PT1664087E

PT1664087E - Remoção de priões utilizando óxidos metálicos em partículas

Info

Publication number: PT1664087E
Application number: PT04783316T
Authority: PT
Inventors: Christopher J Stenland; Jarrett C Terry; Jeffrey A Yuziuk
Original assignee: Bayer Healthcare Llc
Priority date: 2003-09-10
Filing date: 2004-09-07
Publication date: 2007-11-09
Also published as: DE602004008488T2; WO2005026197A1; ES2291947T3; CA2538288A1; EP1664087A1; EP1664087B1; US20050054003A1; DE602004008488D1; PL1664087T3; ATE370962T1; CY1107791T1; DK1664087T3; AU2004272591A1; JP2007527405A

Description

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DESCRIÇÃO "REMOÇÃO DE PRIÕES UTILIZANDO ÓXIDOS METÁLICOS EM PARTÍCULAS"

CAMPO DO INVENTO O invento refere-se à separação ou remoção de proteínas priónicas patogénicas de materiais biológicos. Os priões patogénicos são separados de materiais biológicos expondo o material a óxidos metálicos e/ou dióxido de silício em partículas, incluindo óxidos metálicos pirogenados, como sílica pirogenada.

ANTECEDENTES DO INVENTO

As proteínas priónicas patogénicas (priões patogénicos) estão associadas a encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs), que são doenças neurodegenerativas fatais em humanos e noutras espécies de mamíferos, particularmente ovelhas, cabras, gado vacum, martas, alces e veados. As formas humanas da doença incluem a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), síndroma de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), insónia familiar fatal (FFI) e Kuru. Sintomas destas doenças incluem mioclonia, ataxia e demência progressiva. A patologia destas doenças inclui a formação de placas amilóides no cérebro. 2 A ocorrência de doenças priónicas tem sido associada a transmissão infecciosa, bem como a causas genéticas e esporádicas. Por exemplo, Kuru, que afligiu a antiga tribo da Nova Guiné, foi causada pela ingestão de tecido cerebral infectado de outros membros da tribo durante rituais de canibalismo. Alpers "Slow Transmissible Diseases of the Nervous System" Volume I, S. B. Pruisner e W. J. Hadlow, editores (Nova Iorque: Academic Press), páginas 66-90 (1979). Mais recentemente, foi postulado que a ocorrência da variante da CJD (vCJD) no Reino Unido resultou do consumo de carne de vaca de gado infectado com um prião patogénico. G. Chazot et al., Lancet 347: 1181 (1996); R. G. Will et al., Lancet 347: 921-25 (1996). De modo semelhante, a CJD iatrogénica foi causada pela injecção de hormona de crescimento humana derivada de pituitárias de cadáveres. Brown et al., Lancet 340: 24-27 (1992) . Casos de actividade infecciosa de priões, como notado acima, sugerem que a infectividade de priões poderá ser transmitida através de materiais biológicos.

Crê-se que os priões infectam humanos e outros mamíferos via transmissão de uma proteína, a proteína priónica, sem transmissão concomitante de um ácido nucleico. Foi postulado que o agente infeccioso é uma variante causadora de doenças da proteína priónica celular (PrPc) de ocorrência natural, cuja função fisiológica é presentemente desconhecida. Nesta teoria, a forma variante da proteína priónica (PrPSc) induz alterações estruturais na forma normal da proteína priónica (PrPc) , desse modo convertendo-a na forma causadora de doenças da proteína priónica patogénica (PrPSc) . A PrPSc pode ser detectada 3 sujeitando uma amostra a tratamento com proteinase K e analisando a amostra quanto à presença do polipéptido resistente a proteinases (PrPRES). Ver Patente U.S. N° 6 437 102 de Lee et al.r atribuída à Bayer Corporation, e Lee, D. C., et ai. "Monitoring plasma processing steps with a sensitive Western blot assay for the detection of the prion protein" J. Virol. Methods _84_(1) : 77-89 (2000).

Composições terapêuticas são muitas vezes derivadas de materiais biológicos. Por exemplo, proteínas com valor terapêutico, como Factor VIII, imunoglobulinas, inibidor da a-1 proteinase, plasminogénio/plasmina e albumina, são isoladas de plasma humano. Sabe-se que outros agentes infecciosos, como o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e vírus da hepatite C (HCV), são transmitidos por utilização terapêutica de sangue ou produtos sanguíneos que não foram submetidos a métodos ou procedimentos de inactivação que removem eficazmente os agentes da corrente de processamento do produto. Evidências da transmissão de TSEs através de outros materiais biológicos fazem surgir inquietações quanto à possível transmissão de TSEs pelo sangue e produtos derivados do sangue, produtos recombinantes e outros produtos de origem biológica.

No entanto, os métodos conhecidos para reduzir os riscos de infecção causada por patogenes transmitidos pelo sangue, como HIV e HCV, não são eficazes para inactivar priões. Além disso, métodos que reduzem o risco de infecção por priões, que incluem tratamento com base forte e/ou autoclavagem, não são adequados para utilização com procedimentos destinados à preparação de proteínas 4 terapeuticamente úteis ou úteis de outra forma, pois esses procedimentos desnaturam as proteínas.

Em consequência, é necessário um método para separar priões de materiais biológicos, tais como fracções do plasma sanguíneo e soluções aquosas de proteínas produzidas de forma recombinante. 0 presente invento proporciona um método para separar priões desses materiais biológicos sem desnaturar proteínas com valor terapêutico.

RESUMO DO INVENTO 0 invento proporciona métodos para a separação ou remoção de priões de materiais biológicos. Reconhecer-se-á que esses métodos são úteis para assegurar que produtos originários de materiais biológicos são seguros para utilização subsequente por humanos ou animais que possam ficar infectados com proteínas priónicas patogénicas derivadas do material original.

Em conformidade, num aspecto, o invento refere-se a um método de preparação de uma solução que contém material biológico por adição ao material biológico de um óxido metálico, para obter uma solução que compreende uma mistura do óxido metálico e do material biológico, e separação do óxido metálico da mistura, para formar uma solução resultante. Proteínas priónicas patogénicas que possivelmente contaminam o material biológico estão substancialmente reduzidas na solução resultante. Nalgumas especificações, o método pode incluir avaliar a solução 5 resultante quanto à presença ou quantidade de proteína priónica patogénica.

