PT1689426E - Formulações farmacêuticas para a libertação prolongada de interferões e as suas aplicações terapêuticas - Google Patents

Formulações farmacêuticas para a libertação prolongada de interferões e as suas aplicações terapêuticas Download PDF

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Description

ΡΕ1689426 1 DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS PARA A LIBERTAÇÃO PROLONGADA DE INTERFERÕES E AS SUAS APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS" A invenção presente diz respeito a novas formulações farmacêuticas com base em suspensões coloidais aquosas estáveis e fluidas para a libertação prolongada de princípios activos proteicos, a saber os interferões (IFN), bem como às aplicações terapêuticas destas formulações.
Estas formulações farmacêuticas activas são tanto para a aplicação em terapêutica de seres humanos, como veterinária.
Os interferões são glicoproteínas que pertencem à família das citoquinas. São mediadores biológicos que, fixando-se sobre receptores nas membranas, desencadeia uma resposta celular pleiotrópica. Em resultado cria-se uma actividade antiviral, antiproliferativa e imunomoduladora.
Também foi reconhecida aos interferões a qualidade de agentes antitumorais ou anticancerosos eficazes. Neste documento designa-se como interferão qualquer forma de interferão, tais como os interferões alfa, beta ou gama. Pode produzir-se IFN por engenharia genética. 2 ΡΕ1689426
As formulações farmacêuticas com libertação prolongada de IFN devem cumprir o requisito de originar tão bem quanto possivel no paciente uma concentração de IFN no plasma que se aproxime da observada no sujeito são.
Este objectivo confronta-se com a pequena duração da vida dos IFN no plasma, o que obriga de uma forma que representa um forte constrangimento a injectá-los repeti-damente. A concentração em proteína terapêutica no plasma apresenta então um perfil «em dentes de serra», caracte-rizada por picos de concentração elevados e mínimos de concentração muito baixos. Os picos de concentração, muito superiores à concentração de base no sujeito são, têm efeitos nocivos muito marcados atenta a elevada toxicidade dos IFN. Por outro lado, os mínimos de concentração são inferiores à concentração necessária para conferir um efeito terapêutico, o que leva a uma má cobertura terapêutica do paciente e a efeitos secundários que são graves a longo prazo.
Para além disto, para se reproduzir no paciente uma concentração de interferão no plasma que seja próxima do valor ideal para o tratamento, é importante que a formulação farmacêutica considerada permita libertar a proteína terapêutica ao longo de um intervalo de tempo prolongado, de modo a limitar as variações da concentração plasmática ao longo do tempo.
Além disto, esta formulação activa deve de prefe- 3 ΡΕ1689426 rência satisfazer o seguinte caderno de especificações, que já é do conhecimento do especialista da técnica: 1 - libertação prolongada de um ou diversos interferões activos e não desnaturados (não modificados), de modo a que a sua concentração no plasma seja mantida ao nível terapêutico, 2- forma líquida suficientemente fluida para se facilmente injectável e esterilizável por filtração utilizando filtros com poros cujas dimensões sejam menores ou iguais a 0,2 mícron, 3 - forma liquida estável, 4 - biocompatibilidade e biodegradabilidade, 5 - não toxicidade, 6 - não imunogenicidade, 7 - tolerância local excelente.
Para tentar cumprir estes objectivos, foram já propostas diversas metodologias no estado da técnica.
Na primeira metodologia, a proteína terapêutica nativa é modificada por enxerto covalente de uma de diversas cadeias de polímero ou ainda por enxerto covalente 4 ΡΕ1689426 de uma proteína tal como a albumina do soro humano (HSA). A proteína modificada deste modo tem uma menor afinidade para os seus receptores e o seu período de meia vida na circulação geral aumenta consideravelmente. A amplitude da variação de concentração entre os picos e os mínimos de concentração de proteína no resulta deste modo consideravelmente menor. A título de ilustração desta primeira metodologia, convém notar que a sociedade Schering Plough comercializa sob a designação de VIRAFERON® PEG um interferão alfa 2b quimicamente modificado por enxerto de uma cadeia de polietilenoglicol (PEG) com a massa de 12kD. Esta modificação química traduz-se por um aumento do período de tempo de meia vida no paciente, de 6,8 para 33 horas. De forma concomitante, a actividade biológica da proteína modificada sofre uma diminuição acentuada. Por outro lado, a modificação irreversível da proteína, que já não é sob esta forma uma proteína humana, pode levar, a longo termo, a problemas de toxicidade e imunológicos.
Numa segunda metodologia, foi proposto aumentar-se a duração da actividade graças a formulações contendo pelo menos um polímero e um princípio activo, líquidas à temperatura e sob uma atmosfera ambientes, injectáveis e tornando-se mais viscosas após a injecção, por exemplo sob efeito de uma alteração do pH e/ou da temperatura.
Desta forma e nesta metodologia, a patente US-B-6.143.314 divulga uma solução orgânica de polímero com libertação controlada de PA, formando um implante sólido após a injecção. Esta solução inclui: 5 ΡΕ1689426 o (A) 10 a 80 % em peso de um polímero termoplástico de base, biocompatível, biodegradável e insolúvel em água ou nos fluidos fisiológicos (por exemplo Poliláctico e/ou Poliglicólico); o (B) um solvente orgânico, tal como a N-metil-pirrolidona, que se disperse nos fluidos fisiológicos; o (C) um princípio activo (PA) ; o (D) e por último 1 a 50 % em peso de um agente de libertação controlada, constituído por um copolímero em blocos do tipo Polilácticoglicó-lico/Polietilenoglicol.
Após injecção, o (B) dispersa-se ou dissipa-se nos fluidos fisiológicos. (A) forma um implante encapsu-lante de (C) que não se liga de forma covalente nenhuma nem a (A) nem a (D), e que então se liberta lentamente in vivo. O principal inconveniente desta técnica é utilizar um solvente orgânico (B), potencialmente desnatu-rante do PA (C) (por exemplo proteínas terapêuticas) e tóxico para o paciente. Além disto, a hidrólise do polímero (A) in vivo gera um ácido que pode conduzir a problemas de tolerância local. 6 ΡΕ1689426
Os pedidos de PCT WO-A-99/18.142 e WO-A-00/18.821 dizem respeito a soluções aquosas de polímeros que contêm um PA sob forma dissolvida ou coloidal, que são administráveis a animais de sangue quente, nomeadamente por injecção, e que formam um depósito de PA (por exemplo insulina) gelificado in vivo, uma vez que a temperatura fisiológica é mais elevada do que a sua temperatura de gelificação. 0 gel que assim se forma liberta o PA de modo prolongado. Estes polímeros biodegradáveis específicos são em blocos triplos de tipo ABA ou BAB em que A = poliláctico - coglicólico (PLAGA) ou poliláctico (PLA) e B = poli-etilenoglicol. As temperaturas de transformação líquido/gel para estes polímeros em triblocos são por exemplo de 36, 34, 30 e 26°C. Ao contrário dos polímeros (A) de acordo com a US-B-6.143.314, a hidrólise destes polímeros triblocos ABA ou BAB in vivo conduz a ácidos que podem não ser correctamente tolerados, localmente. O pedido de PCT WO-A-98/11.874 descreve formulações farmacêuticas incluindo um princípio activo lipófilo, um polímero gelificante (Gelrite® = goma gelana desace-tilada ou etil-hidroxicelulose) e um tensioactivo. A interacção polímero/tensioactivo e eventualmente a presença de electrólitos, por si só, tais como os iões Ca++ em concentração fisiológica no caso do polímero Gelrite®, conduz à formação de um gel constituído por um agregado polímero/tensioactivo, ao qual se liga de uma forma não covalente o princípio activo lipófilo. Esta formulação destina-se a uma administração local num órgão alvo (por 7 ΡΕ1689426 exemplo o olho). A associação agregado/princípio activo que se forma in situ permite a liberação lenta do principio activo no órgão alvo.
Uma terceira abordagem tomada para tentar prolongar a acção de uma proteína, mantendo sua bioactividade, foi utilizar uma proteína terapêutica não distorcida e incorporá-la em micro esferas ou em implantes feitos de polímeros biocompatíveis. Nomeadamente esta abordagem é ilustrada pela patente US-B-6.500.448 e pelo pedido US-A-2003/0133.980 que descrevem uma composição para a liberação sustentada de hormona de crescimento humano (hGH) em que a proteína hormonal, previamente estabilizada por complexação com um metal, é então dispersa numa matriz polimérica biocompatível. O polímero é por exemplo um poli(lactido), um poli(glicolido) ou um copolímero poli(lactido-co-glicolido) biocompatível. A composição apresenta-se por sob a forma de uma suspensão de micro esferas numa solução de carboximetilcelulose de sódio. Esta abordagem tem várias desvantagens: primeiro, durante o processo de fabrico de micro esferas, a proteína é colocada em contacto com solventes orgânicos potencialmente desnaturantes. Além disto, as micro esferas são de grande dimensão (1 a 1.000 mícron), o que constitui uma restrição em termos de injecção e da fácil esterilização com um filtro. Finalmente, podem ocorrer problemas de tolerância local durante a hidrólise do polímero in situ.
De acordo com uma quarta metodologia, foram ΡΕ1689426 desenvolvidas formas de proteína terapêutica (nomeadamente de interleuquinas), com libertação prolongada, constituídas por suspensões líquidas de nanopartículas carregadas em proteínas. Esta últimas permitiram a administração da proteína nativa numa formulação líquida com uma pequena viscosidade. A patente FR-B-2.732.218 descreve partículas de vectorização de princípio(s) activo(s), do tipo das com base em poliaminoácido(s), e de dimensão média menor do que 200 pm, para as quais os poliaminoácidos constitutivos incluem pelo menos dois tipos de aminoácidos recorrentes, AAN e AAI, correspondendo o tipo AAN a um aminoácido neutro hidrofóbico, e correspondendo o tipo AAI a um aminoácido com cadeia lateral curta, ionizável. Esta patente divulga especificamente suspensões coloidais que contêm nanopartículas formadas por associações de polímero com a hemoglobina, o citocroma C, a ovalbumina. Estas suspensões são obtidas misturando 100 ou 200 mg de poli-Leu/Glu e 10 mg de citocroma C com 100 mL de uma solução tampão com um pH 7,2. A patente FR-B-2.822.834 descreve uma suspensão coloidal de partículas sub-mícron susceptíveis de serem utilizadas, nomeadamente para a vectorização de princípio (s) activo(s) (PA), sendo estas partículas disposições supra moleculares individualizadas, sendo estas partículas com base em pelo menos um copolímero anfifílico incluindo pelo menos um bloco de polímero (s) hidrófilo (s) do tipo de um polilquilenoglicol (PAG), de preferência polietileno- 9 ΡΕ1689426 glicol (PEG), e pelo menos um copoliaminoácido (s) (PAA) anfifílico linear (es), com ligações α-peptidicas. Esta patente divulga especificamente uma suspensão coloidal obtida misturando 10 mg de copolimero anfifílico com 1 mL de uma solução de insulina a 1,4 mg/mL, a pH 7,4. A patente FR-B-2.838.964 descreve uma suspensão coloidal de partículas sub-mícron susceptíveis de serem utilizadas, nomeadamente para a vectorização de princípio (s) activo(s) (PA), sendo estas partículas constituídas por disposições supra moleculares individualizadas, com base num copolimero anfifílico incluindo pelo menos um bloco de poliaminoácido(s) (PAA) linear (es), hidrófilo (s) com ligações α-peptídicas, sendo os aminoácidos constitutivos deste bloco PAA iguais ou diferentes entre si e existindo pelo menos um bloco polimérico de aminoácidos hidrofóbico, formado por um polímero de um ácido a-hidroxi-carboxílico (PAHC), obtido espontaneamente na ausência de tensioactivo, pondo em presença um copolimero anfifílico e um líquido não solvente dos AAI. Esta patente divulga especificamente uma suspensão coloidal obtida misturando uma solução de insulina com nanopartícuias cuja concentração é de 10 mg/mL, a pH 7,4.
