PT1421200E - Ensaios de pcr multiplex fluorescente para hpv usando múltiplos fluoróforos - Google Patents
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Description
ΡΕ1421200 1
DESCRIÇÃO
"ENSAIOS DE PCR MULTIPLEX FLUORESCENTE PARA HPV USANDO MÚLTIPLOS FLUORÓFOROS"
CAMPO DO INVENTO 0 presente invento está relacionado, de um modo geral, com ensaios baseados em PCR para detectar a presença de subtipos de papilomavírus humano (HPV) em amostras clinicas. Mais especificamente, está relacionado com um ensaio de PCR multiplex fluorescente, em que múltiplos fluoróforos são usados para detectar simultaneamente uma pluralidade de loci de HPV num único tubo de reacção de PCR.
FUNDAMENTO DO INVENTO
Existem mais de 80 tipos de papilomavírus humano (HPV) que causam uma larga variedade de fenótipos biológicos, desde as verrugas proliferativas benignas até aos carcinomas malignos (para revisão, ver McMurray et al., Int. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001)). HPV6 e HPV11 são os tipos mais vulgarmente associados a verrugas benignas, enquanto que HPV16 e HPV18 são os tipos de risco elevado mais frequentemente associados a lesões malignas. A determinação do tipo específico de HPV numa amostra clínica 2 ΡΕ1421200 é, pois, crítico para a previsão do risco de desenvolvimento de doença associada a HPV. Vários métodos baseados em ácidos nucleicos têm sido utilizados para identificar e quantificar tipos específicos de HPV em amostras clínicas, tais como a detecção de ácido nucleico virai por hibridação in situ, análise de transferências Southern, captura de híbridos ou reacção em cadeia da polimerase (PCR). Os métodos baseados em PCR muitas vezes envolvem amplificação de uma única sequência alvo específica de HPV seguido de transferência para membrana do amplicão resultante e hibridação com uma sonda oligonucleotídica marcada radioactivamente.
Outros métodos exploram a elevada homologia entre genes de HPV específicos de diferentes subtipos, através da utilização de sequências iniciadoras de consenso comerciais capazes de amplificar por PCR numerosos subtipos de HPV presentes numa amostra. A presença de um subtipo específico de HPV é então identificada usando uma sonda oligonucleotídica específica de subtipo. Ver, e.g., Kleter et ai., Journal of Clinicai Microbiology 37(8): 2508-2517 (1999); Gravitt et al., Journal of Clinicai Microbiology 38(1):357-361 (2000) . De forma semelhante, os ensaios que utilizam sequências iniciadoras de PCR degeneradas tiram partido da homologia entre diferentes subtipos de HPV, permitindo a detecção de um maior número de tipos de HPV do que os métodos que utilizam séries de sequências iniciadoras específicas. Ver, e.g. Harwood et al., Journal of Clinicai 3 ΡΕ1421200
Microbiology 37(11):3545-3555 (1999). Tais ensaios também requerem experimentação adicional para identificar subtipos especificos de HPV.
Os métodos de PCR atrás descritos podem ser associados a vários problemas. Por exemplo, diferenças de eficiência da reacção entre subtipos de HPV podem resultar na amplificação desproporcionada de alguns subtipos relativamente a outros. Ainda, o equilíbrio de amplificação será desviado para os subtipos que existem em números de cópias mais elevados numa amostra, os quais consumirão os componentes da reacção de PCR, tornando assim menos provável a amplificação subtipos de HPV menos abundantes.