Noutra especificação, o invento refere-se a um método de preparação de uma solução que contém material biológico por adição a material biológico de sílica pirogenada, caracterizada por uma área superficial específica desde cerca de 150 m2/g até cerca de 300 m2/g, para obter uma solução que compreende uma mistura de sílica pirogenada e do material biológico; separação da sílica pirogenada da mistura, para formar uma solução resultante, por passagem da mistura por um sistema de filtração compreendendo um filtro que retém pelo menos uma porção substancial de partículas da sílica pirogenada, e avaliação da solução resultante quanto à presença ou quantidade de proteína priónica patogénica utilizando um imunoensaio. Proteínas priónicas patogénicas que possivelmente contaminam o material biológico estão substancialmente reduzidas na solução resultante.

Noutro aspecto, o invento refere-se a um método de preparação de uma solução que contém material biológico por adição ao material biológico de partículas de dióxido de silício, para obter uma solução que compreende uma mistura de partículas de dióxido de silício e do material biológico; separação das partículas de dióxido de silício da mistura, para formar uma solução resultante, e avaliação da solução resultante quanto à presença ou quantidade de proteína priónica patogénica. Proteínas priónicas patogénicas que possivelmente contaminam o material 6 biológico estão substancialmente reduzidas na solução resultante. 0 invento também se refere a um método de separação de prióes de uma amostra por contacto da amostra, num estado liquido apto a fluir, com um substrato sólido que compreende um óxido metálico; permitindo que a amostra permaneça em contacto com o substrato durante um período de tempo tal que priões presentes na amostra se ligam ao substrato, e separando a amostra do substrato. 0 invento também se refere a um método para separar proteínas priónicas de uma amostra e concentrá-las para análise suplementar por contacto da amostra com um óxido metálico em partículas; separação do óxido metálico em partículas da amostra, e sujeição de proteínas priónicas associadas ao óxido metálico em partículas a análise suplementar.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta colorações "Western" que ilustram a detecção específica de proteína priónica patogénica (PrPSc) após filtração utilizando CAB-O-SIL (sílica pirogenada) nas concentrações indicadas adjacentes aos painéis. Os materiais e métodos utilizados são os indicados no Exemplo 1.

A Figura 2 é uma representação gráfica da remoção de PrPSc utilizando várias quantidades de CAB-O-SIL adicionado. Os dados utilizados para gerar o gráfico estão 7 representados nas experiências de coloração "Western" apresentadas na Figura 1. A Figura 3 apresenta colorações "Western" que ilustram a remoção de PrPSc conseguida por adição de CAB-O-SIL durante a purificação de plasminogénio. Ver Exemplo 2 quanto a pormenores respeitantes a materiais e métodos. A Figura 4 apresenta colorações "Western" que ilustram a remoção de PrPSc conseguida por adição de CAB-O-SIL durante uma variação do processo para a purificação de plasminogénio envolvido na geração dos resultados apresentados na Figura 3. Ver Exemplo 2 quanto a pormenores respeitantes a materiais e métodos. A Figura 5 apresenta colorações "Western" que ilustram a remoção de PrPSc conseguida por adição de AI(OH)3. As vias representam a análise de amostras com A1(0H)3 adicionado (% v/v de ANHYDROGEL) do modo seguinte: a, 0; b, 1; c, 2; d, 5; e, 10, e f, 18. Ver Exemplo 3 quanto a pormenores respeitantes a materiais e métodos.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA O presente invento proporciona um método para preparar soluções em que proteínas priónicas patogénicas que potencialmente contaminam as soluções são substancialmente reduzidas relativamente a uma solução de partida. O invento também proporciona a preparação de proteínas priónicas para análise suplementar com base na sua recuperação a partir de soluções contaminadas.

Em conformidade, num aspecto, o invento refere-se a um método de preparação de uma solução que contém material biológico por adição a material biológico de um óxido metálico, para obter uma solução que compreende uma mistura do óxido metálico e do material biológico, e separação do óxido metálico da mistura, para formar uma solução resultante. Nalgumas especificações, o método também compreende avaliar a solução resultante quanto à presença ou quantidade de proteina priónica patogénica.

Em especificações particulares, o material biológico pode consistir em produtos derivados do sangue, produtos derivados de tecidos ou produtos gerados de forma recombinante. Nalgumas especificações, o material biológico é um produto derivado do sangue. 0 produto derivado do sangue pode ser de origem humana. 0 produto derivado do sangue pode consistir em imunoglobulinas, factores de coagulação do sangue, plasmina, plasminogénio, inibidor da a-1 proteinase ou albumina.

Em especificações particulares, o óxido metálico pode ser silica pirogenada ou alumina pirogenada. 0 óxido metálico pirogenado pode ser silica pirogenada. A silica pirogenada pode caracterizar-se por uma área superficial especifica desde cerca de 130 m2/g até cerca de 380 m2/g. Em especificações particulares, a silica pirogenada pode caracterizar-se por uma área superficial especifica desde cerca de 150 m2/g até cerca de 300 m2/g. A silica pirogenada também pode caracterizar-se por uma área superficial especifica de cerca de 200 m2/g. 9

Nalgumas especificações, o óxido metálico é separado da mistura por filtração. A filtração pode incluir passagem da mistura por um sistema de filtração que retém partículas maiores do que desde cerca de 0,1 mm até cerca de 5 mm. A filtração também pode incluir passagem da mistura por um sistema de filtração que retém partículas maiores do que cerca de 0,8 μτη. A avaliação da solução resultante quanto à presença ou quantidade de proteína priónica patogénica pode incluir avaliar uma amostra quanto à infectividade utilizando um bioensaio de animal ou imunoensaio para a proteína priónica patogénica. 0 imunoensaio pode ser uma coloração "Western" ou ensaio ELISA.

Nalgumas especificações, o óxido metálico pode ser hidróxido de alumínio. O hidróxido de alumínio, na forma de um gel compreendendo cerca de 2% por peso de Al203, pode estar presente numa concentração desde cerca de 1% até cerca de 10% por volume, desde cerca de 1% até cerca de 5% por volume ou de cerca de 3% por volume.

Noutras especificações, o óxido metálico pode ser alumina pirogenada. A alumina pirogenada pode estar presente numa quantidade desde cerca de 0,1% até cerca de 1,0% por peso. A alumina pirogenada também pode estar presente numa quantidade desde cerca de 0,25% até cerca de 0,75% por peso. A alumina pirogenada também pode estar presente numa quantidade de cerca de 0,5% por peso. 10

Ainda noutro aspecto, o invento refere-se a um método de preparação de uma solução que contém material biológico por adição a material biológico de sílica pirogenada, caracterizada por uma área superficial especifica desde cerca de 150 m2/g até cerca de 300 m2/g, para obter uma solução que compreende uma mistura de sílica pirogenada e do material biológico; separação da sílica pirogenada da mistura, para formar uma solução resultante, por passagem da mistura por um sistema de filtração que compreende um filtro que retém pelo menos uma porção substancial de partículas da sílica pirogenada, e avaliação da solução resultante quanto à presença ou quantidade de proteína priónica patogénica utilizando um imunoensaio.