De acordo com uma primeira via de libertação prolongada, a suspensão de nanopartículas que assegura libertação prolongada é constituída por suspensões de lipossomas nos quais a proteína terapêutica nativa não modificada se encontra encapsulada. Depois da injecção, a 10 ΡΕ1689426 proteína é progressivamente libertada dos lipossomas, o que prolonga o período de tempo de presença da proteína na circulação geral. Assim por exemplo, Frossen et al., descrevem no artigo em Câncer Res. 43 página 546, 1983, a encapsulação de agentes anti-neoplásicos em lipossomas para aumentar a sua eficácia terapêutica. A libertação destes agentes é no entanto rápida demais para se obter uma libertação realmente prolongada. A sociedade Liposome Company Inc., na sua patente US-B-5.399.331, propõe melhorar o período de tempo de libertação in vitro do interferão 2 enxertando-o de modo covalente no lipossoma. Deste modo volta a estar-se em presença dos inconvenientes da primeira metodologia envolvendo uma "proteína modificada", tal como se descreveu acima neste documento.
Para se fazer face à falta de estabilidade dos lipossomas, mas mantendo-se as vantagens de uma formulação líquida em nanopartículas com uma pequena viscosidade, a sociedade Flamel Technologies propôs uma segunda via de libertação prolongada na qual a proteína terapêutica s encontra associada a nanopartículas de um polímero solúvel em água "modificado hidrofóbico", isto é, modificado por enxerto de grupos hidrofóbicos. Este polímero é seleccio-nado, em especial, de entre os poliaminoácidos (poligluta-matos ou poliaspartatos) portadores de enxertos hidrofóbicos .
Um dos factores de interesse notáveis destes polímeros modificados hidrofóbicos é o facto de eles se 11 ΡΕ1689426 associarem espontaneamente em água, para formarem nano-partículas.
Outro factor de interesse destes sistemas é que as proteínas ou os péptidos terapêuticos se associam espontaneamente com as nanopartículas de polímeros modificados hidrofóbicos, sendo que esta associação é não covalente e que ocorre sem recorrer nem a um tensioactivo nem a um processo de transformação que seja potencialmente desnaturante. Não se trata de uma encapsulação da proteína numa micro esfera, tal como foi divulgado na patente US-B-6.500.448 e no pedido US-A-2003/0133.980. De um modo completamente diferente, estas nanopartículas de copoli-aminoácidos modificados hidrofóbicos adsorvem espontaneamente as proteínas em solução, sem as modificar quimicamente nem as desnaturar e sem lhes fazer passar por passos de tratamento agressivo do tipo "colocação em emulsão" e "evaporação do solvente". As formulações podem ser armazenadas sob forma líquida ou sob forma liofilizada.
Depois da injecção, por exemplo por via subcutânea, estas suspensões de nanopartículas carregadas com proteínas libertam progressivamente a proteína não desnaturada e bioactiva in vivo. No pedido de patente WO-A-00/30.618 são divulgadas associações não covalentes de princípio activo (PA) proteico/poli[Glu] ou poli[Asp] deste tipo.
Este pedido descreve nomeadamente suspensões 12 ΡΕ1689426 coloidais com pH 7,4 que incluem associações de insulina humana com nanoparticulas de poliglutamato "modificado hidrofóbico". A tabela imediatamente adiante lista os poliaminoácidos "modificados hidrofóbicos" utilizados, e as taxas de associação obtidas nos exemplos do WO-A-00/130.618. EXEM- POLÍMERO Taxa de as- PLO sociação (%) 1 poli [ (Glu-O-Na) o,63bloco (Glu-O-metilo) 0,37] 55 2 poli [Glu-O-Na) 0,66-bloco- (Glu-O-etilo) 0,34] 26 3 poli (Glu-O-Na) 0,65-bloc- (Glu-O-hexadecilo) 0,35] 36 4 poli [ (Glu-O-Na) 0,88-bloco- (Glu-O-dodecilo) 0,12] >90
Estas suspensões coloidais titulam a 1,4 mg/mL de insulina e a 10 mg/mL de poliaminoácido "modificado hidrofóbico" .
Resulta de figura 1 do WO-A-00/30.618 que a duração da libertação in vivo da insulina vectorizada pelas suspensões mencionadas acima, é de 12 h. Seria um factor positivo se esta duração aumentasse.
Deste modo, ainda que este pedido de PCT represente já um progresso considerável, o seu conteúdo técnico ainda pode ser optimizado no que toca à especificação das caracteristicas descrita acima, e sobretudo no que toca ao alongamento da duração da libertação dos interferões in vivo. 13 ΡΕ1689426
Os pedidos de patente francesa não publicados Nos 02/07.008 de 07/06/2002, 02/09.670 de 30/07/2002, 03/50.190 de 28/05/2003 e 01/50.641 de 03/10/2003, dizem respeito a novos poliaminoácidos anfifilicos solúveis em água e incluindo unidades de ácido aspártico e/ou unidades de ácido glutâmico, em que pelo menos uma parte destas unidades seja portadora de enxertos hidrofóbicos. Ao contrário dos poliaminoácidos enxertados hidrofóbicos divulgados no pedido WO-A-00/30.618, estas novas matérias-primas poliméricas formam espontaneamente em meio líquido aquoso suspensões coloidais de nanopartículas que podem ser utilizadas para a libertação prolongada de PA (insulina) . Elas são biocompatíveis, biodegradáveis e as proteínas, em especial as proteínas terapêuticas adsorvem-se espontaneamente sobre essas nanopartículas sem sofrer nenhuma modificação química nem desnaturação.
Estes pedidos visam também novas composições farmacêuticas, cosméticas, dietéticas ou fitossanitárias com base nestes poliaminoácidos.
Incluem-se nos poliaminoácidos "modificados hidrofóbicos" anfifilicos de acordo com o pedido de patente francesa N° 02/07.008, incluem unidades de ácido aspártico e/ou Unidades de ácido glutâmico, portadoras de enxertos hidrofóbicos comportando pelo menos um motivo de alfa-tocoferol (por exemplo o poliglutamato ou o poliaspartato enxertados com o alfa-tocoferol de origem sintética ou natural) . 14 ΡΕ1689426
Este pedido não publicado divulga especificamente uma suspensão coloidal que contém nanoparticulas formadas por associações de polimero/proteina activa e que se obtém misturando 1 mg de um poliglutamato enxertado com alfa-tocoferol e 7 mg de insulina em 1 mL de água, a pH 7,0.
Os poliaminoácidos "modificados hidrofóbicos" anfifilicos de acordo com o pedido de patente francesa N° 02/09670 incluem unidades de ácido aspártico e/ou unidades de ácido glutâmico, portadores de enxertos hidrofóbicos que contenham pelo menos um motivo hidrofóbico ligado à unidades de ácido aspártico e/ou ácido glutâmico por intermédio de uma rótula contendo duas funções amida, e mais precisamente através de um "espaçador" do tipo lisina ou ornitina.
Este pedido não publicado divulga especificamente uma suspensão coloidal que contém nanoparticulas formadas por associações polimero/proteina activa e que se obtém misturando 10 mg de um poliglutamato enxertado com ácido palmitico através de um "espaçador" de lisina e 200 UI de insulina (7,4 mg), em 1 mL de água, a pH 7,4.
Os poliaminoácidos "modificados hidrofóbicos" anfifilicos de acordo com o pedido de patente francesa N° 03/50.190 incluem unidades de ácido aspártico e/ou unidades de ácido glutâmico, algumas das quais são portadoras de pelo menos um enxerto ligado a uma unidade aspártica ou 15 ΡΕ1689426 glutâmica através de um "espaçador" "aminoácido" com base em Leu e/ou Ileu e/ou Vai e/ou Phe, estando ligado um grupo hidrofóbico em C6-C30 por uma ligação éster ao "espaçador".
Este pedido não publicado divulga especificamente uma suspensão coloidal que contém nanoparticulas formadas por associações de polimero/proteina activa e que é obtida misturando uma solução aquosa contendo 10 mg de um poliglutamato enxertado com um enxerto de -Leu-OCs, -Val-OC12 ou -Val-colesterilo, e 200 UI de insulina (7,4 mg), por mililitro de água, a pH 7,4. O pedido de patente francesa N° 01/50.641 divulga homopoliaminoácidos lineares, anfifilicos, aniónicos, que incluem unidades de ácido aspártico ou unidades de ácido glutâmico e cujas extremidade contêm ligados a elas grupos hidrofóbicos contendo de 8 a 30 átomos de carbono.
Em especial, os homopoliaminoácidos tal e qual "modificados hidrofóbicos" são por exemplo um poli[GluONa] com extremidades de Phe-OCis/Cis ou um poli[GluONa] com extremidades de PheOCi8/alfa-tocoferol. Este pedido não publicado descreve igualmente uma suspensão coloidal que contém nanoparticulas formadas por associações polimero/proteina activa e que se obtém misturando 10 mg de um dos polímeros referidos acima e 200 UI de insulina (7,4 mg) por mililitro de água, a pH 7,4. A duração de libertação in vivo da insulina 16 ΡΕ1689426 "vectorizada" pelas suspensões de acordo com estes pedidos não publicados ganharia em ser aumentada.
Em qualquer dos casos, todas estas técnicas anteriores acerca de suspensões coloidais de nanoparticulas de poliaminoácidos modificados hidrofóbicos não revela nenhuma formulação que permita: (1) aumentar suficientemente a duração de libertação da proteína activa após a injecção por via parentérica, em especial subcutânea; (2) e/ou diminuir o pico de concentração plasmá-tica da proteína activa após a injecção da formulação que a contém.
Nestas condições, um dos objectivos essenciais da invenção presente é portanto o de propor uma formulação farmacêutica líquida para a libertação prolongada de IFN(s) activo(s), remediando as carências da técnica anterior, e em especial permitindo obter-se, após injecção por via parentérica (por exemplo subcutânea), uma duração de libertação prolongada in vivo de interferões não desnaturados.
Outro objectivo essencial da invenção é propor uma formulação farmacêutica líquida com libertação prolongada de interferão (ões) in vivo, que seja suficientemente fluida para se tornar facilmente injectável e esterilizável 17 ΡΕ1689426 por filtração através de filtros cuja dimensão de poros seja menor ou igual a 0,2 mícron.
Outro objectivo essencial da invenção é propor uma formulação farmacêutica liquida com libertação prolongada de interferão(ões) in vivo, que seja estável durante a sua conservação, tanto no plano fisico-quimico como no plano biológico.
Outro objectivo essencial da invenção é propor uma formulação farmacêutica liquida com libertação prolongada de interferão(ões) in vivo, que apresente pelo menos uma das seguintes propriedades: biocompatibilidade, biode-gradabilidade, não toxicidade, boa tolerância local.
