PT1684792E - Formulações farmacêuticas para a libertação prolongada de interleucinas e suas aplicações terapêuticas - Google Patents

Formulações farmacêuticas para a libertação prolongada de interleucinas e suas aplicações terapêuticas Download PDF

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Remi Meyrueix
Olivier Soula
Sophie Bignon
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Description

1 ΡΕ1684792
DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS PARA A LIBERTAÇÃO PROLONGADA DE INTERLEUCINAS E SUAS APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS" O presente invento refere-se a novas formulações farmacêuticas à base de suspensões coloidais aquosas estáveis e fluidas para a libertação prolongada de principio(s) activos proteinicos, nomeadamente interleucina (s), assim como as aplicações terapêuticas destas formulações.
Estas formulações farmacêuticas activas estão relacionadas quer com a terapêutica humana quer com a veterinária.
As interleucinas são um grupo de proteínas que pertencem à família da citoquina. Elas possuem numerosas actividades que regulam a resposta inflamatória e a resposta imunológica. Contudo, o seu papel principal é a activação e proliferação de linfócitos T. IL-1, IL-2, IL-11 e IL-12 podem ser mencionadas entre os membros importantes desta família. Por exemplo, IL-2 é produzida por linfócitos T activados por um antigénio. A finalidade desta IL-2 é estimular os outros linfócitos T a fim de permitir a asua activação e diferenciação e deste modo modular a resposta imune mediada por células. 2 ΡΕ1684792
As interleucinas são utilizadas em terapêutica, mas a sua toxicidade bem conhecida permanece muitas vezes como causa principal de interrupção do tratamento. Por exemplo, no caso de IL-2, os acontecimentos principais observados durante a utilização clinica de IL-2 são febre, náusea, diarreia, reacções da pele, dores articulares e apatia. Em alguns casos, isto necessita de hospitalização para cuidados intensivos, e deve-se realçar que, nestes casos casos raros, a injecção de IL-2 estava implicada em mortalidade de doentes. À parte da toxicidade da IL, outrro factor a ter em conta na libertação prolongada das proteínas terapêuticas que as interleucinas representam, é a necessidade de assegurar, dentro do possível, que a concentração plasmática em proteína no doente está próxima do valor observado num sujeito são.
Este objectivo choca com a curta duração de vida da IL no plasma; isto torna necessário injectá-las de modo repetido, o que é muito restritivo. A concentração plasmática em proteína terapêutica apresenta então um perfil "em dente de serra" caracterizado por picos elevados de concentração e mínimos de concentração muito baixos. Os picos de concentração, muitos superiores à concentração basal num sujeito são, possuem efeitos nocivos muito marcantes devido à toxicidade elevada das proteínas terapêuticas, tais como as interleucinas, e mais precisamente a interleucina IL2. Por outro lado, os mínimos 3 ΡΕ1684792 de concentração são inferiores à concentração necessária para se ter um efeito terapêutico, o que acarreta uma má cobertura terapêutica do doente e efeitos secundários graves a longo prazo.
Também, para assegurar que a concentração plasmática em proteína no doente é próxima do valor ideal para o tratamento, importa que a formulação farmacêutica considerada permita a libertação prolongada da proteína terapêutica, de modo a limitar as variações de concentração plasmática no decurso do tempo.
Por outro lado, esta formulação activa deve, preferencialmente, satisfazer o caderno de encargos seguinte, já conhecido pelos especialistas na matéria: 1 - libertação prolongada de uma ou várias interleucias activas e não desnaturadas (não modificadas) , de forma a que a concentração plasmática seja mantida ao nível terapêutico, 2 - forma líquida suficientemente fluida para ser facilmente injectável e esterilizável por filtração em filtros cuja dimensão dos poros seja inferior ou igual a 0,2 microns, 3 - forma líquida estável, 4 - biocompatibilidade e biodegradabilidade, 4 ΡΕ1684792 5 - atoxicidade, 6 - não imunogenicidade, 7 - excelente tolerância local.
Para tentar atingir estes objectivos, várias aproximações foram já propostas na técnica anterior.
Na primeira aproximação, a proteína terapêutica nativa é modificada por enxerto covalente de uma ou mais cadeias de polímero ou ainda por enxerto covalente de uma proteína, tal como a albumina de soro humano (HSA) . A proteína assim modificada possui uma menor afinidade pelos seus receptores e o seu tempo de meia-vida na circulação geral aumenta consideravelmente. A amplitude da variação da concentração entre os picos e os baixos da concentração plasmática em proteína é assim consideravelmente reduzida. Assim, a empresa Cetus propõe, na sua patente US-B-4 766 106, enxertar uma cadeia de polioxietileno com interleucina 2 a fim de aumentar a sua solubilidade e vida no plasma. Do mesmo modo, a empresa Human Genome Science propõe (US-B-5 876 969) enxertar covalentemente interleucinas com albumina do soro humano a fim de aumentar a sua vida no plasma. Esta modificação química traduz-se por um aumento do tempo de meia-vida no doente de 6,8 a 33 horas. Este aspecto da modificação química da proteína terapêutica apresenta, de 5 ΡΕ1684792 modo geral, dois inconvenientes principais. Em primeiro lugar, a modificação irreversível da proteína, que, não sendo mais uma proteína humana, pode conduzir a longo prazo a problemas de toxicidade e de imunogenicidade. 0 segundo inconveniente provém da perda parcial de bioactividade da interleucina IL 2 modificada por esta via.
Numa segunda aproximação, foi proposto aumentar a duração da acção graças a formulações compreendendo, pelo menos, um polímero e um princípio activo, líquidos à temperatura e atmosferas ambientes, injectáveis e tornando-se mais viscosos após injecção, por exemplo sob o efeito de uma alteração de pH e/ou de temperatura.
Assim, neste registo, a patente US-B-6 154 314 divulga uma solução orgânica de polímero de libertação controlada de PA, formando um implante sólido após injecção. Esta solução compreende: (A) 10 a 8 0% em peso de um polímero termoplástico de base, biocompatível, biodegradável e insolúvel em água ou em fluidos fisiológicos (por exemplo, poliláctico e/ou poliglicólico); (B) um solvente orgânico, tal como a N-metilpirrolidona dispersando-se nos fluidos fisiológicos; (C) um princípio activo (PA); 6 ΡΕ1684792 (D) e, finalmente, 1 a 50% em peso de um agente de libertação controlada constituído por um copolímero em bloco do tipo poliláctico-glicólico/polietilenoglicol.
Após injecção, (B) dispersa-se ou dissipa-se nos fluidos fisiológicos. (A) forma um implante encapsulante (C) que não está ligado de modo covalente nem a (A) nem a (D) e que se liberta então, lentamente, in vivo. O principal inconveniente desta técnica é o de utilizar um solvente orgânico (B), potencialmente desnaturante para o PA (C) (e.g. proteínas terapêuticas) e tóxico para o doente. Além disso, a hidrólise in vivo do polímero (A) gera um ácido que pode conduzir a problemas de tolerância local.
Os pedidos PCT WO-A-99/18142 e WO-A-OO/18821 referem-se a soluções aquosas de polímeros que contêm um PA sob forma dissolvida ou coloidal, que são administráveis a animais de sangue quente, nomeadamente por injecção e que formam um depósito de PA (e.g. insulina) gelificado in vivo, porque a temperatura fisiológica é superior à temperatura de gelificação. 0 gel assim formado liberta o PA de modo prolongado. Estes polímeros biodegradáveis particulares são triblocos ABA ou BAB com A = poliláctico-co-glicólico (PLAGA) ou poliláctico (PLA) e B = polietilenoglicol. As temperaturas de transformação líquida gel destes polímeros triblocos são, por exemplo, 36, 34, 7 ΡΕ1684792 30 e 2 6 ° C. À semelhança dos polímeros (A) segundo o documento US-B-6 143 314, a hidrólise destes polímeros triblocos ABA ou BAB in vivo conduz a ácidos que podem não ser correctamente tolerados localmente. O pedido PCT WO-A-98/11874 descreve formulações farmacêuticas compreendendo um princípio activo lipófilo, um polímero gelificante (Gelrite® = goma gelana desacetilada ou etil-hidroxicelulose) e um tensioactivo. A interacção polímero/tensioactivo e eventualmente, tratando-se do polímero Gelrite®, só a presença de electrólitos, tais como iões Ca++ em concentração fisiológica conduz à formação de um gel constituído por um agregado polímero/tensioactivo, ao qual se liga de modo não covalente o princípio activo lipófilo. Esta formulação está destinada a uma administração local num órgão alvo (olho e.g.). A associação agregado/princípio activo que se forma in situ, permite a libertação lenta do princípio activo no órgão alvo.
Uma terceira aproximação utilizada para tentar prolongar a duração da acção de uma proteína conservando a sua bioactividade, utiliza uma proteína terapêutica não desnaturada e incorpora-a em microesferas ou implantes à base de polímeros biocompatíveis. Esta aproximação e especialmente ilustrada pela patente US-B-6 500 448 e o pedido US-A-2003/0133980 que descrevem uma composição de libertação prolongada da hormona de crescimento humano (hGH) na qual, a proteína hormonal, previamente estabi- ΡΕ1684792 lizada por complexação com um metal, é em seguida dispersa numa matriz polimérica biocompativel. 0 polímero bio-compatível é, por exemplo, um poli(láctido) , um poli(gli — cólido) ou um copolímero poli(láctido-co-glicólido). A composição apresenta-se, por exemplo, sob a forma de uma suspensão de microesferas numa solução de carboxime-tilcelulose de sódio. Esta aproximação apresenta vários inconvenientes: Para já, no decurso do processo de fabrico das microesferas, a proteína é colocada em contacto com solventes orgânicos potencialmente desnaturantes. Além disso, as microesfras são de uma dimensão elevada (1 a 1000 microns), o que constitui uma restrição em termos de injecção e de esterilização fácil em filtros. Finalmente, problemas de tolerância local podem ocorrer na altura da hidrólise in situ do polímero.
Segundo uma quarta aproximação, foram desenvolvidas formas de libertação prolongada de proteínas terapêuticas (especialmente interleucinas) constituídas por suspensões líquidas de nanopartículas carregadas de proteínas. Estas últimas permitiram a administração da proteína nativa numa formulação líquida de baixa viscosidade.
