PT1727817E

PT1727817E - Derivados de azabiciclooctan-3-ona e seu uso

Info

Publication number: PT1727817E
Application number: PT05722253T
Authority: PT
Inventors: Jacob Westman; Klas Wiman; Galina Selivanova; Vladimir Bykov
Original assignee: Aprea Ab
Priority date: 2004-03-22
Filing date: 2005-03-22
Publication date: 2010-10-26
Also published as: DE602005023840D1; WO2005090341A1; JP2007530534A; AU2005223728A1; CA2552855A1; DK1727817T3; CY1111256T1; CA2552855C; JP4904561B2; ATE482955T1; US7759361B2; AU2005223728B2; EP1727817B1; US20070142370A1; SE0400708D0; PL1727817T3; EP1727817A1; SI1727817T1; ES2349471T3

Description

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DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE AZABICICLOOCTAN—3—ONA E SEU USO" Âmbito da invenção A presente invenção relaciona-se com derivados de azabiciclooctan-3-ona e com o seu uso em tratamentos. Mais particularmente, a presente invenção relaciona-se com derivados de azabiciclooctan-3-ona para o tratamento de distúrbios e doenças tais como, por exemplo cancro, doenças autoimunes e doenças cardiacas.

Antecedentes da invenção 0 alvo mais comum para mutações em tumores é o gene p53. 0 facto de cerca de metade de todos os tumores humanos terem mutações neste gene é testemunho sólido do seu papel critico como supressor de tumores. 0 p53 pára o ciclo da célula e/ou desencadeia a apoptose em resposta a vários estímulos de stress, incluindo danos no DNA, hipóxia, e activação de oncogenes (Ko e Prives, 1996; Sherr, 1998). Após activação, o p53 inicia as respostas biológicas dependentes de p53 através de transactivação transcricional de genes alvo específicos que possuem motivos de ligação de DNA a p53. Adicionalmente, a proteína p53 multifacetada pode promover a apoptose através da repressão de certos genes sem sítios de ligação de p53 e também por mecanismos independentes da transcrição (Bennett et al., 1998;

Gottlieb e Oren, 1998; Ko e Prives, 1996). Análises de um grande número de genes p53 mutantes em tumores humanos revelaram uma forte selecção para mutações que inactivam a função específica do p53 de ligação ao DNA; a maioria das mutações em tumores são mutações pontuais agrupadas no domínio central do p53 (resíduos 94-292) que contém a 2 actividade específica de ligação ao DNA (Béroud e Soussi, 1998) .

Tanto a paragem do ciclo celular induzida pelo p53 como a apoptose podem estar envolvidas na supressão de tumores mediada por p53. Enquanto que a paragem do ciclo celular induzida por p53 pode presumivelmente ser invertida de diferentes formas, a morte celular induzida por p53 terá a vantagem em ser irreversível. Há, de facto, evidência proveniente de modelos animais in vivo (Symonds et al., 1994) e de tumores humanos (Bardeesy et al., 1995) indicando que a apoptose dependente de p53 desempenha um papel muito importante na eliminação de tumores emergentes, particularmente em resposta a sinalização oncogénica. Além disso, a capacidade do p53 para induzir apoptose determina frequentemente a eficácia da terapia do cancro (Lowe et al., 1994). Tendo em conta o facto de que mais de 50% dos tumores humanos possuem mutações do p53, parece altamente desejável restaurar a função de supressão do crescimento mediado pelo p53 de tipo selvagem em tumores. A vantagem desta abordagem é que ela permite a eliminação selectiva das células tumorais, que possuem o p53 mutante. As células tumorais são particularmente sensíveis à reactivação do p53, supostamente por duas razões principais. Primeiro, as células tumorais são sensibilizadas à apoptose devido à activação de oncogenes (revisto em (Evan e Littlewood, 1998)). Segundo, as proteínas de p53 mutantes tendem a acumular-se em níveis elevados nas células tumorais. Portanto, a restauração da função do tipo selvagem no abundante e presumivelmente "activado" p53 mutante deve desencadear uma resposta apoptótica em grande escala nas células tumorais já sensibilizadas, enquanto que as células normais que expressam níveis baixos ou indetectáveis de p53 não devem ser afectadas. A viabilidade da reactivação do 3 p53 como uma estratégia anti-cancro é suportada pelo facto de uma vasta gama de proteínas p53 mutantes serem susceptíveis à reactivação. Uma estratégia terapêutica baseada em recuperar a apoptose induzida por p53 deve portanto ser poderosa e amplamente aplicável.