Outro objectivo essencial da invenção é propor uma formulação farmacêutica liquida com libertação prolongada de interferão (ões) in vivo, sendo a formulação referida uma suspensão coloidal aquosa com pequena viscosidade incluindo partículas de dimensão inferior ao micron de polímero PO, auto-associadas a pelo menos um interferão, sendo o polímero PO um polímero biodegradável, solúvel em água e portador de grupos hidrofóbicos.
Outro objectivo essencial da invenção é propor uma formulação farmacêutica líquida com libertação prolongada de interferão(ões) in vivo, sendo a formulação referida uma suspensão coloidal aquosa com pequena viscosidade incluindo partículas de dimensão inferior ao mícron de 18 ΡΕ1689426 polímero PO, auto-associadas a pelo menos um interferão, sendo o polímero PO, por exemplo, um poliaminoácido formado por unidades de ácido aspártico e/ou unidades de ácido glutâmico, sendo pelo menos uma parte das unidades referidas portadora de pelo menos um grupo hidrofóbico (GH), e além disto sendo PO biodegradável, solúvel em água, e anfifílico.
Outro objectivo essencial da invenção é propor produtos derivados e/ou precursores da formulação referida, com os objectivos descritos acima. A Entidade Proponente teve pelo menos o mérito de ter desenvolvido formulações farmacêuticas líquidas aquosas com viscosidade pequena à temperatura fisiológica que, de um modo surpreendente, formam um depósito gelificado in vivo após administração parentérica fácil a seres humanos ou a mamíferos de sangue quente, não se despoletando a formação deste depósito nem por uma alteração do pH nem da temperatura durante a injecção parentérica, nem sequer pela dispersão de solvente orgânico no meio fisiológico. 0 depósito gelificado que assim se formou aumenta de modo significativo a duração da libertação in vivo do IFN.
Em consequência a invenção diz respeito a uma formulação farmacêutica líquida para a libertação prolongada de interferão(ões), formulação esta que inclui uma suspensão coloidal, aquosa, com pequena viscosidade, com base em partículas de dimensão inferior ao mícron de polímero 19 ΡΕ1689426 (PO) biodegradável, solúvel em água e portador de grupos hidrofóbicos (GH), estando as partículas referidas associadas de um modo não covalente com pelo menos um interferão e eventualmente com pelo menos outro princípio activo (PA), caracterizada: ♦ por o meio de dispersão da suspensão ser essencialmente constituído por água, ♦ por ser apta a uma sua administração por injecção por via parentérica e a formar em seguida, in vivo, um depósito gelificado, em que a referida formação de um depósito gelificado: o seja, por um lado, provocada pelo menos em parte por pelo menos uma proteína fisiológica presente in vivo, o e permitindo, por outro lado, prolongar e controlar a duração da libertação do PA in vivo, passadas mais do que 24 h após a administração, ♦ por ser líquida nas condições de injecção, ♦ e por ser igualmente líquida à temperatura e/ou ao pH fisiológicos, e/ou em presença: 20 ΡΕ1689426 * de electrólito fisiológico em concentração fisiológica, * e/ou de pelo menos um tensioactivo.
De uma forma vantajosa, a referida gelificação in vivo não provém de uma alteração do pH e/ou da temperatura, nem de uma dispersão in vivo de um ou mais solventes orgânicos eventualmente contidos na formulação injectada.
Sem que se pretenda implicar uma sujeição a qualquer teoria, pode pensar-se que as proteínas fisiológicos presentes in vivo em concentrações fisiológicas permitem a agregação das nanopartículas de PO associadas a pelo menos um interferão. Uma tal gelificação acontece, por exemplo, ao longo de uma ou diversas horas, 24 h, 48 h ou 72 h, entre outras. O depósito gelifiçado obtido após a injecção pa-rentérica da formulação permite um prolongamento interessante da duração da libertação da proteína, bem como uma diminuição do pico de concentração plasmática de interferão (ões) .
De acordo com uma forma optimizada da invenção, a concentração em [PO] será tal que dela resulte a formação de um depósito gelifiçado in vivo, após injecção paren-térica. 21 ΡΕ1689426
De acordo com um modo de definição, que não se baseia sobre um comportamento in vivo tal como o indicado acima, mas sobre um comportamento in vitro, a invenção diz respeito a uma formulação farmacêutica liquida para a libertação prolongada de principio(s) activo(s) -PA-, em que a formulação referida: o é liquida nas condições atmosféricas ambientes, o é igualmente liquida à temperatura e/ou ao pH fisiológicos e/ou em presença: * de electrólito fisiológico em concentração fisiológica, * e/ou de pelo menos um tensioactivo, o e incluindo uma suspensão coloidal, aquosa, com pequena viscosidade, com base em partículas de dimensão inferior ao mícron de polímero PO biodegradável, solúvel em água e portados de grupos hidrofóbicos GH, estando as partículas referidas associadas de um modo não covalente com pelo menos um interferão (e eventualmente com pelo menos um outro princípio activo), e sendo o meio de dispersão da suspensão essencialmente constituído por água, 22 ΡΕ1689426 caracterizada por a sua concentração em [PO] ser fixada num valor suficientemente elevado para permitir a formação de um depósito gelificado in vitro, na presença de pelo menos uma proteína.
De preferência, a formulação farmacêutica líquida de acordo com a invenção é caracterizada por uma concentração em [PO] que seja tal como segue: [PO] > 0,9 Cl, de preferência 20.Cl h [PO] h Cl, e melhor ainda 10.Cl > [po] > Cl em que Cl represente a concentração de "gelifi-cação induzida" das partículas de PO, tal como é medida por um teste GI. O depósito gelificado obtido após injecção paren-térica da formulação permite um prolongamento interessante da duração da libertação da proteína, bem como uma diminuição do pico de concentração plasmática de interfe-rão(ões) . A duração da libertação do PA é significativamente aumentada em relação à das formulações da técnica anterior, em especial das descritas no pedido de patente PCT publicado WO-A-00/30.618 e dos pedidos de patente 23 ΡΕ1689426 francesa não publicados Nos 02/07.008, 02/09.670, 03/50.190 e 01/50.641. O prolongamento da duração da libertação in vivo induzida pelas formulações de acordo com a invenção, é tanto mais apreciável quanto se verifica que os interferões libertados mantêm a sua actividade biológica total e não estão desnaturados.
Os interferões, no sentido da especificação presente, são indiferentemente interferões não modificados ou interferões modificados, por exemplo por enxerto de um ou de diversos grupos de polioxietileno. De entre as proteínas da família dos interferões, podem citar-se: o IFN alfa, o IFN beta e o IFN gama.
Em toda esta especificação, as disposições supra moleculares do polímero PO associado ou não a pelo menos um interferão e, eventualmente, a elo menos um outro princípio activo, serão indiferentemente designadas como "partículas sub-mícron" ou "nanopartículas". Isto corresponde a partículas de diâmetro hidrodinâmico médio (medido e acordo com um modo de operação Md definido adiante nos exemplos), compreendido por exemplo entre 1 e 500 nm, de preferência entre 5 e 250 nm.
Por outro lado, é especialmente importante registar que estas formulações são líquidas, isto é, apresentam de forma vantajosa uma viscosidade muito pequena, o que torna fácil a sua injecção. Elas apenas gelificam in vivo. 24 ΡΕ1689426
De acordo com a invenção, os qualificativos "liquido", "pequena" ou "muito pequena viscosidade" correspondem, de forma vantajosa, a uma viscosidade dinâmica a 20°C inferior ou igual a 5 Pa.s. Pode conseguir-se a medida d referência da viscosidade, por exemplo, a 20°C por intermédio de um reómetro AR1000 (TA Instruments) equipado com uma geometria cone-plano (4 cm, 2o). Mede-se a viscosidade v é medida para um gradiente de tensão de corte de 10 s"1. Este modo, a viscosidade das formulações de acordo com a invenção pode ser, por exemplo, compreendida entre lxlO’3 et 5 Pa.s, de preferência entre lxlO"3 e 0,8 Pa.s e, de modo ainda mais preferencial, de entre lxlO3 e 0,5 Pa.s.
Esta fraca viscosidade torna as formulações da invenção não apenas fáceis de injectar por via parentérica, em especial por via intramuscular ou subcutânea, entre outras, mas também facilmente esterilizáveis e com um custo menor por filtração através de filtros de esterilização cuja dimensão de poro seja de 0,2 ym.
Este estado liquido ou esta pequena viscosidade das formulações da invenção existe também às temperaturas de injecção correspondendo a temperaturas ambientes, por exemplo compreendidas entre 4 e 30°C, bem coo à temperatura fisiológica. A formulação de acordo com a invenção é, de preferência, uma suspensão coloidal aquosa de nanoparti- 25 ΡΕ1689426 cuias associadas a um ou diversos interferões e eventualmente um ou diversos outros PA. Isto não significa que, de acordo com a invenção, o meio de dispersão desta suspensão seja essencialmente formado por água. Na prática, esta água representa, por exemplo, pelo menos 50 % em peso, em relação à massa total da formulação.
No sentido em que se utiliza na invenção, o termo "proteína" designa tanto uma proteína como um péptido. Esta proteína ou este péptido pode ser modificado ou não, por exemplo, por enxertia ou de um ou de diversos grupos polioxietilénicos.
Por "proteínas fisiológicas" entende-se, no sentido utilizado na invenção, as proteínas e/ou os péptido s endógenos dos mamíferos com sangue quente, presentes no local da injecçâo.
Por "temperatura fisiológica", entende-se no sentido que é utilizado na invenção, a temperatura fisiológica dos mamíferos com sangue quente, a saber, por exemplo cerca de 37-42°C.
Por "pH fisiológico", entende-se no sentido que é utilizado na invenção, um pH compreendido por exemplo entre 6 e 7,6.
Por "gel", -se no sentido que é utilizado na invenção, um estado semi-sólido o qual é adquirido pela 26 ΡΕ1689426 formulação líquida de acordo com a invenção, e isto de forma espontânea devida unicamente à presença de proteína (s) fisiológica(s), sem intervenção essencial do pH fisiológico e/ou da temperatura fisiológica e/ou da presença de um electrólito fisiológico (por exemplo Ca++) e/ou da dispersão (ou dissipação) in vivo de um solvente orgânico eventualmente presente na formulação injectada.
Por "electrólito fisiológico" entende-se, no sentido que se utiliza na invenção, qualquer elemento do electrólito (por exemplo iões Ca++) presente nos mamíferos com sangue quente.
Por "concentração fisiológica" entende-se, no sentido que se utiliza na invenção, qualquer concentração fisiológica que exista nos mamíferos com sangue quente, para o meio fisiológico considerado.
Para além disto, as formulações de acordo com a invenção são não tóxicas, bem toleradas localmente e estáveis.
Integra-se igualmente no mérito dos inventores terem desenvolvido um teste GI in vitro que permite seleccionar uma população das formulações preferidas de acordo com a invenção, e determinar as concentrações idóneas em PO nas formulações.
De acordo com a invenção, o teste GI de medição 27 ΡΕ1689426 da concentração de gelificação Cl, é um teste de referência que permite definir a concentração critica Cl, denominada doravante neste documento concentração de gelificação induzida Cl, que caracteriza cada formulação coloidal de acordo com a invenção. 0 teste GI de determinação da concentração Cl de gelificação induzida é o seguinte:
Para determinar a concentração Cl, preparam-se formulações coloidais com concentrações variáveis de polímero anfifílico, de acordo com a invenção, e com uma concentração constante de proteína terapêutica. Para este objectivo dissolvem-se em água desionizada quantidades crescentes de polímero sob uma forma de pó seco. Mantêm-se as soluções a 25°C sob agitação magnética durante 16 horas antes de se misturarem com uma solução concentrada de proteína terapêutica. 0 volume e a concentração desta solução de proteína terapêutica são ajustados para se obter a concentração em proteína pretendida para a formulação [por exemplo 0,3 mg/mL de interferão alfa 2b].