De acordo com um primeiro método de libertação prolongada, a suspensões de nanopartículas de libertação prolongada é a constituída por suspensões de lipossomas nas quais a proteína terapêutica nativa não modificada é encapsulada. Após injecção, a proteína é libertada 9 ΡΕ1684792 progressivamente dos lipossomas, o que prolonga o tempo de presença da proteína na circulação geral. Assim, por exemplo, Frossen et al., descrevem no artigo Câncer Res. 43 p 546, 1983, o encapsulamento de agentes antineoplásicos nos liposomas com o fim de fazer crescer a eficácia terapêutica. A libertação do agentes é, no entanto, muito rápida para se obter uma real libertação prolongada. A empresa Liposome Company Inc, na sua patente US-B-5 399 331, propõe melhorar o tempo de libertação in vitro da interleucina 2 enxertando-a de modo covalente no liposoma; deste modo volta-se a cair aqui outra vez no domínio da aproximação da "proteína modificada" evocada aqui atrás.
Com o fim de minorar a falta de estabilidade dos liposomas, mantendo as vantagens de uma formulação de nanopartículas líquidas e de baixa viscosidade, a empresa Flamel Technologies propôs um a segunda via, na qual a proteína terapêutica é associada a nanopartículas de um polímero hidrossolúvel "modificado hidrófobo", ou seja, modificado por enxerto de grupos hidrófobos. Este polímero é escolhido, em particular, de entre os poliaminoácidos (poliglutamatos ou poliaspartatos) portadores de enxertos hidrófobos.
Um dos interesses notáveis destes polímeros modificados hidrófobos é o de se auto-montar espontaneamente em água para formar nanopartículas.
Um outro interesse destes sistemas é o de que as 10 ΡΕ1684792 proteínas terapêuticas, se associam espontaneamente às nanopartículas de polímeros modificados hidrófobos; esta associação é não covalente, e efectua-se sem o recurso a um tensioactivo nem a um procedimento de transformação potencialmente desnaturante. Não se trata de um encapsulamento da proteína numa microesfera, como divulgado na patente US-B-6 500 448 e o pedido US-A-2003/0133980. De modo totalmente diferente, estas nanopartículas de copoliaminoácidos modificados hidrófobos adsorvem espontaneamente as proteínas em solução, sem as modificar qumicamente nem as desnaturar e sem as fazer passar por etapas de tratamento agressivas do tipo "colocação em emulsão" e "evaporação de solvente". As formulações podem ser armazenadas sob forma líquida ou liofilizada.
Após a injecção, por exemplo por via subcutânea, estas suspensões de nanopartículas carregadas em proteínas libertam progressivamente a proteína não desnaturada e bioactiva in vivo. Tais associações não covalentes de princípio activo (PA) proteínico/poli[Glu] ou poli[Asp] são divulgadas no pedido de patente WO-A-00/30618.
Este pedido descreve, especialmente, suspensões coloidais de pH 7,4 compreendendo associações de insulina humana com nanopartículas de poliglutamato "modificado hidrófobo". A tabela seguinte mostra os poliaminoácidos "modificados hidrófobos" utilizados e as taxas de associação obtidas nos exemplos do documento WO-A-00/30618. 11 ΡΕ1684792 EXEMPLO POLÍMERO Taxa de associação (%) 1 poli[ (Glu-O-Na) 0,63-bloco- (Glu-o-metilo) 0,37] 55 2 poli[ (Glu-O-Na) 0r66_bloco- (Glu-o-etilo) 0,34] 26 3 poli[ (Glu-O-Na) o,65“bloco- (Glu-o-hexadecilo) 0,35] 36 4 poli[ (Glu-O-Na) 0,88_bloco- (Glu-o-dodecilo) 0,12] >90
Estas suspensões coloidais têm 1,4 mg/ml de insulina e 10 mg/ml de poliaminoácido "modificado hidrófo-bo".
Ressalta da figura 1 do documento WO-A-99/30618 que a duração da libertação in vivo da insulina vectorizada pelas suspensões acima visadas, é de pH 12. Esta duração de libertação ganhará em ser aumentada.
Assim, mesmo se este pedido PCT representa já um progresso considerável, o seu conteúdo técnico pode ainda ser optimizado em relação ao caderno de encardos enunciado atrás e sobretudo em relação ao prolongamento da duração da libertação in vivo de interleucinas.
Os pedidos de patente francesa não publicados n°s 02 07008 de 07/07/2002, 02 09670 de 30/07/2002, 03 50190 de 28/05/2003 e 01 50641 de 03/10/2003, referem-se a novos poliaminoácidos anfifilicos, hidrossolúveis e compreendendo unidades aspárticas e/ou unidades glutâmicas, nas quais, pelo menos, uma parte destas unidades é portadora de enxertos hidrófobos. À semelhança dos poliaminácidos modificados hidrófobos divulgados no pedido de patente WO-A-00/30618, 12 ΡΕ1684792 estas novas matérias-primas poliméricas formam, espontaneamente, em meio liquido aquoso, suspensões coloidais de nanoparticulas que podem ser utilizadas para a libertação prolonqada de PA (insulina). Estas são biocompativeis, biodegradáveis e as proteínas, em particular as proteínas terapêuticas são adsorvidas espontaneamente sobre estas nanoparticulas sem sofrer modoficação química ou de desnaturação.
Estes pedidos visam também novas composições farmacêuticas, cosméticas,, dietéticas ou fitossanitárias à base destes poliaminoácidos.
Os poliaminoácidos "modificados hidrófobos" anfi-fílicos de acordo com o pedido de patente francesa N° 02 07008 compreendem unidades aspárticas e/ou unidades glutâmicas, portadoras de enxertos hidrófobos compreendendo, pelo menos, uma porção alfa-tocoferol, e.g. (poli-glutamato ou poliaspartato enxertado pelo alfa tocoferol de origem sintética ou natural).
Este pedido não publicado divulga especificamente uma suspensão coloidal que contém nanoparticulas formadas por associações polímero/poteína activa e que é obtida misturando 1 mg de um poliglutamato enxertado pelo alfa-tocoferol e 7 mg de insulina em 1 ml de água, a pH 7,0.
Os poliaminoácidos "modificados hidrófobos" anfi-fílicos de acordo com o pedido de patente francesa N° 02 13 ΡΕ1684792 07008 compreendem unidades aspárticas e/ou unidades glutâmicas, portadoras de enxertos hidrófobos compreendendo, pelo menos, uma porção de alfa-tocoferol, e.g.: (poli-glutamato ou poliaspartato enxertado pelo alfa-tocoferol de origem sintética ou natural).
Este pedido não publicado divulga, especifica-mente, uma suspensão coloidal que contém nanoparticulas formadas por associações polímero/proteína activa e que é obtida misturando 1 mg de poliglutamato enxertado pelo alfa-tocoferol e 7 mg de insulina em 1 ml de água a pH 7,0.
Os poliaminácidos "modificados hidrófobos" anfi-fílicos de acordo com o pedido de patente francesa N° 02 09670 compreendendo unidades aspárticas e/ou unidades glutâmicas, portadoras de enxertos hidrófobos compreendendo, pelo menos, uma porção hidrofóbica e ligados a unidades de ácido aspártica e/ou ácido glutâmico por intermédio de uma ligação rotativa contendo duas funções amida e, mais precisamente, através de um "espaçador" do tipo lisina ou ornitidina.
Este pedido não publicado divulga especificamente uma suspensão coloidal que contém nanoparticulas formadas por associações polimero/proteina activa e que é obtida misturando 10 mg de um poliglutamato enxertado com ácido palmitico através de um "espaçador" lisina e 200 UI de insulina (7,4 mg) em 1 ml de água, a pH 7,4. 14 ΡΕ1684792
Os poliaminoácidos "modificados hidrófobos" anfifilicos de acordo com o pedido de patente francesa N° 03 50190, compreendendo unidades aspárticas e/ou unidades glutâmicas, em que certas são portadoras de, pelo menos, um enxerto ligado a uma unidade de ácido aspártico ou ácido glutâmico, por intermédio de um "espaçador" "aminoácido" à base de Leu e/ou Ileu, e/ou Vai, e/ou Phe, estando ligado um grupo hidrófobo em C6-C30 através de uma ligação éster ao "espaçador".
Este pedido não publicado divulga especificamente uma suspensão coloidal que contém nanoparticulas formadas por associações polímero/proteina activa e que é obtida misturando uma solução aquosa contendo 10 mg de um poliglutamato enxertado com um enxerto -Leu-OC8, -Val-OC12 ou -Val-coles terilo e 200 UI de insulina (7,4 mg), por mililitro de água, a pH 7,4. 0 pedido de patente francesa n° 01 50641 divulga homopoliaminoácidos lineares, anfifilicos, aniónicos, compreendendo unidades aspárticas ou unidades glutâmicas e cujas extremidades são portadoras de grupos hidrófobos compreendendo de 8 a 30 átomos de carbono.
Em particular, os homopoliaminoácidos telequéli-cos "modificados hidrófobos" são, por exemplo, um poli-[GluONa] com extremidades PheOC18/C18 ou um poli[GluONa] com extremidades PheOC18/alfa-tocoferol. Este pedido não publicado descreve, igualmente, uma suspensão coloidal que 15 ΡΕ1684792 contém nanopartícuias formadas por associações políme-ro/proteína activa e que é obtida misturando 10 mg de um dos polímeros referidos e 200 UI de insulina (7,4 mg) por mililitro de água, a pH 7,4. A duração da libertação in vivo da insulina "vectorizada" pelas suspensões de acordo com os pedidos não publicados, ganhará em ser aumentada.
Em todo o caso, toda esta técnica anterior em relação às suspensões coloidais de nanopartículas de poliaminoácidos modificados hidrófobos, não revela uma formulação que permita: (I) o crescimento suficiente da duração da libertação da proteína activa após a injecção por via parentérica, em particular subcutânea; (II) e/ou a redução do pico de concentração plasmática da proteína activa após injecção da formulação que a contém.
Nestas condições, um dos objectivos essenciais do presente invento é, assim, propor uma formulação farmacêutica líquida para a libertação prolongada de princípio(s) activo(s), remediando as carências da técnica anterior e, em particular, permitindo, após injecção por via parentérica [e.g. sub-cutânea) , obter uma duração de libertação in vivo prolongada para interleucinas não desnaturadas. 16 ΡΕ1684792
Um outro objectivo essencial do invento é o de propor uma formulação farmacêutica liquida de libertação prolongada de interleucina(s) in vivo, que seja suficientemente fluida para ser facilmente injectável e esterilizável por filtração em filtros cuja dimensão de poros é inferior ou igual a 0,2 microns.
Um outro objectivo essencial do invento é o de propor uma formulação farmacêutica liquida de libertação prolongada de interleucina(s) in vivo, que seja estável à conservação, tanto no plano fisico-quimico como no biológico.