Nalgumas especificações, a sílica pirogenada caracteriza-se por uma área superficial especifica de cerca de 200 m2/g, uma densidade de compactação de cerca de 50 g/1 e um comprimento médio de partículas agregadas desde cerca de 0,2 μηι até cerca de 0,3 μιη. A sílica pirogenada é adicionada numa quantidade desde cerca de 0,1% até cerca de 1,0% (peso/peso) da solução compreendendo uma mistura de sílica pirogenada e do material biológico. A sílica pirogenada pode ser adicionada numa quantidade desde cerca de 0,2% até cerca de 0,8% (peso/peso) da solução compreendendo uma mistura de sílica pirogenada e do material biológico. A sílica pirogenada também pode ser adicionada numa quantidade de pelo menos cerca de 0,25% (peso/peso) da solução compreendendo uma mistura de sílica pirogenada e do material biológico. Em especificações particulares, a sílica pirogenada pode ser adicionada numa quantidade de pelo menos cerca de 0,5% (peso/peso) da 11 solução compreendendo uma mistura de sílica pirogenada e do material biológico.

Noutro aspecto, o invento refere-se a um método de preparação de uma solução que contém material biológico por adição a material biológico de partículas de dióxido de silício, para obter uma solução que compreende uma mistura de partículas de dióxido de silício e do material biológico; separação das partículas de dióxido de silício da mistura, para formar uma solução resultante, e avaliação da solução resultante quanto à presença ou quantidade de proteína priónica patogénica. Proteínas priónicas patogénicas que possivelmente contaminam o material biológico estão substancialmente reduzidas na solução resultante.

Nalgumas especificações, a separação de partículas de dióxido de silício da mistura é feita por centrifugação ou filtração.

Noutro aspecto, o invento refere-se a um método de separação de priões de uma amostra por contacto de uma amostra, num estado líquido apto a fluir, com um substrato sólido que compreende um óxido metálico; permitindo que a amostra permaneça em contacto com o substrato durante um período de tempo tal que os priões presentes na amostra se ligam ao substrato, e separando a amostra do substrato. 0 óxido metálico pode ser dióxido de silício ou hidróxido de alumínio. 0 óxido metálico pode ser sílica pirogenada. 12

Noutro aspecto, o invento refere-se a um método para separar proteínas priónicas de uma amostra e concentrá-las para análise suplementar, em que o método é implementado por contacto da amostra com um óxido metálico em partículas; separação do óxido metálico em partículas da amostra; sujeição de proteínas priónicas associadas ao óxido metálico em partículas a análise suplementar. A análise de proteínas priónicas pode incluir imunoensaio, bioensaio de animal, análise espectroscópica ou análise cromatográfica. 0 invento proporciona métodos para a separação ou remoção de priões de materiais biológicos. Materiais biológicos incluem fluidos derivados de forma biológica, como fracções de plasma do sangue, amostras biológicas, como amostras de tecidos, e soluções aquosas de produtos gerados de forma recombinante, como proteínas recombinantes. Em geral, os métodos proporcionam a separação de priões do material biológico por adição ao material biológico de dióxido de silício em partículas ou de um óxido metálico, para obter uma mistura do dióxido de silício em partículas ou óxido metálico e do material biológico. Em seguida, o dióxido de silício em partículas ou óxido metálico é separado da mistura, tal como por filtração ou centrifugação, para obter um material biológico purificado que se caracteriza por uma redução substancial de quaisquer proteínas priónicas patogénicas que possam ter contaminado o material biológico original.

Reconhecer-se-á que esses métodos são úteis para assegurar que produtos originários de materiais biológicos 13 são seguros para utilização subsequente por humanos ou animais que possam ficar infectados com proteína priónica patogénica derivada do material original. Em conformidade, a prática do invento inclui implementar o método revelado em materiais biológicos que possam ou não compreender, de facto, proteínas priónicas patogénicas, como método de certificação de qualidade para o processamento de materiais biológicos potencialmente contaminados.