Pode ser demonstrado que o mau funcionamento da via do p53 está geralmente envolvido em várias doenças, tais como as aqui enumeradas acima. De facto, para além das doenças hiperproliferativas, tais como cancro, vários autores demonstraram o envolvimento do p53 deficiente a actuar em vários outros estados de doença, e.g. doenças autoimunes e doenças cardíacas.

Assim, num artigo de Mountz et al. (1994) é referido que as doenças autoimunes humanas partilham a característica comum de um desequilíbrio entre a produção e destruição de vários tipos de células incluindo linfócitos (SLE), células sinoviais (RA), e fibroblastos (escleroderma). Os oncogenes, incluindo bcl-2, p53, e myc, que regulam a apoptose são também expressos anormalmente. De acordo com os autores, as terapias específicas que induzem a apoptose sem provocar efeitos secundários deveriam melhorar o tratamento da doença autoimune.

Bonafe M et al. (2004) apresenta dados sugerindo que o polimorfismo no codão 72 do p53 contribui para uma variabilidade determinada geneticamente da susceptibilidade à apoptose em pessoas idosas, a qual tem um papel potencialmente relevante no contexto de condições patológicas relacionadas com a idade, tal como isquémia miocárdica.

Okuda et al. (2003) apresentam resultados sugerindo que o p53 pode estar envolvido no processo de regulação da 4 encefalomielite autoimune experimental (EAE) através do controlo da produção de citocina e/ou da eliminação apoptótica de células inflamatórias. A EAE como modelo para doenças inflamatórias autoimunes do sistema nervoso central (SNC) é um modelo amplamente usado para a doença da esclerose múltipla humana.

Tomadas em conjunto, estas duas conclusões sugerem que a restauração farmacológica da função do p53 deveria ser benéfica em vários distúrbios e doenças.

Os presentes inventores verificaram que o composto PRIMA-1 (i.e. 2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo [2.2.2] octan-3-ona) (divulgado na WO 02/24692), é capaz de induzir a apoptose de células que possuem o p53 mutante. Depois também encontraram alguns análogos do Prima-1 que apresentaram resultados semelhantes (divulgado na WO 03/070250). Para além disso, a WO 04/084893 divulga o uso de alguns derivados de azabiciclooctan-3-ona, e.g. PRIMA-1, para a preparação de um medicamento para uso no tratamento de melanoma maligno e/ou de uma condição patológica envolvendo angiogénese indesejada. Não obstante, permanece ainda uma necessidade geral de compostos com actividade no tratamento de distúrbios e doenças relacionados com o mau funcionamento do p53. Preferivelmente, esses compostos devem ter melhores farmacocinética e propriedades farmacodinâmicas. Um dos principais objectivos da presente invenção é fornecer esses compostos. O composto 2-(hidroximetil)-2-(metoximetil)quinuclidina-3-ona é divulgado em Nielsen et al., J. Org. Chem. 31, 1053-1057(1966), mas não é mencionado nenhum uso médico seu no referido artigo. 5

Os presentes inventores surpreendentemente encontraram vários derivados de azabiciclooctan-3-ona evidenciando elevada actividade no tratamento de distúrbios e doenças relacionados com o mau funcionamento do p53. Não só demonstraram grande potência, mas acredita-se também terem propriedades ADME muito favoráveis devido ao seu alto valor de cLogP gue permitirá um elevado consumo celular. Muitos dos análogos podem também ser considerados como pró-fármacos do Prima-1.

Os derivados de azabiciclooctan-3-ona da invenção são considerados potencialmente úteis no tratamento de doenças hiperproliferativas, doenças autoimunes e doenças cardíacas e especialmente no tratamento de distúrbios em que o mau funcionamento da via do p53 pode estar envolvido, e esta descoberta forma a base da presente invenção. Para além disso, acredita-se que os compostos na presente invenção têm efeitos adicionais que são positivos para o tratamento dos distúrbios acima mencionados, tal como será melhor discutido aqui a seguir.

