PT1620469E - Método melhorado de extração e purificação para cereal -glucano - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO MELHORADO DE EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO PARA CEREAL β- GLUCANO"

DOMÍNIO TÉCNICO A presente invenção refere-se de um modo geral aos cereal β-glucanos. Mais particularmente, a invenção refere-se a métodos para a extração e isolamento de aveia β(1 — 3) β(1-4) glucano altamente purificada. A presente descrição também se refere em particular a composições que compreendem um β (1-3)β (1-4) glucano e um depressor do ponto de congelação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As gomas são substâncias hidrofóbicas ou hidrofilicas de peso molecular variando de 10000 a 50000000 Daltons, que num solvente apropriado produzem géis ou suspensões ou soluções altamente viscosas de baixo teor de substância seca. Gomas normalmente usadas em produtos alimentares, medicamentos e em produtos industriais incluem amidos, derivados de celulose, pululano, agar, aloe, gelano, goma de guar, goma de alfarroba, pectina, algina, carragenina, xantano, β-glucano, e goma arábica (ver Whistler, R.L. (1993) Industrial Gums: Polysaccharides and their derivatives Eds. Whistler R.L. e BeMiller J.N. (Academic Press) p 2) .

Glucanos são homopolissacáridos consistindo apenas de glicose. No entanto, uma vez que é possivel ligar as moléculas de glicose em diferentes configurações estereoquimicas, os glucanos são um grupo de compostos diversos com diferentes propriedades químicas, físicas e funcionais. 2

As estruturas químicas de polissacarídeos são de primordial importância na determinação das suas propriedades. Isto pode ser apreciado ao comparar as propriedades de alguns homoglucanos comuns. Por exemplo, a celulose, um β(1-4)-Ό-glucano, é insolúvel em água e altamente cristalina em comparação com outros polissacarídeos. Amílase, um a(l- 4)-D-glucano, é pouco solúvel em água, cristaliza menos bem do que a celulose, e pode formar géis rígidos termo-reversíveis. Dextrano, um (1-6)-α-glucano, com um pequeno grau de ramificação, é extremamente solúvel em água e não é formador de gel. (Ver Dea, I.C.M. em (1993) Industrial Gums: Polysaccharides and their derivaties Eds. Whistler R.L. e BeMiller J.N. (Academic Press), p 21). A aveia β (1 — 3) β(1 — 4) glucano é classificada como uma goma viscosa, (ver Wood, P.J. (1993) Oat Bran Ed P.J. Wood (American Association of Cereal Chemists, Inc. St. Paul, MN)). β(1 — 3) β(1 — 4) glucanos cereais são polissacáridos estruturais presentes nas paredes das células de cereais, tais como cevada e aveia, entre outros.

Aveia β (1-3) β (1-4) glucano é reconhecida pela FDA dos EUA como um agente que pode ajudar na prevenção de doenças cardíacas. Em 1997, a FDA permitiu que os produtos de aveia alegassem ser saudáveis. É importante notar que nenhuma outra fonte de β-glucano, de levedura, fúngica, bacteriana ou de cereal é reconhecida como tendo estes efeitos. Os β (1-3)β(1-4)-glucanos de aveia são, portanto, distintos.

Osβ(1-3)β(1-4) glucanos de aveia não modificada formam soluções em água altamente viscosas a concentrações > 0,75%. Em concentrações > 1,2% as soluções têm a consistência de um hidrogel espesso. 3

Os glucanos de estrutura molecular significativamente diferente, e com diferentes propriedades fisicas e químicas em comparação com a aveia são encontrados em leveduras, fungos e bactérias e em certas bactérias geneticamente modificadas. Por exemplo, gelano, (1-3) β-D-glucopiranosilo [β(1-3)-glucano] produzido em Alcaligenes faecalis é encontrado em Curdlan (Takeda Chemical Ind. Ltd.), β (1 — 3) α(1-6) glucopiranósido produzido em Aureobasidium pullulans é encontrado em pululano, e β (1 — 3) β(1-6) glucopiranósido é encontrado em levedura. 0 peso molecular dos glucanos varia com a fonte. A Tabela 1 mostra o peso molecular médio de gomas típicas.

Tabela 1: Faixa de peso molecular típico de Gomas Comuns GOMA PESO MOLECULAR MÉDIO Ανβί3β(1-3) β (l-4)glucano 500000 - 1000000 Pululano 50000 - 100000 Curdlana -500000 Metil-celulose 10000 - 200000 Carragenina 4500000 Xantana 15000000 - 50000000 Alginato de sódio 10000 - 18000000 A viscosidade de uma solução a 1% de diferentes soluções de goma de polissacárido varia com a origem e natureza química. A Tabela 2 mostra a viscosidade das soluções a 1% de gomas típicas. 4

Tabela 2: Intervalos de viscosidade Típicos de Soluções a 1% das Gomas Comuns, Medidos a 25 ° C GOMAS SOLUÇÃO DE VISCOSIDADE 1%, cP Aveia β(1-3) β (1-4)glucano 500 - 1500 Pululano 2 Goma Arábica 1-5 Metil-celulose 200 Goma de tamarindo 100 - 200 Goma de guar 2000 - 3000 Goma de alfarroba 2000 - 3000 Xantana 2000 - 3000 Alginato de sódio 200 - 700

As propriedades de solubilidade dos glucanos diferem de acordo com a sua origem. Por exemplo, os cereais β (1-3) β (1-4) glucano são normalmente solúveis em solventes aquosos, enquanto a levedura (Saccharomyces cerevisiae) , e a β(1 — 3)β (1-6)-glucanos são insolúveis em solventes aquosos. Os glucanos solúveis são desejáveis. A levedura β-glucano foi solubilizada pela adição de grupos de fosfato (ver Williams et al Immunopharmacol 22:139-156 (1991).

Jamas et al. (Patente dos EUA No. 5, 622, 939), descreve métodos para extrair a β (1-3)β(1-6)glucano solúvel a partir de Saccharomyces cerevisiae. 0 método descrito é complexo, envolvendo a hidrólise ácida, a hidrólise básica e do uso extensivo de centrifugação e ultrafiltração. Não são fornecidos pormenores sobre a estabilidade da levedura solubilizada β(1-3)β(1-6) glucano.

Um certo número de referências da técnica anterior revela métodos de preparação de glucanos e de composições líquido- 5 glucano, composições à base de cereais. Entre estas referências da técnica anterior estão as seguintes:

Beer, et al, Extraction of Oat Gum from Oat Bran: Effects of Process on Yield, Molecular Weight Distribution, Viscosity and (1-3) (1-4) beta-D-Glucan Content of the Gum, Cereal Chemistry 73 (1) : 58-62 (1996). Esta referência descreve a utilização de álcoois numa quantidade igual ou superior a 50% (v/v) para obter a precipitação. A pureza dos glucanos recuperados foi relatada como sendo entre 22 e 63%.

Wood et al, Large Scale Preparation and Propertles of Oat Fractions Enriched in (1-3) (1-4) beta-D-Glucan, Cereal Chemistry 66(2): 97-103 (1989). Esta referência descreve a utilização de álcoois de uma quantidade igual ou superior a 50% (v/v) para obter a precipitação de glucanos. A Patente dos EUA No. 6,323,338 revela um método de isolamento de aveia β-glucano, como um revestimento enriquecido a partir de um extrato de farelo de aveia. O método descrito não utiliza baixas concentrações de álcoois de cadeia curta para a precipitação do glucano.