Está igualmente descrito na bibliografia um ensaio baseado em PCR fluorogénico com exonuclease 5' (Taq-Man PCR) que permite a detecção de produtos de PCR em tempo real e elimina a necessidade de radioactividade. Ver, e.g., Patente U.S. N° 5538848; Holland et ai., Proc. Natl Acad. Sei. USA 88:7276-7280 (1991). Este método utiliza uma sonda marcada, compreendendo um repórter fluorescente (fluoró-foro) e um abafador, o qual hibrida com o DNA alvo entre as sequências iniciadoras do PCR. A excitação do fluoróforo resulta na libertação de um sinal de fluorescência pelo fluoróforo que é abafado pelo abafador. Os amplicões podem ser detectados pela actividade de exonuclease 5'-3' da DNA polimerase Taq, a qual degrada o DNA em cadeia dupla encontrado durante a extensão da sequência iniciadora de PCR, libertando assim o fluoróforo da sonda. Depois, o 4 ΡΕ1421200 sinal fluorescente deixa de ser abafado e a acumulação do sinal fluorescente, que está directamente correlacionado com a quantidade de DNA alvo, pode ser detectado em tempo real com um fluorómetro automático.
Os ensaios de PCR Taq-Man foram adaptados à detecção de subtipos de HPV. Swan et al. (Journal of Clinicai Microbiology 35(4) :886-891 (1997)) descrevem um ensaio com sonda fluorogénica que utiliza sequências iniciadoras específicas de tipo de HPV, que amplificam uma porção do gene Ll, conjuntamente com sondas específicas de tipo. 0 ensaio de Swan et al. mede o sinal fluorescente no final de um número fixo de ciclos de PCR (leitura final) e não em tempo real.
Josefsson et al. (Journal of Clinicai Micro-biology 37(3) :490-96 (1999)) descrevem um ensaio Taq-Man que tem como alvo uma porção altamente conservada do gene EI conjuntamente com sondas especificas de tipo marcadas com diferentes corantes fluorescentes. Uma série de tipos de HPV foram amplificados usando uma mistura de sequências iniciadoras especificas e degeneradas. Josefsson et al. utilizaram até três sondas especificas de tipo por ensaio, as quais foram projectadas para detectar uma porção do gene EI de diferentes subtipos de HPV. Ao contrário do ensaio de Swan et al., Josefsson et al. mediram a acumulação de fluorescência em tempo real.
Tucker et al. (Molecular Diagnosis 6(1) :39-47 5 ΡΕ1421200 (2001)) descrevem um ensaio que tem como alvo uma região conservada da junção E6/E7. Tal como o ensaio de Josefsson, Tucker et al. empregaram a detecção em tempo real e sondas fluorescentes específicas de tipo. Tucker et al. também utilizaram PCR multiplex para detectar simultaneamente sequências alvo de HPV e os loci celulares de actina ou globina no mesmo tubo de reacção. O método atrás descrito tipicamente envolve o teste da presença de um único locus virai numa amostra de DNA, como seja o locus Ll. Uma desvantagem dos ensaios de um único locus é que o elevado grau de homologia entre genes de HPV específicos de um tipo de HPV para outro conduz a uma ocorrência excessiva de resultados falsos positivos. Este nível de homologia torna difícil desenhar um ensaio de PCR que seja específico para um único tipo de HPV. É portanto necessário confirmar os resultados positivos testando a presença de vários loci de um único tipo de HPV. Posterior experimentação necessária para confirmar os resultados positivos é aborrecida e demorada. O estabelecimento do estádio de HPV numa amostra clinica para quatro tipos diferentes de HPV tipicamente consome 26-30 pessoa-hora.
Os ensaios de um único locus podem igualmente conduzir a resultados falsos negativos. Está bem estabelecido que a relação entre o genoma de HPV e o DNA cromossómico do hospedeiro pode mudar durante as múltiplas fases do processo tumorigénico (Para revisão, ver McMurray 6 ΡΕ1421200 et al., Int. J. Exp. Path. 82:15-33 (2001)). As lesões pré-malignas estão muitas vezes associadas a formas epissómicas de DNA de HPV, enquanto os tumores na fase mais tardia tipicamente possuem sequências de HPV integradas. Como resultado da integração correlacionada com fases avançadas de progressão da doença, a grelha de leitura aberta de genes específicos de HPV, tais como o gene Ll, podem ficar interrompidas. Tal interrupção das sequências de genes de HPV podem conduzir a resultados falsos negativos em ensaios que tenham como alvo a sequência interrompida.