Um outro objectivo essencial do invento é o de propor uma formulação farmacêutica liquida de libertação prolongada de interleucina(s) in vivo, que apresente, pelo menos, uma das propriedades seguintes: biocompatibilidade, biodegradabilidade, atoxicidade, não imunogenicidade, boa tolerância local.
Um outro objectivo essencial do invento é o de propor uma formulação farmacêutica para a libertação prolongada lenta de interleucina(s) in vivo, sendo esta formulação uma suspensão coloidal aquosa de baixa viscosidade compreedendo partículas submicrónicas de polímero PO auto-associadas a, pelo menos, uma interleucina, sendo o polímero PO um polímero biodegradável, hidrossolúvel e portador de grupos hidrófobos. 17 ΡΕ1684792
Um outro objectivo essencial do invento é o de propor uma formulação farmacêutica de libertação prolongada de interleucina(s) in vivo, sendo esta formulação uma suspensão coloidal aquosa de baixa viscosidade compreendendo partículas submicrónicas de polímero PO auto-associadas a, pelo menos, uma interleucina, sendo o polímero PO, por exemplo, um poliaminoácido formado por unidades de ácido aspártico e/ou unidades de ácido glutâmico, pelo menos uma parte destas unidades sendo portadoras de enxertos compreendendo, pelo menos, um grupo hidrófobo (GH), sendo o PO, para além disso biodegradável, hidrossolúvel e anfifílico.
Um outro objectivo essencial do invento é o de propor produtos derivados e/ou precursores da formulação visada nos objectivos enunciados. É em particular mérito do requerente do pedido de patente ter preparado formulações farmacêuticas líquidas aquosas de baixa viscosidade à temperatura fisiológica que, de modo surpreendente, formam um depósito gelificado in vivo após a administração parentérica fácil nos seres humanos ou em mamíferos de sangue quente, não sendo a formação deste depósito desencadeada por uma alteração de pH nem de temperatura quando na altura da injecção parentérica, nem pela dispersão de solvente orgânico no meio fisiológico. 0 depósito gelificado assim formado aumenta de uma maneira significativa a duração da libertação do IL in vivo. 18 ΡΕ1684792
De onde resulta que o invento se refere a uma formulação farmacêutica liquida para a libertação pro-lonqada de interleucina(s) , compreendendo esta formulação uma formulação coloidal aquosa, de baixa viscosidade, à base de partículas submicrónicas de polímero (PO) bio-deqradável, hidrossolúvel, seleccionado a partir do grupo de poliaminoácidos, polissacáridos, gelatinas e suas misturas, e portador de grupos hidrófobos (GH), estando as referidas partículas associadas de modo covalente a, pelo menos, uma interleucina e eventualmente com pelo menos um pricípio activo (PA), caracterizada: * por o meio dispersivo da suspensão ser essencialmente constituído por água, * por a sua concentração de [PO] ser fixada até um valor [PO] > 0,9.Cl, de modo que a referida formulação farmacêutica é apta a ser injectada por via parentérica e a formar em seguida in vivo um depósito gelificado, sendo Cl a concentração "indutora de gelificação" das partículas de PO tal como medido num teste GI tal como descrito na descrição, com esta formação de depósito gelificado: + sendo, por um lado, pelo menos, uma parte provocada por, pelo menos, uma proteína fisiológica presente in vivo, + e permitindo, por outro lado, prolongar e controlar a duração da libertação do inter- 19 ΡΕ1684792 leucina e opcionalnalmente do PA in vivo, para lá de 24 h após administração, * por esta ser liquido nas condições injecção, * e por esta ser igualmente liquida à temperatura e/ou ao pH fisiológicos, e/ou na presença + de electrólito fisiológico em concentração fisiológica, + e/ou, pelo menos, um tensioactivo.
Com vantagem, esta gelificação in vivo não resulta de uma alteração de pH e/ou de temperatura, nem de uma dispersão in vivo de um ou mais solventos orgânicos eventualmente contidos na formulação injectada.
Sem se pretender ficar ligado à teoria, pode-se pensar que as proteínas fisiológicas presentes in vivo em concentrações fisiológicas, permitem a agregação de nanopartícuias de PO associadas a, pelo menos, um PA. Uma tal gelificação dá-se, por exemplo, em uma ou mais horas, 24h, 48 h ou 72 h, entre outras.
Segundo um modo de definição que não é mais baseado num comportamento in vivo como aqui indicado atrás, mais sim num comportamento in vitro, o invento refere-se a uma formulação farmacêutica líquida para a libertação prolongada de interleucina(s) e eventualmente outro princípio(s) activo(s) (PA), esta formulação: * sendo líquida à atmosfera ambiente 20 ΡΕ1684792 * sendo igualmente liquida à temperatura e/ou a pH fisiológicos e/ou na presença: + de electrólito fisiológico em concentração fisiológica + e/ou, pelo menos, um tensioactivo, * e compreendendo uma suspensão coloidal, aquosa, de baixa viscosidade, à base de partículas submicrónicas de polímero PO biodegradável, hidrossolúvel, seleccionado a partir do grupo de poliaminoácidos, polissacáridos, gelatinas e suas misturas, e portador de grupos hidrófobos GH, estando as referidas partículas associadas de modo covalente com a referida interleucina, preferencialmente em solução aquosa (e eventualmente pelo menos outro(s) pricípio(s) activo(s)) e o meio dispersivo da suspensão sendo essencialmente constituído por água, caracterizada por a sua concentração em [PO] estar fixada num valor suficientemente elevado para permitir a formação do depósito gelifiçado in vitro, após injecção por via parentérica na presença de pelo menos uma proteína, sendo a referida concentração [PO] tal que [PO] > 0,9.Cl, sendo Cl a concentração "indutora de gelificação" das partículas de PO tal como medido num teste GI tal como descrito na descrição.
Preferencialmente, a formulação farmacêutica líquida de acordo com o invento é caracterizada por a sua concentração em [PO] ser tal que: 21 ΡΕ1684792 • 2 0. Cl > [PO] > Cl, • e melhor ainda 10. Cl > [PO] > Cl com Cl representando a concentração de "geli-ficação induzida" de partículas de PO, tal como medida num teste GI. O depósito gelifiçado após injecção parentérica da formulação permite um prolongamento interessante da duração da libertação da proteína, assim como uma redução do pico de concentração plasmática de interleucia(s). A duração da libertação de interleucina (s) é especialmente significativamente aumentada em relação à das formulações da técnica anterior, em particular as descritas no pedido de patente PCT publicado WO-A-00/30618 e nos pedidos de patente francesa não publicados N°s 02 07008, 02 09670, 03 50190 e 01 50641. O prolongamento da duração da libertação in vivo induzida pelas formulações de acordo com o invento, é tanto mais apreciável quanto as interleucinas libertadas são sempre plenamente bioactivos e não desnaturados.
Interleucinas em termos da presente revelação são interleucinas arbitrariamente não modificadas ou modificadas, por exemplo interleucinas modificadas pelo enxerto de um ou mais grupos polioxietileno. IL-1, IL-2, 22 ΡΕ1684792 IL-11, IL-12 e IL-18 podem ser mencionadas entre as proteínas da família das interleucinas.
Em toda a presente exposição, os arranjos supra-moleculares de polímero PO associado ou não associado com pelo menos uma interleucina e eventualmente com pelo menos um outro PA, serão indiferentemente designados por "partículas submicrónicas" ou "nanopartícuias". Isso corresponde a partículas de diâmetro hidrodinâmico médio (medido segundo o modo operatório Md definido infra nos exemplos) e.g. compreendido entre 1 e 500 nm, preferencialmente entre 5 e 250 nm.
Além disso, é importante notar que estas formulações do invento são líquidas, ou seja, apresentam, com vantagem, uma viscosidade muito baixa, que torna a sua injecção fácil. Estas não gelificam se não in vivo.
Segundo o invento, os qualificativos "líquido", "fraca" ou "muito fraca viscosidade" correspondem, com vantagem, a uma viscosidade dinâmica a 20°C inferior ou igual a 5 Pa.s. A medida de referência para a viscosidade pode ser realizada, por exemplo, a 20°C com a ajuda de um reómetro AR1000 (TA Instruments) equipado com uma geometria de cone plano (4 cm, 2o). A viscosidade v é medida para um gradiente de 10 s”1.
Assim, a viscosidade de formulações de acordo com o invento pode estar, por exemplo, compreendida entre 1.10“ 23 ΡΕ1684792 3 e 5 Pa.s, preferencialmente entre 1.10 3 e 0,8 Pa.s e, mais preferencialmente ainda, entre 1.10-3 e 0,5 Pa.s.
Esta fraca viscosidade torna as formulações do invento não somente facilmente injectáveis por via parentérica, em particular por via intramuscular ou subcutânea, entre outras, como também facilmente esterilizáveis e a menor custo por filtração em filtros de esterilização com uma dimensão de poros de 0,2 μια.
Este estado liquido ou esta baixa viscosidade das formulações do invento existem tão bem a temperaturas de injecção correspondentes a temperaturas ambientes, por exemplo, compreendidas entre 4 e 30°C, como à temperatura fisiológica. A formulação de acordo com o invento é, preferencialmente, uma suspensão coloidal aquosa de nanopartí-culas associadas com uma ou várias interleucinas e eventualmente um ou vários PA. Isso significa que, de acordo com o invento, o meio dispersivo desta suspensão é essencialmente formado por água. Na prática, esta água representa, por exemplo, pelo menos, 50% em peso em relação à massa total da formulação.
No sentido do invento, o termo "proteína" designa quer uma proteína quer um péptido. Esta proteína ou este péptido podem ser modificados ou não, por exemplo, por enxerto de um ou vários grupos polioxietilénicos. 24 ΡΕ1684792
Por "proteínas fisiológicas" entende-se, no domínio do invento, as proteínas e/ou os péptidos endógenos de mamíferos de sangue quente presentes no local da inj ecção.
Por "temperatura fisoológica" entende-se, no domínio do invento, a temperatura fisiológica dos mamíferos de sangue quente, a saber, por exemplo, cerca de 37-42°C.
Por "pH fisiológico" entende-se, no domínio do invento, um pH por exemplo, compreendido entre 6 e 7,6.
Por "gel" entende-se, no domínio do invento, um estado semi-sólido no qual se transforma a formulação líquida de acordo com o invento e isso espontaneamente só pela presença de proteína (s) fisiológica(s), sem intervenção essencial do pH fisiológico e/ou da temperatura fisiológica e/ou da presença de um electrólito fisiológico (Ca++ e.g.) e/ou da dispersão (ou dissipação) in vivo de um solvente orgânico eventualmente presente na formulação inj ectada.
