento de um antigénio, a resposta imunológica é "iniciada". Isto é seguido de um aumento rápido do número de células que participam na resposta imunológica durante a "fase de expansão". Sem expansão, a resposta imunológica tende a ser ineficaz. A fase seguinte, a "fase de contração", controla a dimensão da resposta imunológica com a finalidade de prevenir uma resposta excessiva que possa danificar o hospedeiro. A apoptose, um tipo especifico de morte celular programada, é um processo celular importante durante a fase de contração da resposta imunológica. Se a 2 contração for excessiva, pode dar origem a uma resposta imunológica de curta duração e/ou fraca. Por fim, para imunidade prolongada, a resposta imunológica deve entrar na "fase de manutenção" e gerar "linfócitos T de memória".

Um obstáculo limitador da eficácia da imunoterapia adotiva é a sobrevivência de curta duração das células transferidas. Por exemplo, a ativação in vitro é um passo frequentemente empregue em imunoterapia adotiva, mas linfócitos T ativados in vitro tendem a sofrer apoptose por transferência in vivo. Foi administrada IL-2 a pacientes para estimular a sua resposta imunológica em geral e para aumentar a imunoterapia adotiva. A IL-2 não aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunológica nem favorece a formação de linfócitos T de memória, mas pode ser utilizada para prolongar ou continuar a fase de expansão. No entanto, a IL-2 tem toxicidades significativas quando administrada a pacientes, e os pacientes nem sempre conseguem tolerar quantidades suficientes de IL-2 requeridas para imunoterapia adotiva ótima. Toxicidades associadas a IL-2 em doses elevadas incluem arrepios, náuseas, vómitos, diarreia e "sindroma do extravasamento capilar" (que pode requerer cuidados intensivos). Adicionalmente, é frequente que pacientes submetidos a terapia com IL-2 em doses elevadas também recebam terapia profilática com antibióticos. Klebanoff et al. (PNAS Volume 7 (2004), páginas 1969-74) relatam a atividade antitumoral in vivo de células T CD8+ transfetadas com IL-15 e contempla a utilização destas células em imunoterapia adotiva em humanos. 3 A descrição anterior mostra que é necessário melhorar a imunoterapia adotiva. A presente invenção atenua esta necessidade ao proporcionar linfócitos T com sobrevivência aumentada durante a fase de contração da resposta imunológica, e composições que os compreendem. Vantajosamente, a invenção atenua as necessidades sentidas na área por um método que consegue evitar a toxicidade associada à terapia convencional com IL-2 em doses elevadas. Estas e outras vantagens da invenção, bem como caracteristicas inventivas adicionais, tornar-se-ão claras a partir da descrição da invenção proporcionada aqui.

RESUMO BREVE DA INVENÇÃO A invenção proporciona linfócitos T expressando um polinucleótido recombinante que codifica uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunológica, e composições, por exemplo, composições farmacêuticas, que os compreendem. Adicionalmente, é divulgado um método de preparação de linfócitos T com sobrevivência aumentada, que compreende a transformação, por exemplo, transdução, de linfócitos T com um polinucleótido recombinante que codifica uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante as fases de contração e manutenção da resposta imunológica. 0 método pode ser praticado in vivo, ou ex vivo, e opcionalmente também pode incluir transferir as células transformadas, por exemplo, transduzidas, para um mamífero. Quando os linfócitos T são transformados, por exemplo,

transduzidos, ex vivo e transferidos para um mamífero recetor, o mamífero é preferivelmente o mesmo mamífero de onde foram obtidos os linfócitos T (isto é, os linfócitos T 4 são autólogos). As composições, por exemplo, composições farmacêuticas, podem ser utilizadas no tratamento de um estado clinico, por exemplo, cancro, doença infeciosa, doença autoimune e imunodeficiência. As composições da invenção também podem ser utilizadas in vitro para modificar culturas de células. As composições da invenção também podem ser armazenadas e utilizadas para proporcionar reagentes para os quais podem ser transferidos recetores de células T (TCRs) recombinantes e outras frações, cada um dos quais tem utilidade por si próprio. 0 polinucleótido recombinante transformado, por exemplo, transduzido, nos linfócitos T codifica preferivelmente uma porção funcional, variante ou fusão de IL-7, IL-15, ou ambas a IL-7 e IL-15, que obviamente inclui IL-7 e/ou IL-15 não modificadas.

DESCRIÇÃO BREVE DAS VÁRIAS PERSPETIVAS DAS FIGURAS A FIG. 1 ilustra a atividade biológica de IL-15 expressa por células transformadas de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. IA é um gráfico da proliferação de células CTLL-2 (determinada pela captação de 3H-timidina) na ausência (barra da esquerda) e na presença (barra da direita) de IL-2. A FIG. 2B é um gráfico da proliferação de células CTLL-2 na presença de diferentes quantidades de IL-15 humana recombinante. A FIG. 1C é um gráfico da proliferação de células CTLL-2 na presença de sobrenadantes de células SupTl que expressam o vetor de controlo MSGIN (♦) , vetor MSGV-IL-15 () ou vetor MSGV-

Super IL-15 (A). A FIG. 2 ilustra a sobrevivência de linfócitos do sangue periférico (PBLs) in vitro após remoção de citoquina de 5 acordo com uma forma de realização da invenção. Especif icamente, a FIG. 2 é um gráfico da contagem de células (em milhões) versus os dias de remoção de citoquina para células não transduzidas (NT(♦)) e células transduzidas com um vetor de controlo (MSGIN (X)), um vetor que codifica IL-2 (A), IL-7 () ou IL-15 (·). A FIG. 3 ilustra a produção de interferão gama por PBLs transformados quando cocultivados com células de melanoma de acordo com uma forma de realização da invenção. Especificamente, a FIG. 3 é um gráfico do IFN-γ produzido em resposta à exposição a células de melanoma (526 (barra preta), 624 (barra branca), 888 (barra às riscas) e 938 (barra cinzenta)) por células não transduzidas (NV) , células L2D8 (controlo positivo) ou células transduzidas com vetores que codificam um TCR (TCR) , IL-2, IL-7 ou IL-15. A FIG. 4 ilustra a produção de interferão gama por PBLs transformados quando estimulados com antigénio (gplOO) de acordo com uma forma de realização da invenção. Especificamente, a FIG. 4 é um gráfico do IFN-γ produzido por PBLs não transduzidos (NV), ou PBLs transduzidos com um vetor que codifica um TCR, IL-2, IL-7 ou IL-15, por exposição a células apresentadoras de antigénios pulsadas com diferentes concentrações de péptido gplOO (0 até 100 ng/mL). A FIG. 5 é a sequência de aminoácidos de uma proteína IL-15 madura ilustrando a otimização de codões (SEQ ID NO: 10) de acordo com uma forma de realização da invenção. A proteína madura contém 114 aminoácidos. Sessenta e três codões são substituídos por sequências alternativas que codificam o 6 mesmo aminoácido. Dezanove das substituições originam um desvio de um codão raramente utilizado (< 20%) para um codão mais frequentemente utilizado. A FIG. 6 é um gráfico da quantidade de IL-15 produzida por células NIH/3T3 de acordo com uma forma de realização da invenção. Células NIH/3T3 foram transduzidas com diferentes quantidades de um vetor compreendendo um gene de IL-15 de tipo selvagem (MSGV-IL-15; barras brancas) ou um gene de IL-15 otimizado quanto a codões (CO) (MSGV-CO IL-15; barras pretas). Os dados são representativos de duas experiências. A FIG. 7 é um gráfico da quantidade de IL-15 produzida por células TE671 de acordo com uma forma de realização da invenção. Células TE671 foram transduzidas com diferentes quantidades de um vetor compreendendo um gene de IL-15 de tipo selvagem (MSGV-IL-15; barras brancas) ou um gene de IL-15 otimizado quanto a codões (CO) (MSGV-CO IL-15; barras pretas). Os dados são representativos de duas experiências. A FIG. 8 é um gráfico da quantidade de IL-15 produzida por células 293T de acordo com uma forma de realização da invenção. Células 293T foram transduzidas com diferentes quantidades de um vetor compreendendo um gene de IL-15 de tipo selvagem (MSGV-IL-15; barras brancas) ou um gene de IL-15 otimizado quanto a codões (CO) (MSGV-CO IL-15; barras pretas). Os dados são representativos de duas experiências. A FIG. 9 é um gráfico da quantidade de IL-15 produzida por células transduzidas com vetores compreendendo o gene de IL-15 de tipo selvagem (MSGV-IL-15; barras brancas) ou otimizado quanto a codões (MSGV-CO-IL-15; barras pretas), 7 às diluições do retrovirus indicadas, de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 10 é um gráfico da quantidade de DNA de β-actina, detetada por PCR, das células da FIG. 9 transduzidas com vetores contendo o gene de IL-15 de tipo selvagem de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 11 é um gráfico da quantidade de DNA de β-actina, detetada por PCR, das células da FIG. 9 transduzidas com vetores contendo o gene de IL-15 otimizado quanto a codões de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 12 é um gráfico da quantidade de IL-15 produzida por células não transduzidas ou transduzidas com IL-15 isoladas de diferentes pacientes e estimuladas (barras pretas) ou não estimuladas com OKT3 (barras brancas) de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 13 é um gráfico dos números de células da FIG. 12 em cultura na ausência de citoquina exógena de acordo com uma forma de realização da invenção. Células não transduzidas do Paciente 1 0; células transduzidas com IL-15 do Paciente 1 ♦; células não transduzidas do Paciente 2 Δ; células transduzidas com IL-15 do Paciente 2 Á; células não transduzidas do Paciente 3 o; células transduzidas com IL-15 do Paciente 3 ·; células não transduzidas do Paciente 4 □; células transduzidas com IL-15 do Paciente 4 ; células não transduzidas do Paciente 5 x, e células transduzidas com IL-15 do Paciente 5 *. A FIG. 14 é um gráfico dos números de células (não transduzidas 0; transduzidas com um vetor de controlo , ou transduzidas com vetor de IL-15 ·) em cultura durante mais de 180 dias de acordo com uma forma de realização da invenção. AIB representa linfócitos transduzidos com um vetor de controlo. A FIG. 15 é uma representação gráfica da expressão de certas moléculas da superfície celular por células não transduzidas, células não transduzidas cultivadas com IL-15 e células transduzidas com IL-15 de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 16 é uma representação gráfica da expressão de certas moléculas da superfície celular por células não transduzidas cultivadas em meio contendo IL-2, células não transduzidas cultivadas em meio contendo IL-15 ou células transduzidas com IL-15 de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 17 é um gráfico da proliferação (determinada pela captação de 3H-timidina) de células não transduzidas, ou células transduzidas com um vetor de controlo ou vetor que codifica IL-15, cultivadas na presença (barras brancas) ou ausência (barras pretas) de IL-2 de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 18 é uma representação gráfica de um decurso temporal de coloração com 7-AAD/Anexina-V de células não transduzidas (NT) ou células transduzidas com um vetor de controlo (AIB) ou um vetor que codifica IL-15, cujas células foram cultivadas na ausência de IL-2 e estimuladas por OKT3 de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 19 é uma representação gráfica da expressão de Bcl-2 por células não transduzidas (NT) ou células transduzidas 9 com um vetor de controlo (AIB) ou um vetor que codifica IL-15, cujas células foram cultivadas na presença (histogramas brancos) ou ausência (histogramas cinzentos) de IL-2 de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 20 é uma representação gráfica da expressão de Bcl-XL por células não transduzidas (NT) ou células transduzidas com um vetor de controlo (AIB) ou um vetor que codifica IL-15, cujas células foram cultivadas na presença (histogramas brancos) ou ausência (histogramas cinzentos) de IL-2 de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 21 é um gráfico de linhas que ilustra o IFN-γ produzido por células não transduzidas (NT; ♦) ou células transduzidas com um vetor de controlo (AIB; ·) ou com um vetor que codifica IL-15 (IL-15; ) , em resposta à estimulação com células T2 pulsadas com quantidades variáveis de péptido gplOO de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 22 é um gráfico do IFN-γ produzido por células não transduzidas (NT) ou células transduzidas com um vetor de controlo (AIB) ou um vetor que codifica IL-15, em resposta à estimulação com células T2 pulsadas com diferentes péptidos antigénicos: péptido virai de influenza (Flu; barras brancas), péptido MART-1 (MART; barras cinzentas) ou péptido gplOO (gplOO; barras pretas), antes de a IL-2 ter sido removida do meio de cultura de células, de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 23 é um gráfico do IFN-γ produzido por células não transduzidas (NT) ou células transduzidas com um vetor de controlo (AIB) ou com um vetor que codifica IL-15, em 10 resposta à estimulação com células T2 pulsadas com diferentes péptidos antigénicos: péptido virai de influenza (Flu; barras brancas), péptido MART-1 (MART; barras cinzentas) ou péptido gplOO (gplOO; barras pretas), depois de a IL-2 ter sido removida do meio de cultura de células, de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 24 é um gráfico do número de células (não transduzidas (NT; ♦) , ou transduzidas com vetores de IL-2 () , IL-7 (A) ou IL-15 (x)) sobreviventes in vitro depois de a citoquina exógena ter sido removida do meio de cultura, de acordo com uma forma de realização da invenção. As células foram isoladas de fresco. A FIG. 25 é um gráfico do número de células (não transduzidas (NT; ♦), ou transduzidas com vetor de controlo MSGIN () , vetores de IL-2 (A), IL-7 (χ) ou IL-15 (*)) sobreviventes in vitro depois de a citoquina exógena ter sido removida do meio de cultura, de acordo com uma forma de realização da invenção. As células consistiram em células crioconservadas descongeladas. A FIG. 26 é um gráfico da proliferação (determinada pela captação de 3H-timidina) de células (não transduzidas (NT; ♦), ou transduzidas com vetor de controlo MSGIN (), vetores de IL-2 (A), IL-7 (χ) ou IL-15 (*)) em resposta à estimulação com células dendriticas alogeneicas de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 27 é um gráfico do número de células (não transduzidas (♦), ou transduzidas com vetores que codificam IL-2 (A), IL-7 (χ) ou IL-15 (*)) sobreviventes depois de a 11 citoquina exógena ter sido removida do meio de cultura, de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 28 é um gráfico da proliferação (determinada pela captação de 3H-timidina) de células não transduzidas cultivadas na ausência () ou presença de citoquinas exógenas: IL-2 (·) , IL-7 (A), IL-15 (·) ) por estimulação com diferentes razões de células dendriticas alogeneicas de acordo com uma forma de realização da invenção. A FIG. 29 é um gráfico da proliferação (determinada pela captação de 3H-timidina) de células não transduzidas (NT; ) ou células transduzidas com um vetor que codifica IL-2 (·) , IL-7 (A) ou IL-15 (·) por estimulação com diferentes razões de células dendriticas alogeneicas de acordo com uma forma de realização da invenção.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção procura modular as fases de contração e/ou manutenção da resposta imunológica ao proporcionar linfócitos T com sobrevivência aumentada. Assim, a invenção procura equilibrar a proliferação celular e morte celular, como adicionalmente descrito aqui. A presente invenção proporciona um linfócito T, ou uma população destes, bem como composições, por exemplo, composições farmacêuticas, que os compreendem. 0 linfócito T da presente invenção expressa pelo menos um polinucleótido recombinante que codifica pelo menos uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração de uma resposta imunológica, em que o polinucleótido compreende uma sequência não nativa 12 otimizada quanto a codões compreendendo a SEQ ID NO: 4 que codifica a citoquina, em que a citoquina é IL-15.

Para as presentes finalidades, o linfócito T pode ser qualquer linfócito T, como um linfócito T cultivado, por exemplo, um linfócito T primário, ou um linfócito T de uma linha de células T cultivadas, por exemplo, Jurkat, SupTl, etc., ou um linfócito T obtido de um mamifero. Se for obtido de um mamifero, o linfócito T pode ser obtido de numerosas fontes, incluindo mas não se limitando a sangue, medula óssea, nodo linfático, o timo, ou outros tecidos ou fluidos. Os linfócitos T também podem ser enriquecidos ou purificados. Preferivelmente, o linfócito T é um linfócito T humano. Mais preferivelmente, o linfócito T é um linfócito T isolado de um humano. 0 linfócito T pode ser qualquer tipo de linfócito T e pode provir de qualquer fase do desenvolvimento, incluindo mas não se limitando a linfócitos T duplamente positivos CD4+/CD8+, linfócitos T auxiliadores CD4+, por exemplo, células Thi e Th2, linfócitos T CD8+ (por exemplo, linfócitos T citotóxicos) , células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), leucócitos do sangue periférico (PBLs), linfócitos que se infiltram em tumores (TILs), células T de memória, linfócitos T virgens, e afins. Preferivelmente, o linfócito T é um TIL ou uma PBMC.

As presentes composições inventivas podem compreender um único linfócito T ou uma população destes. A população de linfócitos T pode ser uma população heterogénea compreendendo o linfócito T que expressa o polinucleótido recombinante que codifica a citoquina, para além de pelo menos uma outra célula, por exemplo, um linfócito T, que não expressa o polinucleótido recombinante que codifica a 13 citoquina, ou uma célula diferente de um linfócito T, por exemplo, uma célula B, um macrófago, um neutrófilo, um eritrócito, um hepatócito, uma célula endotelial, uma célula epitelial, uma célula muscular, uma célula cerebral, etc. Alternativamente, a população de linfócitos T pode ser uma população substancialmente homogénea, em que a população compreende maioritariamente linfócitos T expressando o polinucleótido recombinante que codifica a citoquina. A população também pode ser uma população clonal de linfócitos T, em que todos os linfócitos T da população são clones de um único linfócito T expressando um polinucleótido recombinante que codifica a citoquina, de modo que todos os linfócitos T da população expressam o polinucleótido recombinante. De acordo com uma forma de realização da invenção, é preferida uma população clonal. 0 linfócito T da presente invenção ou das presentes composições inventivas expressa pelo menos um polinucleótido recombinante que codifica pelo menos uma citoquina, como discutido aqui. Por outras palavras, o linfócito T expressa uma citoquina que é codificada pelo polinucleótido recombinante. 0 polinucleótido recombinante pode codificar mais do que uma citoquina, por exemplo, duas, três, quatro, cinco ou mais citoquinas. Por exemplo, o polinucleótido recombinante pode compreender um primeiro polinucleótido recombinante e um segundo polinucleótido recombinante. Numa forma de realização preferida, o segundo polinucleótido recombinante codifica a IL-7 e o primeiro polinucleótido recombinante codifica a IL-15, respetivamente. Alternativamente, o polinucleótido recombinante pode compreender mais do que uma cópia da sequência codificadora que codifica as citoquinas, por exemplo, duas cópias do gene de IL-15 em série. 14

Relativamente à presente invenção, o termo "recombinante" refere-se a (i) moléculas que são construídas fora de células vivas reunindo segmentos de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos a moléculas de ácidos nucleicos que podem replicar-se numa célula viva, ou (ii) moléculas resultantes da replicação das descritas em (i) acima. Para as presentes finalidades, a replicação pode ser replicação in vitro, replicação in vivo ou síntese de novo. 0 termo "polinucleótido", como usado aqui, inclui "oligonucleótido", "ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico", e geralmente significa um polímero de DNA ou RNA, que pode ter filamentação simples ou filamentação dupla, sintetizado ou obtido (por exemplo, isolado e/ou purificado) de fontes naturais, que pode conter nucleótidos naturais, não naturais ou alterados, e que pode conter uma ligação internucleótidos natural, não natural ou alterada, como uma ligação fosforamidato ou uma ligação fosforotioato, em vez do fosfodiéster presente entre os nucleótidos de um oligonucleótido não modificado. É geralmente preferido que o polinucleótido recombinante não compreenda quaisquer inserções, deleções, inversões e/ou substituições. No entanto, pode ser adequado nalguns casos, como discutido aqui, que o polinucleótido recombinante compreenda uma ou mais inserções, deleções, inversões e/ou substituições.

