PT1601363E - Aplicação como medicamentos de derivados da colest-4-en-3- ona, composições farmacêuticas que os contêm e novos derivados - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

APLICAÇÃO COMO MEDICAMENTOS DE DERIVADOS DA COLEST-4-EN-3-ONA, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM E NOVOS

DERIVADOS A presente invenção refere-se à aplicação de derivados da colest-4-en-3-ona como medicamentos, em particular como neuro-protectores, por exemplo nas patologias e traumatismos ligados à degenerescência ou à morte dos motoneurónios, às composições farmacêuticas que os contêm, a novos derivados e ao seu processo de preparação.

Os processos neurodegenerativos caracterizam-se pelo mau funcionamento e pela morte dos neurónios que acarretam a perda das funções neurológicas mediadas pelo cérebro (sistema nervoso central, SNC), pela medula espinal e pelo sistema nervoso periférico (SNP). Podem resultar, entre outras coisas, de situações patológicas agrupadas sob a designação de doenças ou de afecções neurodegenerativas, de traumatismo, ou de exposição a toxinas.

As patologias mais importantes que se caracterizam por um processo degenerativo são: - as doenças crónicas neurodegenerativas, hereditárias ou esporádicas, em particular a doença de Alzheimer, a doença de Huntington, a doença de Parkinson, a esclerose lateral amiotrófica, as amiotrofias espinais, a doença de Creutzfeldt-Jakob, a esclerose em placas, a adrenoleucodistrofia, a epilepsia, as demências, a 1 esquizofrenia e os sindromes neurológicos associados à SIDA; - as lesões neuronais ligadas ao envelhecimento; - as neuropatias periféricas hereditárias ou lesionais, como as doenças de Fabry, de Charcot-Marie-Tooth, de Krabbe, as leucodistrofias, as neuropatias diabéticas e as induzidas por tratamentos anti-cancerosos; - os traumatismos cerebrais, dos nervos periféricos ou da medula espinal; - as isquemias do cérebro ou da medula espinal na sequência de um acidente vascular cerebral, ou induzidas por uma falta de irrigação sanguínea; - as degenerescências, hereditárias, lesionais ou ligadas ao envelhecimento dos neurónios sensoriais da visão, como as degenerescências maculares, retinites pigmentares ou as degenerescências do nervo óptico induzidas pelos glaucomas; - as degenerescências, hereditárias, traumáticas ou ligadas ao envelhecimento dos neurónios sensoriais do ouvido, que provocam uma diminuição ou perda da audição.

Uma parte das vias de sinalização afectadas nestas patologias é comum a um grande número de doenças neurodegenerativas. A doença de Alzheimer é a demência mais frequente. Faz surgir uma atrofia do cérebro, uma perda neuronal predominante no corno de Ammon e atinge também os neurónios colinérgicos. Outras patologias, como as atrofias lobares (doença de Pick, doença de Creutzfeld-Jakob), a demência com corpos de Lewy, as demências vasculares, a doença de Parkinson, estão associadas a uma morte neuronal importante na origem dos sintomas destas demências. 2

Actualmente, não existe um tratamento eficaz para deter as degenerescências neuronais. Uma abordagem terapêutica para proteger os neurónios da morte é o fornecimento de proteínas neurotróficas.

Estas proteínas, como a BDNF (brain-derived neurotrophic factor) , a CNTF (ciliary neurotrophic factor), a NGF (nerve growth factor), a GDNF (glia-derived neurotrophic factor), são sintetizadas durante o desenvolvimento embrionário ou após lesão no adulto. Estes factores de crescimento favorecem a sobrevivência, a maturação e a diferenciação das células neuronais. Para além disso, inibem os mecanismos apoptóticos, ativam múltiplas vias de sobrevivência e protegem um grande número de populações neuronais. A sua utilização é proposta na maior parte das degenerescências neuronais.

Compostos que activassem a expressão de factores neurotróficos ou que imitassem a acção destes fatores possuem um potencial terapêutico para o tratamento dos síndromes neurodegenerativos.

Em particular, o fornecimento de moléculas neurotróficas para o tratamento das degenerescências neuronais tem três objectivos: - compensar uma carência potencial de fatores neurotróficos ligada a uma escassez de fornecimento por parte dos alvos periféricos ou centrais dos neurónios e/ou uma perturbação do transporte retrógrado destes fatores; - intervir de forma não específica sobre vias bioquímicas implicadas na cascata degenerativa; 3 - favorecer os fenómenos compensadores naturais de crescimento dendritico e de arborização das terminações nervosas.

Estes compostos produziriam assim um efeito benéfico num grande número de patologias, em particular nas patologias que afectam os sistemas nervosos periférico e central.

Para além disso, no quadro apresentado acima, os motoneurónios são neurónios particularmente presentes na medula espinal e no tronco cerebral. A sua degenerescência ou morte pode conduzir a um enfraquecimento progressivo dos músculos dos membros e, seguidamente, a uma atrofia e eventualmente a uma espasticidade (ou seja, a uma contracção permanente) do músculo.

As patologias mais importantes que resultam da degenerescência e morte dos motoneurónios espinais e/ou bulbares são a esclerose lateral amiotrófica, igualmente conhecida sob a designação de doença de Charcot ou ainda doença de Lou Gehrig, e as amiotrofias espinais infantis, igualmente conhecidas sob as designações de doença de Werdnig-Hoffmann ou doença de Kugelberg-Welander.

Além disso, observa-se uma degenerescência dos motoneurónios em casos de traumatismo com esmagamento e/ou seccionamento da medula espinal ou dos nervos motores periféricos.

De uma forma mais geral, fala-se de amiotrofias espinais em doenças onde está implicada a degenerescência ou morte dos motoneurónios da medula espinal. 4 A esclerose lateral amiotrófica (SLA ou ALS para Amyotrophic Lateral Sclerosis) é uma doença neurodegenerativa associada a diferentes tipos de inclusões como os corpos de Lewy e caracterizada por uma degenerescência dos motoneurónios espinais e corticais cujo desfecho fatal está por vezes associado a uma demência frontal. Ao longo do desenvolvimento da ALS, os fenómenos degenerativos produzem-se, não apenas no cérebro, mas igualmente na medula espinal e, por consequência, no músculo, por carência de inervação.

Continua a procurar-se compostos activos para combater as afecções acima referidas. A patente EP 0 442 350A descreve a utilização de stigmast-4-en-3-ona ou stigmast-4-22-dien-3-ona para o tratamento dos tumores. HORITA, KIYOSHI et al ("Anti-arrhythmia constituent in Herba leonuri" NATURAL MEDICINES, 56(5), 212-214, 2002), descreve a actividade antiarritmica da stigmast-4-en-3-ona (beta-sitosterona) e a utilização médica de extractos de Herba lenuri que a contêm. YANG, Y. et al ("Anti-emetic principies of Pogostemon cablin" PHYTOMEDICINE, 6(2), 89-93, 1999) descreve o efeito antiemético da stigmast-4-en-3-ona e a utilização de plantas medicinais chinesas que a contêm. KOLAK, UFUK et al ("Cardioactive diterpenoids from the roots of Salvia amplexicaulis" PLANTA MEDICA, 67 (8), 761-763, 2001) descreve o efeito vasodepressor da stigmast-4-en-3-ona e a utilização médica de raízes de Salvia amplexicaulis que a contêm. 5 SUZUKI K et al ("The cholesterol metabolite cholest-4-en-3-one and its 3-oxo derivatives suppress body weight gain, body fat accumulation and serum lipid concentration in mice" BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, 8 (16), 2133-2138,1998) descreve o efeito anti-obesidade dos derivados da colesten-3-ona de fórmula I). ΚΑΝΕΚΟ,ΕΜΙ et al ("Induction of Intestinal ATP-binding Cassette Transporters by a Phytosterol-derived LiverXReceptor Agonist" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 278(38), 36091-36098, 2003) descreve o efeito agonista dos recetores LXRs de ergosta-1,4,6,22-tetraen-3-ona e a sua possível utilização terapêutica para a modulação do metabolismo do colesterol. LIN, WEI-YU et al ("Anti-platelet aggregation and Chemical constituents from the rhizome of Gynura japonica" PLANTA MEDICA, 69(8), 757-764, 2003) descreve a actividade antiagregação das plaquetas de stigmast-1,2,22-trien-3-ona e stigmast-1,4-dien-3-ona, e a utilização médica do rizoma de Gynura Japonica que as contém.