Redmond (Patente dos EUA No. 6,284,886) descreve composições de cereais β(1—3)β(1—4) glucano, e métodos de produção destas composições. As composições descritas satisfazem as exigências estritas da indústria de cosméticos, em termos de viscosidade, de resistência ao cisalhamento, e das propriedades que melhoram a humidade. Nenhum método para a extração ou purificação de β(1-3) β(1-4) glucano é descrito. 6

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é resumida nos seguintes parágrafos numerados: 1. Um método para isolar um β(1 — 3) β (1 — 4) glucano a partir de um grão de cereal mordo ou de uma parte moida de um grão de cereal compreendendo: (i) extração do grão de cereal moido ou de uma parte de cereal moida com uma solução alcalina tendo um valor de pH de entre 9 e 10 para um periodo de tempo de cerca de 15 a cerca de 45 minutos para produzir um extrato contendo pelo menos cerca de 0,4 por cento de β (1 — 3) β(1 — 4) glucano; (ii) remoção de material insolúvel e a remoção de um material em partículas tendo um tamanho de partículas superior a cerca de 0,2 jjm a partir do referido extrato para produzir um extrato purificado; (iii) adição de cerca de 10% a cerca de 25% (vol/vol) de um álcool C1-C4 ao extrato purificado para precipitar ο β(1— 3) β(1-4)glucano, e (iv) isolar ο β (1 — 3) β (1-4)glucano. 2. O método do parágrafo 1, em que na referida etapa de adição (etapa iii) cerca de 10% a cerca de 20% (vol/vol) de um álcool selecionado do grupo que consiste por metanol, etanol e isopropanol, é usado para precipitar ο β(1-3) β (1 — 4) glucano a partir do referido extrato purificado. 3. O método do paragrafo 2 em que cerca de 10% a cerca de 20% (vol/vol) de etanol é usado para precipitar ο β(1-3) β(1-4) glucano a partir do referido extrato purificado. 7 4. 0 método do parágrafo 1, em que a referida etapa de retirada de material em partículas compreende ainda: uma ou mais do que uma etapa de adição de um floculante, um coagulante ou um floculante e um coagulante ao referido extrato de modo a extrair o referido material coagulado em partículas tendo um tamanho de partículas superior a cerca de 0,2 μιη e a remoção do material coagulado a partir do referido extrato; digestão do material de amido no referido extrato, e filtragem do material em partículas a partir de um tamanho de partículas superior a 0,2 μιη a partir do referido extrato de modo a produzir o extrato purificado. 5. O método do parágrafo 4 em quem na referida etapa de digestão, o referido material de amido é digerido com uma enzima. 6. 0 método do parágrafo 5, em que antes da digestão do referido material de amido, a referida solução alcalina é neutralizada. 7. 0 método do parágrafo 6, em que a seguir à digestão do referido material de amido a referida enzima é desativada. 8. 0 método do parágrafo 7, em que a referida enzima é inativada pela acidificação da solução neutralizada. 9. 0 método do parágrafo 5, em que a referida enzima é uma amilase. 10. O método do parágrafo 9, em que a referida amilase não necessita de um cofator de cálcio. 8 11. 0 método do parágrafo 1, em que o cereal é selecionado de entre o grupo que consiste por um cultivar de cevada, um cultivar de aveia, um cultivar de trigo, um cultivar de centeio, um cultivar de sorgo, um cultivar de milho miúdo, e um cultivar de milho. 12. 0 método do parágrafo 1 em que a dita etapa de adição (etapa iii) é realizada a uma temperatura de cerca de 1°C até cerca de 10°C. 13. 0 método do parágrafo 1, que compreende ainda uma, ou mais do que uma, etapa de dissolução do β (1-3)β (1-4) glucano isolado, em uma solução aquosa, precipitação do β(1-3)β(1-4) glucano adicionando entre 10% a 25% (vol/vol) do álcool C1-C4 a ser adicionado à solução aquosa, e isolando ο β(1—3)β(1—4) glucano. 14. O método do parágrafo 4, em que o floculante é selecionado do grupo que consiste por uma poliacrilamida, um sal acrilato quaternário e uma macromolécula floculante natural, e o coagulante é selecionado do grupo que consiste por alúmen, cloreto de cal, percloreto de ferro, sulfato de ferro, um polímero orgânico e um polieletrólito sintético com grupos funcionais aniónicos ou catiónicos. 15. 0 método do parágrafo 1, em que cerca de 15% a cerca de 17% (col/vol) do álcool C1-C4 é adicionado ao extrato purificado na etapa (iii). 16. O método do parágrafo 1, em que o grão de cereal moído ou a parte moída do grão de cereal é extraída com uma solução alcalina tendo um valor de pH de cerca de 9,25 a cerca de 9,75. 9 17. 0 método de acordo com o parágrafo 4, em que a etapa de filtragem do material tendo um tamanho de partícula superior a 0,2 μιη a partir do referido extrato é efetuada usando um filtro revestido com uma camada prévia de um auxiliar de filtragem tendo uma porosidade de 0,2 μιη. A presente invenção refere-se de um modo geral a cereaisβ-glucanos. Mais em particular, a invenção refere-se a métodos para a extração e isolamento de uma aveia β(1-3)β (1 — 4) glucano altamente purificada. A presente descrição também se refere em particular a composições compreendendo um β(1-3)β(1 -4) glucano e um depressor de ponto de congelamento.

Num aspeto é aqui descrito um método para a extração e purificação de um cereal β-glucano. O cereal β-glucano é derivado de um grão de cereal ou de uma parte do grão de cereal.

Em particular, a presente descrição proporciona um método para isolar um β(1 — 3) β(1 — 4) glucano a partir de um grão de cereal moido ou de uma parte moida do grão de cereal, compreendendo: (i) extração do grão de cereal moido ou da porção moida do grão de cereal com uma solução alcalina de modo a produzir um extrato contendo pelo menos cerca de 0,4 por cento de β(1—3)β(1—4) glucano; (ii) remoção do material insolúvel e a remoção do material em partículas tendo um tamanho de partículas superior a cerca de 0,2 μιη a partir do extrato de modo a produzir um extrato purificado; 10 (iii) adição de cerca de 10% a cerca de 25% (p/p) de um álcool C1-C4 ao extrato purificado para precipitar ο β(1-3) β(1 — 4) glucano, e (iv) isolar ο β (1 — 3) β(1 — 4) glucano.

Num exemplo do método acima definido, cerca de 10% a cerca de 25% (p/p) de um álcool selecionado do grupo que consiste por metanol, etanol e isopropanol é usado para precipitar o β (1-3) β(1-4) glucano do filtrado. De preferência de cerca de 10% a cerca de 20% (p/p) de etanol são usados para precipitar ο β (1 — 3) β (1 — 4) glucano.

Em um exemplo de um dos métodos descritos acima, a etapa de remoção do material em partículas é constituído por: uma, ou mais do que uma, etapa de adição de um floculante, um coagulante ou ambos, um floculante e um coagulante ao extrato para coagular o material em partículas tendo um tamanho de partícula maior do que cerca de 0,2 μπι, e remoção de material coagulado a partir do extrato; digestão do material de amido no extrato, e filtragem do material em partículas tendo um tamanho de partícula maior do que cerca de 0,2 ma partir do extrato para produzir um extrato purificado.

Em um exemplo do método acima descrito, o material de amido é digerido com uma enzima, tal como uma amílase. Mais em particular, a enzima é digerida com uma amílase que não requer um cofator de cálcio. Em outro exemplo, o extrato alcalino é neutralizado antes de o material de amido ser digerido. Num outro exemplo, a enzima é inativada após a digestão do material de amido, através de, por exemplo, acidificação do extrato alcalino contendo o material de amido digerido. 11 A presente descrição também se relaciona com os métodos acima definidos, em que o cereal é selecionado a partir do grupo consistindo de um cultivar de cevada, um cultivar de aveia, um cultivar de trigo, um cultivar de centeio, um cultivar de sorgo, um cultivar de milho miúdo, um cultivar de milho, e uma mistura destes. A presente descrição é também dirigida aos métodos acima descritos, em que o grão de cereal ou a parte do grão de cereal extraído no passo (i) se encontra na forma de uma farinha grossa ou uma farinha finamente moída.

Em outros exemplos dos métodos acima descritos, o valor de pH da solução alcalina é de cerca de 9,00 a cerca de 10,00, de cerca de 9,25 a cerca de 9,75, ou entre cerca de 9,30 a cerca de 9,50. Em outro exemplo, a etapa de extracção (etapa i) , é realizada ao longo de um período de cerca de 15 a cerca de 45 minutos.

Em mais um exemplo dos métodos acima definidos, a etapa de precipitação é conduzida a uma temperatura de entre cerca de 1°C e cerca de 10°C, ou de entre cerca de 1°C e cerca de 5°C. Em ainda mais um exemplo, o álcool utilizado para conduzir a etapa de precipitação é arrefecido a uma temperatura de pelo menos cerca de -20°C, antes de ser adicionado à solução de β(1—3)β(1—4) glucano.