Os polinucleótidos recombinantes podem ser construídos com base em sintase química e/ou reações de ligação enzimática utilizando procedimentos conhecidos na área. Ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a Edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), e Ausubel et al., "Current Protocols 15 in Molecular Biology", Greene Publishing Associates e John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.Y. (1994). Por exemplo, um oligonucleótido pode ser sintetizado quimicamente utilizando nucleótidos de ocorrência natural ou nucleótidos modificados de forma variada concebidos para aumentar a estabilidade biológica das moléculas, ou para aumentar a estabilidade fisica da hélice dupla formada por hibridização (por exemplo, derivados fosforotioato e nucleótidos substituídos com acridina). Exemplos de nucleótidos modificados que podem ser utilizados para gerar os polinucleótidos recombinantes incluem mas não estão limitados a 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-cloro-uracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetil-citosina, 5-(carboxi-hidroximetil)uracilo, 5-carboximetil-aminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, di-hidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster de metilo do ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3) w, e 2,6-diaminopurina. Alternativamente, um ou mais dos polinucleótidos da presente invenção podem ser adquiridos a empresas, tais como a Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) e Synthegen (Houston, TX). 16 0 termo "isolado", como usado aqui, significa que foi removido do seu ambiente natural. Os polinucleótidos da presente invenção podem, alternativa ou adicionalmente, ser purificados. 0 termo "purificado", como usado aqui, significa que a sua pureza foi aumentada, em que "pureza" é um termo relativo e não deve ser necessariamente considerado como pureza absoluta. Por exemplo, a pureza pode ser pelo menos 50%, pode ser maior do que 60%, 70% ou 80%, ou pode ser 100%. O polinucleótido recombinante pode codificar qualquer citoquina, desde que a citoquina tenha a capacidade de aumentar a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração de uma resposta imunológica. Esta sobrevivência aumentada durante a fase de contração origina uma resposta imunológica mais eficaz e função aumentada de linfócitos T de memória. É preferivel que a citoquina também facilite a formação e sobrevivência de linfócitos T de memória. Entre as citoquinas adequadas encontram-se aquelas que prolongam a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração, tais como, por exemplo (mas não limitadas a estas), quando linfócitos do sangue periférico (PBLs) são transformados (por exemplo, transduzidos) com o polinucleótido recombinante, a citoquina produzida é capaz de manter pelo menos cerca de 25% dos PBLs transduzidos viáveis in vitro durante pelo menos 15 dias, por exemplo, quando cultivados em RPMI 1640 suplementado com 5% soro humano normal, na ausência de citoquinas adicionadas, como IL-2. Preferivelmente, a citoquina produzida mantém pelo menos cerca de 50%, por exemplo, cerca de 75%, dos PBLs transduzidos viáveis in vitro na ausência de citoquina adicionada. Mais preferivelmente, a citoquina produzida mantém 90% ou mais dos PBLs transduzidos viáveis in vitro 17 na ausência de citoquina adicionada. Essas citoquinas codificadas pelo polinucleótido recombinante podem ser, por exemplo, IL-7, IL-15, IL-4, IL-12, IL-21 ou IL-23. Preferivelmente, a citoquina é IL-7 ou IL-15. A interleuquina-15 (IL-15) é uma citoquina envolvida no desenvolvimento de células T. A IL-15 não é normalmente expressa por linfócitos T e normalmente é proporcionada por outras células. Adicionalmente, crê-se que a IL-15 é naturalmente apresentada aos linfócitos T na superfície de outras células (isto é, a IL-15 é apresentada a células T em trans). A citoquina codificada pelo polinucleótido recombinante pode compreender a citoquina completa de tipo selvagem, por exemplo, IL-15 humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 6) ou IL-7 humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 5), ou uma respetiva porção funcional, fusão funcional ou variante funcional. Por "porção funcional" pretende-se significar um fragmento ou parte da citoquina, por exemplo, IL-7 ou IL-15, cujo fragmento ou parte retém a atividade biológica da citoquina. Porções funcionais da citoquina, por exemplo, IL-7 ou IL-15, abrangem, por exemplo, aquelas partes da citoquina que retêm a capacidade para aumentar a sobrevivência de linfócitos T numa extensão semelhante, na mesma extensão ou numa extensão maior do que a citoquina completa de tipo selvagem. 0 termo "fusão funcional", como usado aqui, refere-se a uma proteína de fusão ou proteína quimérica compreendendo uma citoquina completa de tipo selvagem, por exemplo, IL-7 ou IL-15, ou uma respetiva porção funcional, fundida a outra proteína ou respetiva porção. A fusão funcional, tal como a 18 porção funcional, retém a atividade biológica da citoquina, por exemplo, a capacidade para aumentar a sobrevivência de linfócitos T numa extensão semelhante, na mesma extensão ou numa extensão maior do que a citoquina completa de tipo selvagem. A outra proteina à qual é fundida a citoquina, ou respetiva porção ou variante funcional, pode ser qualquer proteina. Estritamente a titulo exemplificativo, a proteina pode ser uma proteina marcadora, que facilita a avaliação dos niveis de expressão da fusão funcional. 0 termo "variante funcional", como usado aqui, é sinónimo de "variante biologicamente equivalente", "derivado biologicamente equivalente" ou "análogo biologicamente equivalente", e refere-se a uma proteina compreendendo a sequência de aminoácidos de tipo selvagem da citoquina, por exemplo, IL-7 ou IL-15, compreendendo pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aminoácidos. A variante funcional pode compreender, por exemplo, a sequência de aminoácidos de tipo selvagem da IL-7 ou IL-15 compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos conservativa.

Porções, fusões ou variantes funcionais da IL-7 e IL-15 também incluem polipéptidos que, quando expressos por linfócitos T transformados, por exemplo, transduzidos, são capazes de recrutar os seus recetores respetivos e iniciar a transdução do sinal. Exemplos de porções funcionais de IL-7 incluem polipéptidos desprovidos dos seus péptidos de sinal de tipo selvagem (Namen et al., Patente U.S. N° 4,965,195). Adicionalmente, uma cauda de epitopo, como a cauda FLAG, pode ser fundida à IL-7 sem perda da função da IL-7 (Namen et al., Patente U. S. N° 4, 965, 195). Adicionalmente, por exemplo (mas sem limitação), a mutação 19 do triptofano no aminoácido 143 da IL-7 em tirosina ou fenilalanina origina variantes funcionais da IL-7 (vander Speck et ai., Cytokine 11_: 227 (2002)). Foi mostrado que porções da sequência codificadora da IL-15 sem as sequências de alguns ou todos os codões de inicio a montante putativos produzem polipéptidos de IL-15 funcionais. De modo semelhante, fusões do polipéptido de IL-15 com, por exemplo (mas sem limitação) , o péptido de sinal CD33 ou sequência lider de pré-prolactina produzem polipéptidos de IL-15 funcionais. Adicionalmente, certos aminoácidos podem ser mutados sem um efeito funcional. Por exemplo (mas sem limitação), é improvável que a lisina no aminoácido 35 da IL-15 humana seja importante para a sua função (Pettit et al.r J. Bio. Chem. 272: 2312-2318 (1997)), e mutações nesta posição ainda originam tipicamente um polipéptido de IL-15 funcional.

Variantes da IL-7 e IL-15 que são capazes de aumentar a sobrevivência de linfócitos T também podem ser facilmente obtidas substituindo um aminoácido numa posição não essencial da sequência da IL-7 ou IL-15 por um aminoácido, ou por deleção de 1, 2, 3, 4, 4-10 ou 11-30 aminoácidos não essenciais. De modo semelhante, 1, 2, 3, 4, 4-10 ou 11-30 aminoácidos podem ser adicionados em regiões não essenciais do polipéptido.

Além disso, aminoácidos essenciais podem ser substituídos por aminoácidos conservativos ou neutros. O profissional irá desejavelmente considerar o contexto no qual é feita qualquer substituição particular de aminoácidos, para além de considerar a hidrofobicidade ou polaridade da cadeia lateral, a dimensão geral da cadeia lateral e o valor pK de cadeias laterais com carácter acidico ou básico em 20 condições fisiológicas. Por exemplo, lisina, arginina e histidina são muitas vezes adequadamente substituídas entre si, e mais frequentemente arginina e histidina. Como é conhecido na área, isto deve-se ao facto de os três aminoácidos terem cadeias laterais básicas, ao passo que os valores pK das cadeias laterais de lisina e arginina são muito mais próximos entre si (cerca de 10 e 12) do que de histidina (cerca de 6). De modo semelhante, glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina são muitas vezes adequadamente substituídas entre si, com a condição de ser frequente que a glicina não substitua adequadamente os outros membros do grupo. Isto deve-se ao facto de cada um destes aminoácidos ser relativamente hidrófobo quando incorporado num polipéptido, mas o facto de a glicina não ter um carbono α dota os ângulos de rotação phi e psi (em torno do carbono a) de tanta liberdade conformacional que resíduos glicinilo podem desencadear alterações na conformação ou estrutura secundária que não ocorrem muitas vezes quando os outros aminoácidos são substituídos entre si. Outros grupos de aminoácidos que é frequente serem adequadamente substituídos entre si incluem mas não estão limitados ao grupo que consiste em ácidos glutâmico e aspártico; o grupo que consiste em fenilalanina, tirosina e triptofano, e o grupo que consiste em serina, treonina e, opcionalmente, tirosina. Adicionalmente, o profissional pode facilmente agrupar aminoácidos sintéticos com aminoácidos de ocorrência natural. A IL-7 ou IL-15 variante da invenção compreende preferivelmente pelo menos cerca de 70% de aminoácidos idênticos à IL-7 ou IL-15 não modificada. Também é desejável que o comprimento dos polipéptidos não difira 21 (isto é, devido a mutações de deleção) em mais de cerca de 10%. O polinucleótido recombinante pode compreender a sequência codificadora de tipo selvagem de ocorrência natural de uma citoquina. Alternativamente, o polinucleótido recombinante pode compreender uma sequência codificadora não nativa que codifica a citoquina. Por "não nativa" pretende-se significar que a sequência codificadora não ocorre na natureza, e é sinónimo de "não natural". A sequência codificadora pode compreender qualquer número de inserções, deleções e/ou substituições, cujas substituições podem ou não causar uma alteração de aminoácidos, por exemplo, uma mutação silenciosa. Nalguns casos é preferível que as substituições não causem uma alteração de aminoácidos, isto é, que sejam uma mutação silenciosa. polinucleótido RNA codificado pelo A sequência codificadora não nativa do polinucleótido recombinante pode ser uma sequência que foi submetida a otimização de codões, isto é, a sequência codificadora não nativa é um produto da otimização de codões. A otimização de codões é uma estratégia pela qual codões num gene clonado, cujos codões não são geralmente utilizados pelo sistema de tradução da célula hospedeira, denominados "codões raros", são alterados por mutagénese in vitro em codões preferidos sem alteração dos aminoácidos da proteína sintetizada (Bradel-Tretheway et al., J Virol Meth 111: 145-156 (2003); Ramakrishna et al., J Virol 7J3: 9174-9189 (2004)). Além disso, o polinucleótido recombinante que codifica a citoquina pode ser adicionalmente modificado, por exemplo, otimizado quanto a codões, para melhorar o dobramento do RNA, de modo a ser minimizado o dobramento do transcrito de 22 recombinante. Sem pretender ficar restringido a qualquer teoria particular, correntemente crê-se que a energia livre minimizada prevista, determinada, por exemplo, por programas computacionais de modelação molecular, está correlacionada com dobramento minimizado do RNA que, por sua vez, facilita a ligação de ribossomas ao RNA e permite expressão eficiente do RNA. Preferivelmente, a sequência codificadora não nativa tem 90% ou menos da energia livre prevista da sequência codificadora nativa. Por outras palavras, prevê-se que a sequência codificadora não nativa tenha uma energia livre que é 90% ou menos da energia livre prevista da sequência codificadora nativa. Mais preferivelmente, a sequência codificadora não nativa tem 50% ou menos da energia livre prevista da sequência codificadora nativa. É muito preferível que a sequência codificadora não nativa tenha 25% ou menos da energia livre prevista da sequência codificadora nativa.

Uma dada sequência de nucleótidos pode ser otimizada quanto a codões utilizando programas computacionais publicamente disponíveis, tais como "Upgene: A Web-based DNA codon optimization algorithm," disponível na "internet" no "website" do Recombinant Vaccine Center da University of Pittsburgh Molecular Medicine Institute, e o "Codon Optimizer Tool," que está disponível na "internet" em modo de acesso gratuito. Alternativamente, uma sequência de nucleótidos pode ser otimizada recorrendo aos serviços de empresas, tais como Blue Heron Bio, Inc. (Bothell, Washington) e GenScript Corp. (Piscataway, NJ).

Por exemplo, os polinucleótidos recombinantes que codificam a IL-7, IL-15, respetivas porções, fusões ou variantes, podem ser modificados de modo a terem codões alternativos. 23

Por exemplo, codões "raros" podem ser substituídos por codões mais frequentemente empregues no genoma dos mamíferos de onde é obtido o linfócito T transformado. Deste modo, a eficiência da expressão da IL-7, IL-15 e/ou respetivas porções, fusões ou variantes pode ser vantajosamente modificada. Assim, a invenção proporciona um polinucleótido recombinante que codifica a IL-7 (SEQ ID NO: 1) ou IL-15 (SEQ ID NO: 2) com codões otimizados expressa num linfócito T para aumentar a sua sobrevivência.

Um polinucleótido recombinante pode ser sintetizado e utilizado para substituir sequências codificadoras de um gene de citoquina de tipo selvagem. Por exemplo, a SEQ ID NO: 3 é uma inserção de polinucleótido sintetizada in vitro, com codões otimizados, que é utilizada para substituir a sequência codificadora num polinucleótido de IL-15 recombinante. A SEQ ID NO: 4 mostra um polinucleótido recombinante compreendendo a sequência de um polinucleótido geneticamente manipulado que codifica a IL-15 humana com codões específicos otimizados e dobramento de RNA otimizado para entrada de ribossomas. Além disso, os polinucleótidos recombinantes inventivos que codificam formas de IL-7 ou IL-15, ou respetivas porções, fusões ou variantes, incluem ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos e ácidos nucleicos peptídicos. Numa forma de realização preferida da presente invenção, o polinucleótido recombinante compreendendo uma sequência codificadora não nativa que codifica a citoquina que foi submetida a otimização de codões compreende a SEQ ID NO: 4.

Relativamente à presente invenção, o polinucleótido recombinante pode compreender outros ácidos nucleicos diferentes da sequência codificadora da citoquina. 0 24 polinucleótido recombinante pode compreender, por exemplo, um gene suicida, entre outros genes ou elementos de expressão, por exemplo, promotores, indutores, intensificadores, marcadores e afins. Preferivelmente, o polinucleótido recombinante compreende um gene suicida. Como usado aqui, o termo "gene suicida" refere-se a um gene que causa a morte da célula que expressa o gene suicida. 0 gene suicida pode ser um gene que confere sensibilidade a um agente, por exemplo, um fármaco, pela célula onde o gene é expresso, e causa a morte da célula quando a célula é contactada ou exposta ao agente. Genes suicidas são conhecidos na área (ver, por exemplo, "Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews", Springer, Caroline J. (Câncer Research UK Centre for Câncer Therapeutics do Institute of Câncer Research, Sutton, Surrey, RU) , Humana Press, 2004) e incluem, por exemplo, o gene da timidina quinase (TK) do Virus Herpes Simplex (HSV), citosina desaminase, purina nucleósido fosforilase e nitrorredutase. Preferivelmente, o gene suicida é o gene TK de HSV. Neste caso, o agente ao qual a célula fica sensível é o fármaco ganciclovir.

Sem pretender ficar restringido a qualquer teoria particular, crê-se que a expressão da citoquina, codificada pelo polinucleótido recombinante, pelo linfócito T confere propriedades desejáveis ao presente linfócito T inventivo, que tornam o linfócito T especialmente útil em métodos de tratamento ou prevenção de um estado clínico, por exemplo, uma doença, num humano. A este respeito, a presente invenção proporciona linfócitos T possuindo essas propriedades desejáveis, incluindo, por exemplo, sobrevivência ou viabilidade aumentada in vitro na ausência de qualquer citoquina adicionada ou exógena no meio de 25 cultura. Numa forma de realização preferida, o linfócito T da presente invenção tem capacidade para sobreviver in vitro na ausência de uma citoquina exógena ou adicionada, como IL-2, pelo menos durante 20 dias. Por outras palavras, o linfócito T pode viver durante 20 dias ou mais in vitro num meio de cultura sem qualquer citoquina exógena ou adicionada. Mais preferivelmente, o linfócito T tem capacidade para sobreviver in vitro na ausência de uma citoquina exógena ou adicionada pelo menos durante 40 dias. Muito preferivelmente, o linfócito T pode sobreviver in vitro na ausência de citoquina exógena ou adicionada pelo menos durante 180 dias. A presente invenção também proporciona um linfócito T que é capaz de se proliferar na ausência de qualquer citoquina exógena ou adicionada, por exemplo, IL-2. Adicionalmente, a presente invenção proporciona um linfócito T que é capaz de resistir a apoptose induzida por remoção de IL-2 in vitro. Além disso, a presente invenção proporciona um linfócito T que tem capacidade para reconhecer um antigénio in vitro na ausência de uma citoquina exógena ou adicionada.