Por "electrólito fisiológico", entende-se, no domínio do invento, qualquer elemento electrólito (por exemplo iões Ca++) presente nos mamíferos de sangue quente.
Por "concentração fisiológica" entende-se, no domínio do invento, qualquer concentração fisiológica 25 ΡΕ1684792 encontrada nos mamíferos de sangue quente, para o meio fisiológico considerado.
Além disso, as formulações de acordo com o invento são não tóxicas, bem toleradas localmente e estáveis. É igualmente mérito dos inventores ter desenvolvido um teste in vitro GI que permite seleccionar uma população de formulações preferidas de acordo com o invento e de determinar concentrações idóneas de PO nas formulações.
De acordo com o invento, o teste GI de medição da concentração de gelificação Cl, é um teste de referência que permite definir a concentração crítica Cl, denominada a seguir como concentração de gelificação induzida Cl, que caracteriza cada formulação coloidal de acordo com o invento. 0 teste GI de determinação da concentração Cl de gelificação induzida é o seguinte:
Com o fim de determinar a concentração Cl a concentração Cl das formulações coloidais de concentrações variáveis em polímero anfifílico de acordo com o invento e de concentração constante em proteína terapêutica. Para este fim colocam-se em solução em água desionizada quantidades crescentes de pó seco de polímero. As soluções 26 ΡΕ1684792 são mantidas a 25°C sob agitação mecânica, durante 16 horas, antes de serem misturadas com uma solução concentrada de proteína terapêutica. 0 volume e a concentração desta solução de proteína terapêutica são ajustados com o fim de obter a concentração da proteína pesquisada para a formulação [por exemplo, 2,5 mg/ml de interleucina 2 (IL2)].
As formulações coloidais assim preparadas são misturadas com uma solução aquosa de albumina de soro bovino (BSA) concentrada a 30 mg/ml, e depois centrifugadas durante 15 minutos a 3000 rpm. As misturas são deixadas sob agitação suave, durante 24 h, antes de serem recuperadas para serem caracterizadas.
As medições de viscoelasticidade são efectuadas com um reómetro TA Instruments AR 1000, equipado com uma geometria de cone plano (diâmetro de 4 cm e ângulo de 1,59°) . Uma deformação de 0,01 rad, situada no domínio de viscoelasticidade linear, é imposta de maneira sinusoidal numa gama de frequência compreendida entre 0,1 e 300 rad/s. A temperatura da amostra é mantida constante a 20°C por intermédio de uma célula de Peltier.
Os espectros de frequência do módulo elástico G' e do módulo viscoso ou de perda, G'', permitem definir o tempo de relaxação característico Tr aqui definido como o inverso da frequência à qual o módulo elástico G' cruza o módulo viscoso G' ' . Encontra-se uma exposição detalhada 27 ΡΕ1684792 destas questões na obra Ferry, Viscoelastic Properties of Polymers, J. D. Ferry, J. Wiley, NY, 1980 e no artigo J. REGALADO et al. Macromolecules 1999, 32, 8580. A medida do tempo de relaxação Tr em função da concentração em polímero da formulação permite definir a concentração Cl à qual este tempo Tr é de 1 segundo. Estes exemplos de valores da concentração de gelificação Cl serão dados nos exemplos 8 a seguir.
Do mesmo modo, podem-se definir as concentrações C0, 1 e CIO para as quais o tempo de relaxação excede, respectivamente, 0,1 s e 10 s. Estas concentrações classificam-se por ordem crescente seguinte: C0,1 < Cl < CIO.
Segundo uma variante da formulação de acordo com o invento: • [PO] > C0, 1 • preferencialmente [PO] > Cl, • e mais preferencialmente ainda [PO] > CIO.
Segundo uma característica adicional vantajosa: [PO] < 20.Cl
No sentido do invento e em toda a presente exposição, os termos "associação" ou "associar" empregues para qualificar as relações entre um ou vários princípios 28 ΡΕ1684792 activos e os polímeros PO (por exemplo, os poliaminoácidos), significam, em particular, que o ou os princípios activos estão ligados covalentemente ao(s) polímero(s) PO [por exemplo, o (ou os) poliaminoácido(s) ] não covalentemente, por exemplo por interacção electrostática e/ou hidrófobo e/ou ligação de hidrogénio e/ou impedimento estereoquímico.
Os polímeros PO de acordo com o invento são polímeros biodegradáveis, hidrossolúveis e portadores de grupos hidrófobos GH. Os grupos hidrófobos podem ser em número reduzido em relação ao resto da cadeia e podem situar-se lateralmente em relação à cadeia ou ser intercalados na cadeia e ser repartidos de modo aleatório (copolímero estatístico) ou repartidos sob forma de sequências ou de enxertos (copolímeros em bloco ou copolímeros sequenciados).
Sem se pretender limitar os polímeros PO modificados hidrófobos podem ser escolhidos de entre o grupo constituído por copoliaminoácidos anfifílicos, polissacáridos - preferencialmente no subgrupo compreendendo os pululanos e/ou ou quitosanos e/ou os mucopolissacáridos, as gelatinas e suas misturas.
De acordo com um modo preferido de realização do invento, PO é escolhido de entre os copoliaminoácidos anfifílicos. 29 ΡΕ1684792
No sentido do invento e em toda a presente exposição, o termo "poliaminoácido" cobre tanto os oligoaminoácidos compreendendo de 2 a 20 unidades "aminoácido" como os poliaminoácidos compreendendo mais de 20 unidades "aminoácido".
Preferencialmente, os poliaminoácidos de acordo com a presente invento são oligómeros ou homopolimeros compreendendo unidades recorrentes de ácido glutâmico ou ácido aspártico ou copolimeros compreendendo uma mistura destes dois tipos de unidades "aminoácido". As unidades consideradas nestes polímeros são aminoácidos possuindo a configuração D ou L ou D/L e estão ligados pelas suas posições alfa ou gama por unidade glutamato ou glutâmico e alfa ou beta por unidade aspártica ou aspartato.
As unidades "aminoácido" preferidas da cadeia de poliaminoácido principal são as que possuem a configuração L e uma ligação do tipo alfa.
Segundo um modo ainda mais preferido de realização do invento, o polímero PO é um poliaminoácido formado por unidades aspárticas e/ou unidades glutâmicas, sendo, pelo menos, uma parte destas unidades portadoras de enxertos compreendendo, pelo menos, um grupo hidrófobo GH. Estes poliaminoácidos são especialmente do tipo dos descritos no pedido de patente PCT WO-A-00/30618.
Segundo uma primeira possibilidade, o (ou os) PO ΡΕ1684792 30 da formulação são definidos pela fórmula geral (I) seguinte:
w na qual: • R1 representa um H, um alquilo linear em C2 a CIO ou alquilo ramificado em C3 a CIO, benzilo, uma unidade aminoácido terminal ou -R4-[GH]; • R2 representa um H, um grupo acilo linear em C2 a CIO ou acilo ramificado em C3 a CIO, um piroglutamato ou -R4-[GH]; • R3 é um H ou uma entidade catiónica, preferencialmente seleccionada do grupo constituído por: - catióes metálicos escolhidos com vantagem do grupo constituído por: sódio, potássio, cálcio, magnésio, - catiões orgânicos escolhidos com vantagem do grupo constituído por: * catiões à base de amina, * catiões à base de oligoamina, * catiões à base de poliamina (sendo a polietilenoimina particularmente preferida) , 31 ΡΕ1684792 * catiões à base de aminoácido(s) escolhidos com vantagem da classe que compreende catiões à base de lisina ou de arginina, ou os poliaminoácidos catiónicos escolhidos com vantagem do grupo constituído pela polilisina ou oligolisina; • R4 representa uma ligação directa ou um "espaçador" à base de 1 a 4 unidades aminoácido; • A representa independentemente um radical -CH2- (unidade aspártica) ou -CH2-CH2- (unidade glu-tâmica); • n/ (n+m) é definida como a taxa de enxerto molar e o seu valor é suficientemente baixo para que o PO colocado em solução em água a pH 7 e a 25°C, forma uma suspensão coloidal de partículas submicrónicas de PO, preferencialmente n/(n+m) está compreendido entre 1 a 25% molar e melhor ainda entre 1 a 15% molar; • n+m é definido como o grau de polimerização e varia de 10 a 1000, preferencialmente entre 50 e 3 0 0; • GH representa um grupo hidrófobo.
De acordo com uma segunda possibilidade, o (ou os) PO da formulação corresponde a uma das fórmulas gerais (II), (III) e (IV) seguintes: ΡΕ1684792 32
PHJ
ITO it1 1 nas quais 1 GH representa um grupo hidrófobo; •Re um grupo alquilo linear em C2 a C6; • R3' é um H ou uma entidade catiónica, preferencialmente seleccionada do grupo constituído por: - catiões metálicos escolhidos com vantagem do grupo constituído por: sódio, potássio, cálcio, magnésio, - catiões orgânicos escolhidos com vantagem do grupo constituído por: * catiões à base de amina, * catiões à base de oligoamina, * catiões à base de poliamina (sendo a polietilenoimina particularmente preferida) , 33 ΡΕ1684792 * catiões à base de aminoácido(s) escolhidos com vantagem da classe que compreende catiões à base de lisina ou de arginina, ou os poliaminoácidos catiónicos escolhidos com vantagem do grupo constituído pela polilisina ou oligolisina; • R50 é um grupo alquilo, dialcoxi ou diamina em C2 a C6; • R4 representa uma ligação directa ou um "espaçador" à base de 1 a 4 unidades aminoácido ; • A representa independentemente um radical -0¾-(unidade aspártica) ou -CH2-CH2- (unidade glu-tâmica); • n'+m' ou n'' é definido como o grau de polime-rização e varia de 10 a 1000, preferencialmente entre 50 e 300.
Com vantagem, os grupos GH do PO representam, cada um, independentemente uns dos outros, um radical monovalente com a fórmula seguinte:
na qual: 34 ΡΕ1684792 - R5 representa um metilo (alanina), isopropilo (valina ), isobutilo (leucina), sec-butilo (isoleucina), benzilo (fenilalanina); R6 representa um radical hidrófobo compreendendo de 6 a 30 átomos de carbono; - 1 varia de 0 a 6.
