ES2291947T3 - Eliminacion de priones usando oxidos metalicos particulados. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de preparar una solución que contiene material biológico, que comprende a) añadir un óxido metálico al material biológico para obtener una solución que comprende una mezcla del óxido metálico y el material biológico; y b) separar el óxido metálico de la mezcla para formar una solución resultante, en la que las proteínas priónicas patógenas que posiblemente contaminan el material biológico se redujeron sustancialmente en la solución resultante.

Description

Eliminación de priones usando óxidos metálicos particulados.
Campo de la invención
La invención se refiere a la separación o depuración de proteínas patógenas priónicas de los materiales biológicos. Los priones patógenos se separan de los materiales biológicos exponiendo el material a óxidos metálicos y/o a dióxido de sílice particulado, incluyendo óxidos metálicos de pirólisis tales como sílice de pirólisis.
Antecedente
La proteína priónica patógena (priones patógenos) está asociada con encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE), las cuales son enfermedades neurodegenerativas mortales en humanos y otras especies mamíferas, particularmente ovejas, cabras, ganado vacuno, visón, uapití, y ciervo. Las formas humanas de la enfermedad incluyen enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), insomnio familiar mortal (FFI), y Kuru. Los síntomas de estas enfermedades incluyen mioclonus, ataxia, y demencia progresiva. La patología de estas enfermedades incluye la formación de placas amiloides en el cerebro.
La aparición de enfermedades priónicas se ha ligado a transmisión infecciosa, así como a causas esporádicas y genéticas. Por ejemplo, Kuru, el cual afligió a la tribu Fore de Nueva Guinea, estaba causada por la ingestión de tejido cerebral infectado de otros miembros de la tribu durante el canibalismo ritual. Alpers, "Slow Transmisible Diseases of the Nervous System", vol. 1, S. B. Pruisney W.J. y W.J. Hadlow, eds. (New York: Academic Press), páginas 66-90 (1979). Más recientemente, la aparición de CJD variante (CJD v) en el Reino Unido se ha postulado que era resultado de consumo de carne de ganado vacuno infectada con un prion patógeno. G. Chazot,y col., Lancet 347: 18181 (1996); R.G. Will,y col., Lancet 347: 921-25 (1996). De forma similar, el CJD iatrogénico se ha causado por inyección de hormona del crecimiento humana derivada de pituitarias de cadáveres. Brown,y col., Lancet 340: 24-27 (1992). Los casos de actividad infecciosa de priones, como se destaca anteriormente, sugieren que la infectividad del prion se puede transmitir a través de materiales biológicos.
Se cree que los priones infectan humanos y otros mamíferos por medio de transmisión de una proteína, la proteína priónica, sin transmisión concomitante de un ácido nucleico. Se ha postulado que el agente infeccioso es una variante causante de enfermedad de la proteína priónica celular (PrP^{C}), que se da en la naturaleza, la función fisiológica de la cual no se conoce actualmente. En esta teoría la forma variante de la proteína priónica (PrP^{S}) induce cambios estructurales en la forma normal de la proteína priónica (PrP^{C}), convirtiéndola de este modo en la forma causante de la enfermedad de la proteína priónica patógena (PrP^{Sc}). Se puede detectar PrP^{Sc} sometiendo una muestra a tratamiento de proteinasa K y analizando la muestra para la presencia del polipéptido resistente a proteinasa (PrP^{RES}). Véase Patente de los Estados Unidos Nº.: 6.497.102 concedida a Lee, y col., transferida a Bayer Corporation, y Lee, D.C. y col., "Monitoring plasma processing steps with a sensitive Western blot assay for the detection of the prion protein", J. Virol. Methods, 84 (1): 77-89 (2000).
Las composiciones terapéuticas se derivan a menudo de materiales biológicos. Por ejemplo, las proteínas valorables terapéuticamente tales como factor VII, inmunoglobulinas, inhibidor de proteinasa \alpha-1, plasminógeno/plasmina, y albúmina se aíslan de plasma humano. Otros agentes infecciosos, tales como virus de inmunodeficiencia humana (HIV) y virus de la hepatitis C (HCV) se han conocido para transmitirse mediante uso terapéutico de sangre o productos sanguíneos que no han sufrido métodos o procedimientos de inactivación que eliminen de forma efectiva los agentes del flujo de procesamiento del producto. La evidencia de la transmisión de TSE a través de aumentos de otros materiales biológicos se refiere a posible transmisión de TSE a través de sangre y productos derivados de sangre, productos recombinantes, y otros productos de origen biológico.
Procedimientos conocidos para reducir el riesgo de infección a partir de patógenos terminales sanguíneos, tales como HIV y HCV, sin embargo, no son efectivas en inactivar priones. Además, procedimientos que reducen el riesgo de infección a partir de priones, los cuales incluyen tratamiento con base fuerte y/o autoclavado, no son adecuados para usar con procedimientos para la preparación de proteínas terapéuticas o proteínas útiles de otra manera, debido a que tales procedimientos desnaturalizan las proteínas.
Se necesita por lo tanto un procedimiento para separar priones de materiales biológicos, tales como fracciones de plasma sanguíneos y soluciones acuosas de proteínas producidas recombinantemente. La presente infección proporciona un procedimiento de separar priones a partir de tales materiales biológicos sin desnaturalizar proteínas terapéuticamente valiosas.
Sumario de la invención
La invención proporciona procedimientos para la separación o depuración de priones a partir de materiales biológicos. Se reconocerá que tales procedimientos son útiles para asegurar que productos que se originan a partir de materiales biológicos son seguros para uso subsiguiente por humanos o animales que pueden llegar a estar infectados con proteína priónica patógena derivada del material original.
De acuerdo con ello, en un aspecto la invención se refiere a un procedimiento de preparar una disolución que contiene material añadiendo un óxido metálico a material biológico para obtener una solución que comprende una mezcla de óxido metálico y el material biológico; y separar el óxido metálico de la muestra para formar una solución resultante. En algunas realizaciones, el procedimiento puede incluir evaluar la solución resultante para la presencia o cantidad de proteína priónica patógena.