Os métodos acima definidos podem ainda compreender uma, ou mais do que uma, etapa de dissolução do β(1-3)β (1-4) glucano isolado a partir da etapa (iv) em uma solução aquosa, precipitando ο β (1-3)β(1-4) glucano pela adição de cerca de 10% a cerca de 25% (p/p) do álcool Ci-C4 à solução aquosa, e isolando ο β (1-3)β(1-4) glucano. 12 A presente descrição também proporciona um método de isolamento de um β(1 — 3)β (1 — 4) glucano a partir de um grão de cereal moido ou de uma parte do grão de cereal moido, que compreende: (i) extração do grão de cereal moido ou de parte do grão de cereal moído com uma solução alcalina para produzir um extrato contendo pelo menos cerca de 0,4 por cento em peso de β(1-3)β(1-4) glucano; (ii) remoção do material insolúvel, e remoção do material em partículas tendo um tamanho de partícula maior do que cerca de 0,2 μιη a partir do extrato para produzir um extrato purificado, em que a etapa de remoção do material em partículas é constituído por: uma, ou mais de uma etapa de adição de um floculante, um coagulante ou ambos um floculante e um coagulante ao extrato para coagular o material em partículas tendo um tamanho de partícula maior do que cerca de 2 μπι, e a remoção de material coagulado a partir do extrato; digerir enzimaticamente o material de amido no extrato, e filtrar o material em partículas tendo um tamanho de partícula superior a cerca de 0,2 μπι a partir do extrato para produzir o extrato purificado; (iii) adição de cerca de 10% a cerca de 25% (p/p) de um álcool Ci-C4, ao extrato purificado para precipitar ο β (1 — 3)β (1 — 4) glucano, e (iv) isolar ο β (1 — 3)β(1 — 4) glucano

Num segundo aspeto, a presente descrição fornece uma composição de cereal β-glucano, composição essa possuindo um grau de pureza de pelo menos cerca de 75% e contendo menos de 10% de impurezas de cinza menos de 10% de impurezas de proteínas, e menos de 5% de impurezas de lípidos. Mais particularmente, a presente descrição refere- 13

se a uma composição de cereal β-glucano possuindo uma pureza de pelo menos cerca de 92%, e que contém menos de 3,5% de impurezas de cinza, menos de 3,5% de impurezas de proteínas, e menos de 1% de impurezas de lípidos. A composição de cereal β-glucano também pode ter um valor de clareza compreendido entre cerca de 5 e cerca de 100 NTU.

Num terceiro aspeto, a presente descrição proporciona uma composição compreendendo um β(1—3)β(1—4) glucano e de cerca de 1% a cerca de 40% em peso, de um depressor do ponto de congelação.

Em exemplos da composição acima definida, ο β (1-3)β(1-4) está presente numa quantidade de cerca de 1,2% a cerca de 1,6% ou de cerca de 1,2% a cerca de 1,3% em peso. Num outro exemplo, o depressor do ponto de congelação é selecionado de entre o grupo constituído por glicerol, propileno glicol, butileno glicol e pentileno glicol.

Num exemplo adicional da composição acima descrita, ο β (1 — 3)β (1 — 4) glucano é uma composição de β (1-3)β(1-4) glucano com uma pureza de pelo menos cerca de 75%, e que contém menos de 10% de impureza de cinza, menos de 10% de impureza de proteínas, e menos de 5% de impureza de lípidos. Mais particularmente, a composição de β-glucano tem uma pureza de pelo menos cerca de 92%, contém menos de 3,5% de impureza de cinzas, menos de 3,5% de impureza de proteínas, e menos de 1% de impureza de lípidos. A composição de β(1-3)β (1 — 4) glucano também pode ter uma clareza de cerca de 5 a cerca de 100 NTU. Mais particularmente, ο β (1-3)β (1-4) glucano utilizado na composição do quarto aspecto da presente descrição é preparado de acordo com os métodos de isolamento acima definidos. 14 0 depressor do ponto de congelação evita a gelificação apreciável de composições de β (1 — 3)β(1 — 4) glucano durante a armazenagem ou transporte. As composições de β (1-3)β(1-4) glucano contendo o depressor do ponto de congelação são por conseguinte vantajosas do ponto de vista comercial, na medida em que podem ser utilizadas diretamente depois de serem armazenadas ou transportadas sem qualquer etapa de tratamento para tornar as composições mais fluidas. 0 método de purificação da presente descrição difere do método divulgado na Patente dos EUA No. 6,323,338, em que as partículas finas são removidas, assim como uma grande proporção de proteínas (-90%) presentes no grão de cereal original. 0 método de purificação da presente descrição permite a utilização de concentrações de álcool de menos de 50% (p/p), por exemplo, soluções alcoólicas aquosas de 10-25% para precipitar o cereal β-glucano. A capacidade de utilizar tais concentrações de álcool é surpreendente tendo em vista os procedimentos de purificação da técnica anterior, que têm utilizado soluções de etanol a 50% para precipitar cereal β-glucano (ver, por exemplo, Wood et al. Large Scale Preparation and Properties of Oat Fractions

Enriched in β(1-3)β(1-4)D-glucan Cereal Chem. 66 97-103 (1989)). Acredita-se que a remoção da matéria em partículas e a maior parte do material proteico, de acordo com o método da presente descrição reduz a quantidade de álcool necessário para precipitar o cereal de β-glucano a partir da solução. 15 A utilização de soluções alcoólicas aquosas de 10-25% para precipitar o cereal β-glucano é vantajosa na medida em que a desidratação grave de cereal β-glucano é evitada, resultando num precipitado de cereal β-glucano que pode ser facilmente suspenso em água. Além disso, a utilização dessas concentrações relativamente mais baixas do álcool permitem que o grão de cereal inicial seja processado numa instalação de fabrico padrão sem a necessidade de sistemas ambientais à prova de explosão. Por exemplo, o uso de soluções alcoólicas aquosas de 20% a uma temperatura final de 7-10°C produz uma pressão de vapor mais baixa do que o Limite Inferior de Explosão (LEL) mais baixo de etanol. Além disso, a eficiência da etapa de extração e a produção de soluções intermediárias contendo cereal β-glucano, a uma concentração superior a 0,4%, permite o processamento utilizando volumes de processo relativamente pequenos.

DESCRIÇÃO DA FORMA DE REALIZAÇÃO PREFERIDA A presente invenção refere-se geralmente a cereal β-glucanos. Mais particularmente, a invenção refere-se a métodos para a extração e isolamento altamente purificada de aveia β(1—3)β(1—4) glucano. A presente descrição também se refere particularmente a composições compreendendo um β (1-3)β(1-4)-glucano e um depressor do ponto de congelação. A prática do presente invento empregará, a menos que indicado em contrário, métodos convencionais de química, química e bioquímica de cereais, no âmbito da técnica atual. Tais técnicas estão totalmente explicadas na literatura. Ver, por exemplo Industrial Gums: Polysaccharides and their derivatives, Eds. Whistler R.L. e BeMiller J.N. (Academic Press), Oats: Chemistry and 16

Technology ed. Webster F.H. (Associação Americana de Quimicos de Cereais, St. Paul, MN).

Tal como indicado na presente memória descritiva e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem as referências em plural a menos que o conteúdo indique claramente o contrário.

Definições

Ao descrever a presente descrição, os termos seguintes serão empregues, e destinam-se a ser definidos como indicado abaixo.

Por "cereal" entende-se qualquer um dos vários grãos, tais como, mas não limitados a, os cultivares de cevada, de aveia, de trigo, de centeio, de sorgo, milho-miúdo, e milho.

Por "glicano" entende-se um polimero de monossacarideos ligados entre si por ligações glicosidicas.

Por "glucano" entende-se um homopolissacárido, consistindo apenas em glucose.

Por "cereal β-glucano" entende-se um glucano com uma estrutura de glucopiranosilo ligada a β (1-3) ou uma estrutura de glucopiranosilo ligada a β(1-4) ou uma estrutura de glucopiranosilo ligada a β(1 -3)β (1-4) , que é derivada de uma fonte de cereais.

Por "β (1-3)β(1-4) glucano" significa um cereal β-glucano. 17

Por "goma" entende-se um polissacarídeo microbiano ou vegetal ou seus derivados, que são dispersáveis em água fria ou quente, para produzir misturas ou soluções viscosas. As gomas podem ser classificadas pela origem, e incluem: gomas exsudadas, gomas de algas marinhas, gomas de sementes, derivados de amido e celulose, e gomas microbianas.

Por "composto de interesse" indica-se qualquer material farmacêutico, medicinal, botânico ou terapêutico misturado com um β(1—3)β(1—4) glucano para produzir uma composição.

Por "floculante" e "coagulante" designam-se moléculas que podem coalescer com sólidos em suspensão (finos) para formar partículas maiores, mais densas, que podem ser separadas por centrifugação. Em exemplos particulares, os coagulantes são moléculas que podem unir partículas em suspensão que têm um tamanho de menos de 1 μπι, e os floculantes são moléculas que podem unir as partículas em suspensão que têm um tamanho maior do que 1 μπι.

Por "material insolúvel" entende-se o material que não é solúvel sob as condições iniciais de extração alcalina do método da invenção. Exemplos não limitativos de tal material incluem fibra, hemicelulose e ligninas.