Tal como são aqui utilizados, os termos seguintes têm o significado apresentado a menos que expressamente indicado em contrário. "Bioensaio de animal" designa um ensaio para priões patogénicos num material que envolve a introdução de uma amostra de teste do material num organismo vivo susceptível a doenças causadas ou associadas a proteínas priónicas patogénicas, seguido de monitorização do organismo quanto a evidências do desenvolvimento de um estado de doença relacionado. Bioensaios de animais incluem, mas não se limitam ao ensaio de infectividade de roedores descrito por Brown, P., et al. "The distribution of infectivity in blood components and plasma derivatives in experimental models of transmissible spongiform encephalopathy" Transfusion 38_(9) : 810-6 (1998). "Produto derivado do sangue" designa qualquer produto gerado a partir de fontes de sangue completo ou fraccionado, geralmente de mamíferos. 14 "Material biológico" designa qualquer material originário de um organismo vivo que pode ser processado na forma de uma solução. Material biológico que pode ser submetido ao método do invento pode incluir qualquer material biológico, mas geralmente será um material que, devido à sua origem, historial de processamento ou outras exposições, está potencialmente contaminado com proteina priónica patogénica. "Óxido metálico" designa um óxido metálico na forma de partículas pequenas com elevada área superficial relativamente ao peso. Estão incluídos óxidos metálicos pirogenados, habitualmente formados por injecção de um cloreto metálico numa chama de hidrogénio e oxigénio ou ar (óxidos metálicos "pirogenados" ou pirogénicos) . Em geral, esse material é amorfo, mas pode compreender misturas de várias fases cristalinas. Estão incluídos dióxido de silício e hidróxido de alumínio em partículas. Essas partículas podem formar agregados tridimensionais de partículas primárias. Óxidos metálicos pirogenados incluem sílica pirogenada e alumina pirogenada. "Sílica pirogenada" designa dióxido de silício coloidal amorfo e pirogénico. "Imunoensaio" designa um ensaio baseado em interacções específicas e detectáveis entre um anticorpo e proteína priónica. Se o próprio imunoensaio for inespecífico relativamente a isoformas não patogénicas e patogénicas da proteína priónica, a sua utilização pode ser acoplada a um procedimento que distingue as isoformas de 15 modo substancial, por exemplo, por digestão proteolitica da isoforma não patogénica. Exemplos de imunoensaios úteis incluem colorações "Western", ELISAs e ensaios de coloração em pontos. "Prião patogénico ou PrPSc" designa qualquer agente infeccioso proteináceo associado a qualquer uma de uma variedade de doenças neurodegenerativas transmissíveis que afectam humanos ou outros mamíferos, incluindo formas presentemente caracterizadas de encefalopatias espongiformes transmissíveis humanas (por exemplo, variante da Doença de Creutzfeldt-Jakob (vCJD), kuru, Doença de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS) e insónia familiar fatal (FFI)), encefalopatias espongiformes bovinas (doença "das vacas loucas"), doença das tremuras (que afecta ovelhas e cabras), doença de emaciação crónica (veados), bem como outras doenças parcialmente caracterizadas e ainda não caracterizadas disseminadas por exposição a uma forma patogénica (isoforma da doença das tremuras - PrPSc) de uma proteína priónica (ver Prusiner, S. B., "Molecular biology of prion disease" Science 252: 1515-1522 (1991)). "Produto gerado de forma recombinante" designa qualquer produto gerado utilizando qualquer construção de ácidos nucleicos manufacturada (como construções utilizadas para gerar organismos transgénicos alterados para produzirem um produto proteico que normalmente não é gerado nem é gerado numa quantidade particular no organismo nativo). Esses produtos podem estar potencialmente contaminados com proteína priónica patogénica devido a qualquer exposição a animais utilizados no processo de 16 produção recombinante ou outros. Reconhecer-se-á que "recombinante" designa originalmente produzido por métodos recombinantes, e que os produtos recombinantes podem ser subsequentemente gerados de um modo que, por si próprio, é tecnicamente não recombinante (por exemplo, um animal transgénico originalmente produzido por tecnologia recombinante e subsequentemente propagado para gerar o produto recombinante). "Dióxido de silício" designa partículas ou agregados de partículas de dióxido de silício de elevada área superficial e dimensão fina das partículas. "Área superficial específica" designa a área superficial por unidade de peso de um sólido em partículas, determinada, por exemplo, pelo método B.E.T. (Brunauer, Emmett e Teller). "Produto derivado de tecidos" designa qualquer produto gerado a partir de tecidos de um organismo vivo, incluindo aqueles produtos gerados para utilização terapêutica ou nutricional, cujo processamento envolve, pelo menos num aspecto, fase de fabrico ou passo de manipulação, a produção de uma solução capaz de formar uma mistura com um óxido metálico ou dióxido de silício ou hidróxido de alumínio em partículas. 0 óxido metálico pirogenado para utilização em métodos do invento pode ser sílica pirogenada ou alumina pirogenada. 0 dióxido de silício em partículas que pode ser utilizado de acordo com pelo menos algumas especificações 17 do método do invento caracteriza-se por ter uma dimensão das partículas primárias muito fina. Dimensões médias de partículas agregadas podem ser mais difíceis de determinar de forma conclusiva e consistente. Nalgumas especificações do invento, o dióxido de silício utilizado é um dióxido de silício coloidal. Dióxido de silício coloidal é uma sílica pirogenada da ordem dos submícrones preparada pela hidrólise em fase de vapor (por exemplo, a 1110°C) de um composto de silício, como tetracloreto de silício. Esses produtos são comercialmente disponibilizados por algumas fontes, incluindo a Cabot Corporation, Tuscola, IL (com a marca registada CAB-O-SIL), e Degussa, Inc., Piscataway, NJ (com a marca registada AEROSIL). 0 dióxido de silício coloidal também é conhecido como sílica coloidal, sílica pirogenada, ácido silícico anidro leve, anidrido silícico e dióxido de silício pirogenado, entre outros. É produzida uma variedade de qualidades comerciais de dióxido de silício coloidal variando o processo de fabrico. Tipicamente, essas modificações não afectam o teor de sílica, gravidade específica, índice de refracção, cor ou forma amorfa. No entanto, estas modificações podem alterar a dimensão das partículas, áreas superficiais e densidades aparentes dos produtos de dióxido de silício coloidal. A área superficial de uma classe de dióxido de silício utilizada em especificações particulares do método do invento varia desde cerca 50 m2/g até cerca de 500 m2/g. O diâmetro médio das partículas primárias da classe preferida de dióxidos de silício utilizada no invento varia 18 desde cerca de 5 nm até cerca de 50 nm. Todavia, em produtos comerciais de dióxido de silício coloidal, estas partículas estão aglomeradas ou agregadas em extensões variáveis. A dimensão (comprimento) média de partículas agregadas pode ir desde cerca de 100 nm (0,1 |M) até cerca de 500 nm (0,5 μπι) . A densidade de compactação de uma classe de dióxidos de silício utilizada no invento varia desde cerca de 20 g/1 até cerca de 100 g/1.

Produtos comercialmente disponíveis de dióxido de silício coloidal podem ter, por exemplo, uma área superficial BET que varia desde cerca de 50 m2/g até cerca de 400 m2/g. Dimensões de partículas comercialmente disponíveis podem variar desde um diâmetro nominal de partículas de cerca de 7 nm até uma dimensão média das partículas primárias de cerca de 40 nm. Estes produtos comercialmente disponíveis são descritos apenas para fins exemplificativos de propriedades aceitáveis de uma classe útil de dióxidos de silício; com esta descrição não se pretende limitar, de modo nenhum, o âmbito do invento. O método do invento pode ser utilizado para separar priões de fracções do plasma sanguíneo. Quando utilizado para separar priões de fracções do plasma sanguíneo, o método do invento pode dar origem a desde pelo menos cerca de 2 até pelo menos cerca de 3 logs de remoção de priões da fracção de plasma do sangue. O método do invento pode ser utilizado para separar priões de soluções aquosas de produtos gerados de forma 19 recombinante. Um produto gerado de forma recombinante pode ser uma proteína gerada de forma recombinante.

Em especificações particulares dos métodos do invento, qualquer proteína priónica patogénica que potencialmente contamina uma fracção de plasma sanguíneo pode ser substancialmente reduzida por adição à fracção de plasma do sangue de dióxido de silício em partículas para formar uma mistura. Em especificações particulares, o dióxido de silício em partículas é adicionado a cerca de 0,5% (peso/peso) da mistura. Em seguida, o dióxido de silício em partículas é removido desta mistura, e a solução resultante tem contaminação por priões substancialmente reduzida relativamente ao material de partida. Em certas especificações, o dióxido de silício pode ser removido por filtração.