Os linfócitos T, ou populações destes, bem como as composições que os compreendem, têm muitas aplicações. Aplicações preferidas incluem o tratamento ou prevenção de um estado clinico, por exemplo, uma doença, como cancro, doença infeciosa e doença autoimune ou imunodeficiência. A este respeito, os linfócitos T da presente invenção ou das presentes composições inventivas podem compreender outros componentes celulares que auxiliam a capacidade do linfócito T para tratar ou prevenir um estado clinico. Por exemplo, o linfócito T pode compreender um recetor especifico para um antigénio de um estado clinico. O 26 recetor pode ser um recetor específico para antigénios que reconhece qualquer antigénio que seja característico do estado clínico, por exemplo, doença, a ser tratado ou prevenido, como discutido aqui. O recetor pode ser o recetor endógeno de células T, isto é, o recetor de células T específico para antigénios que é endógeno ou nativo (de ocorrência natural) do linfócito T. Nesse caso, o linfócito T compreendendo o recetor endógeno de células T pode ser um linfócito T que foi isolado de um mamífero que se sabe expressar o antigénio específico do estado clínico particular. Numa forma de realização preferida, o mamífero pode ser um mamífero que é imunizado com um antigénio de um estado clínico ou específico deste, por exemplo, uma doença. Desejavelmente, o mamífero é imunizado antes de os linfócitos T serem obtidos do mamífero. Deste modo, as células transformadas com o polinucleótido capaz de expressar a citoquina podem incluir células induzidas para terem especificidade para o estado clínico a ser tratado, ou podem incluir uma proporção maior de células específicas do estado clínico. Os linfócitos T obtidos deste modo do mamífero podem então ser transformados, por exemplo, transduzidos, com o polinucleótido recombinante que codifica a citoquina, preparados para reintrodução num mamífero com o estado clínico e reintroduzidos no mamífero, como aqui discutido a seguir. 0 linfócito T compreendendo o recetor endógeno de células T pode ser uma célula T que foi obtida de um mamífero que já tem o estado clínico, por exemplo, doença, a ser tratado. Deste modo, os linfócitos T obtidos do mamífero incluem linfócitos T com especificidade para os antigénios, células 27 ou tecidos do estado clínico, por exemplo, doença (ou albergando o agente etiológico de uma doença). Nesta forma de realização, os linfócitos T são preferivelmente selecionados ou submetidos a triagem quando à especificidade desejada e são opcionalmente expandidos in vitro antes da reintrodução no mesmo ou noutro mamífero.

Alternativamente, o linfócito T compreendendo o recetor endógeno de células T pode ser um linfócito T presente numa população misturada de células isoladas de um mamífero, e a população misturada pode ser exposta ao antigénio que é reconhecido pelo recetor endógeno de células T, sendo cultivada in vitro. Deste modo, o linfócito T que compreende o recetor que reconhece o antigénio específico do estado clínico expande-se ou prolifera in vitro, assim aumentando o número de linfócitos T possuindo o recetor endógeno específico para o antigénio. 0 recetor que é específico para o antigénio específico do estado clínico pode ser, alternativamente, um recetor quimérico recombinante que é específico para um antigénio de um estado clínico. Por exemplo, o recetor pode ser tal que é codificado por um polinucleótido recombinante que é expresso pelo linfócito T. 0 polinucleótido recombinante que codifica o recetor quimérico pode compreender, por exemplo, uma porção de ligação a antigénios, como porções de ligação a antigénios de imunoglobulinas (por exemplo, anticorpos de ocorrência natural e sintéticos, por exemplo, geneticamente manipulados, ou suas porções, scFv, etc.), recetores de células T, recetores de células B, e afins, para além de outra porção que não funciona de modo a ligar-se ao antigénio. Esses recetores quiméricos são conhecidos na área (ver, por exemplo, Hwu et al., JEM 17 8: 361-366 28 (1993); Darcy et al., J. Immunology 164: 3705-3712 (2000); Haynes et al., J. Immunology 166: 182-187 (2001);

Dakappagari et al.r Can Res _60: 3782-3789 (2000), e

Weijtens et al., J. Immunology, 157: 836-843 (1996)).

Por exemplo, os linfócitos T transformados, por exemplo, transduzidos, pelo polinucleótido recombinante que codifica a citoquina também podem ser transformados, por exemplo, transduzidos, com polinucleótidos que codificam um recetor de células T (TCR) exógeno (por exemplo, recombinante) ou outro recetor quimérico recombinante. Esses recetores quiméricos exógenos, por exemplo, TCRs quiméricos, podem conferir ao linfócito T transformado especificidade para antigénios adicionais para além dos antigénios para os quais o recetor endógeno de células T é naturalmente especifico. Isto pode, mas não é necessário, levar à produção de linfócitos T com especificidades duais para antigénios.

Pode ser utilizado qualquer polinucleótido adequado que codifique um recetor quimérico, TCR ou proteína do tipo TCR. TCRs para utilização nesta forma de realização são conhecidos na área. Por exemplo, polinucleótidos que codificam TCRs para gplOO , NY-ESO-1 e MART-1 têm sido utilizados em imunoterapia. Ver, por exemplo, Patente U.S. 5,830,755, Zhao et al., J. Immunology 174(7): 4415-23 (2005), e Hughes et al., Hum Gene Ther. 1_6(4): 457-472 (2005). Nestas formas de realização, a transformação com o polinucleótido recombinante que codifica a citoquina pode ocorrer antes, após ou simultaneamente com a transformação do recetor de células T. O TCR codificado pelos ácidos nucleicos transformados pode ter qualquer forma adequada, incluindo, por exemplo, um TCR de cadeia simples ou uma 29 fusão com outras proteínas (por exemplo, sem limitação, moléculas coestimuladoras). 0 antigénio de uma doença, cujo antigénio é reconhecido pelo recetor endógeno de células T ou recetor quimérico recombinante, pode ser qualquer antigénio que seja característico de uma doença ou de um estado clínico. Por exemplo, o antigénio pode ser mas não está limitado a um antigénio tumoral (também denominado antigénio associado a tumor) ou um antigénio virai. Antigénios tumorais são conhecidos na área e incluem, por exemplo, gplOO, MART-1, TRP-1, TRP-2, tirosinase, NY-ESO-1 (também conhecido como CAG-3), MAGE-1, MAGE-3, etc. Antigénios virais também são conhecidos na área e incluem, por exemplo, qualquer proteína virai, por exemplo, env, gag, pol, gpl20, timidina quinase, e afins. A doença ou estado clínico, que está associado ou é caracterizado pelo antigénio reconhecido pelo recetor endógeno de células T ou recetor quimérico, pode ser qualquer doença ou estado clínico. Por exemplo, a doença ou estado clínico pode ser um cancro, uma doença infeciosa, uma doença autoimune ou uma imunodeficiência, como discutido aqui.

Para finalidades da presente invenção, o cancro pode ser qualquer cancro. Como usado aqui, o termo "cancro" designa qualquer crescimento ou tumor maligno causado por divisão celular anormal e descontrolada que pode disseminar-se para outras partes do corpo através do sistema linfático ou da corrente sanguínea. 0 cancro pode ser, por exemplo, cancro da mama, cancro da próstata, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro retal, cancro da vesícula urinária, linfoma 30 não de Hodgkin, melanoma, cancro renal, cancro pancreático, cancro da cavidade oral, cancro da faringe, cancro do ovário, cancro da tiroide, cancro do estômago, cancro do cérebro, mieloma múltiplo, cancro esofágico, cancro do fígado, cancro cervical, cancro da laringe, cancro do dueto biliar intra-hepático, leucemia mieloide aguda, cancro de tecido mole, cancro do intestino delgado, cancro testicular, leucemia linfocítica crónica, linfoma de Hodgkin, cancro mieloide crónico, cancro linfocítico agudo, cancro do ânus, canal anal ou anorreto, cancro da vulva ou cancro do pescoço, vesícula biliar, pleura, mesotelioma maligno, cancro dos ossos, cancro das articulações, cancro da hipofaringe, cancro do olho, cancro do nariz, cavidade nasal, pescoço ou ouvido médio, cancro da nasofaringe, cancro do uréter, cancro do peritoneu, omento ou mesentério, ou tumor carcinoide gastrointestinal. Um exemplo específico de cancro é melanoma.

Para as presentes finalidades, "doença infeciosa" designa uma doença que pode ser transmitida de pessoa para pessoa ou de organismo para organismo, e é causada por um agente microbiano (por exemplo, constipação comum). Doenças infeciosas são conhecidas na área e incluem, por exemplo, hepatite, doenças sexualmente transmissíveis (por exemplo, Chlamydia, gonorreia), tuberculose, HIV/SIDA, difteria, hepatite B, hepatite C, cólera e influenza.

Para as presentes finalidades, "doença autoimune" refere-se a uma doença na qual o corpo produz uma resposta imunogénica (isto é, do sistema imunológico) a algum constituinte do seu próprio tecido. Por outras palavras, o sistema imunológico perde a sua capacidade de reconhecer algum tecido ou sistema do corpo como "seu" e aborda-o 31 seletivamente e ataca-o como se fosse estranho. Doenças autoimunes podem ser classificadas naquelas em que é afetado predominantemente um órgão (por exemplo, anemia hemolitica e tiroidite anti-imunológica) e naquelas em que o processo de doença autoimune é difundido por muitos tecidos (por exemplo, lúpus eritematoso sistémico). Por exemplo, pensa-se que a esclerose múltipla seja causada por células T que atacam as bainhas que envolvem as fibras nervosas do cérebro e espinal medula. Isto leva a perda de coordenação, fraqueza e visão enevoada. Doenças autoimunes são conhecidas na área e incluem, por exemplo, tiroidite de Hashimoto, doença de Grave, lúpus, esclerose múltipla, artrite reumática, anemia hemolitica, tiroidite anti-imunológica, lúpus eritematoso sistémico, doença celíaca, doença de Crohn, colite, diabetes, escleroderma, psoríase, e afins.

Para as presentes finalidades, "imunodeficiência" designa o estado de um paciente cujo sistema imunológico ficou comprometido por doença ou por administração de químicos. Este estado torna o sistema deficiente no número e tipo de células sanguíneas necessárias para a defesa contra uma substância estranha. Estados ou doenças de imunodeficiência são conhecidos na área e incluem, por exemplo, SIDA (síndroma da imunodeficiência adquirida), SCID (doença de imunodeficiência combinada grave), deficiência seletiva de IgA, imunodeficiência comum variável, agamaglobulinemia ligada ao cromossoma X, doença granulomatosa crónica, síndroma de hiper-IgM e diabetes. A presente invenção também proporciona um método de preparação de um linfócito T com sobrevivência aumentada de células T, por exemplo, um linfócito T como aqui descrito 32 acima. 0 método compreende contactar um linfócito T com um polinucleótido recombinante codificando uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração de uma resposta imunológica, de modo que o contacto conduz à expressão da citoquina pelo linfócito T.

Pode ser utilizado qualquer meio adequado para contactar ou transferir o(s) polinucleótido(s) recombinante(s) transferido(s) para os linfócitos T. Exemplos desses meios incluem mas não estão limitados à utilização de um lípido, proteina, partícula ou outra molécula capaz de facilitar a transformação celular com o polinucleótido. 0 polinucleótido pode estar contido num plasmídeo ou num vetor virai. Vetores virais adequados incluem vetores virais adenovirais, lentivirais, adeno-associados, pox e herpes. Vetores virais são preferivelmente retrovirais e derivados de um vírus que procede à transdução eficiente de linfócitos T. A transformação, por exemplo, transdução, de linfócitos T altera geneticamente os linfócitos T, fazendo com que os linfócitos T possuam um polinucleótido recombinante codificando uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunológica. Apesar de os linfócitos T serem preferivelmente manipulados de modo a codificarem e expressarem essas citoquinas (isto é, não meramente linfócitos T alterados para albergarem esses polipéptidos de citoquinas), a expressão das citoquinas pode ser regulada de modo condicional ou constitutiva. A alteração genética pode conduzir a uma mudança permanente no DNA da linha germinativa do linfócito T, ou pode ser uma mudança temporária. Nalguns casos, a alteração genética inventiva 33 preferivelmente não é uma mudança permanente no DNA da linha germinativa do mamífero de onde é derivado o linfócito T, a menos que a alteração genética ocorra numa célula precursora do linfócito T, tal como numa célula estaminal hematopoiética ou um progenitor de linfócitos T de linhagem restrita. A citoquina expressa pelo polinucleótido atua preferivelmente na célula que segrega a citoquina e/ou linfócitos T colocalizados. Células estaminais hematopoiéticas podem ser obtidas, por exemplo (mas sem limitação) de medula óssea, sangue periférico ou sangue do cordão umbilical. Adicionalmente, uma população de células estaminais hematopoiéticas pode ser opcionalmente enriquecida por tratamento de um mamífero com infusão de G-CSF, ou purificada, por exemplo, com anticorpos, como CD34. De modo semelhante, precursores de linfócitos T de linhagem restrita podem ser obtidos de tecidos tais como mas não se limitando ao timo, por métodos conhecidos na área. Adicionalmente, precursores de linfócitos T de linhagem restrita podem ser enriquecidos por tratamentos tais como mas não se limitando a linfopoietina estromal tímica, ou protocolos de purificação, tais como mas não se limitando à seleção de células CD4+/CD8+.

Os polinucleótidos recombinantes utilizados na presente invenção são preferivelmente exógenos às células que transformam. Adicionalmente, os polinucleótidos recombinantes da presente invenção são preferivelmente "isolados", de modo que o polinucleótido recombinante é removido do seu ambiente ou estado natural. 34

Os polinucleótidos recombinantes descritos aqui compreendem preferivelmente uma região codificadora operativamente ligada a um promotor adequado, cujo promotor é preferivelmente funcional em células T. Promotores virais, tais como, sem limitação, o promotor principal do CMV tardio, o promotor do RSV e o promotor presente na repetição terminal longa do virus das células estaminais murinas, contam-se entre os promotores preferidos úteis no contexto da invenção. Promotores não virais adequados incluem mas não estão limitados ao promotor da fosfogliceroquinase (PGK) e o promotor do fator de alongamento la. Promotores não virais são desejavelmente promotores humanos. Elementos genéticos adequados adicionais conhecidos na área também podem ser ligados, fixados ou inseridos no ácido nucleico e construções inventivos para proporcionar funções, nivel de expressão ou padrão de expressão adicionais. Também podem ser utilizados os promotores nativos para expressão dos genes de citoquinas, em cujo caso preferivelmente não são utilizados no cromossoma que naturalmente os codifica, a menos que sejam modificados por um processo que modifica substancialmente esse cromossoma. Esses cromossomas substancialmente modificados podem incluir cromossomas transfetados e alterados por um vetor retroviral, ou processo semelhante. Em alternativa, cromossomas substancialmente modificados podem compreender um cromossoma artificial, como um HAC, YAC ou BAC.

Os polinucleótidos recombinantes descritos para a presente invenção podem ser inseridos em qualquer vetor adequado. Vetores adequados incluem, sem limitação, vetores virais. Vetores virais adequados incluem, sem limitação, vetores retrovirais, vetores de alfavirus, vacinia, adenovirus, 35 vírus adenoassociado, vírus herpes e vírus da varíola das aves domésticas, e preferivelmente têm uma capacidade nativa ou manipulada para transformar células T. Adicionalmente, os vetores úteis no contexto da invenção podem ser vetores de ácidos nucleicos "nus" (isto é, vetores com poucas ou nenhumas proteínas, açúcares e/ou lípidos encapsulando-os) ou complexados com outras moléculas. Outras moléculas que podem ser adequadamente combinadas com os ácidos nucleicos inventivos incluem, sem limitação, envelopes virais, lípidos catiónicos, lipossomas, poliaminas, partículas de ouro e frações de abordagem seletiva, como ligandos, recetores ou anticorpos que abordam seletivamente moléculas celulares. Um vetor preferido proporcionado pela invenção compreende uma porção da LTR do vírus das células estaminais murinas, ou um respetivo análogo conhecido. São mais preferidos vetores também compreendendo a região gag e sítio de processamento env, que é preferivelmente obtido do vetor SFGtcLuc+ITE4-(que são conhecidos na área). Estes vetores podem ser opcionalmente utilizados para transfetar linfócitos T in vivo.

Além disso, para otimizar a capacidade de vetores, e particularmente vetores virais, para entrarem na célula pelo método da invenção, o método é preferivelmente implementado na ausência de anticorpos neutralizadores dirigidos contra o vetor particular a ser introduzido de modo intracelular, que poderiam impedir a transdução de células alvo. 0 profissional pode testar de modo rotineiro a presença desses anticorpos neutralizadores. Também são conhecidas na área técnicas para prevenir que a presença de anticorpos neutralizadores impeça a produção efetiva de 36 proteínas (ver, por exemplo, a Publicação de Requerimento de Patente Internacional N° WO 96/12406). O polinucleótido recombinante da invenção pode codificar duas citoquinas num único polipéptido. No entanto, é conveniente incorporar ácidos nucleicos que codificam porções de duas citoquinas (ou respetivas porções, fusões ou variantes) num único vetor, em cujo caso cada um dos dois polinucleótidos recombinantes pode estar independentemente em qualquer uma das seis fases de leitura, e posicionados de modo próximo ou distai entre si. Quando os dois polinucleótidos recombinantes são colocados próximos um do outro num vetor, é muitas vezes conveniente conduzir a expressão de ambos os polinucleótidos recombinantes a partir de um único promotor e incluir um sítio interno de entrada de ribossomas (IRES) 5' para a tradução das segundas sequências codificadoras. Alternativamente, um segundo promotor, como um promotor da fosfoglicerol quinase (PGK) (Morgan et al., J. Iirmunol., 1171: 3287-3295 (2003)) pode ser utilizado para conduzir a expressão da segunda construção de ácido nucleico.