Por "material particulado" entende-se um material sólido ou coloidal possuindo um tamanho de partícula superior a cerca de 0,2 μπι.

Por "um grão de cereal moído" ou "uma parte moída do grão de cereal" entende-se um grão de cereal ou parte do grão de cereal, o qual foi moído, raspado ou cortado para uma refeição ou a farinha. Num exemplo específico, a parte 18 molda do grão de cereal é farelo que foi desgastado do grão de cereal, e opcionalmente ainda mais moida e purificada por, por exemplo, classificação de ar ou crivagem para proporcionar um perfil especifico de partícula.

Por "quantidade eficaz" entende-se a quantidade de um composto, ou mais de um composto, de interesse necessário para alcançar um efeito desejado, tal como um efeito fisiológico, ou um efeito estimulador.

Por "sequestrado" entende-se a incorporação, aprisionamento ou solubilização de compostos hemofílicos, ou de compostos hidrofóbicos, por exemplo, compostos hidrofóbicos de baixo peso molecular, tais como óleos essenciais, agentes farmacêuticos, medicinais e terapêuticos.

Por "depressor do ponto de congelação" é entendido um composto que diminui o ponto de congelação de uma composição contendo um β (1 — 3)β(1 — 4) glucano, por exemplo, de cerca de 1°C a 15°C, em relação à da mesma composição sem o depressor do ponto de congelação. 0 depressor do ponto de congelação deve também funcionar para reduzir substancialmente ou impedir a gelificação da composição contendo ο β (1-3)β(1-4) glucano. A presente descrição proporciona um método para isolar um β (1-3)β(1-4) glucano a partir de um grão de cereal moído ou de uma parte moída do grão de cereal, tal como descrito nas reivindicações. Também aqui é descrito um método que compreende: (i) extração do grão de cereal moído ou da parte moída do grão de cereal com uma solução alcalina para produzir um extrato contendo pelo menos cerca de 0,4 por cento em peso de β(1-3)β(1-4) glucano; 19 (ii) remoção do material insolúvel, e remoção do material em partículas tendo um tamanho de partículas superior a cerca de 0,2 μιη a partir do extrato para produzir um extrato purificado; (iii) adição de cerca de 10% a cerca de 25% (p/p) de um álcool Ci-C4 ao extrato purificado para precipitar ο β (1 — 3)β (1 — 4) glucano, e (iv) isolamento do β(1-3) β(1-4) glucano. O cereal β-glucano pode ser isolado de acordo com o método de purificação da presente invenção, a partir de um grão de cereal integral moído ou uma parte moída do grão de cereal, tal como o farelo moído do grão de cereal. De preferência, o farelo do grão de cereal é utilizado. O grão de cereal, ou de uma parte deste que é extraído pode estar na forma de uma refeição grosseiramente moída ou de farinha finamente moída. Os cereais que podem ser utilizados na presente descrição incluem, sem limitação, qualquer um dos cultivares de cevada, de aveia, de trigo, de centeio, de milho, de sorgo, e de milho-miúdo.

Na primeira etapa do método de purificação da presente descrição, o grão moído ou a parte moída do grão é misturado com osmose reversa (RO) purificada ou água desionizada (Dl) com uma concentração final de sólidos de cerca de 4 a cerca de 10%, ou de cerca de 6 a cerca de 8%. O valor do pH da água utilizada na primeira etapa do método de purificação pode ser de cerca de 9,00 a cerca de 10,00, mais particularmente, de cerca de 9,25 a cerca de 9,75, ou de cerca de 9,30 a cerca de 9,50, e pode ser ajustado utilizando uma base inorgânica, tal como hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio. Em um exemplo, o hidróxido de potássio é utilizado numa concentração de cerca de 28 mM a 20 cerca de 35 mM. A utilização de uma solução possuindo um valor de pH de entre 9-10, geralmente reduz a quantidade de polissacáridos não glucano e de proteína que é extraída durante a primeira etapa, e, portanto, proporciona a extração seletiva de cereal β de elevado peso molecular de moléculas de glucano. A extração do cereal β-glucano pode ser realizada ao longo de um período de 15 a 45 minutos, ou ao longo de um período de 15-30 minutos. Deve ser apreciado, no entanto, que os períodos mais longos ou mais curtos de extração podem ser utilizados, dependendo do tipo de cereal β-glucano utilizado.

Na segunda etapa do processo de purificação, qualquer material insolúvel que não pode ser extraído, por exemplo as hemiceluloses ou ligninas, é removido. Exemplos de métodos que podem ser usados para separar o material insolúvel incluem, sem limitação a centrifugação, de preferência com um decantador centrífugo, e peneiramento vibratório.

Qualquer material em partículas finas, incluindo alguns materiais à base de proteínas é também removido a partir da solução alcalina na segunda etapa do método da presente descrição. Este material pode ser removido pela adição de um floculante ou coagulante externo, ou ambos. Os floculantes ou coagulantes que podem ser utilizados na segunda etapa podem ter uma carga líquida positiva, negativa ou neutra. A etapa de coagulação pode ser repetida uma vez ou mais de uma vez.

Exemplos de floculantes que podem ser utilizados incluem, sem limitação, floculantes sintéticos, tais como as 21 poliacrilamidas, os sais quaternários de acrilato e macromoléculas floculantes naturais, tais como o quitosano, um polimero natural derivado da quitina. Os exemplos particulares de floculantes incluem Tramfloc® (Tramfloc Inc.), o floculante catiónico SURFLOCW® 34030 (Jes-Chem Ltd.), floculantes de poliacrilamida (PAM), tais como um floculante Aquamark® Serie AQ 600, ou um floculante Superfloc® Serie C-500 (QEMI Inc.)·

Exemplos de coagulantes que podem ser utilizados no método da presente descrição incluem, sem limitação, os eletrólitos inorgânicos, tais como alúmen, cloreto de cal, cloreto férrico, sulfato ferroso, polímeros orgânicos polieletrólitos sintéticos, com grupos funcionais aniónicos ou catiónicos, e poliacrilamidas.

Os floculantes, coagulantes, ou uma sua mistura, podem ser utilizados a uma concentração de cerca de 0,09% a cerca de 0,20% (p/vol) , ou a partir de cerca de 0,10% a cerca de 0,13% (p/vol). A solução alcalina pode ser incubada com o floculante ou coagulante durante cerca de 10 a cerca de 40 minutos, ou de cerca de 10 a cerca de 2 0 minutos a uma temperatura de cerca de 20 a cerca de 40°C, ou de cerca de 20 a cerca de 30°C. Deve ser apreciado, no entanto, que periodos de tempo mais longos ou mais curtos podem ser utilizados para efetuar a coagulação do material em partículas.

Se os materiais carregados negativamente vão ser removidos da solução contendo o cereal β-glucano, então é preferível que o floculante ou coagulante sejam positivamente carregados. Se os materiais carregados positivamente vão 22 ser removidos a partir da solução, então um floculante ou coagulante carregado negativamente é preferido.

Sem se pretender ficar limitado pela teoria, os floculantes e coagulantes que podem ser utilizados no método da presente invenção funcionam através da formação de agregados grandes, densos com finas partículas de matéria, que podem ser facilmente separados a partir da solução aquosa contendo o cereal β-glucano. 0 material coagulado pode ser removidos por centrifugação, utilizando, por exemplo, um centrifugador de disco de pilha. Outros métodos de separação fisicos conhecidos dos especialistas na técnica também podem ser utilizados para efetuar a separação do material coagulado.