Segundo uma caracteristica assinalável do invento, todos ou parte dos grupos hidrófobos R6 dos PO são escolhidos, de modo independente, do grupo de radicais compreendendo: • um alcoxi linear ou ramificado compreendendo de 6 a 30 átomos de carbono e podendo compreender pelo menos um heteroátomo (preferencialmente O e/ou N e/ou S) e/ou, pelo menos, uma insaturação, • um alcoxi compreendendo 6 a 30 átomos de car bono e possuindo um ou vários anéis carbocíclicos fundidos e contendo, eventualmente, pelo menos, uma insaturação e/ou, pelo menos, um heteroátomo (preferencialmente O e/ou N e/ou S), • um alcoxiarilo ou um ariloxialquilo de 7 a 30 átomos de carbono e podendo compreender, pelo menos, uma unidade de insaturação e/ou, pelo menos, um heteroátomo, preferencialmente O e/ou N e/ou S), 35 ΡΕ1684792
Na prática e sem que isso seja limitativo, o radical hidrófobo R6 do enxerto do PO é proveniente de um precursor alcoólico escolhido do grupo constituído por: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, álcool oleílico, tocoferol ou colesterol.
De acordo com uma primeira forma de realização do invento, as cadeias principais dos poliaminoácidos são homopolímeros de alfa-L-glutamato ou alfa-L-glutâmico.
De acordo com uma segunda forma de realização do invento, as cadeias principais dos poliaminoácidos são homopolímeros de alfa-L-aspartato ou alfa-L-aspártico.
De acordo com uma terceira forma de realização do invento, as cadeias principais dos poliaminoácidos são homopolímeros de alfa-L-aspartato/alfa-L-glutamato ou alfa-L-aspártico/alfa-L-glutâmico.
Com vantagem, a distribuição das unidades aspárticas e/ou glutâmicas da cadeia de poliaminoácido principal do PO é tal que o polímero assim constituído é quer aleatório, quer tipo bloco quer tipo multibloco.
De preferência, o PO utilizado na formulação de acordo com o invento tem uma massa molar que se situa entre 2000 e 100 000 g/mol e, preferencialmente, entre 4000 e 40 000 g/mol. 36 ΡΕ1684792
Numa primeira forma de realização preferida da formulação, o radical hidrófobo R6 do enxerto do PO é derivado de um precursor álcool formado pelo tocoferol: ♦ 1% < [n/(n + m] χ 100 < 10% ♦ de preferência 3,5% < [n/(n + m] χ 100 < 7,5% ♦ n + m varia desde 100 até 400 e, de preferência, entre 120 e 300.
Numa segunda forma de realização preferida da formulação, o radical hidrófobo R6 do enxerto do PO é derivado de um precursor álcool formado pelo colesterol: ♦ 1% < [n/(n + m] χ 100 < 10% ♦ de preferência 3,5% < [n/(n + m] χ 100 < 7,5% ♦ n + m varia desde 100 até 400 e, de preferência, entre 120 e 300.
Em ambos estas formas de realização preferidas da formulação do invento, a concentração de polímero [PO] está, com vantagem, entre 15 e 50 mg/ml.
Numa variante, o PO da formulação de acordo com o invento é portador de, pelo menos, um enxerto do tipo polialquilenoglicol ligado a uma unidade glutamato e/ou aspartato. 37 ΡΕ1684792
Com vantagem, este enxerto é do tipo polialqui-lenoglicol de fórmula (V) seguinte:
R'4 representa uma ligação directa ou um "espaçador" à base de 1 a 4 unidades aminoácido; - X é um heteroátomo escolhido do grupo constituído por oxigénio, azoto ou enxofre; - R7 e R8 representa, independentemente um H, um alquilo linear em Cl a C4; - n''' varia de 10 a 1000, preferencialmente de 50 a 300.
Na prática, o polialquilenoglicol é, por exemplo, um polietilenoglicol. É adequado, de acordo com o invento, que a percentagem molar de enxerto do polialquilenoglicol varie de 1 a 30%.
Os poliaminoácidos PO são, para além disso, extremamente interessantes, pelo facto de que, com uma taxa de enxerto ajustável, estes se dispersam em água a pH 7,4 (por exemplo, com um tampão fosfato) para originar suspensões coloidais. 38 ΡΕ1684792
Ainda, os princípios activos interferão ou outros PA seleccionados a partir de proteínas, péptidos e moléculas pequenas, podem associar-se espontaneamente a nanopartícuias compreendendo poliaminoácidos PO.
Convém compreender que os PO à base de poliaminoácidos contêm funções carboxílicas, que são, quer neutras (forma COOH), quer ionizadas (anião COO-) , segundo o pH e a composição. Por esta razão, a solubilidade numa fase aquosa é directamente função da taxa de COOH livres dos PO (não enxertados pela porção hidrófoba) e do pH. Em solução aquosa, o contra-catião pode ser um catião metálico tal como o sódio, o cálcio ou o magnésio, ou um catião orgânico, tal como a trietanolamina, a tris(hidroximetil)-aminometano ou uma poliamina, tal como a polietilenoimina.
Os PO do tipo poliaminoácidos susceptíveis de serem utilizados na formulação do invento são, por exemplo, obtidos através de métodos conhecidos pelos especialistas na matéria. Os poliaminoácidos estatísticos podem ser obtidos por enxerto do enxerto hidrófobo, previamente funcionalizado pelo "espaçador", directamente no polímero por uma reacção clássica de acoplamento. Os PO poliaminoácidos em blocos ou multiblocos podem ser obtidos por polimerização sequencial dos anidridos de N-carboxi-aminoácidos (NCA) correspondentes.
Prepara-se, por exemplo, um poliaminoácido, homo- 39 ΡΕ1684792 poliglutamato, homopoliaspartato ou um copolimero glu-tamato/aspartato, em bloco, multibloco ou aleatório segundo métodos clássicos.
Para a obtenção de poliaminoácido do tipo alfa, a técnica mais corrente é baseada na polimerização de anidridos de N-carboxi-aminoácidos (NCA), descrita, por exemplo, no artigo "Biopolymers", 1976, 15, 1869 e na obra de H. R. Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydrides and related Heterocycles" Springer Verlag (1987). Os derivados de NCA são, preferencialmente, derivados NCA-O-Me, NCA-O-Et ou NCA-O-Bz (Me = metilo, Et = etilo e Bz = benzilo) . Os polímeros são em seguida hidrolizados em condições adequadas para se obter o polímero na sua forma ácida. Estes métodos são inspirados na descrição dada na patente FR-A-2 801 226 do mesmo detentor. Um certo número de polímeros utilizáveis de acordo com o invento, por exemplo, do tipo poli(alfa-L-aspártico), poli(alfa-L-glutâmico), poli(alfa-D-glutâmico) e poli(gama-L-gutâmico) de massas variáveis estão disponíveis comercialmente. O polímero de ácido poliaspártico do tipo alfa-beta é obtido por condensação do ácido aspártico (para obter uma polissuccinimida) seguida de uma hidrólise básica (cf. Tomida et al. Polymer 1997, 38, 4733-36). O acoplamento do enxerto com uma função ácida do polímero é facilmente realizado por reacção de um poliaminoácido na presença de uma carbodiimida como agente de acoplamento e, eventualmente, um catalisador tal como a 40 ΡΕ1684792 4-dimetilaminopiridina e no seio de um solvente adequado tal como a dimetilformamida (DMF), a N-metilpirrolidona (NMP) ou o sulfóxido de dimetilo (DMSO). A carbodiimida é, por exemplo, a diciclo-hexilcarbodiimida ou a diisopro-pilcarbodiimida. A taxa de enxerto é controlada quimicamente pela estequiometria dos constituintes e reagentes ou pelo tempo de reacção. Os enxertos hidrófobos funcionalizados por um "espaçador" são obtidos pela ligação peptidica clássica ou pela condensação directa por catálise ácida. Estas técnicas são bem conhecidas pelos especialistas na matéria.
Para a síntese de copolímero em blocos ou mul-tiblocos, utilizam-se derivados NCA previamente sintetizados com o enxerto hidrófobo. Por exemplo, o derivado NCA-hidrófobo é copolimerizado com o NCA-O-Benzilo e depois removem-se selectivamente por hidrólise os grupos benzí-licos. A síntese dos poliaminoácidos PO conduz preferencialmente a suspensões aquosas de nanopartícuias de PO.
Tais suspensões podem ser transformadas em pós de nanopartículas de PO por secagem, de maneira adequada e conhecida pelos especialistas na matéria, como por exemplo: aquecimento (estufa...), colocação sob vácuo, utilização de dessecantes, liofilização, atomização.
Estas nanopartículas de PO, em suspensão ou no 41 ΡΕ1684792 estado pulverulento, formam uma matéria-prima para a preparação de formulações de acordo com o invento. A este propósito, pode ser preciso que as formulações de acordo com o invento resultem da associação não covalente de nanoparticulas à base de, pelo menos, um PO e de, pelo menos, um PA, num meio liquido aquoso.
Para a preparação, o PO e/ou a(s) interleucina(s) (e/ou qualquer PA adicional) podem estar sob forma sólida (preferencialmente pó) e/ou sob forma liquida (preferencialmente suspensão aquosa coloidal). A associação interleucina(s)/PO significa no sentido da presente exposição que a(s) interleucina(s) é(são) associado(s) ao (s) polímero(s) PO [e.g. um ou vários poliaminoácido(s)] por uma ou várias ligações para além de uma (ou de várias) ligação(ões) química(s) covalente(s).
As técnicas da associação de uma ou várias interleucinas com o PO de acordo com o invento, são descritas especialmente no pedido de patente WO-A-00/30618. Estas consistem em incorporar, pelo menos, uma interleucina (e um ou vários outros possíveis princípios activos) no meio líquido contendo nanoparticulas de PO, de modo a obter uma suspensão coloidal de nanoparticulas carregadas em ou associadas a uma ou várias interleucinas (e um ou vários outros possíveis princípios activos). 42 ΡΕ1684792 0 invento tem assim igualmente como objectivo um processo de preparação da formulação atrás referida.
Segundo um primeiro modo preferido de realização, este processo é caracterizado por consistir essencialmente: • da concretização de uma suspensão coloidal de nanoparticulas de, pelo menos um PO, • em misturar esta suspensão coloidal de nanoparticulas de PO com, pelo menos, uma interleucina (e um ou vários outros possíveis princípios activos), preferencialmente em solução aquosa, • em juntar eventualmente, pelo menos, um exci-piente, • em se necessário ajustar o pH e/ou a osmola-ridade e, • eventualmente, filtrar a suspensão assim obtida .
Com vantagem, a interleucina (e um ou vários outros possíveis princípios activos) está(estão) sob forma de suspensão ou de solução aquosa para a misutra com a suspensão coloidal de nanoparticulas de PO.