Os resultados obtidos de acordo com uma especificação do presente invento podem ser avaliados utilizando um ensaio de coloração "Western" para medir a partição da remoção de PrPSc por adição de CAB-O-SIL M-5P a uma solução de albumina do soro bovino (BSA) enriquecida com homogenato de cérebro com doença das tremuras (SBH) clarificado. De acordo com o presente invento, pode obter-se remoção até ao limite de detecção, aproximadamente 4,5 logs, adicionando CAB-O-SIL 0,5%, seguido da remoção de CAB-O-SIL utilizando filtração de 0,8 μπι (não mais do que aproximadamente 0,5 logs de remoção são atribuíveis à própria filtração de 0,8 μιη) . Ver Exemplo 1, bem como as Figuras 1 e 2. 20

Além disso, a adição de sílica pirogenada CAB-O-SIL (cerca de 0,25% peso/peso) durante um processo para a purificação de plasminogénio dá origem a pelo menos cerca de 2-3 logs adicionais de remoção de proteína priónica patogénica. O Exemplo 2 descreve as experiências conduzidas para avaliar a remoção de priões neste contexto, ao passo que a Figura 3 apresenta a análise de coloração "Western" dos resultados. Os dados mostram remoção melhorada de 3 logs relativamente a amostras processadas sem aditivo de sílica pirogenada.

Reconhecer-se-á que uma amostra submetida a remoção de priões de acordo com os métodos do invento pode ser exposta a um óxido metálico na forma de uma suspensão numa amostra líquida, ou uma amostra líquida apta a fluir pode ser exposta ao óxido metálico na forma de um substrato sólido. A amostra que foi submetida a remoção de priões pode ser recuperada por uma variedade de meios, incluindo na forma de um filtrado utilizando vários protocolos de filtração, na forma de um sobrenadante utilizando centrifugação ou na forma de um eluato de um substrato sólido.

Os Exemplos seguintes são ilustrativos de especificações particulares do invento, mas não devem ser considerados limitadores do âmbito do invento tal como é aqui reivindicado. 21

EXEMPLOS

Exemplo 1. Remoção de PrPSc Utilizando Várias Concentrações de CAB-O-SIL M-5P

Dissolveu-se albumina do soro bovino (BSA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para dar origem a uma solução de BSA a 1 mg/ml. A solução de BSA foi "enriquecida" com homogenato de cérebro com doença das tremuras (SBH; preparado utilizando cérebros de hamsters infectados com o agente 263K adaptado a hamsters), altamente clarificado, antes da utilização, por centrifugação a 10 OOOg durante 10 minutos para uma concentração final de aproximadamente 1%. Adicionou-se sílica CAB-O-SIL M-5P (CAB-O-SIL) a várias concentrações, seguido de sujeição a vórtice e filtração utilizando um filtro de 0,8 μκι (estimou-se que a filtração por si só é responsável por aproximadamente 0,5 logs de redução de PrPSc) . O CAB-O-SIL foi substancialmente retido pelo filtro.

Apresentam-se na Figura 1 análises de coloração "Western" de Amostra de Entrada, filtrados de CAB-O-SIL 0%, 0,1%, 0,25% e 0,5%. A Figura 2 apresenta uma representação gráfica do efeito de concentrações crescentes de CAB-O-SIL na remoção de PrPSc (quanto a pormenores sobre materiais e métodos ver Patente U.S. N° 6 437 102 de Lô ô et al., atribuída à Bayer Corporation ; Lee, D. C., et al. "Monitoring plasma Processing steps with a sensitive

Western blot assay for the detection of the prion protein" J. Virol. Methods 84(1): 77-89 (2000), que apresenta 22 pormenores relativamente a uma análise sensível de coloração "Western" para a detecção de proteínas priónicas; ver também Stenland, C. J., et al. "Partitioning of human and sheep forms of the pathogenic prion protein during the purification of therapeutic proteins from human plasma" Transfusion _42 (11) : 1497-500 (Novembro de 2002) , que indica que a partição de priões humanos é semelhante à observada no modelo de doença das tremuras no hamster, e Lee, D. C., et al. "A direct relationship between the partitioning of the pathogenic prion protein and transmissible spongiform encephalopathy infectivity during the purification of plasma proteins" Transfusion £1(4): 449-55 (2001), que indica que priões detectados pelos métodos revelados estão correlacionados com a infectividade animal).

As experiências acima, com os resultados apresentados na Figura 1, foram repetidas com a excepção de se ter utilizado um enriquecimento de cérebro com doença das tremuras altamente purificado e não associado a membranas ("preparação Bolton", ver Bolton et al., Arch. Biochem. Biophys. 258: 579-90 (1987)) numa concentração final de aproximadamente 0,5%. As análises "Western" da Entrada, CAB-O-SIL 0%, 0,1%, 0,25% e 0,5% originaram resultados substancialmente idênticos, com remoção até ao limite de detecção resultante da utilização de CAB-O-SIL 0,5%. No entanto, foi notado que, em contraste com os 0,5 logs de remoção por filtração de 0,8 μιη do homogenato de cérebro com doença das tremuras clarificado (do total de 5 logs atingido), 2,5 logs de remoção da preparação Bolton deveram-se apenas à filtração. 23

Exemplo 2. Remoção de PrPSc Utilizando CAB-O-SIL no Processo de Purificação de Plasminogénio

Pormenores de um processo de purificação de plasmina/plasminogénio, propriedade do detentor da presente candidatura, são revelados numa Candidatura de Patente U.S. co-pendente intitulada "Process for Production of Reversibly Inactive Acidified Plasmin Composition" (Publicação de Candidatura de Patente U.S. N° US 20020192794 AI de Dadd et al.). O material de partida para o passo do processo envolvendo a utilização de silica pirogenada é uma pasta formada durante a purificação de imunoglobulina de Fracções Cohn II e III, um precipitado de caprilato referido aqui como Bolo de Caprilato I (CCI).