Foram descritas anteriormente 3-quinuclidinonas 2-substituídas no contexto biológico mas não nas áreas terapêuticas acima mencionadas. Assim, as 2-[iV'-(0-alcoxifenil) piperazinometil]-3-quinuclinidonas (Biel et al. patente US No. 3,598,825) foram descritas como depressoras do sistema nervoso e as 2-metileno 3-quinuclinidonas amino-substituídas foram descritas como agentes antibacterianos (Elkin et al. Patente US No. 3,726,877) e agentes antidepressivos (Biel et al. patente US No. 3,462,442).

Biel et al., na patente US No. 3,384,641, descrevem um método em que a 2-metileno-3-quinuclidinona é reagida com 6 aminas para formar intermediários que, após aquecimento, podem libertar as aminas. Os intermediários são portanto usados para purificação das aminas.

Resumo da invenção

De acordo com um aspecto, a presente invenção relaciona-se com o uso de um composto seleccionado a partir de

0— 2-(hidroximetil)-2-(metoximetil)quinuclidin-3-ona;

\

O

acetato de [2-(metoximetil)-3-oxo-l-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo;

ciclopentanocarboxilato de [2-(metoximetil]-3-oxo-l- azabiciclo [2.2.2]oct-2-il]metilo; e

2-metilpropanoato de {2-[(isobutiriloxi)metil]-3-oxo-l-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il}metilo; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para preparar um medicamento para o tratamento de um distúrbio seleccionado 7 a partir de doenças hiperproliferativas, doenças autoimunes, e doenças cardíacas.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso dos compostos da invenção ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis para o tratamento de doenças associadas ao p53 mutante ou, mais geralmente, ao mau funcionamento da via de sinalização do p53.

De acordo com outro aspecto, a invenção fornece os compostos acima mencionados para uso no tratamento de uma doença seleccionada a partir de doenças hiperproliferativas, doenças autoimunes, e doenças cardíacas.

De acordo com um aspecto adicional, a invenção relaciona-se com um composto seleccionado a partir de

acetato de [2-(metoximetil)-3-oxo-l-azabiciclo[2.2.2] oct-2-il]metilo;

0

ciclopentanocarboxilato de [2—(metoximetil)-3-oxo-l-azabiciclo [2,2,2]oct-2-il]metilo; e 2-metilpropanoato de {2-[ (isobutiriloxi) metil]-3-oxo-l- azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

De acordo ainda com um aspecto adicional, a invenção fornece novas composições farmacêuticas compreendendo os referidos compostos, ou seus sais.

Quaisquer aspectos adicionais são como definido nas reivindicações.

Breve descrição do desenho A Figura 1 representa os resultados das análises por FACS de um composto da invenção.

Descrição detalhada da invenção

Conforme aqui usado, o termo "alquilo menor" a menos que indicado de outro modo, significa um radical hidrocarbilo (alquenilo ou alquinilo) ramificado ou não ramificado, cíclico, saturado ou insaturado. Quando cíclico, o grupo alquilo é preferencialmente C3 a C12, mais preferencialmente C5 a CIO, o mais preferencialmente C5-C7. Quando acíclico, o grupo alquilo é preferencialmente Cl a CIO, mais preferencialmente Cl a C6, o mais preferencialmente metilo, etilo, propilo (n-propilo, isopropilo), butilo (ramificado ou não ramificado) ou pentilo, o mais preferencialmente metilo. 9

Conforme aqui usado, o termo "arilo" significa um grupo aromático, tal como fenilo ou naftilo. Conforme aqui usado, o termo "grupos funcionais" significa no caso de não protegido: hidroxi-, tiolo-, função amina, ácido carboxilico e no caso de protegido: alcoxi menor, N-, 0-, S- acetilo, éster de ácido carboxilico.

Conforme aqui usado, o termo "heteroarilo" significa um grupo heteroaromático mono-, bi-, ou triciclico contendo um ou mais heteroátomos seleccionados preferencialmente a partir de N, 0 e S, tais como piridilo, pirrolilo, quinolinilo, furanilo, tienilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, oxazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, imidazolilo, pirimidinilo, indolilo, pirazinilo, indazolilo, pirimidinilo, tiofenetilo, piranilo, carbazolilo, acridinilo, quinolinilo, benzimidazolilo, benzotiazolilo, purinilo, cinolinilo e pteridinilo.

Conforme aqui usado, o termo "heterociclo não aromático" significa um grupo cíclico não aromático contendo um ou mais heteroátomos preferencialmente seleccionados a partir de N, 0 e S, tais como um pirrolidinilo, piperidilo, piperazinilo, morfolinilo, tetrahidrofuranilo ou monossacárido.