Apesar do desenvolvimento dos ensaios de HPV atrás descritos, deverá ser vantajoso desenvolver um ensaio que seja altamente sensível e reprodutível e que necessite de menos pessoa-hora comparativamente com os métodos descritos na literatura.
SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento está relacionado com um ensaio de PCR multiplex fluorescente para a detecção da presença de um subtipo de HPV numa amostra, o qual usa múltiplos fluoróforos para detectar simultaneamente uma pluralidade de loci de HPV do mesmo subtipo de HPV.
Mais especificamente, o presente invento está relacionado com um método para a detecção da presença de um subtipo de papilomavírus humano (HPV) numa amostra contendo ácido nucleico compreendendo: 7 ΡΕ1421200 amplificação de ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e de uma pluralidade de série de oligonucleótidos para produzir uma pluralidade de amplicões de PCR; em que cada série de oligonucleótidos consiste (a) numa sequência iniciadora directa de PCR discriminatória que híbrida com uma primeira sequência de um subtipo de HPV, (b) uma sequência iniciadora reversa de PCR discriminatória que hibrida com uma segunda sequência do subtipo de HPV a jusante da primeira sequência e (c) uma sonda fluorescente marcada com uma molécula abafadora e um fluoróforo que emite energia num máximo de emissão único; a referida sonda hibrida com uma sequência do subtipo de HPV entre e a primeira e segunda sequências; em que cada série de oligonucleótidos hibrida especificamente com um amplicão diferente de HPV derivado do mesmo subtipo de HPV; permitindo que a referida polimerase de ácidos nucleicos digira cada uma das sondas fluorescentes durante a amplificação para dissociar o referido fluoróforo da referida molécula abafadora; detecção de uma alteração da fluorescência quando da dissociação do fluoróforo e do abafador, a alteração de fluorescência correspondendo à ocorrência de amplificação do ácido nucleico; e ΡΕ1421200 determinação de que a amostra é positiva para o subtipo de HPV se uma alteração da fluorescência for detectada em pelo menos dois máximos de emissão.
Numa realização preferida deste invento, cada uma das séries de oligonucleótidos, de entre a pluralidade de séries de oligonucleótidos, é especifica de um único gene do subtipo de HPV a ser detectado. Por outras palavras, cada uma das séries de oligonucleótidos do método do presente invento híbrida com sequências nucleotídicas derivadas de um único gene de HPV do mesmo subtipo. Por exemplo, as sequências iniciadoras oligonucleotídicas e a sonda de uma primeira série de oligonucleótidos híbrida com o gene E6, as sequências iniciadoras oligonucleotídicas e a sonda de uma segunda série de oligonucleótidos híbrida com o gene E7 e as sequências iniciadoras oligonucleotídicas e a sonda de uma terceira série de oligonucleótidos híbrida com o gene Ll. Como resultado, é criada uma pluralidade de amplicões de PCR em que cada amplicão de PCR é específico de um único gene de HPV do subtipo de HPV a ser detectado.
Numa realização alternativa deste invento, a sequência iniciadora de PCR discriminatória directa e a sequência iniciadora de PCR discriminatória reversa de pelo menos uma série de oligonucleótidos são específicas de um gene diferente do mesmo subtipo de HPV. Por exemplo, uma sequência iniciadora discriminatória directa hibrida com o gene E6 e uma sequência iniciadora discriminatória reversa 9 ΡΕ1421200 híbrida com o gene E7. Como resultado, pelo menos um amplicão de PCR compreende uma sequência de nucleótidos derivada de mais de um gene. A sonda oligonucleotídica específica do referido amplicão pode hibridar, por exemplo, com uma sequência de nucleótidos derivada do gene E6, uma sequência de nucleótidos derivada do gene E7 ou uma sequência de nucleótidos que cruza a fronteira E6/E7.