No pedido de patente japonês JP2002030096 a stigmast-22-en-3-ona e a sua oxima são divulgadas como intermediárias de síntese na preparação de ergosteróis, sendo estes últimos descritos como regeneradores das projeções neuronais com aplicação no tratamento das doenças de Alzheimer e de Parkinson. UENSEREN E ("Gamma irradiation of cholestenone oximes" INIS ATOMINDEX, INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY, vol. 8, no. 6, 1977, páginas 1-21) divulga o composto colest-4-en-3-ona e a sua oxima como intermediários na síntese dos azasteróides. 6

Estes documentos da técnica anterior não descrevem uma utilização de compostos da invenção como medicamentos neuroprotetores.

Ora, a requerente descobriu que os derivados da 4-colesten-3-ona e, em particular, a oxima de colest-4-en-3-ona eram dotados de notáveis propriedades neuroprotetoras, em particular no que diz respeito a motoneurónios, a neurónios do sistema nervoso central, a nervos motores e periféricos, sendo assim úteis como medicamentos, e que alguns entre eles eram, além disso, dotados de notáveis propriedades inibidoras do efeito de moduladores alostéricos positivos dos receptores GABAa (ácido gama-aminobutirico de tipo A).

Dai a presente invenção ter como objecto os compostos de fórmula I

R X E

A C

(D

na qual X representa um grupo =N-OH R representa um grupo escolhido entre

RI 7 R2 R3 = R4 =

R6 =

R5 = A representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com B uma ligação carbono-carbono, B representa um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxi ou em conjunto com A uma ligação carbono-carbono, C representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, D representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com C uma ligação carbono-carbono, E representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com F uma ligação carbono-carbono, F representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com E uma ligação carbono-carbono, bem como os seus sais de 8 adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis, para a sua utilização num método de tratamento terapêutico do corpo humano ou animal, ou seja, como medicamento.

Os sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis podem ser, por exemplo, sais formados com os ácidos clorídrico, bromídrico, nítrico, sulfúrico, fosfóricos, acético, fórmico, propiónico, benzóico, maleico, fumárico, sucínico, tartárico, cítrico, oxálico, glioxílico, aspártico, alcano-sulfónicos como os ácidos metano ou etano-sulfónicos, aril-sulfónicos, como os ácidos benzeno ou paratuoleno-sulfónicos, ou carboxílicos.

Realçamos mais particularmente os compostos acima referidos para os quais, - X representa um grupo =N-OH, A representa em conjunto com B uma ligação carbono-carbono, C, D, representam um átomo de hidrogénio, E, F representam um átomo de hidrogénio ou, em conjunto, uma ligação carbono-carbono, e R significa Rl, - X representa um grupo =N-OH, A representa em conjunto com B uma ligação carbono-carbono, C, D representam um átomo de hidrogénio, E, F representam um átomo de hidrogénio, e R significa R2 ou R3 ou R4, - X representa um grupo =N-OH, A representa em conjunto com B uma ligação dupla, C representa em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, E, F representam um átomo de hidrogénio, e R significa Rl ou R6, - X representa um grupo =N-OH, A representa em conjunto

com B uma ligação dupla, C representa em conjunto com D 9

uma ligação carbono-carbono, E representa em conjunto com F uma ligação carbono-carbono, e R significa RI - X representa um grupo =N-OH, E representa em conjunto com F uma ligação dupla, C, D, A, B representam um átomo de hidrogénio, e R significa Rl, bem como os seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis.

Entre os compostos da invenção, podemos citar ainda - a 5 beta-hidroxi-colestan-3-ona - a oxima de colestan-3-ona bem como os seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis.

Realçam-se em particular - a oxima da colest-4-en-3-ona, - a oxima da 1,4-colestadien-3-ona bem como os seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis.

Os compostos objecto da presente invenção possuem propriedades farmacológicas muito interessantes.

Nomeadamente, são dotados de propriedades neuroprotectoras admiráveis, sobretudo no que diz respeito aos motoneurónios.

Estas propriedades são ilustradas mais adiante na parte experimental. Elas justificam a utilização dos compostos 10 acima descritos, bem como a dos seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis como medicamentos.

Os medicamentos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados, devido às suas propriedades neuroprotectoras, no tratamento ou na prevenção das afecções neurodegenerativas, como, por exemplo, a doença de Huntington, as doenças crónicas neurodegenerativas, hereditárias ou esporádicas, as lesões neuronais ligadas ao envelhecimento, as neuropatias periféricas hereditárias ou lesionais, a doença de Charcot-Marie-Tooth, as neuropatias diabéticas ou induzidas pelos tratamentos anticancerosos, os traumatismos do cérebro, dos nervos periféricos ou da medula espinal, as isquemias do cérebro ou da medula espinal, as degenerescências hereditárias, lesionais ou ligadas ao envelhecimento dos neurónios sensoriais da visão ou as degenerescências do nervo óptico, as degenerescências hereditárias, traumáticas ou ligadas ao envelhecimento dos neurónios sensoriais do ouvido, as atrofias lobares e as demências vasculares e, em particular, as amiotrofias espinais, a esclerose lateral amiotrófica e as patologias devidas aos traumatismos da medula espinal ou dos nervos motores periféricos.

No contexto da invenção, o termo «tratamento» designa o tratamento preventivo, curativo, paliativo, bem como o apoio aos doentes (redução do sofrimento, melhoria da duração de vida, retardamento da progressão da doença), etc. 0 tratamento pode, além disso, ser realizado em combinação com outros ingredientes ou tratamentos, como, nomeadamente, outros compostos activos para tratar as patologias ou traumatismos especificados no presente pedido de patente. 11

Eles apresentam igualmente propriedades inibidoras do efeito de moduladores alostéricos dos recetores GABAa (ácido gama-aminobutírico de tipo A). Exemplos de moduladores alostéricos positivos são: a alopregnanolona ou 3a-hidroxi-5cx-pregnan-20-ona ou 3a,5a-TH-PR0G ou a tetra-hidrodeoxicorticosterona = 3a,20-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona = 3a,5a-TH-D0C, que são neuroesteróides endógenos do sistema nervoso central. Estas propriedades particulares justificam que os compostos da invenção possam igualmente ser utilizados no tratamento de diferentes situações fisiopatológicas, onde estes neuroesteróides já foram descritos como desempenhando um papel importante, por exemplo, nas seguintes situações: - comportamento sexual - morte súbita do recém-nascido, e, em particular - sensibilidade dolorosa ou dores neuropáticas crónicas - ansiedade ou a depressão - lesões traumáticas do sistema nervoso - epilepsias sensíveis aos esteroides, as perturbações do sono ou a intoxicação alcoólica - aprendizagem cognitiva ou as perturbações de memória.