Conforme aqui usado, o termo "halogénio" significa um flúor, cloro, bromo ou iodo.

Conforme aqui usado, e a menos que especificado de outro modo, o termo "substituído" significa que os grupos de interesse são substituídos por pelo menos um grupo funcional, tal como hidroxilo, amina, sulfureto, sililo, ácido carboxilico, halogénio, arilo, etc. 10

Os compostos da invenção serão úteis para tratar várias doenças tais como doenças hiperproliferativas, e.g. cancro, doenças autoimunes, tais como artrite reumatóide e Sindrome de Sjogren, e doenças cardíacas tais como cardiomiopatia idiopática hereditária. O tratamento pode ser preventivo, paliativo ou curativo.

Exemplos de sais de adição farmaceuticamente aceitáveis para uso em composições farmacêuticas da presente invenção incluem os derivados de ácidos minerais, tais como ácidos clorídrico, hidrobrómico, fosfórico, metafosfórico, nítrico e sulfúrico, e ácidos orgânicos, tais como ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzóico, glicólico, glucónico, succínico, e arilsulfónico. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis aqui descritos, por exemplo, veículos, adjuvantes, transportadores ou diluentes, são bem conhecidos dos especialistas na técnica e estão facilmente disponíveis para o público. O transportador farmaceuticamente aceitável pode ser um que seja quimicamente inerte para os compostos activos e que não tenha quaisquer efeitos secundários prejudiciais ou toxicidade nas condições de uso. Formulações farmacêuticas são encontradas e.g. em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed., Mack Printing Company, Easton, Pensilvânia (1995). A composição de acordo com a invenção pode ser preparada para qualquer via de administração, e.g. oral, intravenosa, cutânea ou subcutânea, nasal, intramuscular, ou intraperitoneal. A natureza exacta do transportador ou outro material vai depender da via de administração. Para administração parentérica, é empregue uma solução aquosa parentericamente aceitável, a qual não tem pirogénios e tem o pH, isotonicidade e estabilidade requeridos. Os especialistas na técnica são bem capazes de preparar 11 soluções adequadas e vários métodos estão descritos na literatura. Uma breve revisão de métodos de aplicação de fármacos é também encontrada em e.g. Langer, Science 249: 1527-1533 (1990) . A dose administrada a um mamífero, particularmente a um humano, no contexto da presente invenção deve ser suficiente para produzir uma resposta terapêutica num mamífero ao longo de um intervalo de tempo razoável. Um especialista na técnica vai reconhecer que a dosagem dependerá de uma variedade de factores incluindo da potência do composto específico, da idade, da condição e do peso corporal do doente, assim como do estado/gravidade da doença. A dose será também determinada pela via (forma de administração) horário e frequência de administração. No caso de administração oral, a dosagem pode variar desde cerca de 0,01 mg até cerca de 1000 mg por dia de um composto da invenção ou da quantidade correspondente de um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Os compostos da presente invenção podem ser usados ou administrados em combinação com um ou mais fármacos adicionais úteis no tratamento de doenças hiperproliferativas. Os componentes podem estar na mesma formulação ou em formulações separadas para administração simultânea ou sequencial. Os compostos da presente invenção podem também ser usados ou administrados em combinação com outro tratamento tal como irradiação para tratamento de cancro.

Nos seus estudos dos compostos da invenção, os presentes inventores encontraram um metabolito comum a muitos dos compostos da invenção nomeadamente quinuclidinona de metileno. Os inventores mostraram que este metabolito é 12 capaz de formar conjugados com glutationa (GSH) (Esquema de Reacção 1). 12

GSH

SG

Esquema de Reacçao 1

Embora não pretendam ser limitados por nenhuma teoria, os inventores acreditam que os compostos da presente invenção podem melhorar sinergisticamente o efeito de mais compostos farmaceuticamente activos que são metabolizados in vivo por uma via que compreende uma reacção com glutationa. A explicação pode ser que os compostos da invenção, ao reduzir a quantidade de glutationa intracelular, aumentam a potência do outro composto farmaceuticamente activo. Exemplos de tais compostos farmaceuticamente activos são adriamicina, melfalano, cisplatina.