Misturam-se as formulações coloidais que deste modo se prepararam com uma solução aquosa albumina de soro bovino (BSA) concentrado a 30 mg/mL, e em seguida centri-fuga-se durante 15 minutos a 3.000 rpm. Deixam-se as misturas sob agitação suave durante 24 h antes de serem recuperadas para serem caracterizadas. 28 ΡΕ1689426
As medidas da de viscoelasticidade são levadas a cabo num reómetro TA Instruments AR 1.000, equipado com uma geometria cone-plano (diâmetro de 4 cm e ângulo 1,59) . Uma deformação de 0,01 rad, situada no dominio da viscoelasticidade linear, é imposta a um ritmo sinusoidal percorrendo uma gama de frequências dessa sinusoide compreendida entre 0,1 e 300 rad/s. Mantém-se constante a temperatura da amostra, a 20°C, recorrendo a uma célula de Peltier.
Os espectros, em frequência, do módulo elástico G' e do módulo viscoso ou de perda, G", permitem definir o tempo de relaxação caracteristico Tr, que se define como sendo o inverso da frequência à qual o módulo G' cruza o módulo viscoso G". Pode encontrar-se uma descrição pormenorizada destas questões na obra de Ferry, Viscoelastic Properties of Polymers, J. D. Ferry, J. Wiley, NY, 1980, e no artigo de J. REGALADO et al. Macromolecules 1999, 32, 8580. A medição do tempo de relaxação Tr em função da concentração em polímero da formulação permite definir a concentração Cl à qual esse tempo Tr é superior a 1 segundo. Serão incluídos exemplos de valores da concentração de gelificação Cl no exemplo 7 adiante neste documento.
Do mesmo modo, podem definir-se as concentrações C0,1 e CIO, para as quais o tempo de relaxação ultrapassa respectivamente 0,1 s e 10 s. Estas concentrações classificam-se por ordem crescente do modo seguinte: C0,1 < Cl < CIO. 29 ΡΕ1689426
Numa variante da formulação de acordo com a invenção: > [PO] > C0,1, > de preferência [PO] á Cl, > e mais preferencialmente ainda [PO] ^ CIO.
Respeitando uma característica vantajosa adicional: [PO] ^ 20xCl
No sentido empregue na invenção e em toda a descrição presente, os termos "associação" ou "associar" empregues para qualificar as relações entre um ou mais princípios activos e os polímeros PO (por exemplo os poliaminoácidos), significam em especial que o ou os princípios activos estão ligados ao(s) polímero(s) PO [por exemplo o (ou os) poliaminoácido(s)] por uma ligação não covalente, por exemplo por interacção electrostática e/ou hidrofóbica e/ou por ligação de hidrogénio e/ou por impedimento estereoquímico.
Os polímeros PO de acordo com a invenção são polímeros biodegradáveis, solúveis em água e portadores de grupos hidrofóbicos GH. Os grupos hidrofóbicos podem ser em número pequeno em relação ao resto da cadeia e podem situar-se lateralmente em relação à cadeia ou intercalados 30 ΡΕ1689426 na cadeia, e estar repartidos de modo aleatório (copolimero estatístico) ou repartidos sob a forma de sequências ou de enxertos (copolímeros em blocos ou copolímeros sequenci- ados).
Sem pretender limitar, os polímeros PO modificados hidrofóbicos podem ser seleccionados de entre o conjunto incluindo os copoliaminoácidos anfifílicos, os polissacáridos - de preferência no subgrupo que inclui os pululanos e/ou as quitosanas e/ou os mucopolissacáridos -, as gelatinas ou as suas misturas.
De acordo com um modo preferido de realização da invenção, selecciona-se PO de entre os copoliaminoácidos anfifílicos.
No sentido que lhe é conferido na invenção e na exposição presente, o termo «poliaminoácido» inclui também os oligoaminoácidos contendo entre 2 e 20 unidades de "aminoácido", além dos poliaminoácidos compreendendo mais de 20 unidades de "aminoácido".
De preferência, os poliaminoácidos de acordo com a invenção presente são oligómeros ou homopolímeros que incluem unidades recorrentes de ácido glutâmico ou de ácido aspártico ou copolímeros compreendendo uma mistura destes dois tipos de unidades de "aminoácido". As unidades consideradas nestes polímeros são aminoácidos com a configuração D ou L ou D/L e que se ligam pelas suas posições alfa ou 31 ΡΕ1689426 gama da unidade glutamato ou ácido glutâmico e alfa ou beta da unidade ácido aspártico ou aspartato.
As unidades "aminoácido" preferidas da cadeia principal de poliaminoácido são as que apresentam a configuração L e uma ligação do tipo alfa.
De acordo com um modo ainda mais preferido de realização da invenção, o polímero PO é um poliaminoácido formado por unidades de ácido aspártico e/ou unidades de ácido glutâmico, em que pelo menos uma parte destas unidades seja portadora de enxertos contendo pelo menos um grupo hidrofóbico GH. Estes poliaminoácidos são nomeadamente do tipo dos que estão descritos no pedido de patente PCT WO-A-00/30.618 .
De acordo com uma primeira possibilidade, o (ou os) PO da formulação são definidos pela fórmula geral (I) seguinte:
R1 represente um H, um alquilo linear em C2 a Cio ou ramificado em C3 a Cio, benzilo, uma unidade aminoácido terminal ou -R4-[GH]; ΡΕ1689426 32 R2 represente um H, um grupo acilo linear em C2 a Cio ou ramificado em C3 a Cio, um piro-glutamato ou -R4-[GH]; R3 seja um H ou uma entidade catiónica, de preferência seleccionada de entre o grupo contendo : • os catiões metálicos seleccionados vanta josamente de entre o subgrupo que inclua: o sódio, o potássio, o cálcio, o magnésio, • os catiões orgânicos seleccionados vanta josamente de entre o subgrupo que inclua: 0 os catiões com base em aminas, 0 os catiões com base em oligoaminas, 0 os catiões com base em poliamina (sendo a polietilenoimina especialmente preferida), o os catiões com base em aminoácido (s) , seleccionados vantajosamente de entre a classe que inclua os catiões baseados em lisina ou em arginina, 0 ou os poliaminoácidos canónicos, seleccionados vantajosamente de entre o subgrupo que inclui a polilisina ou a oligolisina; ΡΕ1689426 33 R4 represente uma ligação directa ou um "espaçador" com base em 1 a 4 unidades de aminoácido; A represente independentemente um grupo -CH2-(unidade de ácido aspártico) ou -CH2-CH2-(unidade de ácido glutâmico); n/(n+m) seja definido como a taxa molar de enxertia e varie de 0,5 a 100 %, em termos molares; n/ (n+m) seja definido como a taxa de enxertia molar e o seu valor seja suficientemente para que quando se dissolve o PO em água a pH 7 e a 25°C, se forme uma suspensão coloidal de partículas sub-mícron de PO, de preferência n/(n +m) estará compreendido entre 1 e 25 %, em moles, e ainda mais preferivelmente entre 1 e 15 %, em moles; n + m se defina como o grau de polimerização e varie de 10 a 1.000, de preferência entre 50 e 300; GH represente um grupo hidrofóbico.
De acordo com uma segunda possibilidade, o (ou 34 ΡΕ1689426 os) PO da formulação corresponde(em) a uma das fórmulas gerais (II), (III) e (IV) seguintes:
/ COOR' 3·
COOR m
R L1 I M R50 I rJnf R
[GH] V
O H (IV) nas quais: GH represente um grupo hidrofóbico; R seja um grupo alquilo linear em C2 a Cê/ R3 seja um H ou uma entidade catiónica, de preferência seleccionada de entre o conjunto constituído por: • os catiões metálicos vantajosamente selec-cionados de entre o subconjunto incluindo: o sódio, 0 potássio, o cálcio, 0 magnésio, ΡΕ1689426 35 • os catiões orgânicos seleccionados vantajosamente de entre o subconjunto que inclua: o os catiões com base em aminas, o os catiões com base em oligoaminas, o os catiões com base em poliaminas (sendo especialmente preferida a polietileno-imina), o os catiões com base em aminoácido (s) seleccionados vantajosamente de entre a classe que inclui os catiões com base em lisina ou em arginina, • ou os poliaminoácidos catiónicos vantajosamente seleccionados de entre o subconjunto que inclua a polilisina ou a oligolisina, R se]a um grupo alquilo, dialcoxilo ou diamina em C2 a Cê; R4 represente uma ligação directa ou um "espaçador" com base em 1 a 4 unidades de aminoácido; A represente independentemente um grupo -CH2- 36 ΡΕ1689426 (unidade aspártica) ou -CH2-CH2-(unidade glutâ-mico); n'+ m', em que n' seja definido como o grau de polimerização e varie de 10 a 1.000, de preferência entre 50 e 300.
De forma vantajosa, os grupos GH do PO representem cada um deles independentemente um grupo monovalente com a fórmula seguinte:
na qual: • R5 represente um grupo metilo (alanina), iso-propilo (valina), isobutilo (leucina), sec-butilo (isoleucina), benzilo (fenilalanina); •R represente um grupo hidrofóbico contendo de 6 a 30 átomos de carbono; •1 varie de 0 a 6.
De acordo com uma caracteristica notável da invenção, a totalidade ou uma parte dos grupos hidrofóbicos R6 dos PO são seleccionados de modo independente, de entre o conjunto de grupos que inclui: 37 ΡΕ1689426 • um alcoxilo linear ou ramificado comportando de 6 a 30 átomos de carbono e podendo comportar pelo menos um heteroátomo (de preferência O e/ou N e/ou S) , e/ou pelo menos uma insaturação, • um alcoxilo comportando 6 a 30 átomos de carbono e contendo um ou diversos carbociclos anelados e contendo eventualmente pelo menos uma insaturação e/ou pelo menos um heteroátomo (de preferência O e/ou N e/ou S), • um alcoxiarilo ou um ariloxialquilo com 7 a 30 átomos de carbono e podendo comportar pelo menos uma insaturação e/ou pelo menos um heteroátomo (de preferência O e/ou N e/ou S).
Na prática em sem que isto seja limitativo, o grupo hidrofóbico R6 do enxerto do PO provém de um precursor alcoólico seleccionado de entre o conjunto constituído por: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, álcool oleílico, tocoferol ou colesterol.
De acordo com uma primeira forma de realização da invenção, as cadeias principais dos poliaminoácidos são homopolímeros de alfa-L-glutamato ou de ácido alfa-L-glutâmico.
De acordo com uma segunda forma de realização da 38 ΡΕ1689426 invenção, as cadeias principais dos poliaminoácidos são homopolímeros de alfa-L-aspartato ou de ácido alfa-L-aspártico.
De acordo com uma terceira forma de realização da invenção, as cadeias principais dos poliaminoácidos são copolimeros de alfa-L-aspartato/alfa-L-glutamato ou de ácido alfa-L-aspártico/alfa-L-glutâmico.