Numa realização preferida deste invento, o subtipo de HPV é seleccionado do grupo consistindo em: HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18.
Numa outra realização preferida do método do presente invento, o número de séries de oligonucleótidos é três e as séries de oligonucleótidos hibridam especif icamente com os genes E6, E7 e LI de HPV. Uma amostra é positiva para o subtipo de HPV a ser testado se dois ou três dos genes E6, E7 ou LI forem detectados.
Uma outra realização deste invento utiliza uma sonda oligonucleotídica compreendendo uma sequência de nucleótidos específica de um único tipo de HPV. A referida sonda oligonucleotídica pode ligar-se a amplicões específicos de HPV resultantes de amplificação por PCR de DNA virai usando sequências oligonucleotídicas específicas. Numa outra realização deste invento, a referida sonda oligonucleotídica compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo consistindo em: SEQ ID N0:3, SEQ ID N: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:15, SEQ ID 10 ΡΕ1421200 NO: 18, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:36. O presente invento também utiliza as referidas sondas oligonucleotidicas compreendendo ainda um fluoróforo e uma molécula abafadora. Numa realização preferida deste invento, o fluoróforo é seleccionado do grupo consistindo em: FAM, JOE e TET e o abafador não é fluorescente. Numa realização especialmente preferida deste invento, o abafador é BHQ1. O presente invento ainda utiliza um par de sequências iniciadoras para a amplificação por PCR de ácido nucleico de HPV, em que tanto as sequências iniciadoras de PCR directa como reversa são discriminatórias. Numa realização preferida do invento, as sequências nucleotidicas do par de sequências iniciadoras são seleccionadas do grupo consistindo em: SEQ ID NO:l e SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28 e SEQID NO: 29, SEQ ID NO:31 e SEQ NO:32 e SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:35.
Como aqui é usado, o termo "oligonucleótido" refere-se a oligómeros lineares de monómeros ou ligações naturais ou modificados, incluindo desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos e similares, capazes de se ligarem espe- 11 ΡΕ1421200 cificamente a um polinucleótido alvo através de um padrão regular de interacções monómero-a-monómero, tais como emparelhamento de bases do tipo Watson-Crick. Para fins deste invento, o termo oligonucleótido inclui sondas oligo-nucleotídicas e sequências iniciadoras oligonucleotidicas.
Tal como aqui é usado, o termo "sequência iniciadora" refere-se a um oligonucleótido que é capaz de actuar como um ponto de iniciação da síntese ao longo de uma cadeia complementar, quando colocado em condições nas quais é catalisada a síntese de um produto da extensão de uma sequência iniciadora que é complementar de uma cadeia de ácido nucleico. Tais condições incluem a presença de quatro trifosfatos de desoxirribonucleósidos diferentes e um agente indutor de polimerização, como seja DNA polimerase ou transcriptase reversa, num tampão adequado ("tampão" inclui componentes que são cofactores ou que afectam a força iónica, pH, etc.), e a uma temperatura adequada. Conforme é aqui empregue, uma sequência iniciadora oligo-nucleotídica pode ser natural, como é o caso do produto purificado da digestão com enzimas de restrição ou ser produzido sinteticamente. A sequência iniciadora é, de preferência, de cadeia simples para eficiência máxima na amplificação.
Conforme aqui é usado, "par de sequências iniciadoras" refere-se a duas sequências iniciadoras, uma sequência iniciadora directa e uma sequência iniciadora reversa, que são capazes de participar na amplificação por 12 ΡΕ1421200 PCR de um segmento de ácido nucleico, na presença de uma polimerase de ácido nucleico, para produzir um amplicão de PCR. As sequências iniciadoras que constituem um par de sequências iniciadoras podem ser especificas do mesmo gene de HPV, resultando num amplicão que consiste numa sequência de nucleótidos derivada de um único gene de HPV. Como alternativa, as sequências iniciadoras que constituem um par de sequências iniciadoras podem ser especificas de diferentes genes de HPV que residem em estreita proximidade um do outro dentro do genoma de HPV, produzindo assim amplicões que consistem numa sequência de nucleótidos derivados de mais de um gene.