En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento de preparar una solución que contiene material biológico añadiendo sílice de pirólisis caracterizado por un área de superficie específica de aproximadamente 150 m^{2}/g a aproximadamente 300 m^{2}/g para material biológico para obtener una solución que comprende una mezcla de sílice de pirólisis y el material biológico; separando la sílice de pirólisis de la mezcla para formar una resolución resultante pasando la mezcla a través de un sistema de filtración el cual retiene al menos una parte sustancial de partículas de la sílice de pirólisis; y evaluando la solución resultante para la presencia o cantidad de proteína priónica patógena usando un inmunoensayo. Las proteínas priónicas patógenas que posiblemente contaminan el material biológico están sustancialmente reducidas en la solución resultante.
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de preparar una solución que contiene material biológico añadiendo partículas de dióxido de silicio a material biológico para obtener una solución que comprende una mezcla de partículas de dióxido de silicio y el material biológico; separando las partículas de dióxido de silicio de la mezcla para formar una solución resultante; y evaluando la solución resultante para la presencia de cantidad de proteína priónica patógena. Las proteínas priónicas patógenas que posiblemente contaminan el material biológico están sustancialmente reducidas en la solución resultante.
La invención también se refiere a un procedimiento de separar priones de una muestra poniendo en contacto una muestra en un estado líquido capaz de fluir con un sustrato sólido que comprende un óxido metálico; permitiendo a la muestra permanecer en contacto con el sustrato durante un tiempo tal que los priones en la muestra se unan al sustrato, y separando la muestra del sustrato.
La invención se refiere adicionalmente a un procedimiento de separar proteínas priónicas de una muestra y concentrarlas para análisis adicional poniendo en contacto la muestra con un óxido metálico particular; separando el óxido metálico particulado de la muestra; y sometiendo a las proteínas priónicas asociadas con el óxido metálico particulado a análisis adicional.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra prueba de bandas de Western que ilustra detección específica de proteína priónica patógena (PrP^{Sc}) que sigue a filtración usando CAB-O-SIL (sílice de pirólisis) en las concentraciones indicadas adyacentes a los paneles. Los materiales y procedimientos utilizados son como se indican en el ejemplo 1.
La figura 2 es una representación gráfica de la depuración o retirada de PrP^{Sc} usando varias cantidades de CAB-O-SIL añadido. Los datos usados para generar la gráfica se representan en los experimentos de prueba de bandas de Western como se muestra en la figura 1.
La figura 3 muestra prueba de bandas de Western que ilustra depuración de PrP^{Sc} llevada a cabo mediante adición de CAB-O-SIL durante purificación de plasminógeno. Véase ejemplo 2 para detalles respecto a materiales y procedimientos.
La figura 4 muestra prueba de bandas de Western que ilustra depuración de PrP^{Sc} llevada a cabo mediante adición de CAB-O-SIL durante una variación del procedimiento para purificación de plasminógeno implicado en generar los resultados mostrados en la figura 3. Véase ejemplo 2 para detalles respecto a materiales y procedimientos.
La figura 5 muestra prueba de bandas de Western que ilustra depuración de PrP^{Sc} llevada a cabo mediante adición de Al(OH)_{3}. Los carriles representan análisis de muestras que tienen Al(OH)_{3} añadido (% v/v de ANHIDROGEL) como sigue: a, 0; b, 1; c, 2; d, 5; e, 10; y f, 18. Véase ejemplo 3 para detalles respecto a materiales y procedimientos.
Descripción detallada
La presente invención proporciona un procedimiento para preparar soluciones en las que las proteínas priónicas patógenas que contaminan potencialmente las soluciones se reduzcan sustancialmente en relación a una solución de partida. La invención también permite la preparación de proteínas priónicas para análisis adicional basado en su recuperación a partir de soluciones contaminadas.
De acuerdo con ello, en un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de preparar una solución que contiene material biológico añadiendo un óxido metálico a material biológico para obtener una solución que comprende una mezcla del óxido metálico y el material biológico; y separando el óxido metálico de la mezcla para formar una solución resultante. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente evaluar la solución resultante para la presencia o cantidad de proteína priónica patógena.
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En realizaciones particulares, el material biológico puede ser productos derivados de la sangre, productos derivados de tejidos, o productos producidos recombinantemente. En algunas realizaciones, el material biológico es un producto derivado de la sangre. El producto derivado de la sangre puede ser inmunoglobulinas, factores de coagulación de la sangre, plasmina, plasminógeno, inhibidor de proteinasa \alpha-1, o albúmina.
En realizaciones particulares, el óxido metálico puede ser sílice de pirólisis o alúmina de pirólisis. El óxido metálico de pirólisis puede ser sílice de pirólisis. La sílice de pirólisis se puede caracterizar mediante un área de superficie específica de aproximadamente 130 m^{2}/g a aproximadamente 380 m^{2}/g. En realizaciones particulares, la sílice de pirólisis puede estar caracterizada por un área de superficie específica de aproximadamente 150 m^{2}/g a aproximadamente 300 m^{2}/g. La sílice de pirólisis puede estar caracterizada por un área de superficie específica de aproximadamente 200 m^{2}/g.
En algunas realizaciones, el óxido metálico está separado de la mezcla mediante filtración.
La filtración puede incluir hacer pasar la mezcla a través de un sistema de filtración que retiene partículas mayores que de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 5 mm. La filtración puede incluir también hacer pasar la mezcla a través de un sistema de filtración que retiene partículas mayores que 0,8 \mum.
Evaluar la solución resultante para la presencia o cantidad de proteína priónica patógena puede incluir evaluar una muestra para infectividad usando un bioensayo animal o un inmunoensayo para la proteína priónica patógena. El inmunoensayo puede ser una prueba de bandas de Western o un ELISA.
En algunas realizaciones, el oxido metálico puede ser hidróxido de aluminio. El hidróxido de aluminio, como un gel que comprende aproximadamente AlO_{3} al 2% en peso, puede estar presente a una concentración de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10% en volumen, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5% en volumen, o a aproximadamente el 3% en volumen.
En otras realizaciones, el óxido metálico puede ser alúmina de pirólisis. La alúmina de pirólisis puede estar presente en una cantidad de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 1,0% en peso. La alúmina de pirólisis puede también estar presente en una cantidad de aproximadamente el 0,25% a aproximadamente el 0,75% en peso. La alúmina de pirólisis puede también estar presente en una cantidad de aproximadamente el 0,5% en peso.