Exemplos da síntese de alguns compostos de azabiciclooctan-3-ona estão representados no Esquema de Reacção 2: 13

Esquema de Reacção 2

De acordo com o Esquema de Reacção 2, o hidrocloreto de quinuclidinona (1) é usado como material de partida para a síntese dos intermediários (2), (7) e (8). 0 2,2-Bis- hidroximetil-l-aza-biciclo [2.2.2]octan-3-ona (2) é formado por tratamento de (1) com um excesso de formaldeído e carbonato de potássio de acordo com os métodos descritos por Nielsen et al. (1966). 0 2-Hidroximetil-l-aza-biciclo [2.2.2]octan-3-ona (7) é formado por tratamento de hidrocloreto de quinuclidinona com 1 equiv. de formaldeído e carbonato de potássio. 0 2-Metileno-l-aza-biciclo[2.2.2]octan-3-ona (8) é formado a partir do comporto 7 por um procedimento de desidratação. Estes métodos são também descritos por Nielsen et al. (1966). 0 14 composto 8 está também disponível comercialmente como o seu sal hidrocloreto. 0 2,2-Bis-hidroximetil-l-aza-biciclo [2.2.2]octan-3-ona (2) forma ésteres por tratamento com cloretos de ácidos e uma base adequada tal como trietilamina, piridina ou DMAP num solvente orgânico seguindo protocolos padrão para acilação. A esterificação pode também ser realizada usando ácidos carboxílicos e reagentes de acoplamento tais como DCC e HOBt. Carbonatos e carbamatos podem também ser formados por métodos bem conhecidos de uma pessoa especialista na técnica. Usando apenas 1 equiv. do reagente podem obter-se os derivados monoacoplados. 0 derivado monoacilado e o monocarbonato e o monocarbamato correspondentes podem ser separados dos derivados disubstituídos por cromatografia líquida. 0 composto 15 e os seus análogos podem ser formados por reacção entre 2-metileno-l-aza-biciclo [ 2.2.2]octan-3-ona (8) e aminas em solventes orgânicos e a elevada temperatura do mesmo modo descrito por Singh et ai. (1969) ou por Elkin et al. (patente US No. 3726877). 0 composto 6 e os seus análogos podem ser formados a partir do 2,2-bis-hidroximetil-l-aza-biciclo [2.2.2]octan-3-ona (2) por alquilação, ou com halogenetos de alquilo usando um método como descrito por Schieweck et al. (2001) ou pelo uso de ortoéster conforme descrito por Sampath Kumar et al. (1997). O composto 10 pode também ser formado ou a partir do composto 8 ou a partir do composto 1 por um método conforme descrito por Toender et al. (2000). 15 0 composto 14 pode ser formado ou por reacção do composto 8 com álcoois sob condições básicas conforme descrito por Nielsen et al (1966) ou por alquilação do composto 7 com halogenetos de alquilo de acordo com Schieweck et al. (2001) . A síntese dos compostos 11, 12, 13 a partir do composto 7 pode ser realizada por métodos bem conhecidos da pessoa especialista na técnica.

Exemplos

Exemplo 1. Síntese de 2,2-Bis-hidroximetil-l-aza-biciclo [2,2,2] octan-3-ona (2) (intermediário) A reacção de hidrocloreto de quinuclidinona (1) (disponível comercialmente) (16,9 g, 0,1 mol) com formalina (37% p/p, 150 mL, 2,0 mol) na presença de carbonato de potássio (15,9 g, 0,11 mol) consumiu o material de partida após lh a 52°C. A conversão foi seguida por LC-MS. A mistura de reacção à base de água foi extraída com cloreto de metileno (4x80 mL) e as fases orgânicas combinadas foram secas em MgSCg. O solvente foi removido por evaporação e foi adicionado heptano (500 mL) ao resíduo. Após aquecimento durante uma hora, o extracto de heptano quente foi eliminado. Adicionou-se benzeno (400mL) ao resíduo seguido de aquecimento durante 8 horas. A mistura resultante foi filtrada para limpar em relação ao polímero que se formou durante o aquecimento, e a solução límpida foi evaporada até à secura. O resíduo foi extraído com heptano fervente (300 mL).

Após decantação do heptano, benzeno fervente (400 mL) foi adicionado ao resíduo. Filtração de limpeza e arrefecimento (até 6°C) seguido de isolamento por filtração do precipitado sólido produziu 5,1 g de 2,2-bis-hidroximetil- 16 1-aza-biciclo [2.2.2]octan-3-ona (2) (mp: 136-138 °C) . Uma segunda colheita foi isolada a partir da combinação da solução mãe com o material da extracção do heptano após precipitação em benzeno e produziu 2,9 g de produto. No total 37% de rendimento.