Podem ser utilizados, em particular, devido às suas propriedades neuro-protetoras no que respeita aos motoneurónios, no tratamento das amiotrofias espinais, em especial a esclerose lateral amiotrófica ou amiotrofias espinais infantis, e no tratamento dos traumatismos da medula espinal ou dos nervos motores periféricos, como referido acima. 12

Em geral, a dose diária do composto será a dose mínima para obter o efeito terapêutico. Esta dose dependerá dos diferentes factores citados anteriormente. As doses dos compostos acima descritos e, por exemplo, da oxima de colest-4-en-3-ona, estarão em geral compreendidas entre 0,001 a 100 mg por quilo por dia para o homem.

Se necessário, a dose diária pode ser administrada em duas, três, quatro, cinco, seis ou mais vezes por dia ou em sub-doses múltiplas administradas em intervalos apropriados ao longo do dia. A quantidade escolhida dependerá de múltiplos factores, em particular da via de administração, da duração da administração, do momento da administração, da rapidez de eliminação do composto, do ou dos diferentes produtos utilizados em combinação com o composto, da idade, do peso e da condição física do doente, bem como da sua história médica e de todas as outras informações conhecidas em medicina. A prescrição do médico responsável poderá começar com doses inferiores às habitualmente utilizadas, sendo essas doses progressivamente aumentadas, a fim de controlar o aparecimento de eventuais efeitos secundários. A invenção tem igualmente como objecto as composições farmacêuticas que contêm, pelo menos, um composto supracitado ou um dos seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis, como princípio activo.

Nestas composições, o princípio activo está vantajosamente presente em doses fisiologicamente eficazes; as composições anteriormente citadas contêm, nomeadamente, uma dose neuro- 13 protetora eficaz de pelo menos um princípio activo acima mencionado.

Como medicamentos, os compostos de fórmula I, bem como os seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis podem ser incorporados em composições farmacêuticas destinadas à via digestiva ou parentérica.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem conter, além disso, pelo menos outro ingrediente terapeuticamente activo, para uma utilização simultânea, separada ou distribuída no tempo, em particular quando se trata do tratamento de um indivíduo que sofre de uma patologia ou de um traumatismo ligado à degenerescência ou à morte dos motoneurónios, como definido acima.

As composições farmacêuticas ou medicamentos de acordo com a invenção contêm vantajosamente um ou vários excipientes ou veículos inertes, ou seja, farmaceuticamente inactivos e não tóxicos. Podemos citar, por exemplo, as soluções salinas, fisiológicas, isotónicas, tampão, etc., compatíveis com uma utilização farmacêutica e conhecidas do perito. As composições podem conter um ou vários agentes ou veículos escolhidos entre os dispersantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, etc. Agentes ou veículos utilizáveis em formulações (líquidas e/ou injectáveis e/ou sólidas) são, designadamente, a metilcelulose, hidroximetilcelulose, carboximetilcelulose, ciclodextrinas, polisorbato 80, manitol, gelatina, lactose, óleos vegetais ou animais, acácia, etc. As composições podem ser formuladas sob forma de suspensão injectável, géis, óleos, comprimidos, supositórios, pós, cápsulas, etc., eventualmente por meio de 14 formas galénicas ou de dispositivos que garantam uma libertação prolongada e/ou retardada. Para este tipo de formulação, utiliza-se vantajosamente um agente como a celulose, carbonatos ou amidos. A administração pode ser realizada por qualquer outro método conhecido do perito, de preferência por via oral ou por injecção, tipicamente por via intraperitoneal, intracerebral, intratecal, intravenosa, intra-arterial ou intramuscular. A administração por via oral é preferida. Tratando-se de um tratamento a longo prazo, a via de administração preferida será a sublingual, oral ou transcutânea.

Para as injeções, os compostos são geralmente acondicionados sob a forma de suspensões liquidas, que podem ser injectadas através de seringas ou de perfusões, por exemplo. Considera-se que o débito e/ou a dose injectada, ou de uma maneira geral a dose a administrar, podem ser adaptados pelo especialista em função do doente, da patologia, do modo de administração, etc. Considera-se que podem ser realizadas administrações repetidas, eventualmente em combinação com outros ingredientes activos ou qualquer outro veiculo aceitável no plano farmacêutico (tampões, soluções salinas, isotónicas, em presença de agentes estabilizadores, etc.). A invenção é utilizável nos mamíferos, em particular no ser humano. A presente invenção descreve igualmente um processo de preparação de uma composição descrita acima, caracterizada pelo facto de se misturar, segundo métodos conhecidos, o ou 15 os princípios activos com excipientes aceitáveis, em particular farmaceuticamente aceitáveis.

Os compostos da fórmula I, tal como definidos acima, são conhecidos e podem ser preparados segundo processos descritos na literatura. Certos derivados da fórmula I são produtos novos.

Por esta razao, o presente pedido de patente tem igualmente como objecto os compostos novos de fórmula I

(I) na qual X representa um radical =N-OH e - A representa em conjunto com B uma ligação carbono-

carbono, C, D representam um átomo de hidrogénio, E representa em conjunto com F uma ligação carbono-carbono e R significa Rl, ou - A representa em conjunto com B uma ligação carbono- carbono, C, D representam um átomo de hidrogénio, E, F representam um átomo de hidrogénio e R significa R2 ou R4, ou - A representa em conjunto com B uma ligação carbono- carbono, C representa em conjunto com D uma ligação 16 carbono-carbono, E, F representam um átomo de hidrogénio e R significa R6, ou - A representa em conjunto com B uma ligação carbono-carbono, C representa em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, E representa em conjunto com F uma ligação carbono-carbono e R significa Rl, bem como os seus sais de adição com os ácidos inorgânicos ou orgânicos. A presente invenção descreve igualmente um processo de preparação dos novos compostos de fórmula I, tal como definidos acima, bem como dos seus sais, caracterizado por fazer reagir um composto de fórmula II,

R

A C (||)

E O na qual - A representa em conjunto com B uma ligação carbono-

carbono, C, D representam um átomo de hidrogénio, E representa em conjunto com F uma ligação carbono-carbono e R significa Rl, ou - A representa em conjunto com B uma ligação carbono- carbono, C, D representam um átomo de hidrogénio, E, F representam um átomo de hidrogénio e R significa R2 ou R4, ou 17 - A representa em conjunto com B uma ligação carbono-carbono, C representa em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, E, F representam um átomo de hidrogénio e R significa R6, ou - A representa em conjunto com B uma ligação carbono-carbono, C representa em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, E representa em conjunto com F uma ligação carbono-carbono e R significa Rl, com um halogeneto de hidroxilamina como o cloridrato de hidroxilamina, para obter o composto de fórmula I esperado, que se isola e, se assim se desejar, salifica.

Em condições preferenciais de realização do processo acima descrito, - dissolve-se o produto de partida num mínimo de solvente adaptado, como a piridina - caso esteja presente outra função cetona, ela é bloqueada especificamente por um grupo protector adaptado, como os acetais cíclicos, - utiliza-se um excesso, por exemplo, 2 equivalentes, de halogeneto de hidroxilamina. - opera-se com agitação durante cerca de 24h à temperatura ambiente.

Os compostos de fórmula II são derivados conhecidos, descritos na literatura e acessíveis comercialmente.