Para a finalidade de um método de preparação de um linfócito T, o linfócito T pode ser contactado com o polinucleótido recombinante in vivo, tal como através de um canhão de genes, por exemplo. São conhecidos métodos adequados de administração a um mamífero de um vetor da invenção com a finalidade de terapia genética (ver, por exemplo, Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991);

Jaffe et al., Clin. Res. 3_9: 302A (1991); Rosenfeld et al., Clin. Res. 39: 311A (1991); Berkner, BioTechniques 6_: 616-629 (1988); Crystal et al., Human Gene Ther. _6: 643-666 6: (1995); Crystal et al., Human Gene Ther., 6_: 667-703 37 (1995)). Alternativamente, o linfócito T pode ser contactado com o polinucleótido recombinante in vitro ou ex vivo. Esses métodos pertencem ao âmbito do profissional. Os linfócitos T são preferivelmente transformados ex vivo pelo polinucleótido recombinante.

Preferivelmente, as células transformadas expressam eficientemente a IL-7 e IL-15. Por exemplo, PBLs transformados expressam a IL-7 de modo que, após 3 dias in vitro, o meio de cultura de células tem IL-7 a uma concentração de pelo menos 30 pg/mL, mais preferivelmente 100 pg/mL, ainda mais preferivelmente 500 pg/mL, ou a função equivalente quando a citoquina é uma variante da IL-7. De modo semelhante, por exemplo, os PBLs transformados preferivelmente expressam a IL-15 de modo que, após 3 dias in vitro, o meio de cultura celular tem IL-15 a uma concentração de pelo menos 30 pg/mL, mais preferivelmente 100 pg/mL, ainda mais preferivelmente 500 pg/mL, ou a função equivalente quando a citoquina é uma variante da IL-15. Apesar de não haver nenhum nivel de expressão máximo teórico atingível a partir de células transformadas, uma expressão superior a 50 000 pg/mL não será normalmente necessária para IL-7 ou IL-15.

Para a finalidade do método divulgado de preparação de um linfócito T com sobrevivência aumentada de células T, a citoquina, polinucleótido recombinante, linfócito T podem ser quaisquer dos descritos acima. A presente divulgação proporciona quaisquer dos linfócitos T, ou uma população destes, que sejam preparados pelo método divulgado de preparação de um linfócito T com sobrevivência celular aumentada. 38

Também é proporcionado pela presente invenção um linfócito T para utilização num método de tratamento de um estado clinico, por exemplo, uma doença, num mamifero. 0 método compreende administrar a um mamifero quaisquer dos linfócitos T descritos aqui, ou uma população destes, ou uma composição compreendendo quaisquer dos linfócitos T descritos aqui, numa quantidade eficaz para tratar o estado clinico no mamifero. A presente invenção também proporciona um linfócito T para utilização num método de prevenção de um estado clinico, por exemplo, uma doença, num mamifero. 0 método compreende administrar a um mamifero quaisquer dos linfócitos T descritos aqui, ou uma população destes, ou uma composição compreendendo quaisquer dos linfócitos T descritos aqui, numa quantidade eficaz para prevenir o estado clinico no mamifero.

No tratamento ou prevenção de um estado clinico, por exemplo, uma doença, num mamifero, os linfócitos T que foram transformados, por exemplo, transduzidos, com um polinucleótido recombinante que codifica e expressa uma citoquina podem ser transferidos para o mesmo mamifero de onde foram obtidos linfócitos T. Por outras palavras, o linfócito T utilizado no presente método inventivo de tratamento ou prevenção pode ser um linfócito T autólogo, isto é, pode ser obtido do mamifero onde o estado clinico é tratado ou prevenido. Alternativamente, os linfócitos T podem ser transferidos para outro mamifero, apesar de, na maior parte dos casos, ser preferível que o linfócito T seja autólogo ao mamifero. 39

No caso de os linfócitos T serem autólogos ao mamífero, o mamífero pode ser imunologicamente não manipulado, imunizado, afetado com doença ou ter outro estado antes da recolha de linfócitos T do mamífero. Nalguns casos é preferível que o método compreenda imunização do mamífero com um antigénio do estado clínico antes da obtenção dos linfócitos T do mamífero, transdução dos linfócitos T obtidos com o polinucleótido recombinante e administração do linfócito T, ou de uma composição deste. Como discutido aqui, a imunização do mamífero com o antigénio do estado clínico irá permitir o aumento dos números da população de linfócitos T possuindo um recetor endógeno de células T reativo com o antigénio específico do estado clínico, o que irá aumentar a probabilidade de o linfócito T, obtido para transdução com o polinucleótido recombinante que codifica a citoquina, ter o recetor endógeno de células T.

De acordo com a invenção, um mamífero com um estado clínico pode ser terapeuticamente imunizado com um antigénio desse estado clínico ou associado a esse estado clínico, incluindo imunização via uma vacina. Não pretendendo ficar restringido a qualquer teoria particular, a vacina ou imunogénio é proporcionado para aumentar a resposta imunológica do mamífero ao antigénio do estado clínico presente no ou sobre o agente infecioso ou tecido doente. Essa imunização terapêutica inclui mas não está limitada à utilização de proteínas, péptidos ou respetivos análogos da doença recombinantes ou naturais, ou péptidos da doença modificados, ou respetivos análogos, que podem ser utilizados como uma vacina de modo terapêutico como parte de imunoterapia adotiva. A vacina ou imunogénio pode ser uma célula, lisato celular (por exemplo, de células transfetadas com um vetor de expressão recombinante), um 40 vetor de expressão recombinante ou proteína antigénica. Alternativamente, a vacina ou imunogénio pode ser uma proteína, péptido da doença recombinante parcial ou substancialmente purificado, ou respetivos análogos, ou péptidos modificados ou respetivos análogos. As proteínas ou péptidos podem ser conjugados a lipoproteínas ou administrados em forma lipossómica ou com adjuvante. A presente utilização inventiva de um linfócito T num método de tratamento ou prevenção de um estado clínico num mamífero pode compreender passos adicionais. Por exemplo, uma variedade de procedimentos, como discutido em baixo, pode ser realizada nos linfócitos T antes, de forma substancialmente simultânea ou após o seu isolamento de um mamífero. De modo semelhante, uma variedade de procedimentos pode ser realizada nos linfócitos T antes, de forma substancialmente simultânea ou após a sua transformação com um polinucleótido que codifica pelo menos uma citoquina que aumenta a sobrevivência dos linfócitos T durante a fase de contração.

De acordo com a invenção, não é requerido que outras citoquinas sejam contactadas com os linfócitos T ou administradas a um mamífero que recebe os linfócitos T transformados. No entanto, a utilização de outras citoquinas é preferida nalgumas formas de realização. Outras citoquinas adequadas incluem, sem limitação, IL-4, IL-12, IL-21 e IL-23. Estas outras citoquinas também atuam preferivelmente para aumentar a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração, o que pode facilitar a formação e sobrevivência de linfócitos T de memória. Além disso, um mamífero ao qual são administrados os linfócitos T transformados também pode ser opcionalmente tratado com 41 citoquinas adicionais, antibióticos e outros agentes farmacêuticos. Uma dessas citoquinas preferidas é a IL-2, que é preferivelmente administrada em dosagens baixas. Os linfócitos T transformados também podem opcionalmente ser adicionalmente transformados com ácidos nucleicos para expressarem outras citoquinas, cujas outras citoquinas podem incluir mas não estão limitadas a IL-2 em níveis baixos. Estes ácidos nucleicos podem ser manipulados para colocar a expressão das citoquinas adicionais sob o controlo de promotores constitutivos, reguláveis ou temporalmente controlados. A este respeito, a presente invenção proporciona um linfócito T para utilização num método no qual IL-2 é administrada ao mamífero após a administração ao mamífero do linfócito T ou composição, bem como um método no qual nenhuma citoquina exógena é administrada ao mamífero após a administração do linfócito T ou composição. 0 presente método inventivo pode ser implementado em mamíferos para os quais outros tratamentos do estado clínico falharam ou tiveram menos êxito no tratamento por outros meios. 0 presente método inventivo também pode ser implementado em conjunção com outros tratamentos do estado clínico. Por exemplo, o método pode compreender administrar um regime para combater cancro, por exemplo, quimioterapia não mieloablativa, cirurgia, terapia hormonal e/ou radiação, antes da administração do linfócito T ou composição.

Os linfócitos T, que são preferivelmente autólogos ao mamífero submetido a transfusão, são preferivelmente estimulados com o antigénio do estado clínico, por exemplo, 42 doença, in vitro antes, simultaneamente ou após transformação com o polinucleótido que codifica a citoquina. Os linfócitos T podem ser estimulados in vitro com o antigénio do estado clinico a ser tratado de qualquer modo adequado. 0 antigénio utilizado para estimular as células in vitro é desejavelmente o mesmo antigénio utilizado para imunizar terapeuticamente o mamífero. A este respeito, a presente invenção também proporciona um método de tratamento ou prevenção como descrito aqui, em que o método compreende a imunização do mamífero com um antigénio do estado clínico antes da administração do linfócito T ou composições.

Os linfócitos T podem ser expandidos in vitro após a transformação, por exemplo, transdução, mas antes da transferência ou reintrodução, isto é, administração, num mamífero. Essa expansão in vitro pode tirar partido da estimulação com a população de linfócitos por ativação específica utilizando um ou mais antigénios fortes pré-selecionados. Os linfócitos transformados pré-selecionados podem ser cultivados durante vários dias. Entre os dias 14 e 21 após a transformação, as células podem ser opcionalmente rastreadas quanto a libertação de citoquinas específicas quando expostas a antigénios da doença, preferivelmente no contexto de um complexo de histocompatibilidade principal (MHC). Nesta altura, também pode ser desejável re-estimular a população de linfócitos com o antigénio forte. A re-estimulação utilizando um antigénio forte é preferivelmente realizada a uma concentração semelhante à utilizada para a estimulação inicial, durante um período de tempo semelhante. Se forem utilizadas células dadoras alogeneicas como antigénio forte, a re-estimulação é preferivelmente efetuada a uma 43 razão de 0,5:1 até 4:1, mais preferivelmente a uma razão de 1:1 até 2:1 (dador:paciente). Estas células podem ser diretamente reintroduzidas no paciente ou podem ser congeladas para utilização futura, isto é, para administrações subsequentes a um mamífero. A expansão específica para antigénios pode ser opcionalmente suplementada com expansão em condições que estimulam de forma inespecífica a proliferação de linfócitos, tais como, por exemplo (mas sem limitação) com meio contendo anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-Tac, PHA ou IL-2. No entanto e vantajosamente, a estimulação inespecífica não é necessariamente requerida quando polinucleótidos recombinantes que expressam a IL-7 ou IL-15 são transduzidos nos linfócitos T.

Os linfócitos T, ou populações destes, da presente invenção podem ser formados como uma composição, tal como uma composição farmacêutica compreendendo um transportador, diluente e excipiente farmaceuticamente aceitáveis. A este respeito, a presente invenção proporciona uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, compreendendo um linfócito T, ou uma população deste, que expressa pelo menos um polinucleótido recombinante codificador de uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração de uma resposta imunológica, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

Preferivelmente, a composição compreende linfócitos T transformados com o polinucleótido recombinante e que o expressam.

Composições farmacêuticas contendo os presentes linfócitos T inventivos podem compreender mais do que um tipo de 44 linfócito T, por exemplo, podem compreender linfócitos T que expressam duas citoquinas diferentes que aumentam a sobrevivência de células T. A composição farmacêutica pode alternativamente compreender um linfócito T particular da presente invenção em combinação com outros agentes farmaceuticamente ativos ou fármacos, tais como agentes quimioterapêuticos, por exemplo, um fármaco para combater cancro. 0 transportador pode ser qualquer transportador adequado farmaceuticamente aceitável. No que se refere a composições farmacêuticas, o transportador pode ser qualquer um dos convencionalmente utilizados e baseia-se em considerações físico-químicas, como a solubilidade e ausência de reatividade com o(s) composto (s) ativo (s), e na via de administração. Será apreciado pelo profissional que, para além da composição farmacêutica descrita a seguir, os linfócitos T da presente invenção podem ser formulados como complexos de inclusão.

Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis descritos aqui, por exemplo, veículos, adjuvantes, excipientes e diluentes, são bem conhecidos dos profissionais e são facilmente disponibilizados ao público. É preferido que o transportador farmaceuticamente aceitável seja tal que é quimicamente inerte para o(s) agente(s) ativo(s), por exemplo, o linfócito T, e tal que não tenha efeitos secundários ou toxicidade prejudiciais nas condições de utilização. A escolha do transportador será determinada, em parte, pelo linfócito T, bem como pelo método particular utilizado para administrar o linfócito T. Em conformidade, há uma 45 variedade de formulações adequadas da composição farmacêutica da presente invenção. As seguintes formulações para administração são exemplificativas e de modo nenhum limitadoras. Pode ser usada mais do que uma via para administrar o linfócito T e, em certos casos, uma via particular pode proporcionar uma resposta mais imediata e mais eficaz do que outra via.

Pode ser preparada uma composição farmacêutica compreendendo os linfócitos T transformados de modo a não conter células vivas para além de células sanguíneas e linfócitos. Isto é, a composição pode ser esterilizada excetuando as células sanguíneas, linfócitos ou células T transduzidas. Essas composições podem ser facilmente preparadas por seleção positiva e/ou negativa das células desejadas de uma população de células transformadas com os polinucleótidos recombinantes ou vetores inventivos. Técnicas adequadas de seleção positiva incluem separações por bioaf inidade, que são bem conhecidas na área. Por exemplo, um anticorpo específico para um antigénio da superfície celular de um linfócito T pode ser ligado a uma esférula magnética, incubado com a população transduzida, separado desta e, opcionalmente, lavado. Outra alternativa consiste em utilizar anticorpos semelhantes que foram conjugados de modo fluorescente e submetidos a triagem positiva quanto a células com um citómetro de fluxo capaz de proceder a triagem de células ativadas por fluorescência. De modo semelhante, células indesejadas podem ser eliminadas da composição por qualquer técnica adequada. Técnicas adequadas de seleção negativa incluem remoção imunomagnética de células indesejadas e a utilização de antibióticos para destruir micróbios. Além disso, leucoforese, outras técnicas de filtração, técnica 46 esterilizada, centrifugação diferencial e outros métodos convencionais podem ser utilizados para produzir uma composição adequada para administração a um humano.

Numa forma de realização podem ser administrados vetores e polinucleótidos recombinantes.

Podem encontrar-se células T na maior parte das localizações do corpo de um mamífero. Em conformidade, pode ser utilizada qualquer via de administração adequada. E preferida a administração intravenosa de células quando o mamífero é humano. Uma via particular pode proporcionar uma reação mais imediata e mais eficaz do que outra via. Transportadores adequados farmaceuticamente aceitáveis também são bem conhecidos dos profissionais, e estão facilmente disponíveis. A escolha do transportador será determinada, em parte, pelo método particular utilizado para administrar o vetor recombinante. Em conformidade, há uma grande variedade de formulações adequadas para utilização no contexto da invenção.

Formulações adequadas para administração oral dos ácidos nucleicos e vetores podem consistir em (a) soluções líquidas, como uma quantidade eficaz do composto dissolvida em diluentes, como água, solução salina ou sumo de laranja; (b) suspensões num líquido apropriado, e (c) emulsões adequadas. Formas de comprimidos podem incluir um ou mais de lactose, manitol, amido de milho, amido de batata, celulose microcristalina, acácia, gelatina, dióxido de silício coloidal, croscarmelose sódica, talco, estearato de magnésio, ácido esteárico e outros excipientes, corantes, diluentes, agentes de tamponamento, agentes humedecedores, 47 conservantes, agentes aromatizantes e excipientes farmacologicamente compatíveis.

Formulações preferidas incluem soluções para injeção esterilizadas, isotónicas, aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue, e suspensões esterilizadas aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizadores, agentes espessantes, estabilizadores e conservantes. Os ácidos nucleicos e vetores inventivos podem ser armazenados num estado liofilizado, requerendo apenas a adição do excipiente líquido esterilizado, por exemplo (mas sem limitação) água, para injeções, imediatamente antes da utilização. Soluções e suspensões para injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos esterilizados do tipo previamente descrito.

Os ácidos nucleicos, vetores e células da invenção podem ser formulados em recipientes selados unidose ou multidose, como ampolas e frascos, e podem ser armazenados congelados. Estes ácidos nucleicos, vetores e células da invenção podem ser armazenados em embalagens resistentes à luz, empregando, por exemplo (mas sem limitação) frascos de vidro colorido ou caixas de cartão. De modo semelhante, podem ser incluídas nestas composições instruções de utilização das composições, que preferivelmente cumprem as regulamentações da U.S. Food and Drug Administration, e preferivelmente também das suas agências europeia, japonesa e outras equivalentes. Estes ácidos nucleicos, vetores e células da invenção também estão preferivelmente desprovidos de micróbios não recombinantes (incluindo, sem limitação, fungos e micobactérias) e vírus não 48 recombinantes. Preferivelmente, as instruções sugerem a utilização de uma certa quantidade de uma destas composições (ou intervalo de quantidades), ou sugerem a administração da composição a um mamifero para investigação ou terapia por uma via de administração particular.

Adicionalmente, uma célula e, mais preferivelmente, um ácido nucleico ou vetor da invenção pode ser manipulado em supositórios por mistura com uma variedade de bases, como bases emulsionantes ou bases solúveis em água. Formulações adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas na forma de pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou fórmulas de pulverização contendo, para além do ingrediente ativo, transportadores conhecidos na área como sendo apropriados. A dose administrada a um animal, particularmente um humano, no contexto da invenção irá variar com a forma de realização inventiva, a composição empregue, o método de administração e o sitio particular e organismo a ser tratado. No entanto, a dose deve ser suficiente para proporcionar uma resposta terapêutica.