De forma vantajosa, a distribuição das unidades ácido aspártico e/ou ácido glutâmico da cadeia de poliaminoácidos principal do PO é tal que o polímero constituído deste modo é ou aleatório, ou do tipo em blocos, ou ainda de tipo multiblocos.
De preferência, o PO utilizado na formulação de acordo com a invenção a uma massa molar que se situa entre 2.000 e 100.000 g/mole, e de preferência entre 5.000 e 40.000 g/mole.
Segundo um primeiro modo preferido de realização da formulação, o grupo hidrofóbico R6 do enxerto do PO é proveniente de um precursor alcoólico formado pelo tocoferol: ♦ 1 % < [n/(n+m)]x 100 < 10 % ♦ de preferência 3,5 % ^ [n/(n+m)]x 100 < 7,5 % 39 ΡΕ1689426 ♦ n+m varia entre 100 e 400, de preferência entre 120 e 300.
Segundo um segundo modo preferido de realização da formulação, o grupo hidrofóbico R6 do enxerto do PO é proveniente de um precursor alcoólico formado pelo colesterol: ♦ 1 % < [n/(n+m)]x 100 < 10 % ♦ de preferência 3,5 % ^ [n/(n+m)] x 100 ^ 6,5 o, 0 ♦ n+m varia entre 100 e 400, de preferência entre 120 e 300.
Nestes dois modos preferidos de realização da formulação da invenção, é vantajoso que a concentração em polímero [PO] esteja compreendida entre 15 e 50 mg/mL.
De acordo com uma variante, o PO da formulação de acordo com a invenção é portador de pelo menos um enxerto do tipo polialquilenoglicol, ligado a uma unidade de glutamato e/ou aspartato.
De uma forma vantajosa, este enxerto é do tipo polialquilenoglicol com a fórmula (V) seguinte. 40 ΡΕ1689426
(V) na qual: • R'4 represente uma ligação directa ou um "espaçador" com base em 1 a 4 unidades de ami-noácido; • X seja um heteroátomo seleccionado de entre o conjunto que comporta o oxigénio, o azoto ou o enxofre; • R7 e R8 representem independentemente um H, um alquilo linear em Ci a C4; • n"' varie de 10 a 1.000, de preferência de 50 a 300.
Na prática, o polialquilenoglicol será, por exemplo, um polietilenoglicol. è desejável, de acordo com a invenção, que a percentagem molar de exertia do polialquilenoglicol varie de 1 a 30 I.
Os poliaminoácidos PO são além disto extremamente interessantes, porque a uma taxa de enxertia ajustável, 41 ΡΕ1689426 eles se dispersam em água a pH 7,4 (por exemplo com um tampão fosfato), para dar suspensões coloidais.
Para além disto, os princípios activos que são os interferões ou outros PA seleccionados de entre as proteínas, os péptidos ou as pequenas moléculas, podem associar-se espontaneamente a nanopartículas compreendendo estes poliaminoácidos PO. É conveniente que se entenda que os PO com base em poliaminoácidos contêm funções carboxílicas que são, quer neutras (forma COOH), quer ionizadas (anião C00“) , consoante o pH e a composição. Por esta razão, a solubilidade numa fase aquosa é função directa da taxa de COOH livres dos PO (sem os enxertos com o motive hidrofóbico) e do pH. Em solução aquosa, o contra-catião pode ser um catião metálico tal como o sódio, o cálcio ou o magnésio, ou um catião orgânico tal como o da tri-etanolamina, o do tris(hidroximetil)-aminometano ou uma poliamina tal como a polietilenoimina.
Os PO de tipo poliaminoácido susceptíveis de serem utilizados na formulação da invenção são, por exemplo, obtidos por métodos conhecidos do especialista da técnica. Os poliaminoácidos estatísticos podem ser obtidos por enxertia do enxerto hidrofóbico, previamente funciona-lizado pelo "espaçador", directamente sobre o polímero por uma reacção clássica de acoplamento. Os PO poliaminoácidos em blocos ou em multiblocos podem ser obtidos por 42 ΡΕ1689426 polimerização sequencial dos anidridos dos N-carboxi-aminoácidos (NCA) correspondentes.
Prepara-se por exemplo um poliaminoácido, o homopoliglutamato, o homopoliaspartato ou um copolímero de glutamato/aspartato, em bloco, multibloco ou aleatório, seguindo os métodos clássicos.
Para a obtenção de um poliaminoácido do tipo alfa, a técnica mais corrente baseia-se na polimerização de anidridos de N-carboxi-aminoácidos (NCA), descrita, por exemplo, no artigo em Biopolymers, 1976, 15, 1869, e na obra de H. R. Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydride and related Heterocycles", Springer Verlag (1987) . Os derivados de NCA são de preferência derivados NCA-O-Me, NCA-O-Et ou NCA-O-Bz (Me = Metilo, e = Etilo e Bz = Benzilo) . Os polímeros são em seguida hidrolisados nas condições apropriadas para se obter o polímero sob a sua forma ácida. Estes métodos são inspirados na descrição constante da patente FR-A-2.801.226 da entidade ora solicitante. Um certo número dos polímeros utilizáveis de acordo com a invenção, por exemplo, os de tipo ácido poli (alfa-L-aspártico), ácido poli (alfa-L-glutâmico), ácido poli(alfa-D-glutâmico) e ácido poli(gama-L-glutâmico), com diversos valores diferentes de massa, encontram-se disponíveis no comércio. O ácido poliaspártico de tipo alfa-beta é obtido por condensação do ácido aspártico (para se obter uma polissuccinimida) seguindo-se uma hidrólise básica (cf. Tomida et al., Polymer 1997, 38, 4733-36). 43 ΡΕ1689426 0 acoplamento do enxerto com uma função ácido do polímero é levado a cabo facilmente por reacção do poliaminoácido, na presença de um agente de acoplamento tipo carbodi-imida, e opcionalmente um catalisador tal como a 4-dimetilaminopiridina, e num solvente apropriado tal como a dimetilformamida (DMF), a N-metilpirrolidona (NMP) ou o sulfóxido de dimetilo (DMSO). A carbodi-imida será por exemplo, a diciclohexil-carbodi-imida ou a di-isopropilcarbodi-imida. A taxa de enxertia é quimicamente controlada pela estequiometria dos constituintes e reagentes ou o tempo de reacção. Os enxertos hidrofóbicos funcionalizados por um "espaçador" são obtidos por acoplamento peptídico clássico ou por condensação directa por catálise ácida. Estas metodologias são bem conhecidas do especialista da técnica.
Para a síntese de copolímeroe em bloco ou multibloco, utilizam-se derivados de NCA previamente sintetizados já com o enxerto hidrofóbico. Por exemplo, o derivado NCA-hidrofóbico é copolimerizado com o NCA-O-Benzilo, e em seguida retiram-se selectivamente por hidrólise os grupos benzílicos. A síntese de poliaminoácidos PO leva preferivelmente a suspensões aquosas de nanopartículas de PO.
As suspensões obtidas podem ser transformadas em pós de nanopartículas de PO por secagem, de modo apropriado 44 ΡΕ1689426 e conhecido dos especialistas da técnica, tal como por exemplo: aquecimento (estufa....), tratamento em vazio, utilização de exsicantes, liofilização, atomização.
Estas nanoparticulas de PO, em suspensão ou no estado de pó, formam uma matéria-prima para a preparação das formulações de acordo com a invenção. A este propósito, pode pormenorizar-se afirmando que as formulações de acordo com a invenção resultam da associação não covalente de nanoparticulas com base em pelo menos um PO e pelo menos um PA, num meio liquido aquoso.
Para a preparação, o PO e/ou o (os) interfe-rão(ões) (e/ou o eventual PA suplementar) pode (podem) estar sob forma de um sólido (de preferência um pó) e/ou sob uma forma liquida (de preferência uma suspensão aquosa coloidal). A associação interferão(ões)/PO significa no sentido da especificação presente, que o (ou os) interferão (ões) está (estão) associado (s) com o(s) polímero (s) PO [por exemplo um ou mais poliaminoácido (s) ] por uma ou diversas ligações diferente(s) de uma (ou de várias) ligação (ões) química(s) covalente (s) .
As técnicas de associação de um ou de diversos interferões aos PO de acordo com a invenção, estão descritas nomeadamente no pedido de patente WO-A-00/30.618. Elas 45 ΡΕ1689426 consistem em incorporar pelo menos um interferão (e um ou diversos outros principio (s) activo(s) eventual (is)) no meio liquido que contém nanoparticulas de PO, de modo a se obter uma suspensão coloidal de nanoparticulas carregadas em, ou associadas com, um ou diversos interferões (e um com (ou diversos) outro (s) principio (s) activo(s) eventual (is)) . A invenção tem portanto igualmente como objecto um processo de preparação da formulação descrita acima.
De acordo com um primeiro modo preferido de preparação, este processo é caracterizado por consistir essencialmente: ♦ em produzir uma suspensão coloidal de nanoparticulas com pelo menos um PO, ♦ em misturar esta suspensão coloidal de nanoparticulas de PO com pelo menos um interferão (e um ou mais outros princípio(s) activo(s) eventuais), de preferência em solução aquosa, ♦ em adicionar eventualmente pelo menos um excipiente, ♦ caso seja necessário, em ajustar o pH e/ou a osmolaridade e, 46 ΡΕ1689426 ♦ eventualmente em filtrar a suspensão que deste modo se obtém.
De uma forma vantajosa, o interferão (e um ou mais outros princípio (s) activo(s) eventuais) está sob a forma de uma suspensão ou de uma solução aquosa para misturar com a suspensão coloidal de nanopartícuias de PO.
De acordo com um segundo modo de realização, este processo é caracterizado por consistir essencialmente: ♦ em preparar pelo menos um polímero PO em pó, em misturar este pó com uma suspensão ou solução aquosa de pelo menos um interferão (e um ou diversos outros princípio(s) activo(s) eventuais), de preferência em solução aquosa, em adicionar eventualmente pelo menos um excipiente, caso seja necessário, em ajustar o pH e/ou a osmolaridade, e eventualmente em filtrar a suspensão que deste modo se obteve.
As formulações que se obtêm deste modo podem igualmente ser colocadas sob a forma de um gel, de um pó ou 47 ΡΕ1689426 de um filme, por métodos clássicos conhecidos do especialista da técnica, tais como a concentração por diafil-tração ou por evaporação, o revestimento, a atomização ou a liofilização, entre outras. Estes métodos podem ser eventualmente combinados.
Existe portanto um terceiro modo de concretizar o processo de preparação das formulações liquidas de acordo com a invenção, consistindo este terceiro modo essencialmente : em obter um pó proveniente de uma secagem da formulação liquida de acordo com a invenção, tal como se definiu acima neste documento, em misturar este pó com um meio liquido aquoso, de preferência sob agitação, em adicionar-lhe eventualmente pelo menos um excipiente, caso seja necessário, em ajustar o pH e/ou a osmolaridade, e eventualmente em filtrar a suspensão que assim se obteve.
Os excipientes susceptiveis de serem adicionados são por exemplo agentes antimicrobianos, tampões, antioxi- 48 ΡΕ1689426 dantes, agentes que permitem ajustar a isotonicidade e que são do conhecimento do especialista da técnica. Será portanto possível referir-se a obra: Injectable Drug Development, P.K. Gupta et ai., Interpharm Press, Denver, Colorado 1999. A eventual filtração da formulação líquida através de filtros com uma porosidade igual a, por exemplo, 0,2 ym, permite a sua esterilização. A formulação filtrada pode portanto ser directamente injectada a um paciente.