A invenção tem ainda como objecto a utilização de um composto de fórmula I 18

na qual X representa um átomo de oxigénio ou um grupo =N-OH, R representa um grupo escolhido entre

Ri R2 R3 = R4 R6 = R5 = 19 A representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com B uma ligação carbono-carbono B representa um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxi ou em conjunto com A uma ligação carbono-carbono, C representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, D representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com C uma ligação carbono-carbono, E representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com F uma ligação carbono-carbono, F representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com E uma ligação carbono-carbono, ou de um dos seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis, para a obtenção de um medicamento neuroprotector, nomeadamente destinado ao tratamento de doenças neurodegenerativas como, por exemplo, a doença de Huntington, doenças crónicas neurodegenerativas, hereditárias ou esporádicas, lesões neuronais ligadas ao envelhecimento, neuropatias periféricas hereditárias ou lesionais, doença de Charcot-Marie-Tooth, neuropatias diabéticas ou induzidas por tratamentos anticancerígenos, traumatismos do cérebro, nervos periféricos ou da medula espinal, isquemias do cérebro ou da medula espinal, degenerescências hereditárias, lesionais ou ligadas ao envelhecimento dos neurónios sensoriais da visão ou degenerescências do nervo óptico, degenerescências hereditárias, traumáticas ou ligadas ao envelhecimento dos 20 neurónios sensoriais do ouvido, atrofias lobulares e demências vasculares, doenças e traumatismos ligados à degenerescência dos motoneurónios e, mais particularmente, amiotrofias espinais, em particular as infantis, esclerose lateral amiotrófica, esclerose em placas e traumatismos da medula espinal ou dos nervos motores periféricos.

Em particular, a invenção tem como objecto a utilização de um composto de fórmula I acima referida para a obtenção de um medicamento neuroprotector, destinado, nomeadamente, ao tratamento de patologias ou traumatismos ligados à degenerescência ou morte dos neurónios, entre os mamíferos (em geral doentes) atingidos por patologias ou traumatismos deste género. A invenção tem, mais especificamente, como objecto a utilização de um comporto de fórmula I para a obtenção de um medicamento destinado ao tratamento das amiotrofias espinais infantis e escleroses laterais amiotróficas. A invenção descreve ainda a utilização de um composto de fórmula I acima referida para a obtenção de um medicamento destinado ao tratamento das patologias onde a sobreactivação dos receptores GABAa, (por exemplo, no caso da presença de neuroesteróides como a alopregnanolona e/ou a tetra-hidrodeoxicorticosterona), pode ter um efeito nefasto, como as epilepsias sensíveis aos esteróides, a intoxicação alcoólica, a aprendizagem cognitiva, a sensibilidade dolorosa ou as perturbações do sono. Esta sobreactivação dos receptores GABAa, pode caracterizar-se por efeitos inibidores ou efeitos excitantes. 21 A realização destes medicamentos compreende habitualmente a administração nestes mamíferos de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula I e, em particular, da oxima de colest-4-en-3-ona, em especial para aumentar a sobrevivência dos neurónios ou favorecer o crescimento axonal. A invenção tem como objecto tanto a disponibilização de novos derivados da 4-colesten-3-ona como outros derivados da 4-colesten-3-ona com excepção dos que possam ter sido descritos no estado da técnica. Excluem-se, assim, os descritos na literatura.

As condições preferenciais acima descritas de realização dos medicamentos de fórmula I aplicam-se igualmente a outros objectos da invenção acima referidos, nomeadamente às composições, novos derivados, utilizações e inversamente.

Os exemplos que se seguem ilustram o presente pedido de patente. EXEMPLO 1

Preparou-se uma suspensão correspondente à fórmula

Oxima de colest-4-en-3-ona 20 mg por ml

Excipiente: Emulsão oleosa EXEMPLO 2

Prepararam-se cápsulas moles de fórmula 22

Oxima de colest-4-en-3-ona 250 mg

Excipiente: quantidade suficiente para uma 750 mg cápsula terminada de EXEMPLO 3: Oxima de 1, 4-colestadien-3-ona (R=R1)

Num balão de 100 ml, dissolvem-se 5 g de 1,4-colestadien-3-ona (13 mmol) em 50 ml de piridina, e acrescentam-se 5 g de cloridrato de hidroxilamina. A agitação é mantida durante 24h à temperatura ambiente e evapora-se o solvente a pressão reduzida. Adiciona-se água e, em seguida, acetato de etilo, a fim de efetuar uma extracção. A fase orgânica é lavada com uma solução aquosa acidificada (HC1 1%). O acetato de etilo é evaporado a pressão reduzida. Obtém-se um pó branco com um rendimento superior a 50%.

Análise - Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massa (Electrospray®) - Condições da cromatografia liquida de alto desempenho:

Coluna: Macherey-Nagel - Nucleosil® 300-6 C4 -150x4,6 mm

Gradiente: água (+0,05% TFA) / acetonitrilo (+0,05% ácido trifluoroacético) t= 0 min : 60% acetonitrilo, 40% H20 t= 6 min : 100% acetonitrilo, 0% H20 23

Depois permanece-se 5 min a 100% de acetonitrilo

Tempo de retenção: 5 min 60 segundos {M+H}+ =

Pico detectado em espectrometria de massa 398 EXEMPLO 4: Oxima de 4,24-colestadien-3-ona (R = R2)

Num balão de 10 ml, dissolvem-se 100 mg de 4,24-colestadien-3-ona (0,26 mmol) em 5 ml de piridina, e adicionam-se em seguida 100 mg de cloridrato de hidroxilamina. A agitação é mantida durante 24h à temperatura ambiente e evapora-se o solvente sob pressão reduzida. Adiciona-se água e, em seguida, acetato de etilo, a fim de efetuar uma extração. A fase orgânica é em seguida lavada com uma solução aquosa acidificada (HC1 1%). O acetato de etilo é evaporado a pressão reduzida. Obtém-se um pó branco com um rendimento superior a 50%.

Análise - Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massa (Electrospray®) - Pico detectado em espectrometria de massa: {M+H}+=398 EXEMPLO 5: Oxima de 4,22-colesiadien-3-ona (R=R4)

Num balão de 10 ml, dissolvem-se 10 mg de 4,22-colestadien-3-ona (0, 026 mmol) em 5 ml de piridina, e adicionam-se em seguida 100 mg de cloridrato de hidroxilamina. A agitação é mantida durante 24h à temperatura ambiente e evapora-se o solvente a pressão reduzida. Adiciona-se água e, em seguida, acetato de etilo, a fim de efetuar uma extracção. A fase orgânica é seguidamente lavada com uma solução aquosa acidificada (HC1 1%) . 0 acetato de etilo é evaporado a pressão reduzida. Obtém-se um pó branco com um rendimento superior a 50%.

Análise - Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massa (Electrospray®) - Pico detectado em espectrometria de massa : {M+H}+ =398 EXEMPLO 6: Oxima de 4-stigmast-en-3-ona, (R = R3)

Num balão de 50 ml, dissolvem-se 100 mg de 4-stigmast-en-3-ona (0,24 mmol) em 10 ml de piridina, e adicionam-se em seguida 100 mg de cloridrato de hidroxilamina. A agitação é mantida durante 24h à temperatura ambiente e evapora-se o solvente a pressão reduzida. Adiciona-se água e, em seguida, acetato de etilo, a fim de efetuar uma extracção. A fase orgânica é seguidamente lavada com uma solução aquosa acidificada (HC1 1%) . O acetato de etilo é evaporado a pressão reduzida. Obtém-se um pó branco com um rendimento superior a 50%.