Extraiu-se CCI com L-lisina 200 mM e tampão Tris-HC1 0,1 M durante três horas. Adicionaram-se dois por cento de HYFLO SUPERCEL (auxiliar de filtração - Celite Corporation, Lompoc, CA) e filtrou-se a suspensão num pano de filtração, para remover auxiliar de filtração gasto. O enriquecimento de homogenato de cérebro com doença das tremuras foi adicionado após a filtração no pano e antes das adições de polietilenoglicol (PEG) 3350 3%. O filtrado enriquecido resultante foi dividido em 3 aliquotas. Uma porção não recebeu CAB-O-SIL, a segunda recebeu 0,25% e a terceira alíquota recebeu CAB-O-SIL 0,5% (p/p). Após mais 3 horas de mistura adicionaram-se 2% (p/p) de auxiliar de filtração e filtrou-se o material numa almofada de filtração CUNO SP-90. Analisaram-se os filtrados resultantes, por coloração "Western", quanto ao teor de PrP. 24

Os resultados estão apresentados na Figura 3. Os resultados parecem indicar 0,5 até 1,0 logs de sinal presente nos filtrados de CAB-O-SIL 0,25% e 0,5%. Por investigação subsequente utilizando estudos de controlo, verificou-se que os sinais eram reacções inespecificas de IgG com o anticorpo secundário e não estavam relacionadas com PrP. Apesar do CAB-O-SIL ter removido PrP do material de extracto de CCI, observaram-se níveis comparáveis de proteínas, incluindo concentrações de plasminogénio, para os três níveis de adição de CAB-O-SIL. Assim, o CAB-O-SIL removeu o PrP com efeitos mínimos nos componentes proteicos desejados.

Noutras experiências, o CCI foi extraído utilizando fosfato de sódio dibásico 50 mM contendo L-Lisina 200 mM, PEG 4% e CAB-O-SIL 0,25%. Dez por cento de homogenato de cérebro em bruto foram adicionados no início da extracção e misturados durante 4 horas. Adicionou-se auxiliar de filtração e filtrou-se a solução num CUNO SP90.

Aparece um sinal no filtrado e no enxaguamento (Figura 4). Tal como acima, com estudos de controlo verificou-se que estes sinais não eram específicos do PrP. O PrP ficou retido no auxiliar de filtração e na almofada de filtração.

Exemplo 3._AI (OH) 3 para Remoção de Priões

Tal como no Exemplo 1, BSA 0,1%/TBS foi enriquecido com SBH para concentrações finais de 1% ou 0,1%. 25

Utilizaram-se estas amostras para avaliar o hidróxido de alumínio (AI2O3, 1,9 - 2,2% (p/v) na forma de um gel ou pasta - representado aqui também como A1(0H)3 ou hidróxido de alumínio) (ALHYDROGEL, Superfos Biosector A/S, Dinamarca) como agente útil para a remoção de priões. As percentagens volume/volume abaixo referem-se à proporção do produto ALHYDROGEL adicionado.

Adicionaram-se várias quantidades de AI(OH)3 (concentrações finais de 0 até 18% (v/v), como indicado na Tabela 1) a amostras que continham SBH, e as amostras foram misturadas tal como no Exemplo 1. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 5100 g durante 5 minutos e o sobrenadante e o grânulo foram avaliados quanto ao PrPSc. Na Figura 5, as vias representam a análise de amostras com AI(OH)3 adicionado (% v/v), tal como na Tabela 1.

Tabela 1. Concentração de Al(OH)3 via % pasta de Al (OH) 3 (v/v) a 0.0 b 0.9 c 1.8 d 4.5 e 9.1 f 18.2

Para SBH 1%, a remoção foi superior a 4 logs para hidróxido de alumínio quando tratado com mais de 4,5% (v/v). Para SBH 0,1%, a remoção foi superior a 3 logs para hidróxido de alumínio superior a 1% (v/v). 26

Exemplo 4. Avaliação do Processo de Extracção de Plasminogénio

Para validar um sistema modelo para avaliar a remoção de PrPSc de acordo com uma especificação particular do presente invento, caracterizou-se um modelo escalado negativamente para a extracção do Bolo de Caprilato I (CCI) (como discutido acima relativamente ao procedimento de purificação de plasminogénio) relativamente ao efeito de remoção dos passos de Precipitação/Filtração em Profundidade de PEG. A finalidade deste estudo foi estabelecer um modelo laboratorial do passo de Extracção de CCI e Precipitação/Filtração em Profundidade de PEG no Processo de Plasminogénio em condições padrão. Depois de estabelecido, o sistema modelo foi utilizado para avaliar a remoção de PrPSc em todo o passo do processo.

Em resumo, o CCI foi novamente suspenso em tampão de extracção de base TRIZMA 0,1 M (pH 10,5) a 4°C durante mistura num periodo de 2-3 horas. Após a extracção, ajustou-se o pH da solução para 7,5 e aumentou-se a temperatura do extracto para 20°C. Adicionou-se ao extracto L-lisina para uma concentração final de 100 mM mantendo um pH de 7,5. Adicionou-se polietilenoglicol (PEG) para uma concentração final de 3% (p/p), seguido da adição do auxiliar de filtração HYFLO SUPERCEL para uma concentração final de 4% (p/p). Em seguida, o extracto foi filtrado numa almofada de filtração CUNO SP-30 e o filtrado foi recolhido. Recolheram-se amostras do extracto de CCI inicial, filtrado e extracto. Determinou-se o total de proteínas por A280 e determinou-se a recuperação de 27 plasminogénio por imunonefelometria. A análise de recuperação indicou perdas muito pequenas de proteínas neste passo.

Em seguida, avaliou-se a remoção de PrPSc durante os passos de CCI e precipitação/filtração em profundidade de PEG. A finalidade desta experiência foi determinar a quantidade de PrPSc removido durante os passos de extracção de CCI e precipitação/filtração em profundidade de PEG. 0 protocolo foi igual ao descrito acima com a excepção, durante a extracção de CCI, de se ter adicionado a 100 ml do extracto 1 ml de SBH em bruto 10%, resultando numa concentração final de SBH de 0,1%. A pasta retida pelo filtro CUNO SP-30 foi novamente suspensa para o volume original em TBS. Amostras da Prova (extracto enriquecido antes da filtração), filtrado e nova suspensão da pasta foram analisadas quanto ao plasminogénio e PrPSc por análise "Western".

Os passos acima (sem hidróxido de alumínio nem CAB-0-SIL) resultaram em 1 log de remoção de PrPSc.