Tal como aqui é usado, "único", em referência a fluoróforos do presente invento, significa que cada fluoróforo emite energia num máximo de emissão diferente relativamente a todos os outros fluoróforos usados no ensaio particular. A utilização de fluorófors com máximos de emissão únicos permite a detecção simultânea da energia de fluorescência emitida por cada um de vários de fluoróforos usados no ensaio particular.
Tal como aqui é usado, o termo "discriminatório", usado como referência às sequências iniciadoras e sondas oligonucleotídicas do presente invento, significa que as referidas sequências iniciadoras e sondas são especificas de um único subtipo de HPV. Inclui sequências iniciadoras e sondas de HPV especificas de um único subtipo de HPV, mas que partilham alguma homologia com outros subtipos de HPV. 13 ΡΕ1421200
Sequências iniciadoras e sondas "discriminatórias" do presente invento incluem os oligonucleótidos que não possuem homologia 3' com outros subtipos de HPV em pelo menos um nucleótido ou mais. Tal resíduo é único para o subtipo de HPV específico na posição específica e actua para discriminar o subtipo de HPV dos outros no alinhamento, sendo referido como "base discriminatória". 0 termo "discriminatório", na referência a oligonucleótidos não inclui sequências iniciadoras e sondas que sejam específicas de mais de um subtipo de HPV, i.e. as que partilham homologia total com mais de um subtipo de HPV.
Como aqui é usado, "amplicão" refere-se a um produto específico de uma reacção de PCR, que é produzido por amplificação de PCR a partir de uma amostra compreendendo ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e de um par de sequências iniciadoras específicas. Um amplicão pode consistir numa sequência nucleotídica derivada de um único gene de um único subtipo de HPV ou um amplicão pode consistir numa sequência nucleotídica derivada de mais de um gene de um único subtipo de HPV.
Tal como aqui é usado, "série de oligonucleótidos" refere-se a um grupo de um par de sequências iniciadoras oligonucleotídicas e uma sonda oligonucleo-tídica que hibridam com uma sequência nucleotídica específica de um único subtipo de HPV. A referida série de oligonucleótidos consiste em: (a) uma sequência iniciadora 14 ΡΕ1421200 directa discriminatória que híbrida com uma primeira sequência de um subtipo de HPV; uma sequência iniciadora reversa discriminatória que híbrida com uma segunda sequência do subtipo de HPV a jusante da primeira sequência e (c) uma sonda fluorescente marcada com um fluoróforo e um abafador, a qual híbrida com uma sequência do subtipo de HPV situada entre as sequências iniciadoras. Por outras palavras, uma série de oligonucleótidos consiste numa série de sequências iniciadoras de PCR específicas, capazes de iniciar a síntese de um amplicão específico de um único subtipo de HPV e uma sonda fluorescente que híbrida com o amplicão.
Tal como aqui é usado, "pluralidade" significa dois ou mais.
Como aqui é usado, "híbrida especificamente" em referência a séries de oligonucleótidos, sequências iniciadoras oligonucleotídicas ou sondas oligonucleotídicas, significa que as referidas séries de oligonucleótidos, sequências iniciadoras ou sondas hibridam com um único subtipo de HPV.
Conforme aqui usado, "gene" significa um segmento de ácido nucleico envolvido na produção de uma cadeia polipeptídica. Inclui ambas as sequências traduzidas (região codificadora) e sequências não traduzidas 5' e 3' (regiões não codificadoras) assim como sequências intervenientes (intrões) entre segmentos codificadores individuais 15 ΡΕ1421200 (exões). Para fins deste invento, o genoma de HPV tem nove genes: Ll, L2 e E1-E7.