En aún otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de preparar una solución que contiene material biológico añadiendo sílice de pirólisis caracterizada por un área de superficie específica de aproximadamente 150 m^{2}/g a aproximadamente 300 m^{2}/g para material biológico para obtener una solución que comprende una mezcla de sílice de pirólisis y el material biológico; separando la sílice de pirólisis de la mezcla para formar una solución resultante haciendo pasar la mezcla a través de un sistema de filtración que comprende un filtro el cual retiene al menos una parte sustancial de partículas de la sílice de pirólisis; y evaluando la solución resultante para la presencia o cantidad de proteína priónica patógena que usa un inmunoensayo.
En algunas realizaciones, la sílice de pirólisis se caracteriza por un área de superficie específica de aproximadamente 200 m^{2}/g, una densidad de placa de aproximadamente 50 g/l, y una longitud de partícula de agregado promedio de aproximadamente 0,2 \mum a aproximadamente 0,3 \mum. La sílice de pirólisis se añade en una cantidad de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 1,0% (peso/peso) de la solución que comprende una mezcla de sílice de pirólisis y el material biológico. La sílice de pirólisis se puede añadir en una cantidad de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 0,8% (peso/peso) de la solución que comprende una mezcla de sílice de pirólisis y el material biológico. La sílice de pirólisis se puede añadir también en una cantidad de al menos aproximadamente el 0,25% (peso/peso) de la solución que comprende una mezcla de sílice de pirólisis y el material biológico. En realizaciones particulares, la sílice de pirólisis se puede añadir también en una cantidad de al menos aproximadamente el 0,5% (peso/peso) de la solución que comprende una mezcla de sílice de pirólisis y el material biológico.
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de preparar una solución que contiene material biológico añadiendo partículas de dióxido de silicio al material biológico para obtener una solución que comprende una mezcla de partículas de dióxido de silicio y el material biológico; separar las partículas de dióxido de silicio de la mezcla para formar una solución resultante; y evaluar la solución resultante para la presencia o cantidad de proteína priónica patógena. Las proteínas priónicas patógenas que posiblemente contaminan el material biológico están sustancialmente reducidas en la solución resultante.
En algunas realizaciones, la separación de partículas de dióxido de silicio de la mezcla se lleva a cabo mediante centrifugación o filtración.
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de separar priones de una muestra poniendo en contacto una muestra en un líquido capaz de fluir con un sustrato sólido que comprende un óxido metálico, permitiendo a la muestra permanecer en contacto con el sustrato durante un tiempo tal que los priones en la muestra se unan al sustrato; y separando la muestra del sustrato. El óxido metálico puede ser dióxido de silicio o hidróxido de aluminio. El óxido metálico puede mediante sílice de pirólisis.
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En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de separar proteínas priónicas de una mezcla y concentrarlas para análisis adicional, el procedimiento mediante poner en contacto la mezcla con un óxido metálico particulado; separar el óxido metálico particulado de la muestra; someter proteínas priónicas asociadas con el óxido metálico particulado a análisis adicional. El análisis de proteínas priónicas puede incluir inmunoensayo, bioensayo animal, análisis espectroscópico, o análisis cromatográfico.
La invención proporciona procedimientos para la separación o depuración de priones a partir de materiales biológicos. Los materiales biológicos incluyen fluidos derivados biológicamente, tales como fracciones de plasma sanguíneo, muestras biológicas, tales como muestras de tejidos, y soluciones acuosas de productos producidos recombinantemente, tales como proteínas recombinantes. Generalmente, los procedimientos estipulan la separación de priones a partir del material biológico añadiendo un dióxido de silicio u óxido metálico particulado al material biológico para obtener una mezcla del dióxido de silicio u óxido metálico particulado y el material biológico. El dióxido de silicio u óxido metálico particulado se separa después de la mezcla, tal como mediante filtración o centrifugación, para obtener un material biológico purificado que se caracteriza por una reducción sustancial en cualesquiera proteínas priónicas patógenas que puedan haber contaminado el material biológico original.
Se reconocerá que tales procedimientos son útiles para asegurar que productos que se originan a partir de materiales biológicos son seguros para uso subsiguiente por humanos o animales que podrían llegar a estar infectados con proteína priónica patógena derivada del material original. De acuerdo con ello, la práctica de la invención incluye llevar a cabo el procedimiento descrito en materiales biológicos que pueden o no pueden comprender realmente proteína priónica patógena como un procedimiento de garantía de calidad para el procesamiento de materiales biológicos potencialmente contaminados.
Como se usa en el presente documento, los siguientes términos tienen el significado indicado a menos que se indique expresamente lo contrario:
"Bioensayo animal" quiere decir un ensayo para prion patógeno en un material que implica la introducción de una muestra de prueba del material dentro de un organismo vivo susceptible de enfermedad causada por o asociada con proteínas priónicas patógenas, seguido mediante monitorización del organismos para evidencia del desarrollo de un estado morboso relacionado. Los bioensayos animales incluyen, pero no se limitan a, el ensayo de infectividad de roedores como se describe mediante Brown, P. y col., "The distribution of infectivity in blood components and plasma derivatives in experimental models of transmisible spongiform encephalopathy", Transfusion, 38 (9): 810-6 (1998).
"Producto derivado de sangre" quiere decir cualquier producto producido a partir de fuentes sanguíneas completas o fraccionadas, generalmente de mamíferos.
"Material biológico" quiere decir cualquier material originado a partir de un organismo vivo que puede procesarse como una solución. El material biológico que puede someterse al procedimiento de la invención puede incluir cualquier material biológico pero será generalmente un material que, debido a su origen, historia de procesamiento, u otra exposición, está potencialmente contaminado con proteína priónica patógena.
"Óxido metálico" quiere decir un óxido metálico en forma de partículas pequeñas, que tiene un área de superficie grande en relación al peso. Están incluidos óxidos metálicos de pirólisis, usualmente formados mediante inyección de un cloruro metálico dentro de una llama de hidrógeno y oxígeno en el aire (óxidos metálicos "de pirólisis" o pirogénicos). Generalmente, tal material es amorfo pero puede comprender mezclas de diversas fases cristalinas. Están incluidos dióxido de silicio e hidróxido de aluminio particulados. Tales partículas pueden formar agregados tridimensionales de partículas primarias. Los óxidos metálicos de pirólisis incluyen sílice de pirólisis y alúmina de pirólisis.