Na segunda etapa, qualquer amido ou material relacionado, que esteja presente pode ser digerido utilizando uma enzima, tal como, mas não se limitando, a uma amilase. A enzima pode ser utilizada com uma concentração de entre cerca de 0,05% e cerca de 0,20% (vol/vol) , de entre cerca de 0,09% e cerca de 0,15% (vol/vol), ou de cerca de 0,09% e cerca de 0,11% (vol/vol). Se uma amilase for usada, é preferivel que a solução alcalina seja levada a um valor de pH aproximadamente neutro (isto é, ~pH 7) antes da adição da amilase. Em um exemplo, a solução contendo a amilase é aquecida a uma temperatura de cerca de 50 °C a cerca de 100°C, ou entre cerca de 70°C a cerca de 90°C durante cerca de 20 a cerca de 30 minutos para gelatinizar o amido. A amilase irá hidrolisar o amido e qualquer material relacionado. Geralmente, a amilase, que é escolhida para quebrar o material de amido deve ser funcional e estável nos intervalos de temperatura acima indicados. É particularmente preferido que a amilase não requeira um co- 23 fator de cálcio para digerir o material de amido. Exemplos de tal amilase incluem, sem limitação, Termamyl® LC (Novozymes A/S), e Spezyme® FRED (Genencor International Inc.). A conclusão da reação de hidrólise é determinada quando uma amostra retirada da solução não produz mais um teste positivo de iodo. Neste ponto, a enzima pode ser inativada, por, por exemplo, reduzindo o pH para um valor de cerca de 3,5 a cerca de 4,0. O pH da solução pode ser reduzido usando ácidos inorgânicos fortes, tais como o ácido clorídrico ou ácidos orgânicos fracos, tais como o ácido málico ou o ácido cítrico. Prefere-se, no entanto, que um ácido inorgânico forte, tal como o ácido clorídrico, seja utilizado. Além disso, é preferível que a temperatura da solução seja aumentada para entre 85-90°C para desnaturar a proteína presente na solução. A solução acidificada resultante pode então ser filtrada para remover quaisquer partículas e contaminantes microbiológicos, através de uma almofada de filtro que tem de preferência um ponto de corte de cerca de 20 μιη. Este filtro pode ser revestido com um pré-revestimento de um auxiliar de filtração que tem uma espessura de cerca de 2 a cerca de 5 mm, tal como Celite® C65 (World Minerais), que tem uma porosidade nominal de cerca de 0,2 μιη. Um peso equivalente de um auxiliar de filtração, por exemplo, um auxiliar de filtração lavado com ácido de utilização farmacêutica, tal como o Celite® C300 (World Minerais), podem também ser adicionados como um corpo de entrada para a solução acidificada antes de se efetuar a etapa de filtração. 24 A filtração pode ser realizada utilizando qualquer um de entre um número de dispositivos de filtragem. Um exemplo particular de um dispositivo de filtragem que pode ser utilizado é um f iltro-prensa. No caso em que o tamanho de partícula do material contido no extrato é inferior a 0,5 micron, então a microfiltração e a ultrafiltração cerâmica podem, alternativamente, ser utilizadas para filtrar a solução acidificada.

Na terceira etapa do método de purificação, o cereal β-glucano é precipitado a partir da solução pela adição de um álcool C1-C4. O álcool utilizado para precipitar o cereal β-glucano pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de metanol, etanol, e isopropanol. Se o cereal β-glucano isolado de acordo com o procedimento da presente descrição for ser utilizado na preparação de um produto farmacêutico, ou um produto comestível, então prefere-se que o etanol ou o isopropanol, mais preferencialmente, o etanol, sejam ser utilizados. À medida que a concentração do álcool na solução for aumentado, o cereal β-glucano é precipitado como uma fina suspensão coloidal. A quantidade total de álcool que é necessário para levar a cabo o passo de precipitação pode depender da concentração de cereal β-glucano em solução. O álcool é adicionado a uma concentração final de cerca de 10% a cerca de 25%, em volume, de preferência de cerca de 15% a cerca de 17% em volume. A presente invenção, portanto, evita a utilização de concentrações elevadas de álcool (isto é, as concentrações superiores a 50% em volume), que pode causar a desidratação 25 do cereal β-glucano e resultam na necessidade de homogeneizadores para dispersar o cereal β-glucano. É preferível que a etapa de precipitação seja conduzida a uma temperatura baixa, tal como desde cerca de 1°C a cerca de 10°C, de preferência de cerca de 1°C a cerca de 5°C. Além disso, é preferível que o álcool utilizado na etapa de precipitação seja arrefecido a uma temperatura de pelo menos cerca de -20°C antes de o adicionar à solução de β(1-3)β (1-4) glucano. 0 material de cereal isolado β-glucano final é uma microdispersão ou uma nanodispersão, que está isenta de partículas de grandes dimensões, e não necessita de filtração adicional. As soluções aquosas do cereal β-glucano isolado de acordo com a presente descrição permanecem homogéneas após mais de um ano depois de serem preparadas. A centrifugação, utilizando, por exemplo, um centrifugador de disco da pilha, ou um hidrociclone pode ser usada para isolar o cereal suspenso β-glucano. Se desejado, ο β-glucano isolado, pode ser dissolvido de novo em uma solução aquosa e precipitado de novo com o álcool C1-C4 para aumentar a pureza do β-glucano. 0 sólido isolado pode então ser seco até formar um pó, utilizando, por exemplo, secagem sob vácuo, secagem por pulverização ou secagem em tambor. 0 método preferido de secagem é a secagem sob vácuo, o que produz um sólido granulado grosseiro, que pode ser ainda moído até um tamanho de partícula desejado, por exemplo, com martelo, com pino ou com jacto de moagem. A secagem por vácuo, no entanto, requer menos calor, e pode produzir um 26 cereal relativamente puro β-glucano pois Maillard e outros subprodutos são minimizados.

Para evitar a gelificação do cereal β-glucano em cada uma das etapas do método de purificação da presente invenção, prefere-se que a adição de sais seja minimizada durante o processo. Por exemplo, é preferível que seja utilizada a osmose inversa (RO) de água purificada ou desionizada (Dl), bem como uma amílase não exigindo um cofator de cálcio, tal como Termamyl® LC (Novozymes A/S).

Sem se pretender ficar limitado pela teoria, uma maneira em que a gelificação das soluções de cereais β-glucano pode ocorrer é por reticulação das moléculas de cereal β-glucano, que é iniciada através da coordenação das moléculas de cereal β-glucano a iões, tais como de cálcio. Utilizando baixas quantidades de sal durante o processo, a reticulação das moléculas de cereal β-glucano nas soluções intermediárias formadas no método da presente invenção, pode, por conseguinte, ser minimizada. Além disso, através da limitação da quantidade de sal introduzido durante o método da presente invenção, o cereal β-glucano pode ser isolado essencialmente livre de sais no passo final do método. A composição de cereal β-glucano preparada pelo método de purificação da presente invenção geralmente tem um grau de pureza de pelo menos cerca de 75% e contém menos do que 10% de impurezas de cinzas, menos de 10% de impurezas de proteínas, e menos de 5% de impurezas de lípidos. Mais particularmente, a composição de cereal de β-glucano da presente invenção tem uma pureza de pelo menos cerca de 92%, e contém menos de 3,5% de impurezas de cinzas, menos 27 de 3,5% de impurezas de proteínas, e menos de 1% de impurezas de lípidos. 0 rendimento do cereal β-glucano preparado de acordo com o método de purificação da presente invenção é, geralmente, de cerca de 70 a cerca de 72%.

As soluções homogéneas do cereal β-glucano precipitado podem ser preparadas suspendendo o cereal β-glucano em osmose inversa em água tratada ou desionizada a uma temperatura de cerca de 30 °C a cerca de 45°C durante um período de cerca de 20 a cerca de 30 minutos, ou até que a maior parte do cereal β-glucano tenha sido solubilizado. A solução pode, então, ser pasteurizada e um conservante adicionado.

Soluções aquosas que contêm 1% de cereal β-glucano, isolado de acordo com o método da presente invenção, em geral, possuem as seguintes características: - uma viscosidade de cerca de 200 a cerca de 1500 cP, mais particularmente de cerca de 1000 a cerca de 1500 cP. um valor de clareza de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 UTN (Unidades de Turbidez Nominal), mais particularmente de cerca de 5 a cerca de 40 UTN. - uma concentração de cinzas de cerca de 0,02% a cerca de 0,2%, mais particularmente de cerca de 0,02% a cerca de 0,07%. - uma concentração de proteínas de cerca de 0,02% a cerca de 0,2%, mais particularmente de cerca de 0,02% a cerca de 0,07%. - Uma concentração de lípidos de cerca de 0,005% a cerca de 0,1%, mais particularmente de cerca de 0,005% a cerca de 0,02%.

As soluções estabilizadas de cereal β-glucano isolado de acordo com o método da presente invenção podem ser 28 preparadas da maneira descrita na Patente dos EUA No. 6,284,886. Se estas soluções devem ser utilizados para a preparação de produtos de confeitaria, produtos farmacêuticos, ou outras composições relacionadas, então os conservantes usados no método descrito na Patente dos EUA No. 6,284,886 devem ser um dos que estejam aprovados para o consumo humano e utilização farmacêutica, tais como, mas não limitado a, sorbato de potássio, ácido sórbico, cloreto de benzalcónio, e parabenos. 0 cereal β-glucano isolado de acordo com o método da presente invenção é de particular utilidade na cicatrização de feridas, e na redução de rugas, em que a transferência dos cereais β-glucano através da pele intacta pode levar à reconstrução de colagénio através da estimulação do crescimento de fibroblasto.