Exemplo 5._Efeito de Al (OH) 3 na Recuperação de

Plasminogénio e Remoção de PrPSc

Determinou-se 0 efeito de A1(0H)3 10% (v/v) (ALHYDROGEL, Superfos Biosector A/S, Dinamarca) na recuperação de plasminogénio e remoção de PrPSc durante a filtração/filtração em profundidade de PEG. O protocolo foi igual ao descrito acima no Exemplo 4, com a excepção, após 28 a adição de PEG 3%, de se ter adicionado A1(0H)3 10% (v/v). A pasta retida pelo filtro CUNO SP-30 foi novamente suspensa para o volume original em TBS. Amostras da Prova (extracto enriquecido antes da filtração) , filtrado e nova suspensão da pasta foram analisadas quanto ao plasminogénio e PrPSc por análise "Western". A adição de Al(OH)3 na concentração indicada acima resultou num aumento da remoção de PrPSc de 2 logs (aproximadamente 3 logs com versus 1 log sem).

Exemplo 6._Remoção de PrPSc Utilizando Al (OH) 3 no

Processo de Purificação de Plasminogénio

Determinou-se o efeito de Al(OH)3 3% na remoção de PrPSc durante o processamento do Bolo de Caprilato I (CCI) . O CCI foi extraido e processado como descrito acima. Numa experiência, adicionaram-se enriquecimento de SBH e Al(OH)a 3% (v/v) antes da filtração (polipropileno poroso) do coágulo. Removeram-se amostras da Entrada (Prova) e filtrado de coágulo. Determinou-se a presença de PrPSc em cada amostra por análise "Western". A inclusão de Al(OH)3 3% (v/v) resultou em 2 logs de remoção de PrPSc. Sem Al(OH)3, a remoção foi 0 logs. 29 29 Exemplo 7 ,

Comparação de Sílica Pirogenada e Alumina

Pirogenada

Em contraste com a pasta de A1(0H)3 utilizada na experiência anterior, também se utilizou alumina pirogenada (SPECTRAL, Cabot Corporation, Tuscola, IL) em experiências para comparar o seu efeito com o da silica pirogenada (CAB-O-SIL) .

Cinquenta mililitros de albumina do soro bovino (BSA) 0,1% em TBS foram enriquecidos com 0,5 ml de homogenato clarificado de cérebro de hamster com doença das tremuras ou de um enriquecimento (Bolton) altamente purificado. Após o enriquecimento, recolheu-se para análise uma amostra inicial de 10 ml (Prova), para determinar o titulo inicial do material. Em seguida, adicionaram-se a tubos cónicos de 15 ml aproximadamente 0,05 g de alumina pirogenada ou silica pirogenada. A cada um destes tubos adicionaram-se 10 ml do material enriquecido e inverteram-se os tubos 15-20 vezes.

Prepararam-se unidades de filtração removendo os êmbolos de três seringas de 10 ml e equipando-os com filtros de seringa de 0,8 μιη. Realizaram-se três filtrações para cada um dos tipos de enriquecimento. A primeira filtração não tinha óxido metálico presente, a segunda filtração tinha alumina pirogenada e a terceira tinha silica pirogenada. Analisaram-se as provas e filtrados resultantes por coloração "Western", tendo-se encontrado os sinais seguintes. 30

Tabela 2. Comparação entre Alumina Pirogenada e Sílica Pirogenada quanto à Remoção de PrP

Amostra Enriquecimento de PrP Clarificado* Enriquecimento Bolton* i Prova 4.0 5.5 apenas filtro de 0,8 μιη 3.5 3.0 alumina pirogenada 0,5% 0 0 sílica pirogenada 0,5% 0 0

* Os dados representam valores logio da detecção do sinal de PrP

Observou-se remoção até ao limite de detecção para ambos os óxidos metálicos em ambas as condições de enriquecimento. 31

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO A lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor, não sendo parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 6437102 B, Lee [0004] [0055] • US 20020192794 Al [0057]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • ALPERS. Slow Transmissible Diseases of the Nervous System. Academic Press, 1979, vol. 1, 66-90 [0003] • G. CHAZOT et al. Lancet, 1996, vol. 347, 1181 [0003] • R. G. WILL et al. Lancet, 1996, vol. 347, 921-25 [0003] • BROWN et al. Lancet, 1992, vol. 340, 24-27 [0003] • LEE, D.C. et al. Monitoring plasma processing steps with a sensitive Western blot assay for the detection of the prion protein. J Virol Methods, 2000, vol. 84 (1), 77-89 [0004] • BROWN, P. et al. The distribution of infectivity in blood components and plasma derivatives in experimental models of transmissible spongiform encephalopathy. Transfusion, 1998, vol. 38 (9), 810-6 [0032] • PRUSINER, S. B. Molecular biology of prion disease. Science, 1991, vol. 252, 1515-1522 [0038] • LEE, D.C et al. Monitoring plasma processing steps with a sensitive Western blot assay for the detection of the prion protein. J Virol Methods, 2000, vol. 84 (1), 77-89 [0055] • STENLAND, C.J et al. Partitioning of human and sheep forms of the pathogenic prion protein during the purification of therapeutic proteins from human plasma. Transfusion, November 2002, vol. 42 (11), 1497-500 [0055] • LEE, D.C. et al. A direct relationship between the partitioning of the pathogenic prion protein and transmissible spongiform encephalopathy infectivity during 32 the purification of plasma proteins. Transfusion, 2001, vol. 41 (4), 449-55 [0055] • BOLTON et al. Bolton preparation. Arch Biochem Biophys, 1987, vol. 258, 579-90 [0056]

Lisboa, 29/10/2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de preparação de uma solução que contém material biológico, que compreende: a) adicionar um óxido metálico a material biológico para obter uma solução que compreende uma mistura do óxido metálico e do material biológico, e b) separar o óxido metálico da mistura para formar uma solução resultante, em que proteínas priónicas patogénicas que possivelmente contaminam o material biológico estão substancialmente reduzidas na solução resultante.

2. Método de preparação de uma solução que contém material biológico, que compreende: a) adicionar um óxido metálico a material biológico para obter uma solução que compreende uma mistura do óxido metálico e do material biológico; b) separar o óxido metálico da mistura para formar uma solução resultante, e c) avaliar a solução resultante quanto à presença ou quantidade de proteína priónica patogénica, 2 em que proteínas priónicas patogénicas que possivelmente contaminam o material biológico estão substancialmente reduzidas na solução resultante.

3. Método da reivindicação 2, em que o material biológico é seleccionado do grupo que consiste em produtos derivados do sangue, produtos derivados de tecidos e produtos gerados de forma recombinante.

4. Método da reivindicação 2, em que o material biológico é um produto derivado do sangue.

5. Método da reivindicação 4, em que o produto derivado do sangue é de origem humana.

6. Método da reivindicação 4, em que o produto derivado do sangue é seleccionado do grupo que consiste em imunoglobulinas, factores de coagulação do sangue, plasmina, plasminogénio, inibidor da (X-l proteinase e albumina.