Todos estes exemplos de preparação de formulações líquidas de acordo com a invenção são vantajosamente levados a cabo sob uma atmosfera e uma temperatura ambientes (por exemplo a 25°C).
Seguindo uma disposição interessante da formulação de acordo com a invenção, a fracção em massa em inter-ferão(ões) não associado(s) às partículas sub-mícron de interferão(ões) não associado (s)] em % ponderai será tal que: o [interferão(ões) não associado(s)] < 1 o de preferência [interferão(ões) não associado (s) ] ^ 0,5.
De acordo com a invenção, o interferão preferido é o interferão alfa. 49 ΡΕ1689426
Num dos seus outros aspectos, a invenção engloba qualquer produto derivado que se obtenha a partir da formulação liquida de acordo com a invenção, tal como se definiu acima, e incluindo partículas sub-micron, formadas por associações não covalentes PO/interferão tais como se definiram acima neste documento.
Na prática, estes produtos derivados podem nomeadamente ser constituídos por pós, geles, implantes ou filmes, entre outros.
Além disto, a invenção visa qualquer precursor da formulação líquida injectável, tal como definida supra.
Tratando-se de qualquer modo destes produtos derivados, deve sublinhar-se que a invenção diz respeito a um processo de preparação de um pó derivado da formulação tal como definida acima, sendo este processo caracterizado por o referido pó ser obtido por secagem da formulação tal como definida acima neste documento. A formulação de acordo com a invenção é de preferência farmacêutica, sem se excluírem as formulações cosméticas, dietéticas ou fitossanitárias incluindo pelo menos um PO tal como se definiu acima neste documento, e pelo menos um interferão e eventualmente pelo menos um outro princípio activo. 50 ΡΕ1689426
De acordo com a invenção, o princípio activo suplementar eventual que não seja um interferão, pode ser uma proteína, uma glicoproteína, uma proteína ligada a uma ou diversas cadeias de polialquilenoglicol [de preferência polietilenoglicol (PEG): "proteína-PEGilada"], um polissa-cárido, um lipo-sacárido, um oligonucléotido, um polinu-cléotido ou um péptido.
Pode seleccionar-se este princípio activo suplementar de entre as hemoglobinas, os citocromas, as albuminas, os interferões, as citoquinas, os antigénios, os anticorpos, eritropoietina, a insulina, as hormonas de crescimento, os factores VIII e IX, os factores estimulantes da hematopoiese ou as misturas destes.
De acordo com uma variante, este princípio activo suplementar é uma molécula orgânica "pequena", hidrofóbica, hidrofílica ou anfifílica, por exemplo os péptidos tais como o leuprólido ou a ciclosporina ou as pequenas moléculas tais como as que pertencem à família das antraci-clinas, dos taxóides ou das camptotecinas, e as suas misturas .
Entre as qualidades primordiais da formulação de acordo com a invenção, figuram o seu carácter injectável e a sua capacidade para formar um depósito no local da injecção, in vivo, por gelificação ou então por agregação das nanopartículas, em presença de proteínas fisiológicas ou análogos. 51 ΡΕ1689426 A formulação de acordo com a invenção pode nomeadamente ser injectada por via parentérica, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor. A formulação de acordo com a invenção pode também ser administrada por via oral, nasal, vaginal, ocular ou bucal.
De forma vantajosa, a formulação destina-se à preparação de medicamentos, em especial para administração parentérica, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor, ou ainda por via oral, nasal, vaginal ou ocular.
Ainda que a formulação de acordo com a invenção seja de preferência farmacêutica, isto não exclui as formulações cosméticas, dietéticas ou fitossanitárias contendo pelo menos um PO tal como se definiu acima, e pelo menos um princípio activo correspondente.
De acordo com um outro ainda dos seus aspectos, a invenção visa um processo de preparação de medicamentos, em especial para administração por via parentérica, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor, seja ainda por via oral, nasal, vaginal ou ocular, caracterizado por consistir essencialmente a utilizar uma formulação tal como a definida acima 52 ΡΕ1689426 e/ou qualquer outro produto derivado dela e/ou qualquer precursor da formulação referida. A invenção será mais bem compreendida e as suas vantagens e variantes de concretização tornar-se-ão mais evidentes a partir dos exemplos que se seguem e que descrevem a sintese dos PO formados por poliaminoácidos enxertados com um grupo hidrofóbico, a sua transformação em sistema de libertação prolongada de um interferão, a saber numa formulação de acordo com a invenção (suspensão coloidal aquosa estável) e a demonstração da capacidade de um tal sistema não apenas para se associar a um interferão, mas sobretudo para gelificar/reticular, para libertar de um modo muito prolongado, in vivo, os interferões.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Curvas de concentrações plasmáticas de IFN (picograma/mL) obtidas no cão após injecção subcutânea • da formulação de IFN (A) de acordo com a invenção (exemplos 9 & 10): (curva ---), • e da formulação de IFN (D) testemunho, for a do âmbito da invenção (exemplo 10): (curva -A-A-), 53 ΡΕ1689426 em função do tempo T em horas e a uma dose de IFN de 60 pg/kg.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Polímero anfifílico PI Síntese de um poliglutamato enxertado com alfa-tocoferol de origem sintética
Dissolvem-se 5,5 g de um alfa-L-poliglutamato (com massa equivalente a cerca de 10.000 Da) em relação à de um padrão de polioxietileno, e que se obteve por polimerização de NCAGluOMe seguida por uma hidrólise tal como se encontra descrito no pedido de patente FR-A-2.801.226), em 92 mL de dimetilformamida (DMF), aquecendo-se a 4 0°C durante 2 horas. Uma vez dissolvido o polímero, deixa-se a temperatura baixar até 25°C e adicionam-se sucessivamente 1,49 g de D,L-alfa-tocoferol (> 98 %, adquirido na Fluka®) previamente dissolvido em 6 mL de DMF, 0,09 g de 4-dimetilaminopiridina previamente dissolvida em 6 mL de DMF, e 0,57 g de di-isopropilcarbodi-imida previamente dissolvida em 6 mL de DMF. Passadas 8 horas a 25°C sob agitação, verte-se a mistura reaccional sobre 800 mL de água contendo 15 % de cloreto de sódio e de ácido clorídrico (pH 2) . Em seguida recupera-se o polímero precipitado por filtração, lava-se com ácido clorídrico 0,1 N e depois com água. Em seguida dissolve-se de novo o polímero em 75 54 ΡΕ1689426 mL de DMF e volta a precipitar-se em água contendo tal como acima, sal e ácido clorídrico até pH 2. Depois de duas lavagens com água, lava-se diversas vezes com éter di-isopropílico. Seca-se em seguida o polímero numa estufa de vácuo a 40°C. Obtém-se um rendimento da ordem dos 85 %.
Exemplo 2 : Polímeros anfifílicos P2, P3, P4, P5 e P6
Obtêm-se estes polímeros do mesmo modo que se obteve o polímero PI. Na tabela 1 adiante resumem-se as características destes polímeros. Apresentam-se as do polímero Pl a título comparativo. TABELA 1
Polí mero Mn1 g/mol do poliglutamato Grupo hidrofóbico % de enxertia (RMN)2 Mn1 g/mol do polímero Pl 10.000 alfa-Tocoferol3 7 13.900 P2 10.000 alfa-Tocoferol3 4 14.400 P3 16.900 alfa-Tocoferol3 4 15.200 P4 10.000 Colesterol 5 11.500 P5 16.900 Colesterol 5 12.900 P6 10.000 n-Dodecanol 15 11.500 1 Em equivalentes de polioxietileno. 2 Taxa de enxertia molar estimada por RMN do protão. 3 com origem sintética 55 ΡΕ1689426
Exemplo 3: Preparação de 30 mL de uma formulação de interferão alfa 2b (IFN) baseada no polímero P6. (a) Preparação de uma solução coloidal de polímero anfífílíco:
Introduz-se num recipiente 1,5 g de um pó liofi-lizado constituído pelo poliaminoácido anfifílico P6 do exemplo 2 acima. Dissolve-se este pó em 30 mL de água estéril para injecção. Mantém-se a solução de polímero durante 16 horas a 35°C, sob agitação magnética. Ajusta-se a osmolaridade da solução a 275 ± 20 mOsmol utilizando um osmómetro Fiske Mark 3, e introduzindo a quantidade necessária de uma solução aquosa de NaCl 5,13 M (a 30 %, em peso). Ajusta-se o pH, caso seja necessário, a pH 7,4 + 0,2, por adição de uma solução 1 N de NaOH. Ajusta-se a concentração de polímero a 45 mg/mL adicionando uma solução aquosa estéril de NaCl 0,15 M.
Em seguida filtra-se a solução de polímero através de um filtro com poros com uma dimensão compreendida entre 0,8 e 0,2 mícron, e depois armazena-se a 4°C. (b) Associação entre a proteína e o polímero:
Em seguida mistura-se num recipiente em vidro 26,65 mL da solução coloidal de polímero P6 precedente e 1,85 mL de solução de IFN (PC GEN; solução concentrada a 2,42 mg/mL). Voltam a ajustar-se a osmolaridade e o pH, caso seja necessário, a 300 ± 20 mOsmol e a pH 7,4 ± 0,2, por adição de hidróxido de sódio 0,1 N e de cloreto de 56 ΡΕ1689426 sódio estéril a 0,9 %. Deixa-se maturar a solução contendo proteína durante 5 h a 25°C numa estufa, e em seguida filtra-se através de 0,8-0,2 mícron.
Obtém-se deste modo 30 mL de uma formulação pronta para ser injectada, contendo 0,15 mg/mL de IFN e 40 mg/mL de polímero P6.
Exemplo 4: Preparação de uma formulação de inter-ferão (IFN) com actuação longa de acordo com a invenção presente, com base em um dos polímeros Pl a P5. A preparação é levada a cabo tal como no exemplo 3, preparando-se num primeiro passo uma solução coloidal de polímero com uma concentração 1,25 vezes superior à concentração final pretendida, e misturando-se em seguida esta solução com uma solução de interferão concentrada a 2,42 mg/mL. O volume da solução de proteína é determinado pela selecçâo da razão entre a concentração em polímero e a concentração da proteína utilizada. Tal como no exemplo 3, os ajustamentos de concentrações e de pH são levados a cabo adicionando-se soluções de NaCl e de soda cáustica.
Exemplo 5: Medição do diâmetro hidrodinâmico médio das nanopartícuias de diferentes polímeros PO de acordo com a invenção.
Mede-se o diâmetro hidrodinâmico médio das partículas de polímero PO de acordo com a invenção de acordo com o modo operatório Md definido adiante neste documento. 57 ΡΕ1689426
Preparam-se as soluções de PO a concentrações de 1 ou 2 mg/mL, em meio de NaCl 0,15 M, e deixam-se sob agitação durante 24 h. Em seguida filtram-se estas soluções através de poros 0,8-0,2 ym, antes de se analisarem por difusão dinâmica da luz graças a um aparelho do tipo Brookhaven, funcionando com um feixe laser com um comprimento de onda de 488 nm e com uma polarização vertical. Calcula-se o diâmetro hidrodinâmico das nanoparticulas de polímero PO a partir da função de autocorrelação do campo eléctrico pelo método dos acumulantes, tal como se descreve na obra «Surfactant Science Series», volume 22, Surfactant Solutions, Editado por R Zana, capítulo 3, M. Dekker, 1984.