Em um aspeto adicional da presente descrição, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo: uma quantidade eficaz de um β (1 — 3)β(1 — 4) glucano, e uma quantidade eficaz de um extrato botânico, ou de um agente farmacologicamente ativo. 0 β (1-3)β (1-4) utilizado na composição farmacêutica acima definida, pode ser preparado de acordo com os métodos de isolamento, que foram descritos acima. 0 β (1-3)β(1-4) das composições farmacêuticas acima definidas pode ser derivado a partir de um grão de cereal ou de uma parte do grão de cereal. Em um exemplo, o cereal é selecionado a partir do grupo consistindo de um cultivar de cevada, um cultivar de aveia, um cultivar de trigo, um cultivar de centeio, um cultivar de sorgo, um cultivar de milho-miúdo, um cultivar de milho, e um mistura dos mesmos. 29 Ο β(1-3)β (1-4) utilizado nas composições farmacêuticas da presente descrição pode ser uma composição de β(1-3)β (1-4) possuindo um grau de pureza de pelo menos cerca de 75% e contendo menos do que 10% de impurezas de cinza, menos de 10% de impurezas de proteinas, e menos de 5% de impurezas de lipidos. Mais particularmente, a presente descrição refere-se a uma composição farmacêutica que compreende uma composição de β (1-3) β (1-4) com uma pureza de pelo menos cerca de 92%, e que contém menos de 3,5% de impurezas de cinzas, menos de 3,5% de impurezas de proteinas, e menos de 1% de impurezas de lipidos.

As composições da presente descrição podem ser formadas por mistura de uma solução aquosa que compreende de cerca de 0,01 % em peso a cerca de 20 % em peso, de cerca de 0,01 % em peso a cerca de 1,2% em peso, de cerca de 0,1% em peso a cerca de 1,1% em peso, ou de cerca de 0,5 % em peso a cerca de 1% em peso de β (1 — 3) β (1 — 4) com um, ou mais do que um composto de interesse, tal como um extrato botânico, ou um agente f armacologicamente ativo. Um, ou mais do que um, composto de interesse pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 40% em peso, de cerca de 0,01% em peso a cerca de 25 % em peso, de cerca de 0,01% em peso a cerca de 4 % em peso, de cerca de 0,1 % em peso a cerca de 1,4% em peso, ou de cerca de 0,5 % em peso a cerca de 1,2% em peso. É preferivel que as composições resultantes sejam deixadas em repouso depois de terem sido misturadas durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de uma composição homogénea, sob a forma de uma suspensão, emulsão ou gel. Em muitos casos, a quantidade de tempo necessário para se obter uma composição homogénea é de cerca de oito a cerca de 16 horas. Deve ser apreciado, no entanto, que períodos de tempo mais curtos ou mais longos podem ser necessários, dependendo da quantidade 30 e da pureza de β(1-3)β (1- -4) glucano usado, bem como da quantidade e natureza de cada um, ou mais do que um composto de interesse. As composições da presente descrição, as quais estão na forma de um gel, podem ser convertidas para um estado mais fluido por meio de agitação suave.

Sem se pretender ficar limitado pela teoria, a formação da suspensão homogénea, emulsão ou gel considera-se como sendo causada por um, ou mais de um, composto de interesse a ser isolado ou encapsulado dentro do β(1 — 3)β (1 — 4) glucano, e pela subsequente formação de ligações de hidrogénio entre as moléculas de um, ou mais de um, composto de interesse e ο β (1-3)β(1-4) glucano. Outra possibilidade é que ο β(1-3)β(1-4) glucano atue como um surfatante ou agente emulsionante ou através da redução da tensão interfacial nas fronteiras entre um, ou mais de um, composto de interesse e a fase aquosa na qual ο β (1-3)β (1-4) glucano é disperso e, por conseguinte, solubiliza efetivamente um, ou mais do que um, composto no interior da fase aquosa.

As soluções de beta glucano utilizadas na preparação das composições da presente descrição são geralmente preparadas a partir de um beta glucano tendo uma pureza de cerca de 65% a cerca de 100%, de cerca de 75% a cerca de 100%, ou de cerca de 85% a cerca de 100%. Em particular, as soluções de beta glucano utilizadas na preparação das composições da presente descrição contêm, geralmente, menos de 20%, mais particularmente menos do que 15%, ainda mais particularmente menos de 10%, mais particularmente menos de 5% de impurezas, tais como proteínas, lípidos, hidratos de carbono, e impurezas em partículas.

Exemplos do extrato botânico que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas de acordo com a invenção incluem, 31 sem limitação, extratos de guaraná, ginkgo biloba, noz de cola, Goldenseal, Golo Kola, Schizandra, sabugueiro, erva de São João, Valeriana e Efedrina, chá preto, chá branco, chá java, óleo de alho, fibras, chá verde, óleo de limão, maça, alcaçuz, óleo de cebola, óleo de laranja, alecrim, cardo de leite, Echinacea, ginseng siberiano ou Panax ginseng, erva cidreira, kava kava, fosco, mirtilo, soja, toranja, algas, espinheiro, tilia, sálvia, cravo, manjericão, curcumina, taurina, erva de aveia selvagem, grão de aveia, dente de leão, genciana, aloé vera, lúpulo, canela, menta, uva, camomila, erva-doce, marshmallow, gengibre, olmo, cardamomo, coentro, anis, tomilho, rehmannia, eucalipto, mentol, schisandra, withania, primavera, lycium, e flor de maracujá.

Num exemplo particular, o extrato botânico é um extrato de um grão de aveia. Mais particularmente, o extrato botânico é um extrato de grão de aveia, o qual contém avenantramida.

Como exemplo de um agente farmacologicamente ativo é mencionado um anti-histaminico, um descongestionante, um corticosteroide, um não-esteróide anti-inflamatório, um broncodilatador, um vasodilatador, ou um anestésico local.

Outros exemplos do agente de extrato botânico farmacologicamente ativo que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presente descrição incluem, sem limitação, beta-sitosterol, cafeina, o cafestol, D-limoneno, kabweol, nomilin, oltipraz, sulforafano, tangeretin, ácido fólico, e mentol. A composição farmacêutica da presente descrição pode ser utilizada sob a forma de uma pulverização, um liquido, que pode apresentar-se em forma de gotas ou de um gel. Em um 32 exemplo, o extrato botânico e o agente farmacologicamente ativo compreendem compostos que são rapidamente absorvidos através da mucosa da cavidade oral, da mucosa da cavidade nasal, ou através do tecido da gengiva. É preferido que as composições farmacêuticas da presente descrição, contendo um anestésico sejam aplicadas a uma região especifica e localizada das gengivas ou da superfície da cavidade oral de um sujeito. Também é preferível que as composições da presente descrição, que contenham um agente vasodilatador, tal como a nitroglicerina, sejam aplicadas por debaixo da lingua de um sujeito. As composições farmacêuticas da presente descrição, que compreendem um anti-histamínico, um descongestionante, um corticosteroide, ou um medicamento não-esteróide anti-inflamatório podem ser aplicados na parte posterior da cavidade oral, ou para a cavidade nasal de um sujeito para permitir que a medicação libertada a partir da composição seja inalada pelo paciente. Composições farmacêuticas de acordo com a presente descrição, que compreendem um extrato botânico consumivel, podem ser utilizadas como um elixir oral e expetorante depois de ser utilizado, ou, alternativamente, podem ser engolidas.

As composições farmacêuticas da presente descrição podem conter um diluente ou um veiculo farmacologicamente aceitável, que é escolhido com base na via de administração pretendida na prática farmacêutica padrão.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem também ser administrados oralmente na forma de comprimidos ou cápsulas contendo excipientes, tais como o amido ou a lactose, ou na forma de elixires ou suspensões contendo agentes aromatizantes ou corantes. Eles podem ser injetados 33 parentericamente, por exemplo, por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Para a administração parentérica, eles são melhor usados sob a forma de uma solução estéril isotónica aquosa.

As composições farmacêuticas da presente descrição podem também ser administradas topicamente quando se tratam condições inflamatórias da pele, sob a forma de um creme, uma geleia, um gel, uma pasta, ou um unguento. Por exemplo, as composições farmacêuticas da presente descrição, que contêm um corticosteroide, um medicamento não-esteróide anti-inflamatório, ou um extrato botânico podem ser utilizadas como uma composição tópica, sob a forma de um creme. 0 exemplo 2 demonstra que ο β (1 — 3)β(1 — 4) glucano preparado de acordo com o método da presente invenção, e aplicado sob a forma de uma composição tópica sobre a superfície de uma secção de pele, pode significativamente atravessar o estrato córneo, a epiderme, a derme e o tecido subcutâneo das camadas da pele. Estes resultados sugerem que um agente farmacologicamente ativo ou um extrato botânico encapsulado pelo β(1-3)β(1-4) glucano isolado de acordo com a presente invenção também podem ser eficazmente transferidos para baixo para a derme e para as camadas de tecido subcutâneo da pele de um sujeito.