Análise - Cromatografia líquida/Espectrometria de massa (Electrospray®) - Pico detectado em espectrometria de massa : {M+H}+=428 25 EXEMPLO 7: Oxima de 4,6,22-Ergosta-trien-3-ona (R = R6)

Num balão de 50 ml, dissolvem-se 100 mg de 4,6,22-Ergosta-trien-3-ona (0,25 mmol) em 10 ml de piridina, e adicionam-se em seguida 100 mg de cloridrato de hidroxilamina. A agitação é mantida durante 24h à temperatura ambiente e evapora-se o solvente a pressão reduzida. Adiciona-se água e, em seguida, acetato de etilo, a fim de efectuar uma extracção. A fase orgânica é seguidamente lavada com uma solução aguosa acidificada (HC1 1%). O acetato de etilo é evaporado a pressão reduzida. Obtém-se um pó branco com um rendimento superior a 50%.

Análise - Cromatografia Liguida/Espectrometria de Massa (Electrospray®) - Pico detectado em espectrometria de massa: {M+H}+=410 EXEMPLO 8: Oxima de 1,4,6-Colesta-trien-3-ona (R = Rl)

Num balão de 50 ml, dissolvem-se 100 mg de 1, 4,6-Colesta-trien-3-ona (0,26 mmol) em 10 ml de piridina, e adicionam-se em seguida 100 mg de cloridrato de hidroxilamina. A agitação é mantida durante 24h à temperatura ambiente e evapora-se o solvente a pressão reduzida. Adiciona-se água e, em seguida, acetato de etilo, a fim de efectuar uma extracção, e a fase orgânica é seguidamente lavada com uma solução aguosa acidificada (HC1 1%). O acetato de etilo é evaporado a pressão reduzida. Obtém-se um pó branco com um rendimento superior a 50%. 26

Análise - Cromatografia Líquida/Espectometria de massa (Electrospray®) - Pico detectado em espectrometria de massa : {M+H}+ =396 ESTUDO FARMACOLÓGICO Testámos os seguintes compostos de fórmula I:

Composto N° 1 2 3 4 5

Oxima de colest-4-en-3-ona descrita em Gamma irradiation of cholestenone oximes. Uenseren, Envare. Cekmece Nucl. Res. Train. Cent., Istanbul, Turk. Avail. INIS. Report (1976), (CNAEM-R-157), 21 pp. From: INIS Atomindex 1977, 8 (6), Abstr. No. 295540 . Composto do exemplo 3 Oxima de colestan-3-ona disponível comercialmente em Sigma-Aldrich Colest-4,24-dien-3-ona descrita em Chemical synthesis of cholest-5,7,24-trien-3béta-ol and demonstration of its conversion to cholesterol in the rat. Scallen, Terence J. Univ. of Minnesota,Minneapolis, Biochemical and Biophysical Research Communications (1965), 21(2), 149-55. Colest-4,22-dien-3-ona descrita em 3-Keto-A4-steroids from 3-hidroxi-ène-4 (or ène-5)-steroids. Yamanaka, Toru; Imai, Takashi. (Takasago Perfumery Co., Ltd., Japan). JP 52116456 19770929 Showa.. Application: JP 76-32979 19760325. CAN 88:136852 27 ΑΝ 1978:136852 6 1 8 9

Composto do exemplo 4 Composto do exemplo 5 Composto do exemplo 6 5-beta-hidroxi-colestan-3-ona disponível 10 11 12 13 comercialmente em Sigma-Aldrich 5-alfa-hidroxi-colestan-3-ona disponível comercialmente em Sigma-Aldrich 5-alfa-colest-6-en-3-ona disponível comercialmente em Sigma-Aldrich 24-metilcolest-4,6,22-trien-3-ona descrita em Preparation of 3-bétahidroxi-(24R)-methylcholest-5-ene. Khripach, V. A.; Zhabinskii, V. N.; Zhemosek, E. V.; Lakhvich, F. A. (Institute of Bioorganic Chemistry, Academy of Sciences, Belorussian S.S.R., USSR). U.S.S.R. (1990), et SU 1594181 19900923: SU 88-4612746 19881201. CAN 114:102558 AN 1991:102558 Oxima de colest-5-en-3-ona descrita em Gamma irradiation of cholestenone oximes. Uenseren, Envare. Cekmece Nucl. Res. Train. Cent. Istanbul, Turk. Avail. INIS. Report (1976), (CNAEM-R-157), 14 21 pp. Oxima de colest-4,6-dien-3-ona descrita em Azasteroid from cholesta-4,6-dien-3-one. Ahmad, MohammedS.; Siddiqui, A. H.; Shafiullah; Logani, S. C. Aligarh Muslim Univ., Aligarh, índia. Australian Journal of Chemistry (1969), 22(1), 271-4. Composto do exemplo 7 28 15 16 Oxima de 5-alfa-colest-l-en-3-ona descrita em Polyphosphoric acid-catalyzed Beckmann rearrangement of 3-keto-steroid oximes. Kobayashi, Masaru; Shimizu, Yuzuru; Mitsuhashi, Hiroshi. Fac. Pharm. Sei., Hokkaido Univ., Sapporo, Japan. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (1969), 17 (6), 1255-60. 17 Composto do exemplo 8 1. Efeitos dos compostos de fórmula I sobre a sobrevivência dos motoneurónios

Para pôr em evidência a ação neuroprotectora dos compostos de fórmula I, a requerente estudou a sua atividade num modelo in vitro de privação trófica de motoneurónios de ratos. Seria útil consultar o pedido de patente WO 0142784 da requerente, sobre a cultura dos motoneurónios de medula espinal.

Disseca-se a medula espinal de embriões E14 de rato, e a parte ventral é dissociada por trituração após tripsinização. Os motoneurónios são separados das outras células espinais através de um método conhecido (Camu et al, 1993, Purification of spinal motoneurons from chicken and rat embryos by immunopanning. In «Immunoselection Strategies for Neural cell culture», Neuroprotocols: A companion to Methods in Neurosciences 2, 191-199; Henderson et al., 1993, Neutrophins promote motor neuron survival and are present in embryonic limb bud. Nature 363 (6426) :266-70) . As células são centrifugadas em gradiente de densidade. Os motoneurónios são enriquecidos na fracção das grandes células (as menos 29 densas). As células desta fração são incubadas com um anticorpo anti-p75, um antigénio de superfície presente nos motoneurónios. Adicionam-se anticorpos secundários ligados a esferas magnéticas, e a mistura de células é passada através de uma coluna num iman (Arce et al, 1999). Apenas os motoneurónios são retidos: a sua pureza é da ordem dos 90%.

Os motoneurónios são semeados em fraca densidade em poços de cultura sobre um substracto de poliornitinelaminina num meio neurobasal suplementado de acordo com Raoul et al, 1999, Programmed cell death of embryonic motoneurons triggered through the Fas death receptor. J Cell Biol 147(5):1049-62. Em cada série são incluídos controlos negativos (ausência de factores tróficos) e positivos (em presença de BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) a 1 ng/ml, GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor) a 1 ng/ml e CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor) a 10 ng/ml, comercializados pela firma americana PEPROTECH, Inc. e a firma Sigma-Aldrich.

Os compostos a testar são adicionados 60 minutos após a sementeira, e as culturas são mantidas a 37 "C, a 5% de C02, durante 3 dias.

Os motoneurónios têm uma tendência espontânea para morrer na ausência de factores neurotróficos (Pettmann et Henderson, 1998, Neuronal cell death. Neuron 20(4):633-47). Após 3 dias, a sobrevivência é avaliada por uma medição de fluorescência após incubação das células em presença de calceína, que se torna fluorescente nas células vivas.