"Sílice de pirólisis" quiere decir dióxido de silicio coloidal amorfo, pirogénico.
"Inmunoensayo" quiere decir un ensayo basado en interacción específica y detectable entre un anticuerpo y proteína priónica. Si el inmunoensayo por sí mismo es no específico con respecto a isoformas no patógenas y patógenas de la proteína priónica, su uso suele estar acoplado a un procedimiento que distingue sustancialmente entre las isoformas, por ejemplo mediante digestión proteolítica de la isoforma no patógena. Ejemplos de inmunoensayos útiles incluyen ensayos de bandas de Western, ensayos de ELISA, y ensayos de transferencia por puntos.
"Prion patógeno" o "PrP^{Sc}" significa cualquier agente infeccioso proteico asociado con cualquiera de una diversidad de enfermedades neurodegenerativas transmisibles que afectan a humanos u otros mamíferos, incluyendo formas caracterizadas actualmente de encefalopatías espongiformes transmisibles humanas (por ejemplo, Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob variante (vCJD), kuru, Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS), e insomnio familiar mortal (FFI)), encefalopatías espongiformes bovinas (enfermedad de las "vacas locas"), scrapie (que afecta a ovejas y cabras), enfermedad de consunción crónica (ciervo), así como otras parcialmente caracterizadas y como enfermedades aún no caracterizadas extendidas a través de exposición a una forma patógena (isoforma de scrapie - PrP^{Sc}) de una proteína priónica (véase Prusiner, S.B., "Molecular biology of prion disease", Science 252: 1515-1522 (1991)).
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"Producto producido recombinantemente" significa cualquier producto producido usando cualquier constructo de ácido nucleico hecho por el hombre (tal como constructos usados para generar organismos transgénicos alterados para producir un producto proteico no producido normalmente, o no producido en una cantidad particular, en el organismo nativo). Tales productos pueden estar potencialmente contaminados con proteína priónica patógena debido a cualquier exposición a animales usada en el proceso de producción recombinante o de otra manera. Se reconocerá que "recombinante" significa originalmente producido mediante procedimientos recombinantes, y que la producción subsiguiente de los productos recombinantes se puede llevar a cabo en una manera que es, en sí misma y de sí misma, técnicamente no recombinante (por ejemplo, un animal transgénico originalmente producido a través de tecnología recombinante y propagado subsiguientemente para producción del producto recombinante).
"Dióxido de silicio" quiere decir tamaño de partícula fino, partículas de dióxido de silicio de área de superficie elevada o agregados de partículas.
"Área de superficie específica" significa el área de superficie por peso unitario de un sólido particulado, por ejemplo como se determina mediante el procedimiento de B.E.T. (Brunauer, Emmett, y Teller).
"Producto derivado de tejido" significa cualquier producto producido a partir de tejido de un organismo vivo, incluyendo aquellos productos producidos para uso terapéutico o nutricional, el procesamiento de los cuales implica, en al menos un aspecto, fase de fabricación, o etapa de manipulación, la producción de una solución capaz de formar una mezcla con un óxido metálico o dióxido de silicio particulado o hidróxido de aluminio particulado.
El óxido metálico de pirólisis para usar en procedimientos de la invención puede ser sílice de pirólisis o alúmina de pirólisis. El dióxido de silicio particulado que se puede usar de acuerdo con al menos algunas realizaciones del procedimiento de la invención se caracteriza según un tamaño de partícula principal muy fino. El tamaño de partícula de agregado puede ser más difícil para determinar concluyentemente y consistentemente. En algunas realizaciones de la invención, el dióxido de silicio utilizado es un dióxido de silicio coloidal. Dióxido de silicio coloidal es una sílice de pirólisis submicrónica preparada mediante la hidrólisis de fase de vapor (por ejemplo, a 1110ºC) de un compuesto de silicio, tal como tetracloruro de carbono. Tales productos están comercialmente disponibles a partir de un número de fuentes, incluyendo Cabot Corporation, Tuscola, IL (bajo el nombre comercial CAB-O-SIL) y Deguss, Inc., Piscataway, N.J. (bajo el nombre comercial AEROSIL).
El dióxido de silicio coloidal se conoce también como sílice coloidal, sílice de pirólisis, ácido silícico anhidro ligero, anhídrido silícico, y dióxido silícico de pirólisis, entre otros. Se produce una diversidad de clases comerciales de dióxido de silicio coloidal variando el procedimiento de fabricación. Tales modificaciones no afectan típicamente al contenido en sílice, gravedad específica, índice de refracción, color o forma amorfa. Sin embargo, estas modificaciones pueden cambiar el tamaño de partícula, áreas de superficie, y densidades masivas de los productos de dióxido de silicio coloidal.
El área de superficie de una clase de dióxido de silicio usado en realizaciones particulares del procedimiento de la invención varía de aproximadamente 50 m^{2}/g a aproximadamente 500 m^{2}/g. El diámetro de partícula principal promedio de la clase preferida de dióxidos de silicio utilizados en la invención varía de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 50 nm. Sin embargo, en productos de dióxido de silicio coloidal comerciales, estas partículas están aglomeradas o agregadas en grados que varían. El tamaño de partícula de agregado promedio (longitud) puede ser de aproximadamente 100 nm (0,1 \mum) a aproximadamente 500 nm (0,5 \mum). La densidad de la placa de la única clase de dióxidos de silicio utilizada en la invención varía de aproximadamente 20 g/l a aproximadamente 100 g/l.
Los productos de dióxido de silicio coloidal disponibles comercialmente pueden tener, por ejemplo, un área de superficie de BET que varía de aproximadamente 50 m^{2}/g a aproximadamente 400 m^{2}/g. Los tamaños de partícula disponibles comercialmente pueden variar de un diámetro de partícula nominal de aproximadamente 7 nm a un tamaño de partícula principal promedio de aproximadamente 40 nm. Estos productos comercialmente disponibles se describen para propósitos de ejemplificación de propiedades aceptables de una clase útil de dióxidos de silicio solamente, y esta descripción no significa limitar el alcance de la invención en cualquier manera en absoluto.