De acordo com o terceiro aspeto da presente descrição refere-se a uma composição que compreende um β (1-3)β(1-4) glucano e cerca de 1% a cerca de 40% em peso de um depressor do ponto de congelação. Em outros exemplos, o depressor do ponto de congelação está presente numa quantidade de cerca de 1% a cerca de 30% em peso, ou de cerca de 10% a cerca de 20% em peso. 34 Ο β(1-3)β(1-4) glucano utilizado na composição do terceiro aspeto da presente descrição pode ser preparado de acordo com os métodos de isolamento do presente invento. Outros beta glucanos cereais que podem ser utilizados na presente composição incluem os disponíveis a partir de fornecedores comerciais, tais como Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) e Ceapro Inc. (Edmonton, AB, Canada).

Em um exemplo da composição do terceiro aspeto da presente invenção, ο β (1-3)β(1-4) está presente numa quantidade de cerca de 1,2% a cerca de 1,6% ou de cerca de 1,2% a cerca de 1,3% em peso. Em outro exemplo, o depressor do ponto de congelação é selecionado de entre o grupo constituído por glicerol, propileno glicol, butileno glicol e pentileno glicol.

Num outro exemplo da composição do terceiro aspeto da presente invenção, ο β(1-3)β(1-4) glucano é uma composição de β(1-3)β (1-4) glucano possuindo uma pureza de pelo menos cerca de 75%, e que contém menos de 10% de impurezas de cinzas, menos de 10% de impurezas de proteínas, e menos de 5% de impurezas de lípidos. Mais particularmente, a composição de β-glucano tem um grau de pureza de pelo menos cerca de 92%, e contém menos de 3,5% de impurezas de cinza, menos de 3,5% de impurezas de proteínas, e menos de 1% de impurezas de lípidos. 0 β (1-3)β (1-4) glucano pode também ter um valor de claridade de cerca de 5 a cerca de 100 NTU. O teor de cereal β-glucano pode ser determinado usando uma série de métodos, conhecidos dos peritos na técnica (método McCleary AOAC). Por exemplo, o teor de cereal β-glucano pode ser avaliado por colorimetria e/ou através de técnicas 35 analíticas convencionais, tais como cromatografia de exclusão de tamanho e HPLC (ver Wood et al. Cereal Chem (1977) 54:524; Wood et al. Cereal Chem. (1991) 68:31-39; e Wood et al. Cereal Chem (1991) 68:530-536). Os β-glucanos podem também ser analisados enzimaticamente utilizando kits disponíveis comercialmente, tais como Megazyme (Irlanda) empregando as técnicas de McCleary e Glennie-Hohnes J. Inst. Brew. (1985) 91:285.

As viscosidades podem ser medidas com um viscosímetro rotativo, do tipo de cisalhamento, tal como um Brookfield Syncro-Lectric ou o Haake Rotovisco. Os métodos de utilização do instrumento são conhecidos dos peritos na técnica. Rotineiramente, as medições são feitas em quatro velocidades de rotação de disco a uma temperatura constante de 25°C. O exemplo seguinte é fornecido para exemplificar o presente invento. Variações e alterações serão prontamente evidentes aos peritos na técnica.

Exemplo 1: Método para a purificação de cereal β-glucano derivado de farelo de aveia

Farelo de aveia (The Quaker Oats Company) foi misturado com a osmose inversa alcalina (RO) em água a um pH de cerca de 9,5 até uma concentração de sólidos finais de 4-10%. A temperatura foi mantida a 45°C ± 5°C. O cereal β-glucano foi extraído a partir do farelo de aveia ao longo de um período de 30 minutos. Após este tempo, os sólidos foram removidos por centrifugação, com um decantador centrífugo. O concentrado foi arrefecido até à temperatura ambiente, e o floculante catiónico SURFLOC® 34030 (Jes-Chem Ltd.) foi adicionado a uma concentração de 0,2%. Após um período de 36 incubação de 20 minutos, o material coagulado em partículas foi removido por centrifugação usando uma centrífuga de pilha de disco. O pH do concentrado foi ajustado a aproximadamente neutro, aquecido a > 72°C para gelatinizar o amido, e tratado com a amílase estável ao calor Termamyl® LC (Novozymes A/S). Quando a solução já não produzia um teste positivo de iodo, o pH foi reduzido para cerca de 4,0 para inactivar a enzima, e a mistura foi aquecida a 85°C durante 30 minutos para desnaturar a proteína presente. A solução foi arrefecida a 4°C durante uma hora e, em seguida, aquecida a uma temperatura de cerca de 72°C. Um peso equivalente de CELITE® C300 (World Minerais) foi adicionado à solução, e a mistura foi então filtrada através de um filtro-prensa contendo papéis de filtro de 25 μιη e pré-revestidos, até uma profundidade de cerca 4 mm com CELITE® C65 (World Minerais). A prensa de filtro foi pré-aquecida a uma temperatura de cerca de 65°C, e o pH da corrente de alimentação para a prensa de filtro foi ajustado para 4,5 antes da solução de β-glucano ser filtrada. Após a solução de β-glucano ter sido passada através do filtro, a prensa foi lavada com água de osmose inversa, resultando em uma solução de β-glucano translúcida, de cor amarelo pálido. A solução de β-glucano foi arrefecida a 5°C e 95% de etanol a uma temperatura de -20°C, foi adicionada a um volume final de cerca de 15% (p/p), com agitação. Uma suspensão de β-glucano que se formou foi imediatamente separada da solução por centrifugação numa centrífuga de pilha de disco. Ο β-glucano sólido isolado foi adicionado a água RO a 45°C, deixou-se dispersar e, em seguida, aquecido a entre 60-70°C para produzir uma solução incolor, contendo cerca de 1% de β-glucano. 0 β-glucana separado era incolor, tinha um grau de pureza superior a 75%, uma viscosidade de > 500 cP, e 37 uma claridade de exceção <50 NTU, tal como medido usando um medidor de turbidez.

Exemplo 2. Quantificação da Distribuição de β-Glucano Purificado Aplicado como uma Composição Aquosa para Secções de Pele Abdominal A pele humana abdominal foi recebida com o consentimento informado de cinco dadores saudáveis que sofreram cirurgia plástica. A pele de cada paciente foi libertada a partir da gordura subcutânea, e cortada em três secções. As secções de pele foram congeladas em azoto liquido e esterilizadas durante a noite com uma dose de 25 kGy de radiação gama. As amostras irradiadas foram, cada uma, montadas num volume de 2 0 mL de câmara de perfusão semelhante a FRANZ CELL® (PHACOCELL®, PhaCos GmbH, D-82131-Gauting, Alemanha, ver Artmann, C.W. In vitro percutaneous absorption into human skin, Fundam. Appl. Toxicol., 28, 1-5 (1996)) contendo um meio aceitador. Usando um aplicador de microdose, as amostras irradiadas de pele foram revestidos com 5 mg/cm2 de dosagem da Composição 1455 da Composição 1450 ou uma composição de controlo. As Composições 1455 e 1450 eram composições aquosas contendo 5% e 50%, respetivamente, do β(1-3)β(1-4) glucano, preparado de acordo com o método de isolamento da presente invenção (ver Exemplo 1) . A composição de controlo foi uma composição aquosa que não continha qualquer β (1-3)β (1-4) glucano. A câmara foi mantida livre de bolhas de ar durante o enchimento, a fim de assegurar a completa e uniforme lavagem do tecido da pele. Compensação de pressão, dentro e fora da câmara, e uma humidade constante de ar foi fornecida por meio de ventilação. A temperatura da pele foi monitorada com sensores de temperatura, e o teor de humidade das secções 38 de pele foi monitorizado com um corneómetro. 0 meio foi regulada a 36°C e distribuído de forma contínua. A humidade da pele foi mantida a cerca de 65 unidades de corneómetro, e a temperatura da superfície da pele foi mantida a 32°C através de um canal de ventilação. As condições acima descritas foram mantidas por regulação da temperatura do meio, utilizando uma placa de aquecimento na base da câmara, e tubos de ar, e ajustando o fluxo de ar na câmara. As secções de pele foram fornecidas por meio de circulação uniforme de um meio de nutriente, que lavou as suas superfícies inferiores. A área de aplicação para todas as amostras foi fixada em 10 cm2. As amostras de pele foram incubadas durante oito horas em condições não-oclusivas (abertas).