Pode ser administrado a um mamifero qualquer número adequado de linfócitos T transformados. Não obstante um único linfócito T ser capaz de se expandir e proporcionar um beneficio, é preferível administrar pelo menos 103, mais preferivelmente 145, ainda mais preferivelmente pelo menos 108 e opcionalmente 1012 ou mais linfócitos T transformados. Uma forma de realização preferida da invenção compreende a administração de cerca de 108 até cerca de 1012 linfócitos T transformados a um humano. Não há nenhum limite superior teórico para o número de linfócitos T transformados que 49 pode ser administrado a um mamifero, ou para o número de vezes que linfócitos T podem ser administrados a um mamifero. No entanto, o profissional apreciará que as quantidades excessivas de linfócitos T administradas (por exemplo, nalgumas formas de realização, mais de 1015 ou 1018 células transformadas) podem exceder a capacidade do mamifero para suportá-las, conduzindo a sequelas clinicas indesejáveis e custos desnecessariamente aumentados. De modo semelhante, administrações excessivas de composições terapêuticas a mamiferos podem conduzir a efeitos indesejáveis, como respostas alérgicas e infeção, e assim são preferivelmente evitadas. A invenção também proporciona a transferência ou reintrodução de linfócitos T transformados em mamiferos sem a administração de citoquinas exógenas. De modo semelhante, a invenção proporciona a transferência ou reintrodução de linfócitos T transformados em mamiferos submetidos a terapia com IL-2 em dose baixa e/ou quimioterapia não mieloablativa em conjunção com imunoterapia adotiva. Essa terapia com IL-2 em dose baixa em humanos inclui, por exemplo, tratamento intravenoso com 20 000 até 200 000 IU/kg, uma até três vezes por dia durante pelo menos três doses, preferivelmente pelo menos 9 doses, e até um máximo de 45, preferivelmente 30 ou mais preferivelmente 18 doses. Uma calendarização condicionante de quimioterapia não mieloablativa adequada irá induzir linfopenia transitória e pode consistir, por exemplo, em ciclofosfamida (por exemplo, 15-80 mg/kg por dia durante 1 até 4 dias) seguida de fludarabina (10-50 mg/m2 por dia durante pelo menos 1, preferivelmente 2, mais preferivelmente pelo menos 3 dias até um máximo de 12, preferivelmente 8, mais preferivelmente 5 dias). 50

Como usado aqui, o termo "mamífero" como usado aqui refere-se a qualquer mamífero, incluindo mas não se limitando a mamíferos da ordem Rodentia, como ratinhos e hamsters, e mamíferos da ordem Logomorpha, como coelhos. É preferido que os mamíferos sejam da ordem Carnívora, incluindo Felinos (gatos) e Caninos (cães). É adicionalmente preferido que os mamíferos sejam da ordem Artiodactyla, incluindo Bovinos (vacas) e Suínos (porcos), ou da ordem Perssodactyla, incluindo Equinos (cavalos) . É adicionalmente preferido que os mamíferos sejam da ordem Primatas, Ceboides ou Simoides (macacos) ou da ordem Arthropoides (humanos e símios). Um mamífero especialmente preferido é o humano.

Os termos "aumentar", "tratar" e "prevenir", bem como palavras derivadas destas, como usados aqui, não implicam necessariamente aumento, tratamento ou prevenção a 100% ou completos. Ao invés, há graus variáveis de aumento, tratamento ou prevenção que o profissional reconhece como tendo um benefício ou efeito terapêutico potencial. A este respeito, os presentes métodos inventivos podem proporcionar qualquer quantidade de aumento da sobrevivência de células T ou qualquer grau de tratamento ou prevenção de uma doença. Nalguns casos, tratamento pode abranger a prevenção do estado clínico.

Os exemplos seguintes ilustram adicionalmente a invenção. EXEMPLOS

As seguintes linhas de células foram utilizadas nalguns dos exemplos seguintes. As linhas de células utilizadas incluem a linha de rabdomiossarcoma TE 671 (ATCC HTB-139), a linha 51 epitelial renal humana altamente transfetável 293T (ATCC CRL-11268), a linha de fibroblastos de ratinho NIH/3T3 (ATCC CRL-1658), a linha de células linfoides humanas Sup TI (ATCC CRL-1942), a linha de células linfoblastoides deficientes em TAP T2 (Salter et al., Immunogenetics 21: 235-246 (1985)), a linha de células de empacotamento do virus da leucemia do macaco gibão PG13 (ATCC CRL-10686) e a linha de células de empacotamento ecotrópicas humanas Phoenix Eco (amavelmente fornecida por G. Nolan, Stanford University, Stanford, CA) . 0 meio de cultura de células consistiu em RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% FCS (Invitrogen) , 100 U/mL de penicilina (Invitrogen), 100 yg/mL de Estreptomicina (Invitrogen), 2 mM L-glutamina (Invitrogen) e 25 mM solução tampão HEPES (Invitrogen). As linhas de células foram cultivadas a 37° C numa incubadora humidificada com 5% CO2. EXEMPLO 1

Este exemplo demonstra que polinucleótidos recombinantes com substituição da sequência lider da IL-15 e otimização de codões da IL-15 foram utilizados para expressar o polipéptido da IL-15.

Naquelas células que expressam a IL-15 endógena, a expressão é estritamente regulada a muitos niveis. Foram reconhecidas algumas caracteristicas do gene da IL-15 que podem contribuir para esta regulação. A região 5' não traduzida do mRNA da IL-15 endógena é muito longa, com múltiplos codões de inicio AUG, e polipéptidos endógenos da IL-15 têm péptidos de sinal invulgarmente longos, de 48 aminoácidos. Adicionalmente, 27% dos codões da IL-15 são subótimos. Pensa-se que estes fatores contribuem para a 52 expressão ineficiente da IL-15 e oferecem oportunidades de melhoramentos inventivos.

Um cDNA da IL-15, manipulado para ficar a jusante da sequência líder de pré-prolactina eficientemente segregada em vez do péptido de sinal longo da IL-15, foi clonado no plasmídeo pMSGV, de modo que a construção da IL-15 foi expressa a partir da LTR retroviral plasmídica. Esta construção foi denominada pMSGV-PPL-IL-15. Uma versão da IL-15 otimizada quanto a codões, "Super IL-15", foi preparada e substituiu as sequências codificadoras da IL-15 em pMSGV-PPL-IL-15, para gerar o plasmídeo pMSGV-PPL-Super-IL-15. A sequência Super IL-15 aumenta a porção de codões otimizados de 71% de todos os codões para 95% de todos os codões. As sequências codificadoras não otimizada, PPL-IL-15, e otimizada quanto a codões, PPL-Super-IL-15, foram então subclonadas no vetor de expressão eucariótico pEF-Neo. As construções resultantes, pEF-PPL-IL-15 e pEF-PPL-Super-IL-15, respetivamente, expressaram as sequências codificadoras da IL-15 sob o controlo de um promotor do Fator de Alongamento la humano. A pEF-PPL-IL-15 e pEF-PPL-Super-IL-15 foram transfetadas em células 293T utilizando o reagente Perfectin, e a produção de IL-15 foi determinada utilizando um ensaio ELISA direto. Ambas as construções produziram IL-15 detetável, ao passo que uma transfeção de controlo (GWIZ) não produziu IL-15 detetável (Tabela 1). A repetição da experiência em duplicado utilizando quantidades mais otimizadas de DNA demonstrou adicionalmente produção semelhante de IL-15 a partir de células 293T transfetadas com pEF-PPL-IL-15 ou pEF-PPL-Super-IL-15 (Tabela 2) . Os ensaios de ELISA foram realizados às 24, 48 e 72 horas após a transfeção. 53

Tabela 1 - Produção de IL-15 por Células 293T Transfetadas

Condição IL-15 (pg/mL) 24 horas 1,0 μg PPL-IL15 1 332 24 horas 1,0 μg PPL-Super-IL15 1 351 24 horas 1,0 μg GWIZ 0 24 horas 0,5 μg PPL-IL15 3 854 24 horas 0,5 μg PPL-Super-IL15 1 585 24 horas 0,5 pg GWIZ 0 48 horas 1,0 pg PPL-IL15 6 484 48 horas 1,0 pg PPL-Super-IL15 7 227 48 horas 1,0 pg GWIZ 0 48 horas 0,5 pg PPL-IL15 12 557 48 horas 0,5 pg PPL-Super-IL15 5 462 48 horas 0,5 pg GWIZ 0

Tabela 2 - Reprodutibilidade da Produção de IL-15 a partir de Células 293T Transfetadas (transfeções em duplicado)

Condição IL-15 (pg/mL) 24 horas - 293T/PPL-IL15 5 500 24 horas - 293T/PPL-IL15 5 500 24 horas - 293T/PPL-Super-IL15 4 600 24 horas - 293T/PPL-Super-IL15 3 200 48 horas - 293T/PPL-IL15 23 000 48 horas - 293T/PPL-IL15 19 000 48 horas - 293T/PPL-Super-IL15 24 000 48 horas - 293T/PPL-Super-IL15 26 000 72 horas - 293T/PPL-IL15 44 000 72 horas - 293T/PPL-IL15 64 300 72 horas - 293T/PPL-Super-IL15 55 000 72 horas - 293T/PPL-Super-IL15 50 000

Estes resultados confirmaram a capacidade de polinucleótidos recombinantes para codificar uma citoquina, 54 como a IL-15 humana, que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunológica. Adicionalmente, estes resultados confirmam que essa citoquina pode ser expressa após a transformação de células de mamifero. EXEMPLO 2

Este exemplo demonstra que polinucleótidos recombinantes, com substituição da sequência lider da IL-15 e otimização de codões da IL-15, clonados num vetor retroviral foram utilizados para expressar o polipéptido da IL-15. 0 plasmideo pMSGV-PPL-IL-15 foi modificado por clonagem de um elemento regulador pós-transcrição do vírus da hepatite da marmota (WPRE) na estrutura entre o líder de pré-prolactina e as sequências da IL-15 de tipo selvagem para gerar pMSGV-PPL-IL-15-WPRE. Adicionalmente, foi gerada uma versão mutada da sequência Super-IL-15, pMSGV-PPL-Super-IL-15 (clone 11). Os plasmídeos à base de pMSGV foram transfetados em células 293T utilizando o reagente Perfectin, e a produção de IL-15 foi determinada utilizando ELISA às 24 e 48 horas após a transfeção. Células transfetadas com MGSIN de controlo e pMSGV-PPL-Super-IL-15 (clone 11) mutado em IL-15 não produziram IL-15 ou produziram IL-15 em quantidades apenas escassamente detetáveis, ao passo que células transfetadas com pMSGV-PPL-IL-15, pMSGV-PPL-IL-15-WPRE, e a construção de Super-IL-15 não mutada, pMSGV-PPL-Super-IL-15 (clone 15) produziram quantidades significativas de IL-15.

Tabela 3 - Produção de IL-15 a partir de 293T Transfetadas com Construções Retrovirais

Condição IL-15(pg/mL) 55 24 horas MSGIN 0 24 horas MSGV-IL15 477 24 horas MSGV-IL15-WPRE 35 24 horas MSGV-Super-IL15 (clone 11) 0 24 horas MSGV-Super-IL15 (clone 15) 475 48 horas MSGIN 0 48 horas MSGV-IL15 472 48 horas MSGV-IL15-WPRE 205 48 horas MSGV-Super-IL15 (clone 11) 3 48 horas MSGV-Super-IL15 (clone 15) 467

Estes resultados confirmaram a capacidade de polinucleótidos recombinantes para serem expressos a partir de um promotor retroviral para produzir IL-15 humana imunorreativa. Em consequência, uma citoquina, como a IL-15 humana, que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunológica, pode ser expressa a partir de um vetor retroviral. EXEMPLO 3

Este exemplo demonstra que células de mamífero podem ser transformadas com um polinucleótido recombinante para expressarem uma citoquina, aqui IL-15, que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunológica. Células Phoenix Eco foram transfetadas com os vetores retrovirais de IL-15 e começaram a produzir partículas retrovirais. O sobrenadante retroviral foi recolhido e transferido para placas revestidas com retronectina. Células PG13 foram então transduzidas pelas partículas retrovirais ligadas a estas placas. Após 5 dias em cultura, as células transduzidas produziram IL-15, como determinado 56 por ELISA. Células PG13 em volume transduzidas com pMSGV-PPL-IL-15 ou pMSGV-PPL-Super IL-15 que se verificou produzirem IL-15 foram depois utilizadas para clonagem por diluição limitante. Estas células foram plaqueadas em placas de 96 cavidades às diluições de 3, 1 e 0,3 células/ cavidade. Após 10-14 dias em cultura selecionaram-se cavidades contendo clones isolados. O meio de cultura de células da placa de 96 cavidades foi submetido a amostragem quanto à produção de IL-15 por ELISA. A análise de ELISA revelou que 3/54 (5%) dos clones PG13/ IL-15 produziram, e 49/61 (80%) dos clones PG13/Super IL-15 produziram quantidades detetáveis de citoquina. Os clones PG13/Super IL-15 produziram quantidades consideravelmente maiores de IL-15. Vinte e quatro clones foram selecionados para cada vetor (IL-15 e Super IL-15) e cresceram em placas de 24 e depois de 6 cavidades. Assim que o crescimento atingiu a confluência nas placas de 6 cavidades, o sobrenadante foi recolhido e congelado e as células foram crioconservadas. Vários dos sobrenadantes congelados foram então avaliados por ELISA, e estes resultados estão apresentados na Tabela 4. Vários clones de células de empacotamento produziram quantidades consideráveis de IL-15. 57

Tabela 4 - Produção de IL-15 por Clones Produtores Retrovirais

Transdutantes Transdutantes PG13/MSGV—PPL—IL-15 PG13/MSGV-PPL-Super-IL-15 Clone No IL-15(pg/mL) Clone No IL-15(pg/mL) 2 0 1 1 659 4 0 2 13 079 5 1 11 7 245 7 0 12 1 312 8 0 15 5 624 9 1 438 18 2 439 10 0 19 5 973 11 1 041 21 3 538 15 0 23 18 746 17 0 31 1 473 18 0 32 2 423 19 0 36 1 820 23 0 38 14 754 27 0 39 2 121 32 0 47 4 640 48 0 49 5 640 50 5 966 52 1 087 54 3 400 55 13 561 56 6 345 57 5 990 58 2 779

Assim, este exemplo demonstra que células de mamífero podem ser transformadas com um polinucleótido recombinante para expressarem uma citoquina, aqui IL-15, que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunológica. 58 EXEMPLO 4

Este exemplo demonstra que linfócitos T foram transformados com um polinucleótido recombinante que codifica uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunolóqica e expressam essa citoquina. Neste exemplo utilizaram-se vetores retrovirais para a transdução de linfócitos T humanos com polinucleótidos recombinantes, resultando na expressão de IL-15 humana.

Sup-Tl é uma linha de células linfoblásticas humanas que pode crescer in vitro e é recetiva a transdução retroviral. Sobrenadantes de PG13 em volume foram utilizados para a transdução de células Sup-Tl com sobrenadantes dos vetores de controlo MSGIN, MSGV-IL15 e MSGV-Super-IL-15. Depois empregou-se ELISA para avaliar quanto à IL-15 imunorreativa. Enquanto os transdutantes de controlo não produziram IL-15 significativa, ambos os transdutantes de Sup-Tl IL-1 e Super-IL-15 produzem quantidades significativas de IL-15 (Tabela 5). Os transdutantes Super-IL-15 produziram 10 vezes mais IL-15 em comparação com células T transduzidas com o polinucleótido PPL-IL-15 não otimizado.

Tabela 5 - ELISA de células Sup-Tl transduzidas com sobrenadantes virais em volume

Vetor Retroviral IL-15 (pg/mL) MSGIN 2 sobrenadante em volume de MSGV-IL15 27 sobrenadante de MSGV-Super IL 15 344

Adicionalmente analisaram-se clones individuais de Sup-Tl transduzidos. Sobrenadantes retrovirais, gerados com as 59 construções de IL-15 e Super-IL-15, tendo sido previamente mostrado por ELISA que produzem IL-15, foram descongelados, diluídos em série e transferidos para placas de 24 cavidades revestidas com retronectina. Em seguida, 5 x 104 células Sup-Tl foram transferidas de cada cavidade das placas revestidas com retrovírus após lavagem extensa de cada cavidade com PBS. 0 meio de cultura de células foi então avaliado quanto à produção de IL-15 aos 3 e 6 dias pós-transdução. Selecionaram-se vários clones de cada grupo para um exame mais preciso. Os clones selecionados foram retirados da crioconservação e foram expandidos. Cada grupo foi então plaqueado, a 4 x 106 células/balão, num balão T175. As células cresceram quase até à confluência e sobrenadante retroviral foi recolhido em dois dias consecutivos. Os dois conjuntos de sobrenadante retroviral foram diluídos em série e aplicados em placas de retronectina, e células Sup-Tl foram novamente transduzidas. No dia 5 da cultura, o sobrenadante de Sup-Tl foi recolhido e avaliado por ELISA quanto à produção de IL-15. Em cada uma de duas experiências duplicadas verificou-se que 4/6 clones Sup-Tl transduzidos produzem quantidades significativas de IL-15. A transdução de Sup-Tl utilizando retrovírus dos clones de PG13/MSGV-Super IL-15 2 e 38 conduziu à produção mais elevada de IL-15 (por exemplo, 1 549 pg/e 705 pg/mL a diluições 1:1, respetivamente).

Este exemplo demonstra que linfócitos T individuais podem ser transformados com um polinucleótido recombinante para expressarem uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunológica, aqui IL-15, e que depois estes transformantes individuais podem ser expandidos in vitro. 60 EXEMPLO 5 T podem ser codifica uma linfócitos T imunológica e utilizaram-se linfócitos T resultando na

Este exemplo demonstra que linfócitos transformados com um polinucleótido que citoquina que aumenta a sobrevivência de durante a fase de contração da resposta produzem citoquina funcional. Neste exemplo vetores retrovirais para a transdução de humanos com polinucleótidos recombinantes, expressão de IL-15 humana funcional. CTLL-2 é um clone de linfócitos T citotóxicos de ratinhos C57BL/6 utilizado para avaliar o "fator de crescimento de linfócitos T". As células podem ser estimuladas para proliferação por IL-2 ou IL-15. O ensaio de CTLL-2 foi utilizado para determinar se IL-15 produzida por células Sup-Tl transduzidas era biologicamente ativa. Células CTLL-2 cresceram em cultura durante 4 dias e depois foram recolhidas e lavadas duas vezes em PBS e então foram plaqueadas numa placa de 96 cavidades, 5 x 10J células/ cavidade. As células CTLL-2 foram incubadas na ausência de citoquinas durante 4 horas. Sobrenadantes das células Sup-Tl transduzidas foram então adicionados à cultura em diluições em série. Controlos positivos (IL-2 e IL-15) também foram adicionados a outras cavidades. As células CTLL-2 foram cultivadas durante um total de 24 horas; durante as seis horas finais adicionou-se 3H-Timidina a cada cavidade. As células CTLL-2 foram recolhidas para um filtro e foram lidas num contador β.