De acordo com um segundo modo de concretização, este processo é caracterizado por consistir essencialmente: em tomar um pó de, pelo menos, um polímero PO, 43 ΡΕ1684792 • em misturar este pó com uma suspensão ou solução aquosa de, pelo menos, uma interleucina (e um ou vários outros possíveis princípios activos), preferencialmente em solução aquosa, • em juntar eventualmente, pelo menos, um exci-piente, • em se necessário ajustar o pH e/ou a osmo-laridade e, • eventualmente, filtrar a suspensão assim obtida.
As formulações assim obtidas podem igualmente ser colocadas em forma de geles, de pó ou de filme através dos métodos clássicos conhecidos pelos especialistas na matéria, tais como a concentração por diafiltração ou evaporação, deposição em camada, atomização ou liofilização, entre outros. Estes métodos podem ser eventualmente combinados.
Segue-se uma terceira forma de realização do processo de preparação das formulações líquidas de acordo com o invento, consistindo este terceiro modo essencialmente : • em tomar um pó com origem na secagem da formulação líquida de acordo com o invento, tal como definido aqui atrás, • em misturar este pó com um meio líquido aquoso, preferencialmente sob agitação, 44 ΡΕ1684792 • em juntar eventualmente, pelo menos, um exci-piente, • em se necessário ajustar o pH e/ou a osmo-laridade e, • eventualmente, filtrar a suspensão assim obtida
Os excipientes suseptiveis de serem adicionados são, por exemplo, agentes antimicrobianos, tampões, antiox-idantes, agentes que permitem ajustar a isotonicidade que são conhecidos pelos especialistas na matéria. Poder-se-á, por exemplo, referir a obra: Injectable Drug Development, P.K. Fupta et al., Interpharm Press, Denver, Colorado 1999. A filtração eventual da formulação liquida em filtros de porosidade igual, por exemplo, a 0,2 μιη, permite esterilizá-la. Esta pode ser assim directamente injectada num doente.
Todos estes exemplos de preparação de formulações liquidas de acordo com o invento são, com vantagem, realizados à atmosfera e temperatura ambientes (25°C e.g.).
Numa variante valiosa da formulação de acordo com o invento, a sua fracção em peso de interleucina (s) não associada(s) com as partículas submicrónicas [interleucina (s) não associada(s)], em %, é tal que: o [interleucina(s) não associada(s)] < 1, 45 ΡΕ1684792 o de preferência, [interleucina(s) não associada (s) ] < 0,5, o com maior preferência, [interleucina(s) não associada(s)] < 0,1.
Segundo outros destes aspectos, o invento engloba todo o produto derivado obtido a partir da formulação liquida de acordo com o invento, tal como definida supra e compreendendo partículas submicrónicas, formadas por associações não covalentes PO/interleucina, tais como definidas aqui atrás.
Na prática, estes produtos derivados podem, nomeadamente, ser constituídos por pós, geles, implantes ou filmes, entre outros.
Além disto, o invento visa todos os precursores da formulação líquida injectável tal como definido supra.
Tratando-se sempre destes produtos derivados, deve ser sublinhado que o invento refere-se, igualmente, a um processo de preparação de um pó derivado da formação, tal como definida supra, sendo este processo caracterizado por o referido pó ser obtido por secagem da formulação temperatura ambiente tal como aqui definido atrás. A formulação de acordo com o invento é, de preferência, farmacêutica sem excluir formulações 46 ΡΕ1684792 cosméticas, dietéticas ou fitossanitárias compreendendo pelo menos um PO como anteriormente definido, pelo menos uma interleucina e eventualmente pelo menosoutro principio activo.
De acordo com o invento, o possível princípio activo adicional diferente de uma interleucina pode ser uma proteína, uma glicoproteína, uma proteína ligada a uma ou várias cadeias polialquilenoglicol [preferencialmente PoliEtilenoGlicol (PEG): "proteína-PEGilicada"], um polis-sacárido, um lipossacárido, um oligonucleótido, um poli-nucleótido ou um péptido. 0 princípio activo adicional pode ser seleccionado de entre as hemoglobinas, os citocromos, as albuminas, os interferões, as citoquinas, os antigénios, os anticorpos, a eritropoietina, a insulina, as hormonas de crescimento, os factores VIII e IX, os factores estimulantes de hematopoiese e as suas misturas.
De acordo com uma variante, este princípio activo adicional é uma "pequena" molécula orgânica hidrófoba, hidrófila ou anfifílica, sendo exemplos péptidos tais como leuprida ou ciclosporina, ou pequenas moléculas tais como as que pertencem à família das antraciclinas, dos taxóides ou das camptotecinas e suas misturas. 47 ΡΕ1684792
De entre as qualidades primordiais da formulação de acordo com o invento, figuram o seu carácter injectável e a sua capacidade de formar um depósito no local da injecção, in vivo, por gelificação ou ainda por agregação de nanoparticulas, na presença de proteínas fisiológicas ou análogas. A formulação de acordo com o invento pode, nomeadamente, ser injectada por via parentérica, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor. A formulação de acordo com o invento pode ser também administrada por via oral nasal, vaginal, ocular ou bucal.
Com vantagem, a formulação é destinada à preparação de medicamentos, em particular para administração parentérica, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor, seja por via oral, nasal, vaginal ou ocular.
Se bem que a formulação de acordo com o invento seja de preferência farmacêutica, esta não exclui contudo as formulações cosméticas, dietéticas ou fitossanitárias compreendendo, pelo menos, um PO, tal como definido atrás e, pelo menos, um princípio activo correspondente. 48 ΡΕ1684792
Ainda de acordo com um outro destes aspectos, o invento visa um processo de preparação de medicamentos, em particular para administração parentérica, sucutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor, quer por via oral, nasal, vaginal ou ocular, caracterizada por consistir essencialmente na utilização de, pelo menos, uma formulação atrás definida e/ou todo o produto derivado e/ou todo o produto precursor da referida formulação. 0 invento refere-se igualmente à utilização terapêutica da dita formulação por via parentérica, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor, quer por via oral, nasal, vaginal ou ocular, de modo a que forme um depósito gelificado/reticulado no sitio da injecção. 0 invento será melhor compreendido e as suas vantagens e variantes de formas de realização ficarão bem evidenciadas pelos exemplos, que se seguem e que descrevem a síntese dos PO formados pelos poliaminoácidos enxertados com um grupo hidrófobo, a sua transformação num sistema de libertação prolongada de uma interleucina, a saber em formulação de acordo com o invento (suspensão coloidal aquosa estável) e a demonstração da capacidade de um tal sistema não somente se associar a uma interleucina, mas sobretudo de gelificar/reticular para libertar de maneira muito prolongada in vivo, as interleucinas. 49 ΡΕ1684792
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1: Curvas das Concentrações plasmáticas de IL2 (picograma/ml) medidas no macaco após injecção subcutânea • da formulação de IL2 (E) de acordo com o invento (exemplo 7): curva • da formulação de IL2 (F) testemunha do invento (exemplo 7) curva • e da formulação de IL2 (G) testemunha não de acordo com o invento (exemplo 7): curva em função do tempo T em horas e com uma dose de IL2 de 0,5 mg/kg.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Polímero anfifílico PI Síntese de um poliglutamato enxertado pelo alfa-tocoferol de origem sintética
Solubiliza-se 5,5 g de um alfa-L-glutamato (de massa equivalente a cerca de 10 000 Da) em relação a um 50 ΡΕ1684792 padrão de polioxietileno e obtido por polimerização de NCAGluOMe seguido de uma hidrólise como descrito no pedido de patente FR-A-2 801 226) em 92 ml de dimetilformamida (DMF) aquecendo a 40°C, durante 2 horas. Uma vez o polímero solubilizado, deixa-se a temperatura voltar a 25°C e junta-se, sucessivamente, 1,49 g de D,L-alfa-tocoferol (>98% obtido na Fluka®) previamente solubilizado em 6 ml de DMF, 0,09 g de 4-dimetilaminopiridina previamente solubilizada em 6 ml de DMF e 0,57 g de diisopropilcarbodiimida previamente solubilizada em 6 ml de DMF. Após 8 horas, a 25°C, sob agitação, o meio reaccional é deitado em 800 ml de água contendo 15% de cloreto de sódio e ácido clorídrico (pH 2). O polímero precipitado é em seguida recuperado por filtração, lavado com ácido clorídrico 0,1 N e depois com água. O polímero é em seguida ressolubilizado em 75 ml de DMF e depois reprecipitado em água contendo, como previamente, sal e ácido a pH 2. Após 2 lavagens com água, lava-se várias vezes com éter diisopropílico. O polímero é em seguida seco em estufa sob vácuo, a 40°C. Obtém-se um rendimento da ordem de 85%.
Exemplo 2: Polímeros anfifílicos Pl, P2, P3, P4, P5 e P6
Estes polímeros são obtidos do mesmo modo que para a obtenção do polímero Pl. A tabela 1 abaixo resume as características destes polímeros. As do polímero Pl são dadas a título de comparação. ΡΕ1684792 51 TABELA 1
Polímero Mi1 g/mol do poliglutamato Grupo hidrófobo % de enxerto (RMN)2 Mn1 g/mol de polímero PI 10 000 alfa-tocoferol3 7 13 900 P2 10 000 alfa-tocoferol3 4 14 400 P3 16 900 alfa-tocoferol3 4 15 200 P4 10 000 colesterol 5 11 500 P5 16 900 colesterol 5 12 900 P6 10 000 n-dodecanol 15 11 500 1 Em equivalentes de polioxietileno 2 Taxa de enxerto molar estimada por RMN de protão. 3 de origem suntética
Exemplo 3: Preparação de uma formulação de InterLeucina-2 (IL2) de longa acção de acordo com a presente invento, à base do polímero P3.
Introduz-se num balão uma quantidade de pó liofilizado do polímero anfifílico e de água estéril necessários para obter uma concentração de polímero igual a X = 1,3 vezes a concentração final pretendida na formulação. A dissolução do polímero é prolongada 16 horas sob agitação magnética. A quantidade necessária de IL2 liofilizada (Prospec) é concentrada a X/(X-1) vezes a concentração final pretendida. 52 ΡΕ1684792 A concentração precisa da solução de IL-2 concentrada é determinada por dosagem UV a 280 nm, com a ajuda de espectrofotómetro UV Perkin Elmer Lambda 35.
Esta solução de IL2 é filtrada a 0,8-0,2 μπι e armazenada a 4°C. O seu pH é ajustado a pH 11 por junção de NaOH 1M. Designa-se por Y a razão da concentração em proteína desta solução em relação à concentração desejada na formulação.