No final do período de incubação, as amostras de esfregaços das secções de pele foram retiradas tanto com hastes de gaze de algodão seco como com hastes de gaze algodão embebido em 0,2 mL de metanol/H20 a 70%. As secções de pele foram removidas da câmara Phacocell® e imediatamente congeladas em azoto líquido. As secções de pele foram cortadas em fatias de 15 μιη da camada da córnea da derme profunda. As secções de pele foram deixados secar ao ar sobre lâminas de vidro limpas e não fixadas com qualquer fluido. As fatias foram então coradas com BACTIDROP™ Calcofluor White durante 30 segundos e depois lavou-se o excesso de corante com água desionizada. Os passos de coloração e lavagem foram repetidos duas vezes. A amostra corada foi coberta com uma folha limpa de vidro e examinada por fluorescência com um microscópio de fluorescência LEIKA® com um filtro de excitação que varia entre 400-500 nm, com um pico de 440 nm, um filtro de barreira de 500-520 nm , e uma lâmpada de xénon de arco (queimador) . BACTIDROP™ Calcofluor White é um fluorocromo não 39 específico que se liga à celulose, e após excitação com luz ultravioleta de comprimento de onda longo delineia as paredes celulares de organismos contendo celulose. A deposição das moléculas β-glucano foi monitorada e quantificada utilizando fluorescência brilhante, focos invertidos para manchas brancas (3-5 μιη) vistos sobre as paredes das células das amostras e nos interstícios intercelulares.

As deposições percentuais médias conforme determinado pelo método de coloração de fluorescência acima são mostradas na Tabela 3. Valores de coloração de fluorescência significativos (> 5%) foram observados na camada córnea e na epiderme das amostras de pele tratadas com Composição 1455 e Composição 1450. Valores relativamente mais baixos foram observados nas camadas da derme e tecido subcutâneo das amostras de pele tratadas com Composição 1450 e Composição 1455. Os valores de fluorescência de coloração de <1% foram observadas com as secções da pele que foram tratados com a composição de controlo.

Tabela 3. Deposição Percentual Média de β(1-3) β(1-4) Glucano em diferentes camadas da pele abdominal

Deposição Percentual Média COMPOSIÇÃO 1455 COMPOSIÇÃO 1450 CONTROLO Por Cento Desvio Padrão Por Cento Desvio Padrão Por Cento Desvio Padrão Meio - — - — - — Esfregaço - - - - - Camada Córnea 8,7 1,2 12,8 1,9 0, 6 0,2 40

Deposição Percentual Média COMPOSIÇÃO COMPOSIÇÃO CONTROLO 1455 1450 Por Desvio Por Desvio Por Desvio Cento Padrão Cento Padrão Cento Padrão Epiderme 5,9 1,3 11, 6 2,0 O co 0,2 Derme 2,4 0,5 4,1 1,1 0, 6 0,1 Subcutâneo 1,4 0,5 1,5 0,4 0,9 0,1 A documentação das descobertas através de fotografias (não mostradas) também demonstrou uma absorção significativa de β-glucano pela camada da epiderme das amostras de pele. A medição da fluorescência foi realizada de acordo com procedimentos e documentação de controlo de qualidade. Números de controlo de BACTIDROP™ Calcofluor White foram testados utilizando os organismos de controlo de qualidade reconhecidos e que foram considerados aceitáveis. (Microbiologia M. Pettenkofer Institute, Munchen) . A avaliação estatística foi realizada pelo pacote de software estatístico SAS / STATISTICA®. Tanto o material fisico como os programas de computador utilizados foram validados. A presente invenção foi descrita em relação a formas de realização preferidas. No entanto, será óbvio para os peritos na técnica que podem ser feitas várias variações e modificações.

Lisboa, 29 de abril de 2013

Claims (17)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para isolar um β(1-3) β(1-4) glucano a partir de um grão de cereal mordo ou de uma parte moida de um grão de cereal compreendendo: (i) extração do grão de cereal moido ou de uma parte de cereal moida com uma solução alcalina tendo um valor de pH de entre 9 e 10 para um período de tempo de cerca de 15 a cerca de 45 minutos para produzir um extrato contendo pelo menos cerca de 0,4 por cento de β(1-3) β(1-4) glucano; (ii) remoção de material insolúvel e a remoção de um material em partículas tendo um tamanho de partículas superior a cerca de 0,2 μιη a partir do referido extrato para produzir um extrato purificado; (iii) adição de cerca de 10% a cerca de 25% (vol/vol) de um álcool Ci-C4 ao extrato purificado para precipitar ο β(1- 3) β(1 — 4) glucano, e (iv) isolar ο β (1 — 3) β(1 — 4) glucano.

2. 0 método da reivindicação 1, em que na referida etapa de adição (etapa iii) cerca de 10% a cerca de 20% (vol/vol) de um álcool selecionado do grupo que consiste por metanol, etanol e isopropanol, é usado para precipitar ο β (1 — 3) β (1 — 4) glucano a partir do referido extrato purificado.

3. 0 método do paragrafo 2 em que cerca de 10% a cerca de 20% (vol/vol) de etanol é usado para precipitar ο β (1 -3) β(1-4) glucano a partir do referido extrato purificado.

4. O método da reivindicação 1, em que a referida etapa de retirada de material em partículas compreende ainda: uma ou mais do que uma etapa de adição de um floculante, um coagulante ou um floculante e um coagulante ao referido 2 extrato de modo a extrair o referido material coagulado em partículas tendo um tamanho de partículas superior a cerca de 0,2 μηι e a remoção do material coagulado a partir do referido extrato; digestão do material de amido no referido extrato, e filtragem do material em partículas a partir de um tamanho de partículas superior a 0,2 μιη a partir do referido extrato de modo a produzir o extrato purificado.

5. O método da reivindicação 4 em quem na referida etapa de digestão, o referido material de amido é digerido com uma enzima.

6. O método da reivindicação 5, em que antes da digestão do referido material de amido, a referida solução alcalina é neutralizada.

7. O método da reivindicação 6, em que a seguir à digestão do referido material de amido do referido enzima é desativado.

8. O método da reivindicação 7, em que a referida enzima é inativada pela acidificação da solução neutralizada.

9. O método da reivindicação 5, em que a referida enzima é uma amílase.

10. O método da reivindicação 9, em que a referida amílase não necessita de um cofator de cálcio.

11. O método da reivindicação 1, em que o cereal é selecionado de entre o grupo que consiste por um cultivar de cevada, um cultivar de aveia, um cultivar de trigo, um 3 cultivar de centeio, um cultivar de sorgo, um cultivar de milho miúdo, e um cultivar de milho.

12. 0 método da reivindicação 1 em que a dita etapa de adição (etapa iii) é realizada a uma temperatura de cerca de 1°C até cerca de 10°C.

13. 0 método do reivindicação 1, que compreende ainda uma, ou mais do que uma, etapa de dissolução do β (1 — 3) β (1 — 4) glucano isolado, em uma solução aquosa, precipitação do β(1-3)β(1-4) glucano adicionando entre 10% a 25% (vol/vol) do álcool C1-C4 a ser adicionado à solução aquosa, e isolando ο β (1—3)β(1—4) glucano.

14. O método da reivindicação 4, em que o floculante é selecionado do grupo que consiste por uma poliacrilamida, um sal acrilato quaternário e uma macromolécula floculante natural, e o coagulante é selecionado do grupo que consiste por alúmen, cloreto de cal, percloreto de ferro, sulfato de ferro, um polimero orgânico e um polieletrolito sintético com grupos funcionais aniónicos ou catiónicos.

15. 0 método da reivindicação 1, em que cerca de 15% a cerca de 17% (vol/vol) do álcool C1-C4 é adicionado ao extrato purificado na etapa (iii) .

16. 0 método da reivindicação 1, em que o grão de cereal moido ou a parte moida do grão de cereal é extraída com uma solução alcalina tendo um valor de pH de cerca de 9,25 a cerca de 9,75.

17. 0 método de acordo com o reivindicação 4, em que a etapa de filtragem do material tendo um tamanho de partícula superior a 0,2 μιη a partir do referido extrato é 4 efetuada usando um filtro revestido com uma camada prévia de um auxiliar de filtragem tendo uma porosidade de 0,2 μιη. Lisboa, 29 de abril de 2013