Após 3 dias em cultura a 31° C, a 5% de C02, e em humidade saturante, até 50% dos motoneurónios semeados inicialmente 30 sobrevivem no meio suplementado com factores neurotróficos, ao passo que menos de 15% dos motoneurónios sobrevivem em meio basal isoladamente. A actividade dos compostos a testar foi avaliada pela sua capacidade de impedir a morte dos motoneurónios quando adicionados ao meio neurobasal por comparação com a sobrevivência dos motoneurónios em meio suplementado com factores neurotróficos.

Os compostos de fórmula I de acordo com a invenção demonstraram uma actividade numa concentração capaz de permitir uma melhor taxa de sobrevivência dos motoneurónios no meio basal. Esta taxa de sobrevivência é expressa por um valor, o rácio. Se o rácio for superior a 0, o efeito dos compostos é positivo na sobrevivência dos motoneurónios.

Os resultados obtidos são os seguintes:

Composto N° Concentração em μΜ Rácio 1 5 1 2 5 0,6 6 5 LO O 7 6 0,25 8 10 0,3 15 5 0,2 17 5 0,3 9 1 0,5

Devido ao seu efeito trófico sobre os motoneurónios espinais, os compostos de fórmula I de acordo com a invenção mostram-se 31 assim úteis como medicamento, nomeadamente no tratamento das amiotrofias, em particular no tratamento da esclerose lateral amiotrófica ou das amiotrofias espinais infantis, e no tratamento dos traumatismos da medula espinal. 2. Efeitos dos compostos de fórmula I sobre a neuroprotecção

Efectua-se uma axotomia do nervo facial em ratos recém-nascidos, com 2-3 dias de idade. Os animais recebem a oxima de colest-4-en-3-ona 4 horas antes da secção unilateral do nervo e, em seguida, diariamente durante 5 dias, por via subcutânea. Sete dias após a secção do nervo, os animais são anestesiados e, em seguida, fixados por perfusão intracardiaca de paraformaldeido. 0 cérebro é então retirado e inserido em parafina. A análise histológica de secções seriadas de 7ym do núcleo facial, coloridas com violeta de cresil, permite contar o número de motoneurónios do lado intacto, bem como do lado do nervo seccionado (Casanovas et al., Prevention by lamotrigine, MK-801 and N omega-nitro-L-arginine methyl ester of motoneuron cell death after neonatal axotomy, Neuroscience, 1996, 71, 313-325).

Os resultados obtidos são os seguintes: A sobrevivência dos motoneurónios do núcleo facial entre os ratos recém-nascidos axotomizados e tratados com a oxima de colest-4-en-3-ona é aumentada até 40% com uma dose compreendida entre 3 e 100 mg/kg, consoante a via de administração, por comparação com o nervo não seccionado. 3. Efeitos dos compostos de fórmula I sobre a neuroprotecção 32

Realiza-se o esmagamento do nervo ciático em ratos adultos segundo o método descrito por Azzouz et al., Enhancement of mouse sciatic nerve regeneration by the long chain fatty alcohol, N-hexacosanol, Exp. Neurol., 1996, 138:189-97). Os animais recebem os compostos a testar no dia do esmagamento e, em seguida, todos os dias durante 4 semanas, e por via subcutânea. Todas as semanas, os animais são anestesiados para realizar um registo eletromiográfico no músculo da barriga da perna, após estimulação supramáxima do nervo ciático. Mede-se assim a amplitude, a duração e o atraso dos potenciais de acção desencadeados (CMAP). Quatro semanas após o esmagamento do nervo, os animais são sacrificados com uma injecção de uma dose letal de anestésico, e um segmento do nervo lesado é retirado, fixado em glutaraldeido 4% e inserido em resina. A análise histológica de secções seriadas, coloridas com azul de toluidina, permite uma contagem semi-automatizada das fibras degeneradas e não-degeneradas, bem como uma medição do tamanho dos axónios e da espessura da bainha de mielina das fibras não-degeneradas.

Os resultados obtidos são os seguintes: A administração da oxima de colest-4-en-3-ona reduz entre 20 e 40% o número de fibras degeneradas em comparação com os animais não tratados. De forma ainda mais espectacular, a regeneração das fibras nervosas é fortemente estimulada pelos compostos a testar desde a segunda semana após o esmagamento, com um efeito máximo observado quatro semanas após o esmagamento. Assim, quatro semanas após o esmagamento, a amplitude dos CMAP nos ratos tratados pelos compostos a testar com uma dose entre 0,3 e 30 mg/kg/dia, consoante a via de administração, é aumentada de 40 a 70%, e a velocidade de 33 em comparaçao com os condução nervosa melhorada de 30 a 50%, ratos não tratados. 4. Efeitos dos compostos de fórmula I sobre a protecção dos neurónios estriatais da morte induzida pela superexpressão de uma forma mutada da huntingtina

Preparam-se culturas primárias de neurónios estriatais conforme descrito na literatura (Primary striatal neuronal culture, Mao L. et al., Methods Mol Med., 2003, 79:379-86). As células são eletroporadas de acordo com o processo descrito por Raoul et al., (Motoneuron death triggered by a specific pathway downstream of Fas. potentiation by ALSlinked SOD1 mutations Neuron, 2002, 35:1067-83) antes da sementeira com um vector ou plasmídeo de expressão contendo um elemento promotor seguido do ADN codificador de uma forma truncada da huntingtina que compreende os 480 primeiros aminoácidos e 68 CAG (Saudou et al., Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions, Cell, 1998, 95:55-66). Um segundo vector de expressão contendo o ADN codificador da green fluorescent protein (GFP) é igualmente eletroporado e serve de gene repórter. O AND do plasmídeo que codifica a huntingtina foi preparado por purificação com cloreto de césio. O plasmídeo que contém a sequência GFP foi preparado em colunas Qiagen. A integridade das sequências de ADN é verificada por sequenciação, transfecção e western blotting. As células que sobrevivem à eletroporação são semeadas a uma densidade de 4000 células por poço de placas de 96 poços. A cultura realiza-se em meio Neurobasal (GIBCO) complementado com piruvato e B-27 (Beckton Dickinson). As células são mantidas em cultura durante 7 dias sem mudar o meio. 34

Os tratamentos com os compostos a testar realizam-se apenas após a sementeira a uma concentração final de 1 μΜ em 0,5% de dimetil-sulfóxido (DMSO). Os controlos positivos realizam-se por adição de BDNF a 5 ng/ml final. Os controlos negativos recebem apenas 0,5% de DMSO. A morte celular é avaliada após os 7 dias por contagem do número de células vivas que exprimem a GFP. A actividade dos compostos a testar foi avaliada pela sua capacidade de impedir a morte dos neurónios estriatais cultivados no meio neurobasal em comparação com a sobrevivência dos neurónios estriatais em meio suplementado com BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor).