Procede-se em seguida à mistura a temperatura ambiente da solução de proteína e da solução de polímero. Para um volume de polímero, junta-se X-l volumes de solução de proteína. O pH e osmolaridade são ajustados a pH 7,4 + 0,2 e 300 + 20 mOsm.
Assim, para preparar uma formulação de IL2 de longa acção de acordo com o invento à base do polímero P3 contendo 20 mg/ml de polímero P3 e 2,5 mg/ml de IL2, a solução inicial de polímero é concentrada a 26 mg/ml. A solução inicial de IL2 é concenrada a 11 mg/ml. Para um volume de polímero, junta-se 0,3 volumes de solução de proteína.
Exemplo 4: Medição de um diâmetro hidrodinâmico médio das nanopartículas de diferentes polímeros PO de acordo com o invento. 53 ΡΕ1684792 0 diâmetro hidrodinâmico médio das partículas de polímero PO de acordo com o invento é medido de acordo com o modo operatório Md definido aqui a seguir:
As soluções de PO são preparadas com concentrações de 1 ou 2 mG/ml em meio de NaCl 0,15 M e deixadas sob agitação, durante 24 h. Estas soluções são em seguida filtradas em 0,8-0,2 μιη, antes de os analisar em difusão dinâmica de luz graças a um aparelho do tipo Brookhaven, funcionando com um raio laser de comprimento de onda de 488 nm e polarizado verticalmente. O diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas de polímero PO é calculado a partir da função de autocorrelação do campo eléctrico pelo método dos cumulantes, como descrito na obra "Surfactant Science Series", volume 22, Surfactant
Solutions, Ed. Zana, cap. 3, M. Dekker, 1984.
Obtêm-se os resultados seguintes para os polímeros PO P2, P3, P4 e P6 do exemplo 2: TABELA 2
Polímero Diâmetro hidrodinâmico médio (nm) P2 60 P3 90 P4 30 P6 15 54 ΡΕ1684792
Exemplo 5: Associação espontânea de uma proteína às nanopartículas de polímero PO
Uma solução de tampão fosfato a 25 mM é preparada a partir de pó de NaH2P04 (Sigma ref S-0751) e ajustada com soda IN (SDS ref 3470015) a pH = 7,2.
Uma suspensão coloidal de nanopartículas de polímero PI é preparada por dissolução durante uma noite do polímero liofilizado a 5 mg/ml na solução de tampão fosfato precedente.
Uma solução mãe de BSA (Sigma A-2934) é preparada por dissolução durante duas horas de proteína a 10 mg/ml no mesmo tampão.
As soluções mãe assim como o tampão são filtradas em 0,22 μπι. São realizadas misturas por junção de volumes pré-determinados de duas soluções mãe e diluição no tampão fosfato de modo a ter no final uma gama de amostras possuindo uma concentração constante em polímero (0,1 mg/ml) e concentrações crescentes de proteínas (0 a 1,8 mg/ml).
As amostras são deixadas 5 horas a associar-se a 25°C e depois são analisadas por electroforése capilar num método dito frontal onde é possível visualizar separadamente a proteína e o complexo proteína-polímero. Para 55 ΡΕ1684792 mais detalhes sobre esta técnica, consultar o artigo seguinte: Gao JY, Dublin PL, Muhoberac BB, Anal. Chem. 1997, 69, 2945. As análises são realizadas num equipamento
Agilent G16000A munido com um capilar com uma bolha de silício fundido (tipo G1600-62-232). A altura do primeiro patamar correspondente à proteína livre permite determinar a concentração em BSA não associada. A experiência mostra que para quantidades de proteínas inferiores a 0,1 g de proteína por g de polímero, a proteína está associada às nanopartículas de polímero.
Exemplo 6: Determinação da concentração de gelificação Cl para os polímeros PO Pl, P3 e P6. 0 teste GI é aplicado a formulações de IL2 associada aos polímeros Pl, P3 P6 dos exemplos 1 e 2. As concentrações em proteínas destas formulações são relatadas na tabela abaixo. A medição do tempo de relaxação das formulações na presença de BSA (concentração de 30 mg/ml) efectua-se segundo um modo operatório do teste GI. A concentração crítica Cl, para a qual o tempo de relaxação excede 1 s é registado nas tabela 3 para IL2: TABELA 3:
Concentração de gelificação induzida para formulações de IL2 Polímero Pl P3 P6 Concentração em IL2 (mg/ml) 2,5 2,5 2,5 Concentração Cl (mg/ml) 17 17 >50 56 ΡΕ1684792
Exemplo 7: Farmacocinética da interleucina 2 (IL2) no macaco após injecção subcutânea de diversas formulações à base de poliaminoácidos anfifilicos.
As formulações seguintes são preparadas segundo um modo operatório descrito no exemplo 3. TABELA 4
Referência Polímero Concentração em polímero (mg/ml) Concentração em IL2 (mg/ml) E PI 30 2,5 F P3 20 2,5 G P6 40 2,5
As formulações E e F que possuem uma concentração em polímero superior à concentração de gelificação Cl medida no exemplo 6 pertencem à selecção segundo o invento. Ao contrário, a formulação G tem uma concentração inferior à concentração de gelificação Cl e não pertence à selecção segundo o invento.
Estas formulações são injectadas com uma dose de 0,5 mg/kg em macacos Cynomolgus. As recolhas de plasma são efectuadas nos tempos 1, 5, 11, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 240 horas. A concentração plasmática em IL2 é medida nas recolhas por doseamento ELISA (kit Immunotech IM 3583). 57 ΡΕ1684792
Os tempos Tmax e T50 para as formulações E, F, e G estão registados na tabela 5 abaixo. TABELA 5
Referência da formulação Tmax (h) T50 (h) E 32 34,5 F 32 37,5 G 4 10,5
Assim, as formulações E e F, que pertencem à se-lecção segundo o invento, apresentam uma duração da libertação consideravelmente acrescida em relação à formulação G que não pertence à selecção de acordo com o invento.
Exemplo 8: observação da gelificação in vivo de formulações de acordo com o invento após injecção subcutânea . 0 comportamento subcutâneo de formulação de acordo com o invento foi estudado no porco doméstico. Procedeu-se a injecções sob a pele do ventre, a 4 mm de profundidade, de seis porcos domésticos, com 0,3 ml de formulações seguintes:
Formulação A: solução aquosa isotónica a pH 7,3 do polímero P6 do exemplo 2 concentrada a 45 mg/ml.
Formulação B: solução aquosa isotónica a pH 7,3 do polímero PI do exemplo 1 concentrada a 20 mg/ml. 58 ΡΕ1684792
Os sítios injectados foram removidos 72 horas após administração. 0 exame histológico revela a presença de um depósito gelifiçado de polímero para a formulação B. Apresenta-se sob a forma de zonas uniformemente coloridas. Este fenómeno não é, ao contrário, observado para a formulação A para a qual o polímero está infiltrado entre as fibras de colagénio.
Pode-se sublinhar que a matriz de polímero B é perfeitamente biodegradável dado que o tecido volta completamente ao seu estado normal após 21 dias.
Lisboa, 13 de Março de 2012

Claims (33)

  1. ΡΕ1684792 1 REIVINDICAÇÕES 1. Formulação farmacêutica liquida para a libertação prolongada de interleucina(s) , compreendendo esta formulação, pelo menos uma interleucina, eventualmente pelo menos um outro principio activo PA, preferencialmente em solução aquosa e uma suspensão coloidal, aquosa, de baixa viscosidade, à base de partículas submicrónicas de polímero (PO) biodegradável, hidrossolúvel, seleccionado a partir do grupo que compreende poliaminoácidos, polissacáridos, gelatinas e suas misturas, e portador de grupos hidrófobos (GH) , estando as referidas partículas associadas de modo não covalente com a referida interleucina e eventualmente com o referido princípio activo (PA), caracterizado por: ♦ o meio dispersivo da suspensão ser essencialmente constituído por água, ♦ a sua concentração em [PO] ser fixada num valor [PO] > 0,9.Cl, de forma que a referida formulação farmacêutica esteja apta a ser injectada por via parentérica e a formar em seguida in vivo um depósito gelificado, em que Cl é a concentração de "gelificação induzida" das partículas de PO, tal como medido num teste GI tal como descrito na descrição, com esta formação de depósito gelificado: o sendo, por um lado, pelo menos, uma uma parte provocada por, pelo menos 2 ΡΕ1684792 proteína fisiológica presente in vivo, o e permitindo, por outro lado, prolongar e controlar a duração da libertação do interleucina e opcionalnalmente do PA in vivo, para lá de 24 h após administração, ♦ esta ser líquida nas condições injecção, ♦ e esta ser igualmente líquida à temperatura e/ou ao pH fisiológicos, e/ou na presença o de electrólito fisiológico em concentração fisiológica, o e/ou, pelo menos, um tensioactivo.
  2. 2. Formulação farmacêutica liquida para a libertação prolongada de interleucina(s) e eventualmente outro(s) princípio(s) activo(s) (PA), sendo esta formulação: • líquida à atmosfera ambiente, • igualmente líquida à temperatura fisiológica e/ou a pH fisiológico e/ou na presença de: electrólito fisiológico em concentração fisiológica, - e/ou, pelo menos, um tensioactivo • e compreendendo, pelo menos uma interleucina, eventualmente pelo menos um outro princípio activo PA, preferencialmente em solução aquosa e uma suspensão coloidal, aquosa, de baixa 3 ΡΕ1684792 viscosidade, à base de partículas submicró-nicas de polímero (PO) biodegradável, hidros-solúvel, seleccionado a partir do grupo que compreende poliaminoácidos, polissacáridos, gelatinas e suas misturas, e portador de grupos hidrófobos (GH), estando as referidas partículas associadas de modo não covalente com a referida interleucina e eventualmente com o referido princípio activo (PA) e o meio dispersivo da suspensão sendo essencialmente constituído por água, caracterizada por a sua concentração em [PO] ser tal que [PO] > 0,9.Cl, em que Cl é a concentração de "gelificação induzida" das partículas de PO, tal como medido num teste GI tal como descrito na descrição.
  3. 3. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a sua concentração em [PO] ser tal que: • 20.Cl > [PO] > 0,9 Cl, • e melhor ainda 10.Cl > [PO] > Cl,
  4. 4. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por os polímeros modificados hidrófobos PO serem seleccionados do grupo constituído por polissacáridos escolhidos a partir do grupo de pululanos, quitosanos e mucopolissacáridos. 4 ΡΕ1684792
  5. 5. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por os grupos hidrófobos (GH) se situarem lateralmente em relação à cadeia.