Obtêm-se os seguintes resultados para os polímeros PO P2 P3 P4 e P6 do exemplo 2: TABELA 2
Polímero Diâmetro hidrodinâmico médio (nm) P2 60 P3 90 P4 30 P6 15
Exemplo 6: Associação espontânea de uma proteína com as nanoparticulas de polímero PO
Prepara-se uma solução de tampão fosfato 25 mM a 58 ΡΕ1689426 partir de NaH2PC>4 em pó (Sigma, refa S-0751) e ajusta-se a um pH = 7,2 com soda cáustica 1 N (SDS, refa 3474015).
Prepara-se uma suspensão coloidal de nanopartí-culas de polímero Pl por dissolução durante uma noite, do polímero liofilizado, a 5 mg/mL na solução precedente de tampão fosfato.
Prepara-se uma solução de reserva de BSA (Sigma A-2934) por dissolução durante duas horas desta proteína a 10 mg/mL no mesmo tampão.
Filtra-se a solução de reserva bem como o tampão através de filtros cujos diâmetros de poro sejam inferiores a 0,22 ym.
Preparam-se misturas adicionando volumes previa-mente determinados das duas soluções de reserva e por diluição com o tampão fosfato, de modo a se obter como produto final uma gama de amostras com uma concentração constante em polímero (0,1 mg/mL) e com concentrações crescentes em proteínas (0 a 1,8 mg/ml).
Deixam-se as amostras durante 5 horas a associar-se a 25°C e em seguida analisam-se por electroforese capilar por um método apelidado de frontal, no qual é possível visualizarem-se em separado a proteína e o complexo proteína-polímero. Para mais pormenores acerca 59 ΡΕ1689426 deste método, poderá consultar-se o seguinte artigo: Gao J. Y., Dublin, P. L., Muhoberac, B. B., Anal. Chem. 1997, 69, 2945. As análises são obtidas num aparelho Agilent G16000A munido de um capilar com bolha em silicio fundido (do tipo G1600-62-232). A altura do primeiro prato que corresponde à proteína livre permite determinar a concentração em BSA não associado. A experiência mostra que para quantidades de proteína inferiores a 0,1 g de proteína por g de polímero, a proteína está associada às nanopartículas de polímero.
Exemplo 7 Determinação da concentração de gelificação Cl para os polímeros PO: PI a P4 e P6.
Aplica-se o teste GI a formulações de IFN associadas aos polímeros PI a P6 dos exemplos 1 e 2. As concentrações em proteína nestas formulações estão listadas na tabela adiante. A medição do tempo de relaxação das formulações em presença de BSA (a uma concentração de 30 mg/mL) efectua-se seguindo o modo de operação do teste GI. A concentração crítica Cl, à qual o tempo de relaxação excede 1 s, está listada na tabela 3 para o IFN. TABELA 3:
Concentração de gelificação induzida oara formulações de IFN Polímero PI P2 P3 P4 P6 Concentração em IFN (mg/mL) 0,3 0,15 0,15 0,15 0,3 Concentração Cl (mg/mL) 17 >30 16 17 >50 60 ΡΕ1689426
Exemplo δ: Farmacocinética do IFN no cão após injecção subcutânea de uma formulação de IFN pertencendo à selecção de acordo com a invenção.
Prepara-se uma formulação (A) de IFN (concentração de 0,3 mg/mL) e de polímero anfifílico PI com uma concentração de 30 mg/mL seguindo o modo operatório descrito no exemplo 4. Injecta-se esta formulação por via subcutânea em cães Beagle (n = 3) , à dose de 60 yg/kg) . Obtêm-se amostras de soro nos instantes de 1, 5, 11, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 e 240 horas após a injecção. Mede-se a concentração em IFN no plasma destas amostras por doseamento ELISA ( estojo Immunotech IM 3193).
Obtém-se deste modo um perfil de concentração média no plasma tal como se representa na figura 1, que torna realmente muito clara a libertação prolongada da proteína no soro, em comparação com a obtida a partir de uma formulação testemunho (D) que não pertence à invenção, de IFN (concentração de 0,3 mg/mL) e de polímero anfifílico P6 com a concentração de 40 mg/mL (cf. a tabela 4, exemplo 9) . Num plano quantitativo, o prolongamento da libertação do IFN pelas formulações de acordo com a invenção é estimado pela medição: (a) do período de tempo Tmax, mediana dos períodos de tempo para os quais a concentração no plasma é máxima, 61 ΡΕ1689426 (b) do período de tempo T5o, média dos períodos de tempo ao fim dos quais a área sob a curva de concentração no plasma atinge 50 % do seu valor máximo medido.
No caso desta formulação, os períodos de tempo Tmax e T50 assumem os valores de:
Tmax = 48 horas, T50 = 54,2 horas.
Exemplo 9: Farmacocinética do IFN no cão após injecção subcutânea de diversas formulações de IFN baseadas em poliaminoácidos anfifílicos.
Preparam-se as seguintes formulações seguindo o modo operatório descrito no exemplo 4. TABELA 4
Formulação Polímero Concentração Concentração Tempo de em polímero em IFN relaxação (mg/mL) (mg/mL) Tr (s) A PI 30 0,3 >10 B PI 10,5 0,15 <0,3 C P2 15 0,15 <0,03 D P6 40 0,3 0,4 62 ΡΕ1689426 A formulação A apresenta uma concentração em polímero superior à concentração de gelificação Cl medida no exemplo 7. Por outras palavras, o período de tempo de relaxação, medido no teste GI é superior a 1 segundo. Esta formulação A pertence portanto à selecção de acordo com a invenção. Por outro lado, as formulações B, C e D têm concentrações inferiores às suas concentrações de gelificação e não pertencem à selecção de acordo com a invenção.
Estas formulações são injectadas à dose de 60 yg/kg em cães Beagle. Obtêm-se amostras de plasma nos momentos correspondentes a 1, 5, 11, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 e 240 horas.
Mede-se a concentração plasmática de IFN tal como no exemplo precedente. Os períodos de tempo Tmax e T50 para as formulações A, B, C e D estão listados na tabela 5 imediatamente adiante. TABELA 5
Formulação de Referência Tmax (h) T50 (h) A 48 54,2 B 5 1—1 l_ C 11 19,3 D 5 17,3
Deste modo, a formulação A, que pertence à selecção de acordo com a invenção, apresenta uma duração de 63 ΡΕ1689426 libertação consideravelmente aumentada em relação às formulações B, C, e D que não pertencem à selecção de acordo com a invenção.
Exemplo 10: Observação da gellflcação in vivo das formulações de acordo com a invenção, após injecção subcutânea .
Estudou-se o comportamento subcutâneo das formulações de acordo com a invenção, no porco doméstico. Levaram-se a cabo injecções sob a pele do ventre, a 4 mm de profundidade, em seis porcos domésticos, com 0,3 mL das seguintes formulações:
Formulação A: solução aquosa isotónica com pH 7.3 do polímero P6 do exemplo 2, com concentração de 45 mg/mL.
Formulação B: solução aquosa isotónica com pH 7.3 do polímero PI do exemplo 1, com concentração de 20 mg/mL.
Foram obtidas amostras dos locais injectados 72 horas após a administração. O exame histológico revela a presença de um depósito gelificado de polímero, para a formulação B. Ele apresenta-se sob a forma de placas com coloração uniforme. Este fenómeno não se observa, em contrapartida, no caso da formulação A para a qual o polímero se infiltrou entre as fibras de colagénio. 64 ΡΕ1689426
Pode sublinhar-se que a matriz de polímero B é perfeitamente biodegradável, uma vez que o tecido readquiriu por complete o seu estado normal ao fim de 21 dias.
Lisboa, 23 de Março de 2010

Claims (33)

  1. ΡΕ1689426 1 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação farmacêutica líquida para a libertação prolongada de interferão (ões), formulação esta que inclua pelo menos um interferão, eventualmente pelo menos um outro principio activo (PA), de preferência em solução aquosa, e uma suspensão coloidal, aquosa, com viscosidade pequena, baseada me partículas sub-mícron de um polímero (PO) biodegradável, solúvel em água e portador de grupos hidrofóbicos (GH), partículas estas que estejam associadas de um modo não covalente com o interferão referido e eventualmente com o outro princípio activo (PA) referido, caracterizada por: ♦ o meio em que se dispersa a suspensão ser constituído essencialmente por água, ♦ a sua concentração em [PO] assumir um valor suficientemente elevado de modo que a formulação farmacêutica referida seja apta para ser injectada por via parentérica, e para formar em seguida in vivo um depósito gelificado, em que essa formação de depósito gelificado: o seja, por um lado, pelo menos parcialmente provocada por pelo menos uma proteína fisiológica presente in vivo, 2 ΡΕ1689426 o permita, por outro lado, prolongar e controlar a duração de libertação do interferão e eventualmente do PA in vivo, durante mais do que 24 h após a sua administração, ♦ se caracterize por ser liquida nas condições de injecção, ♦ e seja também igualmente líquida à temperatura e/ou ao pH fisiológicos, e/ou em presença : * de electrólito fisiológico em concentração fisiológica, * e/ou de pelo menos um tensioactivo.
  2. 2. Formulação farmacêutica líquida para a libertação prolongada de interferão(ões) e, eventualmente, de outro (s) princípio(s) activo(s) -PA-, em que esta formulação: o seja líquida nas condições atmosféricas ambientes, o seja igualmente líquida à temperatura e/ou ao pH fisiológicos e/ou em presença: 3 ΡΕ1689426 * de electrólito fisiológico em concentração fisiológica, * e/ou de pelo menos um tensioactivo, o e inclua pelo menos um interferão, eventualmente pelo menos um outro principio activo (PA), de preferência em solução aquosa, e uma suspensão coloidal, aquosa, com viscosidade pequena, baseada em partículas sub-mícron de polímero PO biodegradável, solúvel em água e portador de grupos hidrofóbicos GH, partículas estas que estejam associadas de um modo não covalente com o referido interferão e eventualmente com o referido princípio activo PA, sendo o meio em que se dispersa a suspensão essencialmente constituído por água, caracterizada por a sua concentração em [PO] se fixar num valor suficientemente elevado para permitir a formação de depósito gelificado in vitro, em presença de pelo menos uma proteína.
  3. 3. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a concentração em [PO] ser tal que: [PO] > 0,9xCl, 4 ΡΕ1689426 de preferência, 20xCl > [PO] á Cl, e melhor ainda, 10x01 > [PO] á Cl em que Cl represente a concentração de "gelifi-cação induzida" das partículas de PO tal como é medida por um teste GI.
  4. 4. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterlzada por os polímeros modificados hidrofóbicos PO serem seleccionados de entre o conjunto que contenha: os poliaminoácidos, os polissacári-dos - de preferência no subconjunto que inclua os pululanos e/ou as quitosanas e/ou os mucopolissacáridos -, as gelatinas ou as misturas de todos estes.
  5. 5. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por os grupos hidrofóbicos (GH) se situarem lateralmente em relação à cadeia.
  6. 6. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por o polímero PO ser um poliaminoácido formado por unidades de ácido aspártico e/ou unidades de ácido glutâmico, sendo pelo menos uma parte destas portadoras de enxertos que contenham pelo menos um grupo hidrofóbico (GH).