As células CTLL-2 não proliferaram na ausência de citoquina exógena, ao passo que células CTLL-2 proliferaram quando IL-2 ou IL-15 de controlo foram adicionadas ao seu meio. 61

Adicionalmente, sobrenadantes de células Sup-Tl transduzidas com GFP não estimularam a proliferação de CTLL-2. No entanto, a adição de sobrenadantes de células Sup-Tl transduzidas com vetores de IL-15, particularmente dos transdutantes de Super-IL-15, estimularam a proliferação de CTLL-2 (FIG. 1) . A FIG. 1 A mostra que as células CTLL-2 utilizadas não proliferam na ausência de citoquina, como IL-2, mas são competentes para proliferação se forem expostas a citoquina, como IL-2. A FIG. 1 B demonstra que as células CTLL-2 utilizadas responderam à IL-15 recombinante. A FIG. 1 C mostra os resultados da adição de sobrenadantes de Sup-Tl. 0 sobrenadante de controlo, MSGIN, não conseguiu induzir qualquer proliferação. 0 sobrenadante de MSGV-1L-15 estimulou uma proliferação fraca mas detetável e o sobrenadante de MSGV-Super-IL-15 estimulou uma proliferação forte semelhante à de IL-15 recombinante.

Em consequência, este exemplo demonstra que células Sup-Tl transduzidas de modo retroviral produzem IL-15 biologicamente ativa. Além disso, este exemplo demonstra que o polinucleótido recombinante inventivo que codifica uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunológica pode transformar linfócitos T para produzirem citoquina biologicamente ativa. EXEMPLO 6

Este exemplo demonstra que linfócitos do sangue periférico (PBLs) podem ser uma fonte de linfócitos T transformados que são transformados com um polinucleótido recombinante para expressarem uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta 62 imunológica e produzirem citoquina funcional. Especificamente, este exemplo demonstra o modo como PBLs foram transduzidos para produzirem IL-15.

No Dia 0, PBLs frescos foram obtidos de sujeitos humanos e foram ativados com o anticorpo OKT3. No dia seguinte, as células foram transduzidas com vetores retrovirais em placas revestidas com retronectina. A transdução foi repetida no Dia 3. No Dia 7, as células foram suspensas em meio fresco e foram plaqueadas, a 1,5 x 106 células/ cavidade, numa placa de 24 cavidades. No Dia 9 seguiu-se a remoção de meio de cultura e ensaio por ELISA quanto à produção de IL-15. Os resultados deste ensaio, apresentados na Tabela 6, indicaram que os PBLs tinham sido transduzidos com o vetor Super IL-15 e produziram niveis mensuráveis de IL-15.

Tabela 6 - Produção de IL-15 por PBLs Transduzidos/Estimulados com OKT3

Grupo IL-15 (pg/mL) 24 horas PBL/MSGIN 0 24 horas PBL/MSGV-Super-IL-15 clone 2 39 24 horas PBL/MSGV-Super-IL-15 clone 38 34 48 horas PBL/MSGIN 0 48 horas PBL/MSGV-Super-L-15 clone 2 67 48 horas PBL/MSGV-Super-IL-15 clone 38 61

Em consequência, PBLs transduzidos com o vetor Super IL-15 produzem niveis mensuráveis de IL-15. EXEMPLO 7

Este exemplo demonstra que linfócitos do sangue periférico (PBLs) podem ser uma fonte de linfócitos T transformados com um polinucleótido recombinante para expressarem uma 63 citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunolóqica e produzirem citoquina funcional. Especificamente, este exemplo demonstra que PBLs foram transduzidos com IL-7 ou IL-15. Além disso, as células transduzidas exibiram sobrevivência in vitro aumentada e mantiveram a sua reatividade com antigénios tumorais.

As células T não produzem naturalmente IL-7 ou IL-15. Em conformidade, vetores retrovirais capazes de expressar IL-2, IL-7 e IL-15 foram geneticamente manipulados. Para preparar um vetor capaz de produzir quantidades suficientes de IL-15 fizeram-se várias alterações na cassete de expressão da IL-15. Em primeiro lugar, a sequência lider da IL-15 natural foi substituida pela sequência lider mais facilmente processada do gene da pré-prolactina. Em seguida, o codão de inicio da tradução foi otimizado de acordo com a sequência de consenso de Kozak e, por fim, a sequência codificadora da proteina foi otimizada de modo a substituir codões raros por codões mais abundantes ao mesmo tempo otimizando o dobramento do RNA, para minimizar a energia livre e facilitar a ligação de ribossomas. Este novo vetor de expressão de IL-15, Super-IL-15, produz significativamente mais proteina IL-15 do que vetores previamente relatados (ver Exemplos acima). PBMCs de pacientes previamente vacinados com péptidos gplOO foram transduzidos para testar os três vetores de expressão de citoquinas numa comparação lado a lado. As células foram pulsadas in vitro com o péptido gplOO, no dia seguinte efetuou-se a adição de IL-2 e depois foram expostas aos vetores de citoquinas nos dias 3 e 4. Aos 6-7 dias pós-transdução, as células foram avaliadas quanto à produção de 64 citoquinas depois de serem cultivadas na ausência de qualquer citoquina adicionada. Os PBLs transduzidos produziram as citoquinas que foram manipulados para expressar. A Tabela 7 mostra a produção de citoquinas por PBLs transduzidos com vetores, medida por ELISA ("NT" é controlo não transduzido). As células foram cultivadas na presença ou ausência de 0KT3, para estimular a ativação de células T, e adicionou-se anticorpo anti-Tac a alqumas culturas, para bloquear a captação de IL-2 segreqada. Todos os valores foram determinados após 3 dias de cultura na ausência de citoquinas adicionadas, com a exceção de "Meio de Início", que representa meio do início da remoção de IL-2. PBLs transduzidos foram então cultivados em meio desprovido de IL-2 (FIG. 2). As culturas com vetor de controlo ("MSGIN") e pseudotransduzidas ("NT") perderam rapidamente a viabilidade nas primeiras duas semanas após a remoção de IL-2. As células manipuladas para produzirem as diferentes citoquinas expandiram-se após a remoção de citoquina e continuaram a sobreviver, durante um período até quatro semanas pós-remoção de citoquina, com maior sobrevivência tardia das populações de células manipuladas com IL-7 e IL-15 do que para as células manipuladas com IL-2.

Tabela 7 - Expressão de Citoquinas por Células Transduzidas

Adicionado a Meio Adicionado a Meio IL-2 (pg/ mL) IL-2 (pg/mL) IL-15 (pg/ mL) IL-15 (pg/mL) IL-7 (pg/ mL) IL-7 (pg/mL) NT Transdu-zidas ccm IL-2 NT Transdu-zidas com IL-15 NT Transdu-zidas com IL-7 Sem 0KT3 Sem Ab 0,0 122,3 0,0 239,9 11,8 4069,9 Sem IgG2a 0,0 188,4 25,5 232,3 6,8 3360,2 65 OKT3 Sem OKT3 Anti- Tac 0,5 191,7 0,0 246,3 6,7 3474,0 Sem OKT3 Meio de Início 0,0 2,7 0,0 0,0 7,2 141,6 + ΟΚΤ3 Sem Ab 1,6 5103,0 0,0 1617,0 7,6 16557,0 + ΟΚΤ3 IgG2a 108,2 5999,0 0,0 2054,0 6,9 16467,0 + ΟΚΤ3 Anti- Tac 116,5 7073,0 0,0 2146,0 6,7 14480,0 + OKT3 Meio de Início 0,0 252,0 0,0 36,0 7,8 152,

Para determinar se as células manipuladas retêm a sua capacidade para reconhecer as células de melanoma ou a proteina gplOO, as células foram cocultivadas com células T2 pulsadas com péptido gplOO ou linhas de células de melanoma que expressam gplOO. A produção por linfócitos T de interferão gama foi medida por ELISA, para determinar a reatividade. A FIG. 3 demonstra que linhas de células de melanoma que expressam gpl00/HLA-A2 foram reconhecidas por células transduzidas. Todas as linhas de células de melanoma 526, 624, 888 e 938 expressam gplOO, mas apenas 526 e 624 expressam HLA-A2. Na FIG. 3, IL-2, IL-7 e IL-15 são linfócitos T transduzidos com as citoquinas, L2D8 é um clone de linfócito T citotóxico anti-gplOO, TCR é um transfetante de controlo e NV é um controlo não transduzido. A FIG. 4 demonstra que todas as populações de células transformadas com polinucleótidos de citoquinas recombinantes retiveram a capacidade para reagir com células T2 pulsadas com proteínas gp 100. Esta reatividade foi medida por produção de interferão gama em resposta ao antigénio. A FIG. 4 também revela que PBLs transduzidos com 66 citoquinas (IL-2, IL-7 e IL-15) produziram mais interferão quando as T2 foram pulsadas com concentrações menores de antigénio gplOO (10 ng/mL, 1 ng/mL) do que PBLs de controlo (TCR, vetor de controlo; NV, sem controlo de vírus).

Em consequência, este exemplo demonstra que a transdução bem-sucedida de PBLs com IL-7 ou IL-15 e que as células transduzidas com citoquina exibiram sobrevivência aumentada in vitro e mantiveram (e chegaram mesmo a aumentar) a sua reatividade com antigénios tumorais. EXEMPLO 8

Este exemplo demonstra a "Expansão REP" de TILs transformados com citoquina para números terapêuticos. TILs transformados com citoquina são expandidos utilizando um único protocolo de expansão rápida (REP), depois são testados novamente quanto à atividade e especificidade de acordo com o protocolo descrito acima no Exemplo 7. Oito dias antes da recolha de células e reinfusão, uma alíquota de células é removida para contagem e novo ensaio. As células são avaliadas quanto à especificidade de péptidos e reconhecimento tumoral por ensaio de coincubação e ELISA, como descrito acima. Se a densidade celular for maior do que 1 x 10s/mL, as células são separadas em balões adicionais ou são transferidas para sacos de cultura Baxter de 3 litros. Depois adiciona-se IL-2 para 1 000 CU/mL, adiciona-se fungizona para 1,25 pg/mL e adiciona-se cipro para 5-10 pg/mL. No dia 11 adiciona-se IL-2 a balões de REP a 1 000 CU/mL. As culturas de células são separadas consoante o necessário. 67

No dia 14, as células são recolhidas e são preparadas para ciclos de REP adicionais ou são crioconservadas. Se as células tiverem crescido atingindo números suficientes para o tratamento de pacientes, uma amostra é recolhida de cada balão para testes de microbiologia 2-3 dias antes do inicio da terapia com TILs (o teste demora 2 dias). IL-2 é novamente adicionada, a 1 000 CU/mL, no dia 14 e a cada 3 dias até o produto final ser preparado para infusão.

No dia 12-20, o produto final é preparado para infusão no paciente. O conteúdo dos balões (células e meio) é transferido para tubos de centrífuga de 250 mL, ao passo que células em sacos de cultura Baxter são recolhidas utilizando um sistema de recolha de células por centrifugação continua Baxter/Fenwal. Aliquotas são recolhidas de sacos representativos e são reunidas para um teste de Gram. As células são submetidas a rotação até serem transformadas em grânulos (1 000 rpm, 15 minutos, cerca de 25° C) e são combinadas num único tubo, depois são lavadas por ressuspensão em 0,9% (p/v) cloreto de sódio, seguida de centrifugação, e finalmente são ressuspensas em 45-400 mL de 0,9% cloreto de sódio. Adiciona-se albumina humana (25% p/v) para uma concentração final de 2,5% (p/v). Removem-se aliquotas para contagem de células e testes de viabilidade por exclusão de azul de tripano, e para testes de controlo de qualidade. O produto final é infundido intravenosamente assim que possível.

Este exemplo demonstra o modo como TILs podem ser preparados e transferidos para um paciente após transformação com um polinucleótido recombinante que codifica uma citoquina que aumenta a sobrevivência de 68 linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunológica. EXEMPLO 9

Este exemplo demonstra a geração de vetores de IL-15 de tipo selvagem e otimizados quanto a codões. A construção de plasmideos de vetores retrovirais foi realizada do modo seguinte: o vetor retroviral pMSGVl, que contém uma LTR do vírus de células estaminais murinas e sinais de processamento de RNA semelhantes à classe MFG de vetores retrovirais, foi utilizado como coluna vertebral vetorial. A construção pormenorizada deste vetor foi recentemente descrita (Hughes et al., Hum Gene Ther 16: 457-472 (2005)) .

Foram construídos dois plasmideos de vetores retrovirais que codificam a IL-15 humana. pMSGVl PPL IL-15, que contém a sequência da IL-15 nativa ligada à sequência líder de pré-prolactina (PPL IL-15) bovina, foi montado por inserção de um fragmento Nco I/BamHI de uma construção de expressão de IL-15 (amavelmente fornecida por Y. Tagaya, National Institutes of Health, Bethesda, MD) (Marks-Konczalik et al., Proc Natl Acad Sei USA 91_: 11445-11450 (2000)) nos sítios Nco I/SnaB I de pMSGVl. Foi sintetizado um gene da IL-15 otimizado quanto a codões no qual foram feitas 63 substituições de codões na região proteica madura da sequência PPL IL-15 (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA). Estas alterações na sequência codificadora minimizaram a utilização de codões raros mantendo uma baixa energia livre, como calculado pelo pacote de RNA Vienna (Hofacker, Nucleic Acids Res 3JL: 3429-3431 (2003)). Este gene 69 sintético foi depois subclonado e inserido nos sítios Nco I/SnaB I de pMSGVl, dando origem a pMSGVl PPL CO IL-15. 0 vetor retroviral de recetores de células T anti-MART-1, designado AIB, foi utilizado para transduções de controlo. Este vetor também emprega a cadeia vertebral de vetor retroviral pMSGVl (Hughes et al., Hum Gene Ther 1_6: 457-472 (2005) ) . A redundância do código genético não é refletida numa distribuição homogénea de tRNAs para certos aminoácidos, conduzindo ao potencial de "codões raros" em qualquer cistrão determinado. A análise da sequência de DNA da proteína IL-15 madura revelou que 29 dos 114 codões (25%) foram utilizados com uma frequência < 20% em genes humanos. Em comparação, o gene da IL-2 contém 20 codões raros numa sequência codificadora que totaliza 133 codões (15%) . Foi concebida uma sequência codificadora de IL-15 alternativa tomando em consideração: 1) a frequência de codões e 2) minimização do dobramento do ácido nucleico, como previsto por cálculos da energia livre. A sequência de ácido nucleico final do gene sintético da IL-15 inclui um total de 63 substituições de codões. Dezanove destes codões alternativos substituem codões nativos com frequências de utilização inferiores a 20%. A sequência de aminoácidos do gene otimizado da IL-15 permanece idêntica à sequência de tipo selvagem (Fig. 5). O transcrito de RNA de tipo selvagem tem uma energia livre prevista de 76 kcal/mol; a molécula otimizada quanto a codões tem uma energia livre prevista de 38 kcal/mol. Este gene sintético foi subclonado no vetor retroviral de IL-15 de tipo selvagem, substituindo a sequência da proteína madura de tipo selvagem e deixando intacta a sequência líder de pré-prolactina bovina. 70 EXEMPLO 10

Este exemplo demonstra que vetores retrovirais de IL-15 de tipo selvagem e otimizada quanto a codões têm expressão comparável em linhas de células transfetadas. A atividade dos vetores pMSGVl PPL IL-15 e pMSGVl PPL CO IL-15 foi testada por transfeção de linhas de células NIH/3T3, TE671 e 293T, em triplicado, com diluições em série de DNA plasmidico dos vetores retrovirais. A transdução retroviral foi efetuada do modo seguinte: Placas de 24 cavidades tratadas com cultura não de tecido (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) foram revestidas com 25 pg/mL de fragmento de fibronectina recombinante (RetroNectin, Takara, Otsu, Japão). Adicionaram-se sobrenadantes de vetores retrovirais e incubaram-se as placas a 32 °C durante 2-4 horas, seguido de armazenamento a 4o C durante a noite. As placas foram aquecidas para a temperatura ambiente, removeu-se sobrenadante e adicionaram-se a cada cavidade 0,1 - 1,0 x 106 células com 1 mL de meio de cultura de tecido por cavidade. As placas foram depois incubadas durante a noite, numa incubadora humidificada com 5% CO2, a 37° C. A produção de citoquina de cada linha celular foi avaliada por ELISA.

Em todas as condições testadas e em cada linha de células, a IL-15 foi produzida em niveis semelhantes por células que receberam o DNA vetorial nativo ou otimizado quanto a codões (Figs. 6-8). EXEMPLO 11 71

Este exemplo demonstra que a otimização de codões não influencia a produção de retrovirus por linhas de células de empacotamento.