7. Método da reivindicação 2, em que o óxido metálico é seleccionado do grupo que consiste em sílica pirogenada e alumina pirogenada.

8. Método da reivindicação 2, em que o óxido metálico é sílica pirogenada.

9. Método da reivindicação 8, em que a sílica pirogenada é caracterizada por uma área superficial específica desde cerca de 130 m2/g até cerca de 380 m2/g. 3

10. Método da reivindicação 8, em que a sílica pirogenada é caracterizada por uma área superficial específica desde cerca de 150 m2/g até cerca de 300 m2/g.

11. Método da reivindicação 8, em que a sílica pirogenada é caracterizada por uma área superficial específica de cerca de 200 m2/g.

12. Método da reivindicação 2, em que a separação do óxido metálico da mistura compreende filtração.

13. Método da reivindicação 12, em que a filtração compreende passar a mistura por um sistema de filtração que retém partículas maiores do que desde cerca de 0,1 μιη até cerca de 5 μιη.

14. Método da reivindicação 12, em que a filtração compreende passar a mistura por um sistema de filtração que retém partículas maiores do que cerca de 0,8 μιη.

15. Método da reivindicação 2, em que a avaliação da solução resultante quanto à presença ou quantidade de proteína priónica patogénica compreende avaliar uma amostra quanto à infectividade utilizando um ensaio seleccionado do grupo que consiste num bioensaio de animal ou num imunoensaio para a proteína priónica patogénica.

16. Método da reivindicação 2, em que a avaliação da solução resultante quanto à presença ou quantidade de proteína priónica patogénica compreende avaliar uma amostra 4 quanto à presença de proteína priónica patogénica utilizando um imunoensaio.

17. Método da reivindicação 16, em que o imunoensaio é seleccionado do grupo que consiste em colorações "Western" e ensaios ELISA.

18. Método da reivindicação 16, em que o imunoensaio é uma coloração "Western".

19. Método da reivindicação 2, em que o óxido metálico é hidróxido de alumínio.

20. Método da reivindicação 19, em que o hidróxido de alumínio, na forma de um gel compreendendo cerca de 2% por peso de AI2O3, está presente numa concentração desde cerca de 1% até cerca de 10% por volume.

21. Método da reivindicação 19, em que 0 hidróxido de alumínio, na forma de um gel compreendendo cerca de 2% por peso de A1203, está presente numa concentração desde cerca de 1% até cerca de 5% por volume.

22. Método da reivindicação 19, em que o hidróxido de alumínio, na forma de um gel compreendendo cerca de 2% por peso de A1203, está presente numa concentração de cerca de 3% por volume.

23. Método de preparação de uma solução que contém material biológico, que compreende: 5 a) adicionar ao material biológico silica pirogenada, caracterizada por uma área superficial especifica desde cerca de 150 m2/g até cerca de 300 m2/g, para obter uma solução que compreende uma mistura de silica pirogenada e do material biológico; b) separar a silica pirogenada da mistura para formar uma solução resultante por passagem da mistura por um sistema de filtração que compreende um filtro que retém pelo menos uma porção substancial de partículas da sílica pirogenada, e c) avaliar a solução resultante quanto à presença ou quantidade de proteína priónica patogénica utilizando um imunoensaio, em que proteínas priónicas patogénicas que possivelmente contaminam o material biológico estão substancialmente reduzidas na solução resultante.

24. Método da reivindicação 23, em que a sílica pirogenada é caracterizada por uma área superficial específica de cerca de 200 m2/g, uma densidade de compactação de cerca de 50 g/1 e um comprimento médio de partículas agregadas desde cerca de 0,2 μηι até cerca de 0,3 μιη.

25. Método da reivindicação 23, em que a sílica pirogenada é adicionada numa quantidade desde cerca de 0,1% até cerca de 1,0% (peso/peso) da solução que compreende uma mistura de sílica pirogenada e do material biológico. 6

26. Método da reivindicação 23, em que a sílica pirogenada é adicionada numa quantidade desde cerca de 0,2% até cerca de 0,8% (peso/peso) da solução que compreende uma mistura de sílica pirogenada e do material biológico.

27. Método da reivindicação 23, em que a sílica pirogenada é adicionada numa quantidade de pelo menos cerca de 0,25% (peso/peso) da solução que compreende uma mistura de sílica pirogenada e do material biológico.

28. Método da reivindicação 23, em que a sílica pirogenada é adicionada numa quantidade de pelo menos cerca de 0,5% (peso/peso) da solução que compreende uma mistura de sílica pirogenada e do material biológico.

29. Método de preparação de uma solução que contém material biológico, que compreende: a) adicionar partículas de dióxido de silício a material biológico para obter uma solução que compreende uma mistura de partículas de dióxido de silício e do material biológico; b) separar da mistura as partículas de dióxido de silício para formar uma solução resultante, e c) avaliar a solução resultante quanto à presença ou quantidade de proteína priónica patogénica, 7 em que proteínas priónicas patogénicas que possivelmente contaminam o material biológico estão substancialmente reduzidas na solução resultante.

30. Método da reivindicação 29, em que a separação das partículas de dióxido de silício da mistura compreende centrifugação ou filtração.

31. Método da reivindicação 29, em que a separação das partículas de dióxido de silício da mistura compreende centrifugação.

32. Método de separação de priões de uma amostra, que compreende: a) contactar uma amostra, num estado líquido apto a fluir, com um substrato sólido que compreende um óxido metálico; b) permitir que a amostra permaneça em contacto com o substrato durante um período de tempo tal que priões presentes na amostra se ligam ao substrato, e c) separar a amostra do substrato.

33. Método da reivindicação 32, em que o óxido metálico é dióxido de silício ou hidróxido de alumínio.

34. Método da reivindicação 32, em que o óxido metálico é sílica pirogenada. 8

35. Método para separar proteínas priónicas de uma amostra e concentrá-las para análise suplementar, cujo método compreende: a) contactar a amostra com um óxido metálico em partículas; b) separar da amostra o óxido metálico em partículas; c) submeter proteínas priónicas associadas ao óxido metálico em partículas a análise suplementar.

36. Método da reivindicação 35, em que a análise suplementar de proteínas priónicas compreende pelo menos uma técnica analítica seleccionada do grupo que consiste em imunoensaio, bioensaio de animal, análise espectroscópica e análise cromatográfica. Lisboa, 29/10/2007