El procedimiento de la invención se puede usar para priones separados de fracciones de plasma sanguíneo. Cuando se usa para separar priones de fracciones de plasma sanguíneo, el procedimiento de la invención puede resultar en de al menos aproximadamente 2 a al menos aproximadamente 3 unidades logarítmicas de depuración de priones a partir de la fracción de plasma sanguíneo.
El procedimiento de la invención se puede usar para separar priones a partir de soluciones acuosas de productos producidos recombinantemente. Un producto producido recombinantemente puede ser una proteína producida recombinantemente.
En realizaciones particulares de los procedimientos de la invención, cualquier proteína priónica patógena que potencialmente contamina una fracción de plasma sanguíneo puede reducirse sustancialmente añadiendo dióxido de silicio particulado a la fracción de plasma sanguíneo para forma una mezcla. En realizaciones particulares, se añade el dióxido de silicio particulado a aproximadamente el 0,5% (peso/peso) de la mezcla. El dióxido de silicio particulado se retira después de esta mezcla y la solución resultante tiene contaminación por priones sustancialmente reducida en relación al material original. El dióxido de silicio se puede eliminar mediante filtración en ciertas realizaciones.
Los resultados logrados de acuerdo con una realización de la presente invención se pueden evaluar usando un ensayo de bandas de Western para medir el fraccionamiento de la eliminación de PrP^{Sc} mediante la adición de CAB-O-SIL M-5P a una solución de seroalbúmina bovina (BSA) fortalecida con homogenado de cerebro con scrapie aclarado (SHB). De acuerdo con la presente invención, el aclarado al límite de detección, aproximadamente 4,5 unidades logarítmicas, se puede lograr añadiendo CAB-O-SIL al 0,5% seguido por eliminación de CAB-O-SIL usando filtración de 0,8 \mum (depuración de no más de aproximadamente 0,5 unidades logarítmicas es atribuible a la filtración de 0,8 \mum por sí misma). Véase ejemplo 1, así como figuras 1 y 2.
Adicionalmente, la adición de sílice de pirólisis CAB-O-SIL (aproximadamente 0,25 peso/peso) durante un procedimiento para purificación de resultados de plasminógeno da como resultado al menos aproximadamente depuración de 2-3 unidades logarítmicas adicionales de proteína priónica patógena. El ejemplo 2 describe los experimentos llevados a cabo para evaluar depuración de priones en este contexto, mientras la figura 3 muestra análisis de bandas de Western de los resultados. Los datos muestran depuración mejorada de 3 unidades logarítmicas sobre muestras procesadas con ningún aditivo de sílice de pirólisis.
Se reconocerá que una muestra sometida a depuración de priones de acuerdo con los procedimientos de la invención se puede exponer a un óxido metálico como una suspensión en una muestra líquida, o una muestra líquida, capaz de fluir puede exponerse al óxido metálico en forma de un sustrato sólido. La muestra aclarada se puede recuperar mediante una diversidad de medios, incluyendo como un filtrado usando diversos protocolos de filtración, como un sobrenadante que usa centrifugación, o como un eluato a partir de un sustrato sólido.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de realizaciones particulares de la invención, pero no deberían verse como limitando el alcance de la invención como se reivindica en el presente documento.
Ejemplos Ejemplo 1 Depuración de PrP^{Sc} Usando Diversas Concentraciones de CAB-O-SIL M-5P
Se disolvió seroalbúmina bovina (BSA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) creando una solución a 1 mg/ml de BSA. La solución de BSA se "fortaleció" con homogenado de cerebro con scrapie (SBH; preparado usando cerebros de hámster infectados con el agente adaptado a hámster de 263 K), aclarado altamente antes de usar mediante centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos a una concentración final del 1% aproximadamente. Se añadió sílice CAB-O-SIL M-5P (CAB-O-SIL) a diversas concentraciones, seguido por agitación y filtración usando filtro de 0,8 \mum (se estimó filtración sola para llevar las cuentas para aproximadamente reducción de 0,5 unidades logarítmicas en PrP^{Sc}). Se retuvo sustancialmente CAB-O-SIL mediante el filtro.
Se muestran análisis de bandas de Western en filtrados de Muestra de Entrada, CAB-O-SIL al 0%, 0,1%, 0,25% y 0,5% en la figura 1. La figura 2 muestra una representación gráfica del efecto de incrementar concentración de CAB-O-SIL en depuración de PrP^{Sc}. (Para materiales y procedimientos en detalle, véase Patente de los Estados Unidos Nº.: 6.437.102 concedida a Lee, y col., transferida a Bayer Corporation; y Lee, D.C., y col., "Monitoring plasma processing steps with a sensitive Western blot assay for the detection of the prion protein", J. Virol. Methods, 84 (1): 77-89 (2000), que proporcionan detalles respecto a análisis de bandas de Western sensibles para la detección de proteínas priónicas; véase también, Stenland, y col., "Partitioning of human and sheep forms of the pathogenic prion protein during the purification of therapeutic proteins from human plasma", Transfusion, 42 (11): 1497-500 (noviembre de 2002), indicando que el fraccionamiento de priones humanos es similar a aquel observado en el modelo de scrapie de hámster; y Lee, D.C., y col., "A direct relationship between the partitioning of the pathogenic prion protein and transmissible spongiform encephalopathy infectivity during the purification of plasma proteins", Transfusion, 41 (4): 449-55 (2001), indicando que los priones detectados mediante los procedimientos descritos correlacionan con infectividad
animal.
Los experimentos anteriores, con resultados como se muestran en la figura 1, se repitieron excepto en que se usó un refuerzo de cerebro con scrapie no asociado a membrana, altamente purificado ("Bolton Preparation", véase Bolton y col., Arch. Biochem. Biophys., 258: 579-90 (1987)) a aproximadamente concentración final del 0,5%. Los análisis de Western de Entrada, CAB-O-SIL al 0,1%, 0,25% y 0,5% produjeron resultados sustancialmente idénticos, con depuración al límite de detección que resulta de uso de CAB-O-SIL al 0,5%. Sin embargo, se destacó que, en contraste con la depuración de aproximadamente 0,5 unidades logarítmicas mediante filtración de 0,8 \mum del homogenado de cerebro con scrapie aclarado (de las 5 unidades logarítmicas totales logradas), la depuración de 2,5 unidades logarítmicas de la preparación de Bolton se debió a filtración sola.