Os resultados obtidos são os seguintes:

Composto N° Concentrações em μΜ Razão 1 1 0,3 4 1 0,2 9 1 0,5 11 1 0,3 12 1 0,3

Na concentração de 10“6 M, os compostos a testar mostram um efeito protector da morte celular induzida pela huntingtina mutada até 60% em comparação com as células tratadas pelo BDNF. 35

Devido ao seu efeito neuroprotector, os compostos de fórmula I de acordo com a invenção demonstram assim ser úteis como medicamentos destinados ao tratamento ou à prevenção das afecções neurodegenerativas, nomeadamente no tratamento das amiotrofias espinais, da esclerose lateral amiotrófica, no tratamento dos traumatismos da medula espinal e dos nervos periféricos e no tratamento da doença de Huntington. 5. Efeitos dos compostos de fórmula I sobre a potencialização dos receptores GABAÃ pelos esteroides

Realizaram-se experiências eletrofisiológicas in vitro com neurónios de rato (secções de hipocampo, neurónios sensíveis em cultura), como se segue:

As experiências são efectuadas com hipocampos retirados de ratos Sprague Dawley com 10 a 21 dias de idade. Os animais são sacrificados por decapitação, e o seu cérebro é rapidamente transferido para ACSF (Artificial Cerebro-Spinal Fluid) sem sódio (composição: KC1 2 mM, NaH2P04 1,2 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 0,5 mM, NaHC03 26 mM, glucose 11 mM, sacarose 250 mM) , mantido a uma temperatura de 4°C e arejado com carbogénio (mistura 95% 02, 5% C02). Os hipocampos são extraídos de cada hemisfério cerebral e em seguida cortados em secções de 300 μΜ de espessura por um «tissue chopper». As secções ficam a repousar em meio ACSF (composição: NaCl 126 mM, KC1 2 mM, NaH2P04 1,2 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 0,5 mM, NaHC03 26 mM, glucose 11 mM) à temperatura ambiente, pelo menos uma hora antes do registo. Seguidamente, utilizando uma pipeta, deposita-se uma secção sobre um sistema de registo multi-eléctrodo (MEA, MultiChannel Systems™, Germany) colocando-a de forma a cobrir os 64 eléctrodos. Para evitar qualquer 36 modificação de posicionamento pelo fluxo de perfusão, coloca-se sobre a secção uma grelha carregada com um «U» em platina. 0 MEA é então rapidamente inserido no sistema de registo e a câmara infundida com o ACSF arejada com carbogénio; o meio da câmara é ligado à terra. 0 ACSF infundido, bem como o MEA, são mantidos a uma temperatura de 37°C. Um dos eléctrodos é seleccionado como eléctrodo de estimulação. Uma corrente de estimulação bifásica, com uma intensidade de 300 μΑ que dura 0,1 ms, é gerada a partir deste eléctrodo à razão de uma estimulação todos os 30 segundos. As respostas desencadeadas são visualizadas simultaneamente ao nivel dos outros 59 eléctrodos do MEA. Os axónios dos colaterais de Schaeffer são estimulados em CA3. Na região CAI, 6 a 12 eléctrodos são seleccionados para registar os potenciais de campo que correspondem à soma das variações dos potenciais pós-sinápticos dos neurónios situados na proximidade de cada eléctrodo. As moléculas testadas são dissolvidas no meio ACSF (a concentração final em DMSO é ^ 0,1%) e transportadas para a secção graças ao sistema de perfusão.

Os neurónios sensitivos de rato são cultivados 1 a 2 dias e, em seguida, registados com a técnica de patch-clamp, conforme descrito em De Roo M. et al. (Dehydroepiandrosterone potentiates native ionotropic ATP receptors containing the P2X2 subunit in rat sensory neurones, J Physiol, 2003, 552:59-71).

Os resultados obtidos são os seguintes:

Sobre as secções do hipocampo, uma pequena fracção dos potenciais pós-sinápticos de campo registados na região CAI corresponde a uma transmissão GABAa excitadora: ela é 37 bloqueada por antagonistas clássicos dos receptores GABAa (20 μΜ de bicuculina ou 50 μΜ de picrotoxina) e potencializada por moduladores alostéricos positivos dos receptores GABAa: benzodiazepina (1-10 μΜ de Diazepam) e esteroides (10-1000 nM de alopregnanolona ou tetra-hidrodeoxicorticosterona) . O efeito potenciador dos esteroides desaparece quando os receptores GABAa são dessensibilizados pela adição de uma concentração saturante de GABA (10 mM). O efeito excitador do GABA está ligado à passagem dos iões hidrogenocarbonato (HCC>3~) através dos receptores GABAa.

Nos neurónios sensitivos registados em patch-clamp, são desencadeadas correntes abrindo selectivamente os receptores GABAa destes neurónios pela aplicação rápida de um antagonista GABAA-selectivo, a isoguvacina. As correntes de cloro assim desencadeadas são bloqueadas pela bicuculina e potenciadas pela alopregnanolona.

Os resultados mostram que a oxima de colest-4-en-3-ona (testada apenas até 10 μΜ) não tem efeito sobre os receptores GABAa (secção de hipocampo ou neurónios sensitivos). Por outro lado, a oxima de colest-4-en-3-ona consegue bloquear o efeito de moduladores alostéricos positivos (alopregnanolona ou tetra-hidrodeoxicorticosterona) dos receptores GABAa, e isto de maneira dose-dependente e em concentrações equivalentes àquelas onde se observam os efeitos neurotróficos in vitro.

Os compostos de fórmula I têm portanto um efeito «protector» em todas as patologias onde a sobreativação dos receptores GABAa, devido à presença de alopregnanolona e/ou de tetra-hidrodeoxicorticosterona, pode ter um efeito nefasto, quer 38 seja sob a forma de efeitos inibidores ou de efeitos excitadores mediados pelos receptores GABAa.

Estudo toxicológico A administração no rato, em particular da oxima da colest-4-en-3-ona, por via oral, subcutânea, intraperitoneal e intravenosa, em doses até 300 mg/kg/dia, por tratamento com administração quotidiana que pode prolongar-se até 28 dias, não mostrou toxicidade significativa.

No macaco, a administração por via oral de doses diárias crescentes até 1500mg/kg, ao longo de um período de 10 dias, não revelou qualquer toxicidade. 10-08-2012 39

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de fórmula I

   na qual X representa um grupo =N-OH, R representa um grupo escolhido entre

   RI R2 R3 = R4 R6 = R5 = 1 A representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com B uma ligação carbono-carbono, B representa um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxi ou em conjunto com A uma ligação carbono-carbono, C representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, D representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com C uma ligação carbono-carbono, E representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com F uma ligação carbono-carbono, F representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com E uma ligação carbono-carbono, ou um dos seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis, para a sua utilização num método de tratamento terapêutico do corpo humano ou animal, ou seja, como medicamento.
2. 2. Um composto de acordo com a reivindicação 1 para a sua utilização de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de, na fórmula I, A representar em conjunto com B uma ligação carbono-carbono, C, D representarem um átomo de hidrogénio, E, F representar um átomo de hidrogénio ou em conjunto uma ligação carbono-carbono e R significar Rl, ou seja, a oxima de colest-4-en-3-ona ou a oxima de 1,4-colestadien-3-ona, ou um dos seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis, para a sua utilização como medicamento.
3. 3. Um composto de acordo com a reivindicação 1 para a sua utilização de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de, na fórmula I, A representar em conjunto com B uma 2 ligação carbono-carbono, C, D representar um átomo de hidrogénio, E, F representarem um átomo de hidrogénio e R significar R2 ou R3 ou R4, ou um dos seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis, para a sua utilização como medicamento.
4. 4. Un composto de acordo com a reivindicação 1 para a sua utilização de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de, na fórmula I, A representar em conjunto com B uma dupla ligação, C representar em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, E, F representar um átomo de hidrogénio e R significar RI ou R6, ou um dos seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis, para a sua utilização como medicamento.
5. 5. Um composto de acordo com a reivindicação 1 para a sua utilização de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de, na fórmula I, A representar em conjunto com B uma ligação carbono-carbono, C representar em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, E representar em conjunto com F uma ligação carbono-carbono e R significar Rl, ou um dos seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis, para a sua utilização como medicamento.
6. 6. Um composto de acordo com a reivindicação 1 para a sua utilização de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de, na fórmula I, E representar em conjunto com F uma ligação carbono-carbono, C, D, A, B, representar um átomo de hidrogénio e R significar Rl, ou um dos seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis, para a sua utilização como medicamento.
7. Utilização de um composto de fórmula I 3 7. (!) A C na qual X representa um grupo =N-OH ou um átomo de oxigénio, e R representa um grupo escolhido entre