Exemplo 2. Métodos para O-acilação de 2,2-bis-hidroximetil-1-aza-biciclo [2.2,2] octan-3-ona (2) 2,1 Éster do ácido 2-isobutiriloximetil-3-oxo-l-aza-biciclo [2,2,2]oct-ilmetil isobutírico

o A uma solução agitada de bismetilol de 3-quinuclidinona (0,25g, 1,35 mmol) em diclorometano seco (15 mL) , foram

adicionados 4-dimetilamino piridina (33 mg, 0,27 mmol) e trietilamina (0,75g, 7,4 mmol) sob atmosfera de azoto. A mistura de reacção foi arrefecida até 0°C, foi adicionado cloreto de isobutirilo(0,31g, 0,9 mmol) lentamente a 0 °C e a agitação foi continuada durante 18-20h à temperatura ambiente (26-27°C). A mistura de reacção foi arrefecida com água fria (25 mL), extraida com diclorometano (3X50 mL), as camadas orgânicas foram lavadas com solução de NaHC03 a 10%, solução salina de cloreto de sódio e seca em sulfato de sódio, filtrada e concentrada para obter o produto bruto. O produto bruto foi purificado como um liquido viscoso (225mg, 52%) por cromatografia de coluna em sílica gel usando 0,8:99,2 de metanol:clorofórmio como eluente.

Testes de Biologia A linha de células do carcinoma do pulmão humano H1299-Hisl75, que possui um elemento de construção p53 mutante 17 regulado por tetraciclina, foi usada para estudar os efeitos antiproliferativos e de indução da apoptose dos presentes compostos.

Protocolo do ensaio WST-1

Cultura de células

As células foram cultivadas em Meio de Dulbecco Modificado por Iscove suplementado com 10% de soro bovino fetal, L-glutamina e gentamicina.

Sementeira das células

As células foram removidas para experimentação quando estavam cerca de 75-100% confluentes. Após tripsinização, as células foram diluídas até uma concentração celular de 30000 células/mL em meio de cultura de células. As células foram colocadas em placas de 96 poços com fundo plano a 100 μL/poço (3000 células/poço). A última coluna da placa foi preenchida só com o meio, 100 μL/poço, para usar como branco. As células foram então incubadas durante a noite numa incubadora de células.

Tratamento das células

Após cerca de 16-24 horas de incubação em placas de 96 poços, as células foram tratadas com os diferentes compostos. Os fármacos foram dissolvidos em DMSO a uma concentração de 0,1 Me depois mais diluídas em PBS até às concentrações desejadas. Foram então adicionados 5 μύ de cada composto a cada poço. Uma coluna de células foi geralmente não tratada como controlo. As placas de células foram colocadas de novo na incubadora de células.

Adição de reagente WST-1 18

Após 96 horas na incubadora de células, foi adicionado o reagente WST-1 às placas. Foram adicionados ΙΟμίϋ de reagente a cada poço das placas (incluindo as células não tratadas e os poços só com meio). A absorbância das amostras foi medida num espectrof otómetro a 450 nm após cerca de 1-2 horas de incubação na incubadora de células. Antes de ler as placas, estas foram verificadas visualmente por comparação da cor nos poços só com o meio e a cor nos poços com as células não tratadas. O meio deve permanecer com cor vermelho-rosa enquanto que as células não tratadas devem mudar de vermelho-rosa para laranja.

Análise de WST-1 A média dos valores da absorbância para as células não tratadas foi calculada para cada placa. A % de supressão de crescimento foi calculada como: 100_( ( AbS amostra/AbS células não tratadas) X 100) .

Os resultados das análises de WST-1 são expressas como valores de CI50, i.e. concentração que inibe o crescimento de pelo menos 50% das células. Os valores de CI50 dos compostos de acordo com a invenção, assim como os do composto de referência não de acordo com a invenção, são mostrados na Tabela 1. Naqueles casos em que o composto de acordo com a invenção foi testado na forma de sal de adição de ácido o ácido correspondente é mostrado na Tabela 1.