Ejemplo 2 Depuración de PrP^{Sc} Usando CAB-O-SIL en Procedimiento de Purificación de Plasminógeno
Se describen detalles de un procedimiento de purificación de plasmina/plasminógeno, sujeto a derechos para el cesionario de la presente solicitud, en una Solicitud de Patente de los Estados Unidos en trámite junto con la presente solicitud, titulada "Process for Production of Reversibly Inactive Acidified Plasmin Composition" (Publicación de Solicitud de Patente Nº.: US 20020192794 A1 concedida a Dadd, y col.). El material de partida para la etapa de procedimiento que implica uso de sílice de pirólisis es una pasta formada durante la purificación de inmunoglobulina a partir de las Fracciones de Cohn II y II, un precipitado de caprilato referido en el presente documento como Torta de Caprilato I (CCI).
CCI se extrajo con L-lisina a 200 mM y tampón de Tris-HCl al 0,1 M durante tres horas. Se añadió HYFLO SUPERCEL al dos por ciento (ayuda de filtro - Celite Corporation, Lompoc, CA), y la suspensión se filtró a través de una tela de filtro retirando coadyuvante de filtro gastado. El refuerzo de homogenado de cerebro con scrapie se añadió después de la filtración de tela y antes de las adiciones de polietilenglicol 3350 (PEG) al 3%. El filtrado reforzado resultante se dividió en 3 alícuotas. Una parte no recibió nada de CAB-O-SIL, la segunda recibió CAB-O-SIL al 0,25%, y la tercera alícuota recibió CAB-O-SIL al 0,5% (p/p). Tras mezclar otras 3 horas, se añadió coadyuvante de filtro al 2% (p/p), y el material se filtró a través de un lecho corto de filtro CUNO SP-90. Los filtrados resultantes se analizaron mediante prueba de bandas de Western para contenido en PrP.
Los resultados se muestran en la figura 3. Los resultados parecen indicar 0,5 al 1,0 unidades logarítmicas de señal presente en los filtrados de CAB-O-SIL al 0,25% y al 0,5%. En la investigación subsiguiente usando estudios de control, las señales estaban mostrando ser reacciones de IgG no específicas con el anticuerpo secundario, y no estaba relacionado el PrP. Aunque CAB-O-SIL eliminó el PrP del material de extracto de CCI, se observaron niveles de proteínas comparables que incluían concentraciones de plasminógeno para todos los tres niveles de adición de CAB-O-SIL. Así, CAB-O-SIL eliminó el PrP con afección mínima en los componentes proteicos deseados.
En otros experimentos, se extrajo el CCI usando fosfato de sodio dibásico 50 mM conteniendo L-lisina 200 mM, PEG al 4%, y CAB-O-SIL al 0,25%. Se añadió homogenado de cerebro en bruto al diez por ciento en el comienzo de la extracción y se mezcló durante 4 horas. Se añadió coadyuvante de filtro y la solución se filtró a través de un CUNO SP90.
Aparece una señal en el filtrado y aclarado (figura 4). Como anteriormente, los estudios de control verificaron que estas señales no fueron específicas de PrP. El PrP se retuvo en el coadyuvante de filtro y en el lecho corto de filtro.
Ejemplo 3 Al(OH)_{3} para Depuración de Priones
Como en el ejemplo 1, se reforzó BSA/TBS al 0,1% con SBH a concentraciones finales del 1% o del 0,1%. Estas muestras se usaron para evaluar hidróxido de aluminio (Al_{2}O_{3}, al 1,9-2,2% (p/v) como un gel o suspensión -representado también como Al(OH)_{3} o hidróxido de aluminio en el presente documento) (ALHYDROGEL, Superfos Biosector A/S, Dinamarca) como un agente útil para depuración de priones. Los porcentajes de volumen/volumen más adelante hacen referencia a la proporción del producto ALHYDROGEL añadido.
Se añadieron diversas cantidades de Al(OH)_{3} (concentraciones finales del 0 al 18% (v/v) como se indica en tabla 1) a muestras que contienen SBH, y las muestras se mezclaron como en el ejemplo 1. Las muestras se centrifugaron después a 5100 g durante 5 minutos, y el sobrenadante y el sedimento se ensayaron para PrP^{Sc}. En la figura 5, los carriles representan análisis de muestras que tienen Al(OH)_{3} añadido (en % v/v) como en tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Concentración de Al(OH)_{3}
1
2
Para la SHB al 1%, la depuración fue mayor de 4 unidades logarítmicas para hidróxido de aluminio cuando se trató con más del 4,5% (v/v). Para SHB al 0,1% la depuración fue mayor de 3 unidades logarítmicas para hidróxido de aluminio mayor del 1% (v/v).
Ejemplo 4 Evaluación de Procedimiento de Extracción de Plasminógeno
Con el fin de validar un sistema modelo para evaluar depuración de PrP^{Sc} de acuerdo con una realización particular de la presente invención, se caracterizó un modelo a escala reducida para extracción de Torta I de Caprilato (CCI) (como se discute anteriormente respecto a procedimiento de purificación de plasminógeno) con respecto al efecto de depuración de las etapas de Precipitación de PEG/Filtración Profunda. El propósito de este estudio era establecer un modelo a escala de Bench de la extracción de CCI y la etapa de Precipitación de PEG/Filtración Profunda en el Procedimiento de Plasminógeno bajo condiciones estándar. Una vez establecido, el sistema modelo se usó para evaluar depuración de PrP^{Sc} a través de la etapa de procedimiento.