  7. 7. Formulação de acordo com a reivindicação 6, 5 ΡΕ1689426 caracterizada por o (ou os) PO ser ou (serem) definido (s) pela fórmula geral (I) seguinte:
    R1 represente um H, um alquilo linear em C2 a Cio ou ramificado em C3 a Cio, benzilo, uma unidade aminoácido terminal ou -R4-[GH]; R2 represente um H, um grupo acilo linear em C2 a Cio ou ramificado em C3 a Cio, um piroglutamato ou -R4-[GH]; R3 seja um H ou uma entidade catiónica, de preferência seleccionada de entre o grupo contendo: • os catiões metálicos seleccionados vantajosamente de entre o subgrupo que inclua: o sódio, o potássio, o cálcio, o magnésio, • os catiões orgânicos seleccionados vantajosamente de entre o subgrupo que inclua: ΡΕ1689426 6 o os catiões com base em aminas, o os catiões com base em oligoaminas, o os catiões com base em poliamina (sendo a polietilenoimina especialmente preferida), o os catiões com base em aminoácido(s), se-leccionados vantajosamente de entre a classe que inclua os catiões baseados em lisina ou em arginina, o ou os poliaminoácidos canónicos, seleccio-nados vantajosamente de entre o subgrupo que inclui a polilisina ou a oligolisina; R4 represente uma ligação directa ou um "espaçador" com base em 1 a 4 unidades de aminoácido; A represente independentemente um grupo -CH2-(unidade de ácido aspártico) ou -CH2-CH2- (unidade de ácido glutâmico); n/ (n+m) seja definido como a taxa molar de enxertia e varie de 0,5 a 100 %, em termos molares; n/ (n+m) seja definido como a taxa de enxertia molar e o seu valor seja suficientemente para ΡΕ1689426 7 que quando se dissolve o Po em água a pH 7 e a 25°C, se forme uma suspensão coloidal de partículas sub-mícron de PO, de preferência n/ (n +m) estará compreendido entre 1 e 25 %, em moles, e ainda mais preferivelmente entre 1 e 15 %, em moles; n + m se defina como o grau de polimerização e varie de 10 a 1.000, de preferência entre 50 e 300; GH represente um grupo hidrofóbico.
  8. I Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o (ou os) po corresponderem a uma das fórmulas gerais (II)' (III) e (IV) seguintes. .3*
    (II)
    [GH]
    (IV) ΡΕ1689426 na quais: GH represente um grupo hidrofóbico; R seja um grupo alquilo linear em C2 a Οε; R3' seja um H ou uma entidade catiónica, de preferência seleccionada de entre o conjunto constituído por: • os catiões metálicos vantajosamente selec-cionados de entre o subconjunto incluindo: o sódio, o potássio, o cálcio, o magnésio, • os catiões orgânicos seleccionados vantajosamente de entre o subconjunto que inclua: o os catiões com base em aminas, 0 os catiões com base em oligoaminas, 0 os catiões com base em poliaminas (sendo especialmente preferida a polietileno-imina), o os catiões com base em aminoácido (s) seleccionados vantajosamente de entre a classe que inclui os catiões com base em lisina ou em arginina, ΡΕ1689426 9 • ou os poliaminoácidos catiónicos vantajosamente seleccionados de entre o subconjunto que inclua a polilisina ou a oligolisina, R50 seja um grupo alquilo, dialcoxilo ou di-amina em C2 a Ce; R4 represente uma ligação directa ou um "espa-çador" com base em 1 a 4 unidades de aminoácido; A represente independentemente um grupo -CH2-(unidade aspártica) ou -CH2-CH2- (unidade glutâ-mico); n'+ m', em que n' seja definido como o grau de polimerização e varie de 10 a 1.000, de preferência entre 50 e 300.
  9. 9. Formulação de acordo com a reivindicação 7 ou a 8, caracterizada por os grupos GH do PO representarem, cada um deles independentemente dos outros, um grupo monovalente com a fórmula seguinte: na qual: H O
    R (GH) 10 ΡΕ1689426 • R5 represente um grupo metilo (alanina), isopropilo (valina), isobutilo (leucina), sec-butilo (isoleucina), benzilo (fenilalanina); • R6 represente um grupo hidrofóbico contendo de 6 a 30 átomos de carbono; • 1 varie de 0 a 6 .
  10. 10. Formulação de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por todos ou parte dos grupos hidrofóbicos R6 dos PO serem seleccionados de modo independente de entre o conjunto de grupos que inclua: • um alcoxilo linear ou ramificado comportando de 6 a 30 átomos de carbono e podendo comportar pelo menos um heteroátomo (de preferência O e/ou N e/ou S), e/ou pelo menos uma insaturaçâo, • um alcoxilo comportando 6 a 30 átomos de carbono e contendo um ou diversos carbociclos anelados e contendo eventualmente pelo menos uma insaturaçâo e/ou pelo menos um heteroátomo (de preferência O e/ou N e/ou S), • um alcoxiarilo ou um ariloxialquilo com 7 a 30 átomos de carbono e podendo comportar pelo menos uma insaturaçâo e/ou pelo menos um heteroátomo (de preferência O e/ou N e/ou S). 11 ΡΕ1689426
  11. 11. Formulação de acordo com a reivindicação 9 ou a 10, caracterizada por o grupo hidrofóbico R6 do enxerto do PO ser proveniente de um precursor alcoólico seleccionado de entre o conjunto constituído por: o octa-nol, o dodecanol, o tetradecanol, o hexadecanol, o octa-decanol, o álcool oleílico, o tocoferol ou o colesterol.
  12. 12. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o PO ser constituído por um homopolímero de alfa-L-glutamato ou de ácido alfa-L-gtutâmico.
  13. 13. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o PO ser constituído por um homopolímero de alfa-L-aspartato ou de ácido alfa-L-aspártico.
  14. 14. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o PO ser constituído por um copolímero de alfa-L-aspartato/alfa-L-glutamato ou de ácido alfa-L-aspártico/ alfa-L-glutâmico.
  15. 15. Formulação de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por no PO, a distribuição das unidades ácido aspártico e/ou ácido glutâmico portadoras de enxertos que incluam pelo menos um motivo GH ser tal que o polímero assim constituído seja quer aleatório, que de tipo em blocos, quer ainda de tipo em multiblocos.
  16. 16. Formulação de acordo com a reivindicação 1, 12 ΡΕ1689426 caracterizada por a massa molar do PO se situar entre 2.000 e 100.000 g/mole, e de preferência entre 5.000 e 40.000 g/mole.
  17. 17. Formulação de acordo com as reivindicações 7 e 9, caracterizada por o grupo hidrofóbico R6 do enxerto do PO ser proveniente de um precursor alcoólico formado pelo tocoferol e no qual: ♦ 1 % < [n/(n+m)]x 100 < 10 % ♦ de preferência 3,5 % ^ [n/(n+m)]x 100 ^ 7,5 % ♦ n+m varie de 100 a 400, de preferência entre 120 e 300.
  18. 18. Formulação de acordo com as reivindicações 7 e 9, caracterizada por o grupo hidrofóbico R6 do enxerto do PO ser proveniente de um precursor alcoólico formado pelo colesterol: ♦ 1 % < [n/(n+m)]x 100 < 10 % ♦ de preferência 3,5 % ^ [n/(n+m)] x 100 d 6,5 o, 0 ♦ n+m varie de 100 a 400, de preferência entre 120 e 300. 13 ΡΕ1689426
  19. 19. Formulação de acordo com a reivindicação 17 ou a 18, caracterizada por a concentração em polímero [PO] estar compreendida entre 15 e 50 mg/mL.
  20. 20. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada por a sua viscosidade a 20°C ser inferior ou igual a 5 Pa. s.
  21. 21. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada por a sua fracção mássica em interferão(ões) não associado(s) às partículas sub-mícron [interferão(ões) não associado(s)] em % em peso, ser tal que: o [interferão(ões) não associado(s)] < 1 o de preferência [interferão(ões) não associado (s) ] ^ 0,5.
  22. 22. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada por o interferão ser o interferão alfa.
  23. 23. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada por o (ou os) princípio (s) activo(s) suplementar(es) que não sejam um interferão, ser(em) uma proteína, uma glicoproteína, uma proteína ligada a uma ou a diversas cadeias de polial-quilenoglicol [de preferência de polietilenoglicol (PEG): 14 ΡΕ1689426 "proteína-PEGilada"], um polissacárido, um lipossacárido, um oligonucleótido, um polinucleótido ou um péptido, sendo este (ou estes) princípio(s) activo(s) suplementar(es) de preferência seleccionado(s) de entre as hemoglobinas, os citocromas, as albuminas, os interferões, as citoquinas, os antigénios, os anticorpos, a eritropoietina, a insulina, as hormonas de crescimento, os factores VIII e IX, os factores estimulantes da hematopoiese ou as misturas de todos estes.
  24. 24. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada por ela ser injectável por via parentérica, subcutânea, intramuscular, intradér-mica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor.
  25. 25. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada por ela se destinar à preparação de medicamentos, em especial para uma administração parentérica, subcutânea, intramuscular, intradér-mica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor, ou ainda por via oral, nasal, vaginal ou ocular.
  26. 26. Processo de preparação de medicamentos, em especial para uma administração parentérica, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor, ou ainda por via oral, nasal, vaginal ou ocular, caracterizado por ser essencialmente constituído por envolver a utilização de pelo menos uma formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25. 15 ΡΕ1689426
  27. 27. Produto derivado caracterizado por incluir partículas sub-mícron, formadas por associações não cova-lentes PO/PA tais como as definidas na reivindicação 1 também por ser obtido a partir da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25.
  28. 28. Produto derivado de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por ele ser constituído por um pó ou por um gel.
  29. 29. Processo de preparação da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por consistir essencialmente: ♦ em produzir uma suspensão coloidal de nano-partículas com pelo menos um PO, ♦ em misturar esta suspensão coloidal de nano-partículas de PO com pelo menos um interferâo (e um ou mais outros princípio(s) activo(s) eventuais) , de preferência em solução aquosa, ♦ em adicionar eventualmente pelo menos um excipiente, ♦ caso seja necessário, em ajustar o pH e/ou a osmolaridade e, ♦ eventualmente em filtrar a suspensão que deste modo se obtém. 16 ΡΕ1689426
  30. 30. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por o (ou os) PA(s) assumirem a forma de uma suspensão ou de uma solução, aquosas, para as misturas com uma suspensão coloidal de nanoparticulas de PO.
  31. 31. Processo de preparação da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por consistir essencialmente: ♦ em preparar pelo menos um polimero PO em pó, ♦ em misturar este pó com uma suspensão ou solução aquosa de pelo menos um interferão (e um ou diversos outros principio(s) activo(s) eventuais), de preferência em solução aquosa, ♦ em adicionar eventualmente pelo menos um excipiente, ♦ caso seja necessário, em ajustar o pH e/ou a osmolaridade, e ♦ eventualmente em filtrar a suspensão que deste modo se obteve.
  32. 32. Processo de preparação da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por consistir essencialmente: 17 ΡΕ1689426 em obter um pó proveniente de uma secagem da formulação liquida de acordo com a invenção, tal como se definiu acima neste documento, em misturar este pó com um meio liquido aquoso, de preferência sob agitação, em adicionar-lhe eventualmente pelo menos um excipiente, caso seja necessário, em ajustar o pH e/ou a osmolaridade, e eventualmente em filtrar a suspensão que assim se obteve.
  33. 33. Processo de preparação de um pó derivado da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por o pó referido ser obtido por secagem da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25. Lisboa, 23 de Março de 2010
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