Para avaliar se a otimização de codões influencia a produção de retrovirus por linhas de células de empacotamento, células de empacotamento Phoenix Eco foram transfetadas com com pMSGVl PPL IL-15 e pMSGVl PPL CO IL-15. Cinco x 105 células de empacotamento Phoenix Eco foram plaqueadas em cada cavidade de uma placa de cultura de tecido de 6 cavidades. No dia seguinte, as células foram transfetadas com 2 yg de DNA plasmidico de pMSGVl PPL IL-15 ou pMSGVl PPL CO IL-15 utilizando o reagente GenePorter2 (Gene Therapy Systems, San Diego, CA). Vinte e quatro horas depois, o meio foi aspirado e substituído por 2 mL de meio fresco/cavidade. Às 48 horas pós-transfeção recolheu-se o sobrenadante da cultura de células contendo retrovirus. As transfeções foram realizadas em triplicado para cada plasmídeo; assim, 3 preparações separadas de retrovirus foram produzidas a partir de cada plasmideo. A geração de clones de células de empacotamento de titulo elevado foi realizada do modo seguinte: Células de empacotamento Phoenix Eco foram transfetadas com pMSGVl PPL IL-15 ou pMSGVl PPL CO IL-15 utilizando o reagente GenePorter2. O sobrenadante retroviral foi recolhido às 48 horas pós-transfeção e foi transferido para placas de cultura não de tecido revestidas com fibronectina recombinante (Takara). Células PG13 foram então transduzidas nestas placas. Clones foram isolados por cultura com diluição limitante e foram rastreados quanto à produção de IL-15 por ELISA (R&D Systems). Sobrenadantes retrovirais produzidos por estes clones foram então 72 aplicados em placas revestidas com RetroNectina (Takara) e foram utilizados para a transdução de células Sup Tl. Selecionou-se um clone de titulo elevado produzido a partir de pMSGVl PPL CO IL-15 com base na produção de IL-15 por células Sup Tl transduzidas. Depois extraiu-se DNA genómico do clone de PG13 selecionado e efetuou-se uma coloração "Southern" para verificar a integridade vetorial e avaliar o número de integrações. Este clone foi utilizado para a produção de retrovirus para todas as experiências subsequentes onde foram transduzidos linfócitos humanos. 0 retrovirus resultante foi titulado por análise de coloração "Northern" em pontos (Onodera et al.., Hum Gene Ther _8: 1189-1194 (1997)) utilizando uma sonda comum a ambos os vetores. Sobrenadantes retrovirais de células Phoenix Eco transduzidas com o vetor nativo ou otimizado quanto a codões continham quantidades comparáveis de RNA (dados não mostrados). EXEMPLO 12

Este exemplo demonstra a expressão aumentada de IL-15 em células transduzidas com o vetor retroviral otimizado quanto a codões.

Preparações vetoriais retrovirais descritas no exemplo anterior foram utilizadas para a transdução de células NIH/3T3. Utilizaram-se sobrenadantes retrovirais para a transdução de células NIH/3T3, para avaliar a produção de IL-15 em células alvo. Aplicaram-se 400 pL de sobrenadantes retrovirais não diluidos e diluidos em série a placas de 24 cavidades de cultura não de tecido revestidas com fibronectina recombinante, como previamente descrito. Em seguida, 1 x 105 células NIH/3T3 foram transduzidas em cada 73 cavidade das placas revestidas com retrovirus. Às 24 horas pós-transdução, as cavidades foram lavadas três vezes com 2 mL de PBS (Biofluids, Rockville, MD) e depois foram cheias com 2 mL de meio fresco. 0 meio de cultura de células foi recolhido às 72 horas pós-transdução e o teor de IL-15 foi analisado por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Vinte e quatro horas após a transdução, as placas foram lavadas, para eliminar qualquer vestígio de IL-15 que pudesse ser transportado do sobrenadante retroviral. Quarenta e oito horas depois, o meio de cultura de células foi recolhido e avaliado quanto à IL-15 (Fig. 9). As células transduzidas com um retrovirus que codifica GFP não produziram níveis detetáveis de IL-15 (dados não mostrados). 0 meio de cultura de células de NIH/3T3 transduzidas com diluições em série 2 vezes de retrovirus pMSGVl PPL IL-15 continha 436, 205, 98 e 44 pg/mL de IL-15. Em contraste, meio de cultura de células de NIH/3T3 transduzidas com diluições semelhantes de retrovirus pMSGVl PPL CO IL-15 continha 1051, 498, 248 e 135 pg/mL de IL-15, um aumento de aproximadamente 2,5 vezes da produção de IL-15.

Para excluir diferenças nas eficiências de transdução dos vetores retrovirais de IL-15 de tipo selvagem e otimizada quanto a codões, DNA genómico foi isolado e analisado quanto às sequências vetoriais. Utilizando "primers" oligonucleotídicos idênticos realizou-se PCR, e a amplificação específica dos vetores foi normalizada para β-actina coamplifiçada. A amplificação por PCR empregou DNA genómico extraído de lisatos celulares utilizando solução QuickExtract (Epicentre, Madison, WI) . Foram sintetizados "primers" oligonucleotídicos flanqueando o sítio múltiplo 74 de clonagem da coluna vertebral do vetor retrO'vrral pMSGVl: (SEQ ID NO: 7) + (SEQ ID NO: 8). Também foram empregues "primers" oligonucleotídicos para a amplificação de β-actina. Realizou-se PCR durante 30 ciclos a 96° C durante 30 segundos, 60° C durante 30 segundos e 12° C durante 90 segundos num Aparato de Aplicação de Ciclos Térmicos PTC-200 (Global Medicai Instrumentation, Ramsey, MN) . Os produtos de PCR foram processados num gel de agarose 1% e foram subsequentemente submetidos a imagiologia e quantificados com um sistema analisador de imagens luminescentes LAS-1000 (Fujifilm Medicai Systems EUA). Calculou-se a razão da intensidade da banda do inserto vetorial em comparação com a banda correspondente de β-actina para cada uma das amostras de lisatos celulares.

Como mostrado nas Figs. 10 e 11, a transdução com o retrovirus de tipo selvagem ou otimizado quanto a codões conduziu a eficiências comparáveis de transferência genética. EXEMPLO 13

Este exemplo demonstra que a transdução com vetor de 1-15 de PBLs humanos resulta em produção de citoquina dependente da estimulação e persistência das células na ausência de suporte de citoquina exógena. A transdução de PBLs e estudos de remoção de citoquina foram realizados do modo seguinte: Obtiveram-se PBLs, por leucaferese, de pacientes com um historial de melanoma que foram tratados num protocolo de vacina peptídica adjuvante no National Câncer Institute. Os linfócitos foram purificados por centrifugação numa almofada de Ficoll/ 75

Hypaque, foram lavados em HBSS e cultivados em meio consistindo em meio AIM-V (Invitrogen) suplementado com 300 IU/mL de IL-2, 5% soro AB humano (Valley Biomedical, Winchester, Virgínia), 100 U/mL de penicilina (Invitrogen), 100 yg/mL de Estreptomicina (Invitrogen), 2 mM L-glutamina (Invitrogen), 55 μΜ 2-mercaptoetanol e 25 mM solução tampão HEPES (Invitrogen). Linfócitos ativados de modo policlonal foram gerados por adição de 50 ng/mL de OKT3 no dia 0 da cultura. Linfócitos reativos com péptidos foram gerados a partir de PBLs obtidos de pacientes previamente vacinados com o péptido gplOO:209-217 (210M) modificado no residuo de ancoragem (20); estes PBLs foram ativados por adição de 1 yg/mL de gplOO:209-217 (210M) ao meio de cultura de linfócitos, na ausência de IL-2, no dia 0. No dia 1 adicionaram-se às células 300 IU/mL de IL-2. Os linfócitos foram cultivados a 37° C numa incubadora humidificada com 5% CO2. As células ativadas com OKT3 foram transduzidas nos dias 2 e 3 da cultura, ao passo que células estimuladas com péptido foram transduzidas entre os dias 5 e 7 da cultura. Cada cultura foi exposta a retrovirus por um total de duas vezes, em dias sucessivos, por transferência de 0,5 - 1,0 x 106 células, num volume de 1 mL de meio, para cada cavidade de uma placa de cultura não de tecido de 24 cavidades que havia sido sequencialmente revestida com RetroNectina (Takara) e depois retrovirus.

Realizaram-se estudos requerendo a remoção das células de IL-2 exógena por recolha e lavagem de linfócitos três vezes em meio de cultura de linfócitos sem IL-2. Após a lavagem final, o meio foi testado por ELISA de IL-2 e/ou IL-15 (Endogen, Cambridge, MA, e R&D Systems, respetivamente), para verificar que não estava presente nenhuma citoquina residual. As células foram então ressuspensas em meio de 76 cultura de linfócitos sem IL-2, a uma concentração de 1 x 106 células/mL, e regressaram a recipientes de cultura de tecidos. As células foram enumeradas e avaliadas quanto à viabilidade, por exclusão de tripano, a cada 3-7 dias. 0 meio foi refrescado a cada 3-7 dias por remoção de metade do meio gasto e substituição do volume com meio de cultura de linfócitos sem IL-2.

Clones de células de empacotamento retrovirais PG13 contendo o gene da IL-15 foram gerados utilizando pMSGVl PPL CO IL-15. Selecionou-se um clone de células produtoras de titulo elevado com base na sua capacidade para efetuar a transdução de células Sup TI de modo a expressarem IL-15. Uma coloração "Southern" verificou a integridade vetorial e demonstrou 4 sitios de integração vetorial (dados não mostrados). Esta célula de empacotamento de vetor retroviral de IL-15 otimizada quanto a codões foi utilizada para produzir o retrovirus utilizado em todos os estudos subsequentes envolvendo linfócitos humanos transduzidos com IL-15. As eficiências da transdução foram 50-70% após duas transduções sequenciais, como avaliado por PCR semiquantitativa e PCR em tempo real (dados não mostrados).

Um ensaio de produção de IL-15 por linfócitos foi realizado do modo seguinte: Linfócitos de controlo ou transduzidos com IL-15 foram lavados três vezes em meio de cultura. Em seguida, 2 x 105 linfócitos foram ressuspensos em meio de cultura de células sem IL-2 e foram plaqueados em placas de 96 cavidades de fundo redondo. Metade das cavidades foi pré-revestida com anticorpo OKT3 (200 yg/cavidade). Após 3 dias em cultura, os sobrenadantes da cultura de células foram recolhidos para análise por ELISA (R&D Systems). 77 PBLs estimulados com OKT3 de 5 pacientes foram transduzidos com o vetor de IL-15. A produção de citoquinas a partir destas células variou desde 251 até 2095 pg/mL (as células não transduzidas não produziram quantidades detetáveis de IL-15). A estimulação das células com OKT3 ligado às placas resultou num aumento de 2 até 5 vezes da produção de citoquina; entre 1186 e 3957 pg/mL de IL-15 foram produzidos pós-estimulação (Fig. 12). A ativação dependente da estimulação da LTR retroviral está bem descrita (Plavec et al., Gene Ther _4: 128-139 (1997); Auten et al., Hum Gene Ther 1_0: 1389-1399 (1999); Parkman et al., Annu Rev Med 51: 33-47 (2000)) e foi previamente relatada em linfócitos transduzidos de modo retroviral com IL-2 (Liu et al., J Immunother 26: 190-201 (2003)).

Após 7 dias em cultura e 4 dias após a transdução final, os linfócitos foram extensamente lavados, para remover todos os vestigios de citoquinas solúveis, e regressaram à cultura na ausência de citoquina exógena. A viabilidade e contagens de células dos linfócitos não transduzidos diminuiram rapidamente. Pelo dia 30 após a remoção de citoquina não foi possível detetar células não transduzidas. Em contraste, linfócitos transduzidos com IL-15 persistiram uniformemente in vitro durante mais de 60 dias (Fig. 13) . Após 60 dias, a viabilidade de 2 de 5 culturas transduzidas com vetor de IL-15 diminuiu significativamente, ao passo que as restantes 3 culturas persistiram para além de 80 dias na ausência de citoquina adicionada. Numa experiência semelhante, realizada durante um período de tempo mais longo, células transduzidas com IL-15 persistiram in vitro durante 181 dias, ao passo que linfócitos não transduzidos e linfócitos transduzidos com 78 um gene de controlo não foram detetáveis após cultura durante 30 dias na ausência de citoquina exógena (Fig. 14) .

Durante estes estudos, linfócitos de 17 pacientes foram transduzidos com o vetor de IL-15. De modo consistente, culturas de linfócitos transduzidos com IL-15 demonstraram persistência prolongada in vitro após remoção de IL-2 em comparação com culturas de controlo. Em 16 de 17 culturas, linfócitos transduzidos com IL-15 viáveis foram detetados aos 40-181 dias após remoção de citoquina. No entanto, uma das 17 culturas transduzidas com IL-15 exibiu expansão clonal logarítmica durante mais de 365 dias (dados não mostrados); esta linha de células está sob investigação ativa. EXEMPLO 14

Este exemplo demonstra que células T humanas ativadas expressam IL-15Rcx.

Ratinhos deficientes em IL-15 e IL-15Ra manifestam fenótipos semelhantes, exibindo números decrescidos de células CD8+ e uma ausência quase total de células CD8 de memória, sugerindo que o IL-15Roí de alta afinidade é crítico para a função da IL-15 in vivo (Kovanen et al., Immunol Rev 202; 67-83 (2004)). In vitro, níveis suprafisiológicos de citoquina podem recrutar recetores da IL-15 de afinidade intermédia e baixa em linfócitos sem IL-15Ra. Para determinar se o IL-15Roí foi expresso em células T ativadas com OKT3, avaliaram-se linfócitos transduzidos com IL-15, bem como células de controlo não transduzidas, que cresceram em meio contendo IL-2 ou IL-15 (Fig. 15) . O IL-15Ra foi detetado com um anticorpo policlonal biotinilado e anticorpo de controlo biotinilado de isotipo 79 correspondente; o anticorpo ligado à superfície celular foi então etiquetado com estreptavidina-PE (R&D Systems). A PE foi detetada por citometria de fluxo.

Linfócitos não transduzidos, estimulados com 0KT3 e IL-2 no dia 0 da cultura, expressaram IL-15Ra em subconjuntos de CD4+ e CD8+ (86% e 69% positivos em comparação com o controlo do isotipo, respetivamente). Linfócitos não transduzidos estimulados com 0KT3 e crescendo em meio contendo 100 ng/mL de IL-15 não manifestaram coloração de IL-15Rcx, nem linfócitos transduzidos com vetor de IL-15. Assim, IL-15 exógena ou endógena aparentou regular negativamente a expressão do IL-15Ra. EXEMPLO 15

Este exemplo demonstra o fenótipo de linfócitos transduzidos com IL-15.

Subconjuntos de linfócitos T são muitas vezes definidos por expressão na superfície celular de moléculas coestimuladoras, moléculas de adesão e recetores; estas proteínas da superfície celular, por sua vez, são sujeitas a influências, como estimulação via TCR e recrutamento de citoquinas. Para definir adicionalmente a influência da transdução com IL-15 em linfócitos T, avaliaram-se culturas de longa duração de linfócitos transduzidos com IL-15 que cresceram na ausência de citoquina exógena, bem como linfócitos não transduzidos que cresceram em meio contendo IL-2 ou IL-15. A expressão na superfície celular de CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L e CCR7 foi medida utilizando anticorpos conjugados com FITC, PE ou APC e os controlos do isotipo correspondentes (BD Pharmingen, 80

San Diego, CA) . FITC, PE ou APC foi detetado utilizando citometria de fluxo.

Os linfócitos transduzidos com IL-15 demonstraram aumentos modestos na coloração quanto a CD27, CD28 e CD62L relativamente a linfócitos não transduzidos cultivados em IL-2 ou IL-15 (Fig. 16). Isto refletiu-se na percentagem de células exibindo coloração positiva, em comparação com controlos do isotipo, e na intensidade da fluorescência média. Não se observaram diferenças na expressão de CD45RA, CD45RO ou CCR7 (dados não mostrados). EXEMPLO 16

Este exemplo demonstra que PBLs estimulados com OKT3 transduzidos com IL-15 continuam a proliferar na ausência de suporte de citoquina exógena e resistem a apoptose induzida por remoção da citoquina.

Quando PBLs estimulados com OKT3 foram transduzidos com o gene da IL-15, permaneceram viáveis durante períodos de tempo prolongados em cultura, mas o número de células deixou de aumentar. Os mecanismos desta persistência foram analisados avaliando primeiramente a incorporação de timidina. O ensaio de proliferação de linfócitos foi realizado do modo seguinte: Linfócitos foram lavados três vezes com meio de cultura e foram plaqueados, a 1 x 105 células/cavidade, numa microplaca de fundo redondo de 96 cavidades na presença ou ausência de 300 IU/mL de IL-2. As células foram cultivadas durante um período total de quatro dias e, nas 16 horas finais da cultura, adicionou-se a cada cavidade 1 yCi/cavidade de [metil-3H] timidina (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) . DNA celular foi recolhido e contado por contagem de cintilações líquidas. 81

No dia 7 da cultura, linfócitos não transduzidos, transduzidos com vetor de controlo e transduzidos com IL-15 foram lavados para eliminar IL-2, depois foram cultivados na presença ou ausência de IL-2 durante 4 dias. Adicionou-se 3H-timidina durante as 16 horas finais da cultura. A avaliação da incorporação de timidina revelou que as células transduzidas com IL-15 continuaram a proliferar na ausência de citoquina exógena, ao passo que as células não transduzidas ou transduzidas de controlo não o fizeram (Fig. 17) .

Depois avaliou-se se as células transduzidas com IL-15 ficaram protegidas de morte apoptótica por remoção de IL-2. Frações de cultura de PBLs não transduzidos, transduzidos com vetor de controlo e transduzidos com IL-15 foram sequencialmente removidas de IL-2 durante 3 dias consecutivos, começando no dia 7 da cultura. Quatro dias depois, as células foram coradas quanto a 7-AAD/Anexina V e foram analisadas por citometria de fluxo (Fig. 18). A coloração de Anexina V e 7-AAD para a deteção de células apoptóticas foi realizada utilizando o Estojo de Apoptose Anexina V-PE I (BD Pharmingen). A imunofluorescência foi medida utilizando um citómetro de fluxo FACscan e foi analisada utilizando "software" CellQuest Pro (Becton Dickinson).

Populações de células não transduzidas e transduzidas com o gene de controlo demonstraram um aumento de células apoptóticas num periodo de 24 horas após a remoção da citoquina; a percentagem de células sofrendo apoptose (positividade para Anexina V, mas não 7-AAD) atingiu um pico a aproximadamente 14-17%, 48 horas após a remoção da 82 citoquina. As células necróticas, definidas por positividade para 7-AAD, acumularam-se continuamente nestas culturas após remoção de IL-2, e aproximadamente 35% das células nas populações sem suporte de citoquina ficaram necróticas ou sofreram apoptose pelas 72 horas. Em contraste, PBLs transduzidos com IL-15 resistiram à apoptose após remoção de IL-2. Ao longo de 72 horas, a percentagem de células apoptóticas aumentou ligeiramente de 4,3 para 5,7%, ao passo que as células necróticas aumentaram de 3,5 para 6,4%. EXEMPLO 17

Este exemplo demonstra que PBLs transduzidos com IL-15 mantêm expressão de Bcl-2 e Bcl-XL após remoção de IL-2.