  6. 6. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por o polímero (PO) ser um poliaminoácido formado por unidades de ácido aspártico e/ou unidades de ácido glutâmico, sendo pelo menos uma parte destas unidades portadoras de enxertos compreendendo, pelo menos, um grupo hidrófobo (GH).
  7. 7. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o (ou os) PO serem definidos pela fórmula geral (I) seguinte:
    NHRT na qual • R1 representa um H, um alquilo linear em C2 a CIO ou alquilo ramificado em C3 a CIO, benzilo, uma unidade aminoácido terminal ou -R4-[GH]; • R2 representa um H, um grupo acilo linear em C2 ΡΕ1684792 5 a CIO ou acilo ramificado em C3 a CIO, um piroglutamato ou -R4-[GH]; • R3 é um H ou uma entidade catiónica, preferencialmente seleccionada do grupo constituído por: - catiões metálicos escolhidos com vantagem do grupo constituído por: sódio, potássio, cálcio, magnésio, - catiões orgânicos escolhidos com vantagem do grupo constituído por: * catiões à base de amina, * catiões à base de oligoamina, * catiões à base de poliamina (sendo a polietilenoimina particularmente preferida) , * catiões à base de aminoácido(s) escolhido(s) com vantagem da classe que compreende catiões à base de lisina ou de arginina, ou os poliaminoácidos catiónicos escolhidos com vantagem do grupo constituído pela polilisina ou oligolisina; • R4 representa uma ligação directa ou um "espaçador" à base de 1 a 4 unidades aminoácido; • A representa independentemente um radical -CH2- (unidade de ácido aspártico) ou -CH2-CH2-(unidade de ácido glutâmico); • n/ (n+m) é definida como a taxa de enxerto ΡΕ1684792 6 molar e varia desde 0,5 a 100% molar; • n/ (n+m) é definida como a taxa de enxerto molar e o seu valor é suficientemente baixo para que o PO dissolvido em água a pH 7 e a 25°C, forma uma suspensão coloidal de partículas submicrónicas de PO, preferencialmente n/(n+m) está compreendido entre 1 a 25% molar e melhor ainda entre 1 a 15% molar; • n+m varia de 10 a 1000, preferencialmente entre 50 e 300; • GH representa um grupo hidrófobo.
  8. 8. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o (ou os) PO corresponderem a uma daS fórmulas gerais (II), (III) e (IV) seguintes:
    ΡΕ1684792 7 nas quais: • GH representa um grupo hidrófobo • R30 é um grupo alquilo linear em C2 a C6; • R3' é H ou uma entidade catiónica, de preferência seleccionada do grupo constituído por: - catiões metálicos escolhidos com vantagem do grupo constituído por: sódio, potássio, cálcio, magnésio, - catiões orgânicos escolhidos com vantagem do grupo constituído por: * catiões à base de amina, * catiões à base de oligoamina, * catiões à base de poliamina (sendo a polietilenoimina particularmente preferida) , * catiões à base de aminoácido(s) escolhido(s) com vantagem da classe que compreende catiões à base de lisina ou de arginina, ou os poliaminoácidos catiónicos escolhidos com vantagem do grupo constituído pela polilisina ou oligolisina; • R50 é um grupo alquilo, dialcoxi ou diamina em C2 a C6; • R4 representa uma ligação directa ou um "espa-çador" à base de 1 a 4 unidades aminoácido; • A representa independentemente um radical -CH2- ΡΕ1684792 (unidade aspártica) ou -CH2-CH2- (unidade glu-tâmica); • n' + m' ou n' ' é definido como o grau de polimerização e varia de 10 a 1000, preferencialmente entre 50 e 300.
  9. 9. Formulação de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada por os grupos GH do PO representarem, cada um, independentemente, uns dos outros um radical monovalente com a fórmula seguinte:
    - R5 representa um metilo (alanina), iso-propilo (valina ), isobutilo (leucina), sec-butilo (isoleucina), ou benzilo (fenilala-nina); R6 representa um radical hidrófobo compreendendo de 6 a 30 átomos de carbono; - 1 varia de 0 a 6.
  10. 10. Formulação de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por todos ou parte dos radicais hidrófobos R6 9 ΡΕ1684792 dos PO serem escolhidos de modo independente do grupo de radicais compreendendo: • um alcoxi linear ou ramificado compreendendo de 6 a 30 átomos de carbono e podendo compreender pelo menos um heteroátomo (preferencialmente 0 e/ou N e/ou S) e/ou, pelo menos, uma insaturação, • um alcoxi compreendendo 6 a 30 átomos de carbono e possuindo um ou vários anéis carbociclicos condensados e contendo, eventualmente, pelo menos, uma unidade de insaturação e/ou, pelo menos, um heteroátomo (preferencialmente O e/ou N e/ou S), • um alcoxiarilo ou um ariloxialquilo de 7 a 30 átomos de carbono e podendo compreender, pelo menos, uma insaturação e/ou, pelo menos, um heteroátomo (preferencialmente O e/ou N e/ou S) .
  11. 11. Formulação de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada por o radical hidrófobo R6 do enxerto do PO ser proveniente de um precursor alcoólico escolhido do grupo constituído por octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, álcool oelílico, tocoferol e colesterol.
  12. 12. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o PO ser constituído por um homopolímero de alfa-L-glutamato ou alfa-L-glutâmico. 10 ΡΕ1684792
  13. 13. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o PO ser constituído por um homopolímero de alfa-L-aspartato ou alfa-L-aspártico.
  14. 14. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o PO ser constituído por um copolímero de alfa-L-aspartato/alfa-L-glutamato ou alfa-L-aspártico/alfa-L-glutâmico.
  15. 15. Formulação de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por no PO, a distribuição das unidades aspárticas e/ou glutâmicas portadoras de enxertos compreendendo, pelo menos, uma porção GH ser tal que o polímero assim constituído seja quer aleatório, seja quer do tipo de bloco seja quer do tipo multibloco.
  16. 16. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a massa molar do PO se situar entre 2000 e 100 000 g/mol e preferencialmente entre 5000 e 40 000 g/mol.
  17. 17. Formulação de acordo com as reivindicações 7 e 9, caracterizada por o radical hidrófobo R6 do enxerto do PO ser derivado de um percursor álcool formado pelo tocoferol, e por: ♦ 1% < [n/(n + m] χ 100 < 10% ♦ de preferência 3,5% < [n/(n + m] χ 100 < 7,5% 11 ΡΕ1684792 ♦ η + m varia desde 100 até 400 e, de preferência, entre 120 e 300.
  18. 18 Formulação de acordo com as reivindicações 7 e 9, caracterizada por o radical hidrófobo R6 do enxerto do PO ser derivado de um precursor álcool formado pelo colesterol: ♦ 1% < [n/(n + m] * 100 < 10% ♦ de preferência 3,5% < [n/(n + m] χ 100 < 7,5% ♦ n + m varia desde 100 até 400 e, de preferência, entre 120 e 300.
  19. 19. Formulação de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizada por a concentração de polímero [PO] estar entre 15 e 50 mg/ml.
  20. 20. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada por a sus viscosidade ser menor ou igual a 5 Pa.s a 20°C.
  21. 21. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada por a sua fracção em peso de interleucina(s) não associada(s) com as partículas submicrónicas [interleucina(s) não associada(s) ] , em %, ser tal que: o [interleucina(s) não associada(s)] < 1, o de preferência, [interleucina(s) não associada (s) ] < 0,5, 12 ΡΕ1684792 o com maior preferência, [interleucina(s) não associada(s)] < 0,1.
  22. 22. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada por a interleucina ser interleucina 2.
  23. 23. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada por o(s) principio(s) activo(s) adicional(ais) diferentes da(s) interleucina(s) ser(serem) uma proteína, uma glicoproteína, uma proteína ligada a uma ou várias cadeias polialquilenoglicol [preferencialmente polietilenoglicol (PEG): "proteína- PEGilada"], um polissacárido, um lipossacárido, um oligonucleótido, um polinucleótido ou um péptido, sendo este(s) princípio (s) activo(s) adicional(ais) preferencialmente seleccionado(s) de entre as hemoglobinas, os citocromos, as albuminas, os interferões, as citoquinas, os antigénios, os anticorpos, a eritropoietina, a insulina, as hormonas de crescimento, os factores VIII e IX, os factores estimulantes da hematopoiese e suas misturas.
  24. 24. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada por ser injectável por via parentérica, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor.
  25. 25. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada por se destinar à 13 ΡΕ1684792 preparação de medicamentos, particularmente para administração por via parentérica, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor, ou por via oral, nasal, vaginal ou ocular.
  26. 26. Processo para a preparação de medicamentos, particularmente para administração por via parentérica, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral ou num tumor, ou por via oral, nasal, vaginal ou ocular, caracterizado por consistir essencialmente na utilização de pelo menos uma formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25.
  27. 27. Produto derivado caracterizado por compreender partículas submicrónicas, formadas por associações não covalentes PO/PA tais como definidas na reivindicação 1 e por este ser obtido a partir da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25.
  28. 28. Produto derivado de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por este ser constituído por um pó ou por um gel.
  29. 29. Processo de preparação da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado por este consistir essencialmente em: * tomar uma suspensão coloidal de nano- uma partículas de PO com, pelo menos, 14 ΡΕ1684792 interleucina (e um ou vários outros possíveis princípios activos), preferencialmente em solução aquosa, * juntar eventualmente, pelo menos, um exci-piente, * se necessário ajustar o pH e/ou a osmo-laridade e, * eventualmente filtrar a suspensão assim obtida.
  30. 30. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por o (ou os) PA(s) estar(em) sob a forma de suspensão ou solução aquosa para a mistura com a suspensão coloidal de nanopartículas de PO.
  31. 31. Processo de preparação da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por este consistir essencialmente em: tomar um pó de, pelo menos, um polímero PO, misturar este pó com uma suspensão ou solução aquosa de, pelo menos, uma interleucina (e um ou vários outros possíveis princípios activos), preferencialmente em solução aquosa, juntar eventualmente, pelo menos, um exci-piente, se necessário ajustar o pH e/ou a osmo- laridade e 15 ΡΕ1684792 eventualmente filtrar a suspensão assim obtida.
  32. 32. Processo de preparação da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por este consistir essencialmente em: tomar um pó proveniente da secagem da formulação líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, misturar este pó com um meio líquido aquoso, preferencialmente sob agitação, juntar eventualmente, pelo menos, um exci- piente, se necessário ajustar o pH e/ou a osmo- laridade e, eventualmente filtrar a suspensão assim obtida.
  33. 33. Processo de preparação de um pó derivado da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por o referido pó ser obtido por secagem da formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25. Lisboa, 13 de Março de 2012
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