Como aqui é usado, "locus" refere-se à posição num cromossoma em que reside o gene de uma caracteristica. 0 termo locus inclui qualquer um dos alelos de um gene especifico. Também inclui genes homólogos de diferentes subtipos de HPV. Por exemplo, os ensaios de PCR que detectam o gene Ll em HPV16 e HPV6 são ensaios de um único locus, apesar da detecção de sequências de diferentes subtipos de HPV. Pelo contrário, por exemplo, os ensaios que detectam o gene Ll e o gene EI de um único tipo de HPV são ensaios de múltiplos loci, mesmo apesar de ser detectado um único subtipo de HPV.
Tal como aqui é usado, "HPV" significa papiloma-vírus humano. "HPV" é um termo geral usado para referir qualquer subtipo de HPV, actualmente conhecido ou a ser subsequentemente descrito. emitida do
Tal como aqui é usado, "fluoróforo" refere-se a uma molécula repórter fluorescente que, quando excitada com um laser, lâmpada de tungsténio, mercúrio ou xenon ou um diodo que emite luz, liberta energia na forma de luz com um espectro definido. Através do processo de transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET), a luz emitida pelo fluóforo pode excitar uma segunda molécula cujo espectro de excitação se sobrepõe ao espectro de emissão do fluoróforo. A transferência da energia 16 ΡΕ1421200 fluoróforo para uma outra molécula abafa a emissão do fluoróforo. A segunda molécula é conhecida como molécula abafadora. 0 termo "fluoróforo" é aqui usado indiferentemente com o termo "repórter fluorescente".
Como aqui é usado "abafador" ou "molécula abafadora" refere-se a uma molécula que, quando ligada a uma sonda fluorescente compreendendo um fluoróforo, é capaz de aceitar a energia emitida pelo fluoróforo, abafando assim a emissão do fluoróforo. Um abafador pode ser fluorescente, o qual liberta a energia aceite como luz, ou não fluorescente, que liberta a energia aceite como calor, e pode ser ligada a qualquer posição ao longo do comprimento da sonda.
Tal como aqui é usado "abafador escuro" refere-se a um abafador não fluorescente.
Como aqui é usado, "sonda" refere—se a um oli-gonucleótido que é capaz de formar um estrutura em dupla cadeia com uma sequência num ácido nucleico alvo, devido à complementaridade de pelo menos uma sequência da sonda com uma sequência na região alvo, ou região a ser detectada. 0 termo "sonda" inclui um oligonucleótido como descrito atrás, com ou sem um fluoróforo e uma molécula abafadora ligados. 0 termo "sonda fluorescente" refere-se a uma sonda compreendendo um fluoróforo e uma molécula abafadora.
Como aqui é usado, "FAM" refere-se ao fluoróforo 6-carboxi-fluoresceina. 17 ΡΕ1421200
Como aqui é usado "JOE" refere-se ao fluoróforo 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína.