Tabela 1 Exemplos dos compostos testados e valores de CI50 do ensaio WST-1 19

»50 μΜα 20 μΜ

20

17 μΜ

38 μΜ

aComposto não de acordo com a invenção Análise por FACS

As células H1299-Hisl75 foram colocadas em placas de 6 poços numa densidade inicial de 10,000 células/cm2, cultivadas durante a noite e tratadas com os compostos da invenção. Após 24 horas de tratamento, o meio contendo células flutuantes foi recolhido e colocado com as células aderentes colhidas. As células foram lavadas uma vez com PBS e ressuspendidas em 200 μ]1, de PBS. Etanol a 70% gelado foi adicionado durante a agitação em vortex e as células foram armazenadas a -20°C durante 24 horas. As células fixadas foram então recolhidas por centrifugação, lavadas 21 uma vez em PBS e incubadas em 100 μ]1 de tampao corante PI (5 μg/mL de PI e 250 μg/mL de RNaseA) durante 30 minutos a 37°C. As amostras foram ensaiadas usando um citómetro de fluxo FACSCalibur e o pico sub G0/G1 quantificado usando o programa CELLQuest. Os resultados obtidos com um compostos de acordo com a invenção são mostrados na Figura. 22

Referências

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Lisboa, 19 de Outubro de 2010

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composto seleccionado a partir de

\ o o^\ acetato de [2-(metoximetil)-3-oxo-l azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]-metilo;

ciclopentanocarboxilato de [ 2-(metoximetil) -3-oxo-l azabiciclo[2.2.2]oct-2-il] met i lo; e

2-metilpropanoato de {2-[(isobutiriloxi)metil]-3-oxo l-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il}metilo; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

2. Composto seleccionado a partir de

2-(hidroximetil)-2-(metoximetil)quinuclidin-3-ona; 2 acetato de

Ο [2-(metoximetil)-3-oxo-l- azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo;

ciclopentanocarboxilato de [2-(metoximetil)-3-oxo-l-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo;

2-metilpropanoato de {2-[ (isobutiriloxi)metil]-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il}metilo; ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, para uso como medicamento. menos um

3. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e pelo excipiente farmaceuticamente aceitável. 3

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, compreendendo pelo menos um outro composto farmaceuticamente activo.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, em que o, pelo menos um, outro composto farmaceuticamente activo é um composto útil no tratamento de doenças hiperproliferativas.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, em que o outro composto farmaceuticamente activo é seleccionado a partir de adriamicina, melfalano e cisplatina.

7. Composto seleccionado a partir de

O— 2-(hidroximetil)-2-(metoximetil)quinulidin-3-ona; acetato de

\ O

[2-(metoximetil)-3-oxo-l- azabiciclo[2.2.2]oct-2-il)metilo; 4

ciclopentanocarboxilato de [2-(metoximetil)-3-oxo-l-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo;

2-metilpropanoato de {2-[(isobutiriloxi)metil]-3-oxo-l-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il}metilo; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para uso no tratamento de um distúrbio seleccionado a partir de doenças hiperproliferativas, doenças autoimunes e doenças cardíacas. 8. 0 composto de acordo com a reivindicação 7, em que o distúrbio é cancro. 9. 0 composto de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, para uso em combinação com um ou mais fármacos adicionais úteis no tratamento de doenças hiperproliferativas.

10. O composto de acordo com a reivindicação 9, em que um ou mais fármacos adicionais úteis no tratamento 5 de doenças hiperproliferativas sao seleccionados a partir de adriamicina, melfalano e cisplatina. 11. 0 composto de acordo com a reivindicação 8, para uso em combinação com tratamento de radiação.

12. Uso de um composto seleccionado a partir de

O— OH 2-(hidroximetil)-2-(metoximetil)quinuclidin-3-ona;

N 0^\ acetato de [2-(metoximetil)-3-oxo-l-azabiciclo [ 2.2.2]oct-2-il]metilo;

ciclopentanocarboxilato de [2-(metoximetil)-3-oxo-l azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo; e 6
2-metilpropanoato de {2-[ (isobutiriloxi)metil]-3-oxo-l-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il}metilo; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, para preparar um medicamento para o tratamento de um distúrbio seleccionado a partir de doenças hiperproliferativas, doenças autoimunes e doenças cardíacas. 13. 0 uso de acordo com a reivindicação 12, em que o distúrbio é cancro. Lisboa, 19 de Outubro de 2010