Brevemente, se resuspendió CCI en tampón de extracción de base TRIZMA 0,1 M (pH 10,5) a 4ºC mezclando mientras durante 2-3 horas. Tras la extracción, se ajustó el pH de la solución a 7,5 y la temperatura del extracto se incrementó a 20ºC. Se añadió L-lisina al extracto a una concentración final de 100 mM, manteniendo mientras un pH de 7,5. Se añadió polietilenglicol (PEG) a una concentración final del 3% (p/p) seguido por la adición de coadyuvante de filtro HYFLO SUPERCEL a una concentración final del 4% (p/p). El extracto se filtró después a través de un lecho corto de filtro CUNO SP-30 y se recogió el filtrado. Se recogieron muestras a partir del extracto de CCI inicial, se filtraron, y se extrajeron. La proteína total se determinó mediante A_{280} y la recuperación de plasminógeno se determinó mediante inmunonefelometría. Los análisis de recuperación indicaron pérdida de proteína muy pequeña a través de esta etapa.
A continuación, se evaluó la depuración de PrP^{Sc} durante la etapa de CCI y Precipitación de PEG/Filtración Profunda. El propósito de este experimento fue determinar la cantidad de PrP^{Sc} eliminada durante las etapas de extracción del CCI y Precipitación de PEG/Filtración Profunda.
El protocolo fue el mismo como se describe anteriormente, excepto en que durante la extracción de CCI, se añadió 1 ml de SBH en bruto al 10% dentro de 100 ml del extracto dando como resultado concentración de SBH final del 0,1%. La pasta retenida mediante el filtro CUNO SP-30 se resuspendió a volumen original en TBS. Se analizaron muestras de la Prueba (extracto reforzado anterior a filtración), filtrado y resuspensión de pasta tanto para plasminógeno como para PrP^{Sc} mediante análisis de Western.
Las etapas anteriores (sin nada de hidróxido de aluminio o CAB-O-SIL) dieron como resultado 1 unidad logarítmica de depuración de PrP^{Sc}.
Ejemplo 5 Efecto de Al(OH)_{3} en Recuperación de Plasminógeno y Depuración de PrP^{Sc}
Se determinó el efecto de Al(OH)_{3} al 10% (v/v) (ALHYDROGEL, Superfos Biosector A/S, Dinamarca) en recuperación de plasminógeno y depuración de PrP^{Sc} durante la precipitación de PEG/filtración en profundidad. El protocolo se describió anteriormente en el ejemplo 4, excepto en que, tras la adición de PEG al 3%, se añadió Al(OH)_{3} al 10% (v/v). La pasta retenida por el filtro CUNO SP-30 se resuspendió a volumen original en TBS. Muestras de la Prueba (extracto reforzado previo a filtración), filtrado, y resuspensión de pasta se analizaron tanto para plasminógeno como para PrP^{Sc} mediante análisis de Western.
Añadir Al(OH)_{3} a la concentración anteriormente indicada dio como resultado un incremento en depuración de PrP^{Sc} de 2 unidades logarítmicas (aproximadamente 3 unidades logarítmicas con frente a 1 unidad logarítmica
sin).
Ejemplo 6 Depuración de PrP^{Sc} Usando Al(OH)_{3} en Procedimiento de Purificación de Plasminógeno
Se determinó el efecto de Al(OH)_{3} al 3% en depuración de PrP^{Sc} durante el procesamiento de Torta I de Caprilato (CCI).
\newpage
Se extrajo y se procesó CCI como se describe anteriormente. En un experimento, tanto refuerzo de SBH como Al(OH)_{3} al 3% (v/v) se añadieron antes de la filtración de tela (propileno poroso). Se eliminaron muestras de la Entrada (Prueba) y del filtrado de la tela. La presencia de PrP^{Sc} se determinó en cada muestra mediante análisis de Western.
La inclusión de Al(OH)_{3} al 3% (v/v) dio como resultado 2 unidades logarítmicas de depuración de PrP^{Sc}. Sin Al(OH)_{3}, la depuración fue de 0 unidades logarítmicas.
Ejemplo 7 Comparación de Sílice de Pirólisis y Alúmina de Pirólisis
En contraste con la suspensión de Al(OH)_{3} utilizada en el experimento precedente, la alúmina de pirólisis (SPECTRAL, Cabot Corporation, Tuscola, IL), se usó también en experimentos comparando su efecto con sílice de pirólisis (CAB-O-SIL).
Se reforzaron cincuenta mililitros de seroalbúmina bovina (BSA) al 0,1% en TBS con 0,5 ml de bien refuerzo de homogenado de cerebro con scrapie de hámster aclarado o bien un refuerzo altamente purificado (Bolton). Tras el refuerzo, una muestra inicial de 10 ml (Prueba) se tomó para análisis para determinar la valoración inicial del material. A continuación, se añadieron aproximadamente 0,05 g de bien alúmina de pirólisis o bien sílice de pirólisis a tubos cónicos de 15 ml. A cada uno de estos tubos, se añadieron 10 ml del material reforzado, y los tubos se invirtieron 15-20 veces.
Las unidades de filtración se prepararon retirando los émbolos de tres jeringuillas de 10 ml y ajustándolas con filtros de jeringuillas de 0,8 \mum. Se llevaron a cabo tres filtraciones para cada uno de los tipos de refuerzo. La primera filtración no tuvo ningún óxido metálico presente, la segunda filtración tuvo alúmina de pirólisis, y la tercera tuvo sílice de pirólisis. Las pruebas y filtrados resultantes se analizaron mediante prueba de bandas de Western y se hallaron las siguientes señales.
TABLA 2 Comparación de Alúmina de Pirólisis con Sílice de Pirólisis para Depuración de PrP
3
Se observó eliminación al límite de detección para ambos óxidos metálicos bajo ambas condiciones de refuerzo.

Claims (36)

1. Un procedimiento de preparar una solución que contiene material biológico, que comprende
a) añadir un óxido metálico al material biológico para obtener una solución que comprende una mezcla del óxido metálico y el material biológico; y
b) separar el óxido metálico de la mezcla para formar una solución resultante, en la que las proteínas priónicas patógenas que posiblemente contaminan el material biológico se redujeron sustancialmente en la solución resultante.
2. Un procedimiento de preparar una solución que contiene material biológico, que comprende
a) añadir un óxido metálico al material biológico para obtener una solución que comprende una mezcla del óxido metálico y el material biológico;
b) separar el óxido metálico de la mezcla para formar una solución resultante; y
c) evaluar la solución resultante para la presencia o cantidad de proteína priónica patógena,
en el que las proteínas priónicas patógenas que contaminan posiblemente el material biológico están sustancialmente reducidas en la solución resultante.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el material biológico se selecciona del grupo que consta de productos derivados de sangre, productos derivados de tejidos, y productos producidos recombinantemente.