Como aqui é usado, "TET" refere-se ao fluoróforo 5-tetracloro-fluoresceína.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIGURA 1 mostra a sequência das sequências iniciadoras e sondas oligonucleotidicas usadas nas reacções de PCR TaqMan multiplex, as suas posições dentro da grelha de leitura aberta (A do codão de iniciação = 1) e a concentração final de cada oligo na reacção de PCR multiplex. AS seis sequências iniciadoras de cada tipo de HPV foram combinadas num lote de seis sequências iniciadoras concentradas (lOOx). Cada uma das sondas foi guardada como um lote concentrado (lOOx). FIGURA 2 mostra uma curva de concentração da sonda HPV16L1 TaqMan duplamente marcada com FAM. 0 ciclo de patamar médio (n=3) ± DP foi determinado aumentando e de proporcionalmente as concentrações da sonda HPV16L1 num volume de reacção de PCR TaqMan de 50 μΐ usando 100 cópias de plasmídeo HPV16L1 como DNA molde. As colunas com a mesma letra não são significativamente diferentes (p>0,05) baseado nas análises pós teste "ANOVA one-way" múltiplas comparações de Turkey. 18 ΡΕ1421200 FIGURA 3 mostra um curva de concentração de sonda HPV16L1 TaqMan duplamente marcada com FAM. 0 ARn (Rn-linha de base) médio (n = 3) ± DP foi determinado aumentando proporcionalmente as concentrações de sonda HPV16L1 num volume de reacção de PCR TaqMan de 50 μΐ, usando 100 cópias de plasmideo HPV16L1 como DNA molde. As colunas com a mesma letra não são significativamente diferentes (p>0,05) baseado nas análises pós teste "ANOVA one-way" e de múltiplas comparações de Turkey. FIGURA 4 descreve o ciclo de patamar de diferentes concentrações das sequências iniciadoras HPV16L1. Tanto as sequências iniciadoras directa como reversa foram testadas em combinação em concentrações diferentes usando 10 cópias de plasmideo HPV16L1 como DNA molde. FIGURA 5 mostra o ARn de diferentes concentrações da sequência iniciadora HPV16L1. Tanto as sequências iniciadoras directa como reversa foram testadas em combinação em diferentes concentrações usando 10 cópias de plasmideo HPV16L1 como DNA molde. FIGURA 6 mostra a sensibilidade do ensaio de PCR multiplex para HPV6. Os resultados (média ± DP, n = 3) obtidos com cada uma das sondas especificas estão descritos por diferentes símbolos: os quadrados representam a sonda HPV6L1-FAM, os círculos representam a sonda HPV6E6-JOE e os triângulos representam a sonda HPV6E7-TET. 19 ΡΕ1421200 FIGURA 7 mostra a sensibilidade do ensaio de PCR multiplex para HPV11. Os resultados (média ± DP, n = 3) obtidos com cada uma das sondas especificas estão descritos por diferentes símbolos: os quadrados representam a sonda HPV11L1-FAM, os círculos representam a sonda HPV11E6-J0E e os triângulos representam a sonda HPV11E7-TET. FIGURA 8 mostra a sensibilidade do ensaio de PCR multiplex para HPV16. Os resultados (média ± DP, n = 3) obtidos com cada uma das sondas específicas estão descritos por diferentes símbolos: os quadrados representam a sonda HPV16L1-FAM, os círculos representam a sonda HPV16E6-JOE e os triângulos representam a sonda HPV16E7-TET. FIGURA 9 mostra a sensibilidade do ensaio de PCR multiplex para HPV18. Os resultados (média ± DP, n = 3) obtidos com cada uma das sondas específicas estão descritos por diferentes símbolos: os quadrados representam a sonda HPV18L1-FAM, os círculos representam a sonda HPV18E6-JOE e os triângulos representam a sonda HPV18E7-TET. FIGURA 10 mostra a sensibilidade do ensaio de PCR multiplex para HPV6 usando uma diluição seriada de DNA virai purificado a partir de uma amostra clínica humana. Os resultados (média ± DP, n = 3) obtidos com cada uma das sondas específicas estão descritos por diferentes símbolos: quadrados representam a sonda HPV6L1-FAM, os círculos representam a sonda HPV6E6-JOE e os triângulos representam a sonda HPV6E7-TET. 20 ΡΕ1421200 FIGURA 11 mostra a sensibilidade do ensaio de PCR multiplex para HPV11 usando uma diluição seriada de DNA virai purificado a partir de uma amostra clinica humana. Os resultados (média ± DP, n = 3) obtidos com cada uma das sondas especificas estão descritos por diferentes simbolos: quadrados representam a sonda HPV11L1-FAM, os circulos representam a sonda HPV11E6-JOE e os triângulos representam a sonda HPV11E7-TET. FIGURA 12 mostra a sensibilidade