Linfócitos CD8 de pacientes com HIV demonstram niveis decrescidos de proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL, que podem ser invertidos por exposição a IL-15 (27). Uma vez que linfócitos transduzidos com IL-15 resistem à apoptose após remoção da citoquina, linfócitos CD4 e CD8 foram avaliados quanto à expressão de Bcl-2 e Bcl-XL (Figs. 19 e 20) . As proteínas intracelulares Bcl-2 e Bcl-XL foram detetadas utilizando anticorpos conjugados com FITC e PE e os seus controlos do isotipo respetivos (BD Pharmingen e Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) . As células foram lavadas duas vezes em tampão de coloração, composto por PBS com 0,5% BSA, e foram coradas com anticorpos da superfície celular ou controlos do isotipo correspondentes, seguido de incubação no escuro durante 20 m a 4o C. Em seguida, as células foram lavadas mais duas vezes com tampão de coloração antes da análise. Efetuou-se coloração intracelular fixando e permeabilizando as células com solução Cytofix/Cytoperm (BD Pharmingen), duas lavagens 83 em tampão Perm/Wash (BD Pharmingen), coloração com anticorpos intracelulares ou controlos do isotipo, e duas lavagens adicionais antes da análise.

Os niveis de Bcl-2 e Bcl-XL foram regulados negativamente em células não transduzidas e transduzidas de controlo aos 2 dias pós-remoção da citoquina. Em contraste, a expressão destas proteínas foi mantida em linfócitos CD4 e CD8 transduzidos com IL-15 após remoção de IL-2; Bcl-XL não demonstrou nenhum decréscimo da expressão, ao passo que Bcl-2 exibiu um decréscimo modesto da expressão (18% e 16% de decréscimo em células CD4 e CD8 transduzidas com IL-15 versus 47-48% e 53-54% de decréscimo em culturas de CD4 e CD8 de controlo). EXEMPLO 18

Este exemplo demonstra que o reconhecimento de péptidos específicos por linfócitos transduzidos com IL-15 é mantido após remoção de IL-2.

Para avaliar adicionalmente a função de linfócitos transduzidos com IL-15, culturas de linfócitos estimulados com péptidos com reatividade para o antigénio de melanoma gplOO foram geradas e subsequentemente transduzidas com o vetor de IL-15 otimizado quanto a codões. Linfócitos não transduzidos e transduzidos com IL-15 exibiram padrões idênticos de coloração com o tetrâmero gplOO, com 50-80% de células CD8 corando positivamente após uma ronda de estimulação peptídica (dados não mostrados) . Subsequentemente realizaram-se experiências de cocultura utilizando como estimuladores células T2 pulsadas com péptido. O ensaio de reatividade de linfócitos - antigénio foi realizado do modo seguinte: Prepararam-se células alvo 84 pulsando células T2 com 10-1000 ng/mL de péptido em meio de cultura de células durante 2 horas a 37° C. Utilizaram-se os seguintes péptidos restringidos a HLA-A2: péptido de influenza (GILGFVFTL) (SEQ ID NO: 9), péptido MART-1:27-35 ou gplOO:209-217 nativo. Foram cocultivadas 1 x 105 células efetoras (PBLs) com 1 x 105 células alvo (T2 pulsadas com péptido) num volume final de 0,2 mL em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades de fundo redondo. Vinte e quatro horas depois, sobrenadantes da cultura celular foram recolhidos e avaliados guanto à produção de interferão γ por ELISA (Endogen).

Quantidades comparáveis de IFN-γ foram libertadas por linfócitos de controlo e transduzidos com IL-15 por exposição a células T2 pulsadas com diluições em série do péptido gplOO (Fig. 21) . A reatividade especifica para péptidos foi demonstrada por secreção de IFN-γ por cultura de linfócitos de controlo e transduzidos com IL-15 com células T2 pulsadas com gplOO, mas não com o péptido de influenza restringido a HLA-A2 (Flu). A reatividade para o péptido MART só foi observada na cultura transduzida com o recetor de células T MART (Fig. 22). Quando as culturas de linfócitos foram retiradas de IL-2, a viabilidade e número das culturas de controlo (não transduzidas e transduzidas com TCR MART) diminuíram, ao passo que linfócitos transduzidos com IL-15 permaneceram viáveis; isto foi semelhante ao padrão previamente demonstrado em linfócitos ativados com OKT3 (dados não mostrados) . Cinco dias após a remoção de IL-2, as células foram novamente testadas quanto à reatividade para péptidos contra células alvo pulsadas T2; as culturas de controlo demonstraram secreção diminuída de IFN-γ por encontro com T2 pulsadas com gplOO, ao passo 85 que células transduzidas com IL-15 mantiveram um nível elevado de secreção específica de IFN-γ (Fig. 23). EXEMPLO 19

Este exemplo demonstra a capacidade dos TILs transduzidos para proliferarem por estimulação com células dendríticas alogeneicas (alo-DC). Põe-se a hipótese de que a estimulação de TILs com células alo-DC será intensificada nas células transduzidas com citoquinas de cadeias gama comuns. Além disso, as células dendríticas são capazes de capturar IL-15 via o IL-15Rcx e apresentá-lo em trans a células T (que não expressam o IL-15Ra). DCs alogeneicas foram geradas e cocultivadas com os TILs durante 4 dias na ausência de IL-2 exógena. Adicionou-se 3H-timidina à cultura nas últimas 18 horas da cultura. As células transduzidas com IL-15 exibiram a maior capacidade de proliferação (Figura 26). IL-2 também exibiu capacidade de proliferação por estimulação com DCs alogeneicas.

Este exemplo demonstrou a capacidade de proliferação de células que expressam IL-2, IL-7 e IL-15 na ausência de citoquina exógena. EXEMPLO 20

Este exemplo demonstra que PBLs transduzidos exibem sobrevivência aumentada na ausência de citoquina exógena no meio de cultura. PBLs isolados do Paciente JS foram estimulados com 0KT3 e depois foram transduzidos com vetores retrovirais que 86 codificam IL-2, IL-7 ou IL-15. As células foram então cultivadas na ausência de citoquina exógena durante um periodo até 40 dias. Como mostrado na Figura 27, as células transduzidas com IL-2, IL-7 ou IL-15 exibiram sobrevivência para além dos 35 dias, ao passo que células não transduzidas não sobreviveram para além de 20 dias.

Este exemplo demonstrou que células transduzidas com vetores que codificam IL-2, IL-7 ou IL-15 têm sobrevivência aumentada na ausência de citoquina exógena e resistem à apoptose induzida por remoção de IL-2. EXEMPLO 21

Este exemplo demonstra a capacidade de proliferação de PBLs transduzidos com vetores retrovirais de IL-2, IL-7 ou IL- 15. PBLs transduzidos com vetores retrovirais que codificam IL-2, IL-7 ou IL-15 foram cocultivados durante 3 dias com DCs alogeneicas e foram pulsados com 3H-timidina nas últimas 18 horas da cultura. Como mostrado na Figura 29, os PBLs transduzidos exibiram capacidade de proliferação em resposta à estimulação com DCs alogeneicas, na ausência de citoquina exógena, ao passo que células não transduzidas demonstraram muito pouca, se alguma, capacidade de proliferação nas mesmas condições. No entanto, as células não transduzidas foram capazes de proliferar na presença de IL-2, IL-7 ou IL-15 exógena no meio (Figura 28).

Este exemplo demonstrou a capacidade de proliferação de PBLs transduzidos com IL-7 ou IL-15 na ausência de citoquina exógena. 87 EXEMPLO 22

Este exemplo demonstra um método de construção de um vetor que codifica a IL-15 e que compreende um gene suicida e um método de teste da expressão de cada gene.

Oito construções retrovirais compreendendo o gene da IL-15 otimizado quanto a codões ou de tipo selvagem e o gene da timidina quinase (TK) do virus Herpes Simplex (HSV) otimizado quanto a codões ou de tipo selvagem foram construídas na coluna vertebral de pMSGV: pMSGV-wtHSVtk-IRES-CO IL15, pMSGV-wtHSVtk-PGK-CO IL15, pMSGV-wtIL15-PGK-wtHSVtk, pMSGVl-C0-IL-15-IRES-CO-HSV-TK, pMSGVl-wtIL15-IRES-wtHSVtk, pMSGVlppl-CO IL15-IRES-wtHSVtk, pMSGVlppl-CO IL15-PGK-C0-HSV TK e pMSGVlppl-CO ILl5-PGK-wtHSVtk. Especificamente, a IL-15 de tipo selvagem ou otimizada quanto a codões foi modificada pela inserção de genes HSV-TK de tipo selvagem ou otimizados quanto a codões quando a expressão do HSV-TK é mediada por um elemento IRES ou utilizando o promotor de PGK. A estrutura dos vetores é indicada pelo nome do vetor. Por exemplo, o vetor pMSGV-wtHSVtk-IRES-CO IL15 tem o gene HSV-TK de tipo selvagem precedendo o elemento IRES, que precede o gene da IL-15 otimizado quanto a codões.

Para determinar se IL-15 e HSV-TK podem ser expressos em células transduzidas com os vetores, células de empacotamento retrovirais Phoenix Eco são transfetadas com os oito vetores diferentes com genes suicidas (e vetores de IL-15 sem o HSV-TK). O sobrenadante retroviral é aplicado em placas revestidas com Retronectina, que então são utilizadas para a transdução de células NIH/3T3. As células também são transduzidas com o vetor retroviral de GFP (MSGIN) como controlo.

No Dia 0, células NIH/3T3 foram plaqueadas com diluições em série de ganciclovir (GCV) (0, 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 e 10 μΜ) . No Dia 1, o meio destas culturas de células foi substituído. No Dia 2, sobrenadantes das culturas de células foram recolhidos e testados por ELISA quanto a IL-15. Também se determinaram os números de células vivas por exclusão de azul de tripano. As contagens de células diminuíram com doses crescentes de GCV para todas as células transduzidas com um vetor que codifica HSV-TK otimizado quanto a codões ou de tipo selvagem, ao passo que as contagens de células transduzidas com vetores de controlo, MSGIN, wtIL-15 e CO-IL-15, não diminuíram de um modo dependente da dose de GCV. Além disso, as quantidades de IL-15 diminuíram, de um modo dependente da dose de GCV, em culturas de células transduzidas com vetores que codificam HSV-TK de tipo selvagem ou otimizado quanto a codões e IL-15 de tipo selvagem ou otimizada quanto a codões, ao passo que nenhuma IL-15 foi produzida por células transduzidas com o vetor de controlo MSGIN, e as quantidades de IL-15 não diminuíram, de um modo dependente da dose de GCV, para células transduzidas com um vetor desprovido do gene de HSV-TK.

Para determinar se os vetores de IL-15/TK podem ser expressos por linfócitos T, PBLs são estimulados com OKT3 e são cultivados em meio contendo IL-2. Nos dias 2 e 3 da cultura, as células são transduzidas em placas de Retronectina pré-revestidas com sobrenadantes retrovirais. O sobrenadante do vetor de IL-15 é diluído 1:4 e utilizado como condição de controlo. No dia 6 da cultura realiza-se um ensaio de produção de citoquina durante 3 dias, em que a produção de citoquina é avaliada por ELISA. 89

Deve considerar-se que a utilização dos termos "um" e "uma" e "o" e "a" e referentes semelhantes, no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações seguintes), abrange o singular e o plural, a menos que indicado aqui em contrário ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser considerados termos abertos (isto é, significando "incluindo mas não limitado a"), a menos que notado em contrário. É pretendido que a recitação aqui de intervalos de valores sirva meramente de método abreviado de referência individual a cada valor separado dentro do intervalo, a menos que indicado aqui em contrário, e cada valor separado é incorporado na especificação tal como se fosse individualmente recitado aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado aqui em contrário ou a menos que claramente contradito pelo contexto. É pretendido que a utilização de quaisquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como"), proporcionados aqui sirva meramente para iluminar melhor a invenção e não imponha uma limitação ao âmbito da invenção, a menos que reivindicado em contrário. Nenhuma linguagem utilizada na especificação deve ser considerada indicadora de que qualquer elemento não reivindicado é essencial para a prática da invenção.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> GOVERNO DOS ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA, REPRESENTADO PELO SECRETÁRIO, DEPARTAMENTO DE SAÚDE E SERVIÇOS HUMANOS 90

<120> IMUNOTERAPIA ADOTIVA COM SOBREVIVÊNCIA AUMENTADA DE LINFÓCITOS T <130> 238474 <150> 60/617,340 <151> 2004-10-08 <150> 60/617,768 <151> 2004-10-12 <160> 10 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 lu &1y €ys

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Lisboa, 30 de Abril de 2012

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Linfócito T isolado que expressa pelo menos um polinucleótido recombinante que codifica uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração de uma resposta imunológica, em que 0 polinucleótido recombinante compreende uma sequência codificadora não nativa e otimizada quanto a codões que codifica a citoquina, e em que a citoquina é IL-15 e a sequência codificadora compreende a SEQ ID NO: 4.

2. Linfócito T isolado da reivindicação 1, em que o linfócito T sobrevive in vitro na ausência de uma citoquina exógena durante pelo menos 40 dias.

3. Linfócito T isolado da reivindicação 1, em que o linfócito T sobrevive in vitro na ausência de uma citoquina exógena durante pelo menos 180 dias.

4. Linfócito T isolado de qualquer uma das reivindicações 1 até 3, em que o linfócito T prolifera in vitro na ausência de uma citoquina exógena.

5. Linfócito T isolado de qualquer uma das reivindicações 1 até 4, em que o linfócito T resiste à apoptose induzida por remoção de IL-2 in vitro na ausência de uma citoquina exógena.

6. Linfócito T isolado de qualquer uma das reivindicações 1 até 5, em que o linfócito T reconhece um antigénio in vitro na ausência de uma citoquina exógena. 2

7. Linfócito T isolado da reivindicação 1, em que o linfócito T expressa um primeiro polinucleótido recombinante e um segundo polinucleótido recombinante, em que o primeiro polinucleótido recombinante codifica a IL-15, e em que o segundo polinucleótido recombinante codifica a IL-7.

8. Linfócito T isolado de qualquer uma das reivindicações 1 até 7, em que a sequência codificadora não nativa tem 50% ou menos da energia livre prevista da sequência codificadora nativa.

9. Linfócito T isolado de qualquer uma das reivindicações 1 até 8, em que o polinucleótido recombinante, o primeiro polinucleótido recombinante ou o segundo polinucleótido recombinante compreende um gene suicida.

10. Linfócito T isolado da reivindicação 9, em que o gene suicida é o gene da timidina quinase (TK) do Virus Herpes Simplex (HSV).

11. Linfócito T isolado de qualquer uma das reivindicações 1 até 10, em que o linfócito T é um linfócito de infiltração em tumores (TIL).

12. Linfócito T isolado de qualquer uma das reivindicações 1 até 11, em que o linfócito T é um linfócito T humano. 3

13. Linfócito T isolado de qualquer uma das reivindicações 1 até 12, em que o linfócito T compreende um recetor especifico para um antigénio de um estado clinico.

14. Linfócito T isolado da reivindicação 13, em que o recetor é um recetor de células T (TCR) endógeno.

15. Linfócito T isolado da reivindicação 13, em que o recetor é um recetor quimérico recombinante.

16. Linfócito T isolado de qualquer uma das reivindicações 13 até 15, em que o estado clinico é cancro.

17. Linfócito T isolado da reivindicação 16, em que o cancro é melanoma.

18. População isolada de células compreendendo o linfócito T de qualquer uma das reivindicações 1 até 17.

19. Composição farmacêutica compreendendo o linfócito T de qualquer uma das reivindicações 1 até 17, ou a população de células da reivindicação 18, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

20. Utilização do linfócito T isolado de qualquer uma das reivindicações 1 até 17, ou da população de células da reivindicação 18, na preparação de um medicamento destinado ao tratamento de um estado clinico num mamífero, em que o estado clínico é selecionado do grupo que consiste num cancro, uma doença infeciosa, uma doença autoimune e uma imunodeficiência. 4

21. Utilização da composição farmacêutica da reivindicação 19 na preparação de um medicamento destinado ao tratamento de um estado clinico num mamífero, em que o estado clínico é selecionado do grupo que consiste num cancro, uma doença infeciosa, uma doença autoimune e uma imunodeficiência.

22. Utilização da reivindicação 20 ou 21, em que o linfócito T é autólogo ao mamífero.

23. Utilização de qualquer uma das reivindicações 20 até 22, em que IL-2 é administrada ao mamífero após a administração do medicamento.

24. Utilização de qualquer uma das reivindicações 20 até 23, em que quimioterapia não mieloablativa é administrada ao mamífero antes da administração do medicamento.

25. Utilização de qualquer uma das reivindicações 20 até 24, em que o mamífero é imunizado com um antigénio da doença antes da administração do medicamento.

26. Utilização de qualquer uma das reivindicações 20 até 25, em que o linfócito T é expandido in vitro antes da administração do medicamento.

27. Composição compreendendo linfócitos T transformados e expressando pelo menos um polinucleótido recombinante que codifica uma citoquina que aumenta a sobrevivência de linfócitos T durante a fase de contração da resposta imunológica, em que o polinucleótido recombinante compreende uma sequência codificadora não 5 nativa e otimizada quanto a codões que codifica a citoquina, e em que a citoquina é IL-15 e a sequência codificadora compreende a SEQ ID NO: 4.

28. Linfócito T isolado de qualquer uma das reivindicações 1 até 17, população de células da reivindicação 18 ou composição farmacêutica da reivindicação 19 para utilização no tratamento de um estado clinico num mamifero, em que o estado clinico é selecionado do grupo que consiste num cancro, uma doença infeciosa, uma doença autoimune e uma imunodeficiência.

29. Linfócito T isolado, população de células ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 28, em que o linfócito T é autólogo ao mamifero.

30. Linfócito T isolado, população de células ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que IL-2 deve ser administrada ao mamifero após a administração do linfócito T isolado, da população de células ou da composição farmacêutica.

31. Linfócito T isolado, população de células ou composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 até 30, em que quimioterapia não mieloablativa é administrada ao mamifero antes da administração do linfócito T isolado, da população de células ou da composição farmacêutica. 6

32. Linfócito T isolado, população de células ou composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 até 31, em que o mamífero é imunizado com um antigénio da doença antes da administração do medicamento.

33. Linfócito T isolado, população de células ou composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 até 32, em que o linfócito T deve ser expandido in vitro antes da administração do linfócito T isolado, da população de células ou da composição farmacêutica. Lisboa, 30 de Abril de 2012