   Ri R2 R3 = R4 R6 = R5 = 4 A representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com B uma ligação carbono-carbono, B representa um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxi ou em conjunto com A uma ligação carbono-carbono, C representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, D representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com C uma ligação carbono-carbono, E representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com F uma ligação carbono-carbono, F representa um átomo de hidrogénio ou em conjunto com E uma ligação carbono-carbono, ou um dos seus sais de adição com os ácidos farmaceuticamente aceitáveis, para a obtenção de um medicamento destinado a ser utilizado como neuroprotector.
8. 8. Utilização, de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo facto de o medicamento neuroprotector se destinar ao tratamento de uma doença neurodegenerativa.
9. 9. Utilização, de acordo com a reivindicação 7 ou 8 caracterizada pelo facto de o medicamento neuroprotector se destinar ao tratamento de uma doença neurodegenerativa escolhida entre a doença de Huntington, as doenças crónicas neurodegenerativas, hereditárias ou esporádicas, as lesões neuronais ligadas ao envelhecimento, as neuropatias periféricas hereditárias ou lesionais, a doença de Charcot-Marie-Tooth, as neuropatias diabéticas ou induzidas pelos tratamentos anticancerigenos, os traumatismos do cérebro, dos nervos periféricos ou da medula espinal, as isquemias do 5 cérebro ou da medula espinal, as degenerescências hereditárias, lesionais ou ligadas ao envelhecimento dos neurónios sensoriais da visão ou as degenerescências do nervo óptico, as degenerescências hereditárias, traumáticas ou ligadas ao envelhecimento dos neurónios sensoriais do ouvido, as atrofias lobares e as demências vasculares, as doenças e traumatismos ligados à degenerescência dos motoneurónios, as amiotrofias espinais, a esclerose em placas e os traumatismos da medula espinal ou dos nervos motores periféricos.
10. 10. Utilização de acordo com uma das reivindicações 7 a 9 caracterizada pelo facto de o medicamento neuroprotector se destinar ao tratamento de uma doença neurodegenerativa escolhida entre as patologias ou traumatismos ligados à degenerescência ou à morte dos neurónios, nos mamíferos atingidos por essas patologias ou traumatismos.
11. 11. Utilização de acordo com uma das reivindicações 7 a 10 caracterizada pelo facto de o medicamento neuroprotector se destinar ao tratamento das amiotrofias espinais infantis.
12. 12. Utilização de acordo com uma das reivindicações 7 a 10 caracterizada pelo facto de o medicamento neuroprotector se destinar ao tratamento das escleroses laterais amiotróficas.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo facto de o medicamento neuroprotector se destinar ao tratamento da sensibilidade dolorosa ou das dores neuropáticas crónicas.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo facto de o medicamento neuroprotector se destinar ao tratamento das lesões traumáticas do sistema nervoso. 6
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo facto de o medicamento neuroprotector se destinar ao tratamento das epilepsias sensíveis aos esteroides, das perturbações do sono ou da intoxicação alcoólica.
16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo facto de o medicamento neuroprotector se destinar ao tratamento da aprendizagem cognitiva ou das perturbações da memória.
17. 17. Utilização de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo facto de o medicamento neuroprotector se destinar ao tratamento da ansiedade ou da depressão.
18. 18. Utilização de acordo com uma das reivindicações 7 a 17 caracterizada pelo facto de o composto de fórmula I de acordo com a reivindicação 1 ser a oxima de colest-4-en-3-ona.
19. 19. Un composto de fórmula I

    (D na qual X representa um radical =N-OH e - A representa em conjunto com B uma ligação carbono-carbono, C, D representa um átomo de hidrogénio, E representa em conjunto com F uma ligação carbono-carbono e R significa Rl, ou 7 - A representa em conjunto com B uma ligação carbono- carbono, C, D representa um átomo de hidrogénio, E, F representa um átomo de hidrogénio e R significa R2 ou R4, ou - A representa em conjunto com B uma ligação carbono- carbono, C representa em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, E, F representa um átomo de hidrogénio e R significa R6, ou - A representa em conjunto com B uma ligação carbono- carbono, C representa em conjunto com D uma ligação carbono-carbono, E representa em conjunto com F uma ligação carbono-carbono e R significa Rl, assim como os seus sais de adição com os ácidos inorgânicos ou orgânicos.
20. 20. Uma composição farmacêutica caracterizada pelo facto de ela conter como principio activo pelo menos um dos medicamentos tais como os definidos na reivindicação 1, assim como um excipiente farmaceuticamente aceitável.
21. 21. Une composição farmacêutica caracterizada pelo facto de ela conter como princípio activo pelo menos um dos medicamentos tais como os definidos na reivindicação 2, assim como um excipiente farmaceuticamente aceitável.
22. 22. Une composição farmacêutica caracterizada pelo facto de ela conter como princípio activo pelo menos um dos medicamentos tais como os definidos numa qualquer das reivindicações 3 a 6, assim como um excipiente farmaceuticamente aceitável. 8
23. 23. Uma composição farmacêutica de acordo com uma qualquer de o óleo das reivindicações 21 a 22, caracterizada pelo facto excipiente farmaceuticamente aceitável ser pelo menos um vegetal ou animal. 10-08-2012 9

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    Date Pour totrtes quesíions sur cetle comniunlcation ; Tei. +31 (0)70 340 4S 00 24.05.12 Hétéranac Demande n°. í BfeVet Ν°. BiM 000111 EP 04717660.7 - 1216 /1601363 Demartdeur / Tfttíiaii'& Trophos Déclsíon reiative â la dèlivrance efun brevet européen en application de farticle 97(1) GBE La demande de brevet européen No:. 04717660.7 ayant été dúment examinée, ii esí prooédé, pour Fensemble des Etats contraotants désignés à ía dèlivrance d’úá brevet européen ayant pour titre ceSóí qui %ur® dans la noíifieation en date du 26.01.12 émis© en application dé ia règle 71 (3) OBE et dans !a versio n oo nform e βαχ doeu menta indíqués dans cette nótífioation . Mo de brevet ; 1601363 Date de dépôt : 05.03.04 Priorité revendiquée : 11.03.03/FRA 0302992 28;G9G3/FRA 0311324 Les Etats contraotants et te(s) Titulaire(s) du brevet : AT BE BG CH CYCZ DE DK EE ES Fl FR GB GR HU IE IT Ll LU MG NL PL PT RO SE SI SK TR Trophos Pare Scientifique Luminy, Case 931 13288 Marseilfe Cedex 9/FR La décisiorj prend etfet au jou-r de la pubiicatãon au Bulletin europeen des brevets de la mentipn de la dèlivrance (art. 97(3) CBÊ). Date de publication de eette mention au Bulletin européen des Brevets No 12/25 du 20.06.12. Bayrak S Hoff P Division d'examen Sazzamni R

    Letlre recommandée OÊ3 Form 20CSA ífíiò? (17/05/12} au courrier interne : 18.05.12