4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el material biológico es un producto derivado de sangre.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el producto derivado de sangre es de origen humano.
6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el producto derivado de sangre se selecciona del grupo constituido por inmunoglobulinas, factores de coagulación sanguíneos, plasmina, plasminógeno, inhibidor de proteinasa \alpha-1, y albúmina.
7. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el óxido metálico se selecciona del grupo constituido por sílice de pirólisis y alúmina de pirólisis.
8. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el óxido metálico es sílice de pirólisis.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la sílice de pirólisis se caracteriza por un área de superficie específica de aproximadamente 130 m^{2}/g a aproximadamente 380 m^{2}/g.
10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la sílice de pirólisis se caracteriza por un área de superficie específica de aproximadamente 150 m^{2}/g a aproximadamente 300 m^{2}/g.
11. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la sílice de pirólisis se caracteriza por un área de superficie específica de aproximadamente 200 m^{2}/g.
12. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que separar el óxido metálico a partir de la mezcla comprende filtración.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la filtración comprende hacer pasar la mezcla a través de un sistema de filtración el cual retiene partículas mayores que de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 5 \mum.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la filtración comprende hacer pasar la mezcla a través de un sistema de filtración el cual retiene partículas mayores que aproximadamente 0,8 \mum.
15. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que evaluar la solución resultante para la presencia o cantidad de proteína priónica patógena comprende evaluar una muestra para infectividad usando un ensayo seleccionado del grupo constituido por un bioensayo animal o un inmunoensayo para la proteína priónica patógena.
16. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que evaluar la solución resultante para la presencia o cantidad de proteína priónica patógena comprende evaluar una muestra para la presencia de proteína priónica patógena usando un inmunoensayo.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el inmunoensayo se selecciona del grupo constituido por ensayos de bandas de Western y ensayos de ELISA.
18. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el inmunoensayo es una prueba de bandas de Western.
19. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el óxido metálico es hidróxido de aluminio.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el hidróxido de aluminio, como un gel que comprende aproximadamente 2% en peso de Al_{2}O_{3}, está presente a una concentración de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10% en volumen.
21. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el hidróxido de aluminio, como un gel que comprende aproximadamente 2% en peso de Al_{2}O_{3}, está presente a una concentración de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5% en volumen.
22. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que el hidróxido de aluminio, como un gel que comprende aproximadamente 2% en peso de Al_{2}O_{3}, está presente a una concentración de aproximadamente el 3% en volumen.
23. Un procedimiento de preparar una solución que contiene material biológico, que comprende
a) añadir sílice de pirólisis caracterizada por un área de superficie específica de aproximadamente 150 m^{2}/g a aproximadamente 300 m^{2}/g a material biológico para obtener una solución que comprende una mezcla de sílice de pirólisis y el material biológico;
b) separar la sílice de pirólisis de la mezcla para formar una solución resultante haciendo pasar la muestra a través de un sistema de filtración que comprende un filtro el cual retiene al menos una parte sustancial de partículas de la sílice de pirólisis y
c) evaluar la solución resultante para la presencia o cantidad de proteína priónica patógena usando un inmunoensayo,
en el que las proteínas priónicas patógenas que posiblemente contaminan el material biológico están sustancialmente reducidas en la solución resultante.
24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la sílice de pirólisis se caracteriza por un área de superficie específica de aproximadamente 200 m^{2}/g, una densidad de placa de aproximadamente 50 g/l, y una longitud de partícula de agregado promedio de aproximadamente 0,2 \mum a aproximadamente 0,3 \mum.
25. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la sílice de pirólisis se añade en una cantidad de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 1,0% (peso/peso) de la solución que comprende una mezcla de sílice de pirólisis y el material biológico.
26. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la sílice de pirólisis se añade en una cantidad de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 0,8% (peso/peso) de la solución que comprende una mezcla de sílice de pirólisis y el material biológico.
27. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la sílice de pirólisis se añade en una cantidad de al menos aproximadamente el 0,25% (peso/peso) de la solución que comprende una mezcla de sílice de pirólisis y el material biológico.
28. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la sílice de pirólisis se añade en una cantidad de al menos aproximadamente el 0,5% (peso/peso) de la solución que comprende una mezcla de sílice de pirólisis y el material biológico.
29. Un procedimiento de preparar una solución que contiene material biológico, que comprende
a) añadir partículas de dióxido de silicio a material biológico para obtener una solución que comprende una mezcla de partículas dióxido de silicio y el material biológico;
b) separar las partículas de dióxido de silicio de la mezcla para formar una solución resultante; y
c) evaluar la solución resultante para la presencia o cantidad de proteína priónica patógena,
en el que las proteínas priónicas patógenas que posiblemente contaminan el material biológico están sustancialmente reducidas en la solución resultante.
30. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que separar las partículas de dióxido de silicio de la mezcla comprende centrifugación o filtración.
31. El procedimiento de la reivindicación 29, en el que separar las partículas de dióxido de silicio de la mezcla comprende centrifugación.
32. Un procedimiento de separar priones de una muestra, que comprende
a) poner en contacto una muestra en un estado líquido capaz de fluir con un sustrato sólido que comprende un óxido metálico;
b) permitir a la muestra permanecer en contacto con el sustrato durante un tiempo tal que los priones en la muestra se unen al sustrato; y
c) separar la muestra del sustrato.
33. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que el óxido metálico es dióxido de silicio o hidróxido de aluminio.
34. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que el óxido metálico es sílice de pirólisis.
35. Un procedimiento de separar proteínas priónicas de una mezcla y concentrarlas para análisis adicionales, comprendiendo el procedimiento,
a) poner en contacto la muestra con un óxido metálico particulado;
b) separar el óxido metálico particulado de la muestra;
c) someter las proteínas priónicas asociadas con el óxido metálico particulado a análisis adicionales.
36. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el análisis adicional de proteínas priónicas comprende al menos una técnica analítica seleccionada del grupo constituido por inmunoensayo, bioensayo animal, análisis espectroscópico, y análisis cromatográfico.
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