do ensaio de PCR multiplex para HPV16 usando uma diluição seriada de DNA virai purificado a partir de uma amostra clinica humana. Os resultados (média ± DP, n = 3) obtidos com cada uma das sondas especificas estão descritos por diferentes simbolos: os quadrados representam a sonda HPV16L1-FAM, os círculos representam a sonda HPV16E6-JOE e os triângulos representam a sonda HPV16E7-TET. FIGURA 13 mostra a sensibilidade do ensaio de PCR multiplex para HPV18 usando uma diluição seriada de DNA virai purificado a partir de uma amostra clínica humana. Os resultados (média ± DP, n = 3) obtidos com cada uma das sondas específicas estão descritos por diferentes simbolos: os quadrados representam a sonda HPV18L1-FAM, os circulos representam a sonda HPV18E6-JOE e os triângulos representam a sonda HPV18E7-TET. 21 ΡΕ1421200
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
Este invento está relacionado com um ensaio para a detecção de subtipos de HPV numa amostra clínica que substancialmente reduz o risco de resultados falsos negativos comparativamente com outros ensaios conhecidos. E do conhecimento geral que a relação entre o genoma de HPV e o DNA cromossómico hospedeiro pode sofrer alterações durante as múltiplas fases do processo tumori-génico (Para uma revisão, ver McMurray et al., Int. J. Exp. Path. 82:15-33 (2001)). As lesões pré-malignas estão muitas vezes associadas a formas epissómicas de DNA de HPV, enquanto que os tumores numa fase mais tardia tipicamente possuem sequências de HPV integradas. Como resultado da integração correlacionada com faces avançadas de progressão da doença, a grelha de leitura aberta de genes específicos de HPV, tais como o locus Ll, pode ficar interrompida. Tal interrupção da sequência do gene de HPV pode conduzir a resultados falsos negativos em ensaios destinados a detec-tar especificamente a sequência interrompida.
Assim, uma realização preferida do presente invento proporciona um método para identificação da presença de uma subtipo específico de HPV numa amostra, em que o referido método compreende a detecção e amplificação simultâneas de uma pluralidade de genes de HPV de um único subtipo de HPV. Uma amostra é considerada positiva para o subtipo de HPV se uma maioria da pluralidade dos genes de 22 ΡΕ1421200 HPV for detectada pelos métodos do presente invento. Uma outra realização preferida do presente invento proporciona um ensaio relativamente à presença de um subtipo especifico de HPV, em que o referido ensaio compreende a detecção e amplificação simultâneas de três genes de HPV de um único subtipo de HPV. Uma amostra é considerada positiva para o subtipo de HPV se pelo menos dois dos três genes forem detectados e negativo para HPV se nenhum dos três genes for detectado pelos métodos do presente invento. 0 referido ensaio reduz o risco de obtenção de resultados falsos negativos associados a ensaios que testam um único locus de HPV. 0 método do presente invento é altamente especifico e reprodutível. 0 método do presente invento para a detecção de subtipos de HPV numa amostra clinica também reduz substancialmente o risco de resultados falsos positivos comparativamente com outros ensaios conhecidos na área. Tais resultados falsos positivos são causados pelo elevado grau de homologia entre genes específicos de HPV, comparativamente com os mesmos genes de HPV de um subtipo de HPV diferente. Este nível de homologia torna difícil projectar um ensaio de PCR que seja específico de um único subtipo de HPV. Quando da utilização de outros métodos conhecidos na área que detectam loci isolados, é portanto necessário confirmar os resultados positivos testando seriadamente a presença de vários loci de um único tipo de HPV. A experimentação adicional necessária para verificar os resultados positivos é aborrecida e demorada. 0 23 ΡΕ1421200 estabelecimento do estatuto de HPV de uma amostra clínica para quatro tipos de HPV diferentes tipicamente consome 26-30 pessoa-horas.
Ao contrário dos métodos disponíveis na área, o presente invento proporciona um método para detectar e amplificar simultaneamente uma pluralidade de genes distintos de HPV de um único subtipo de HPV, reduzindo assim substancialmente a ocorrência de resultados falsos positivos vulgarmente associados a ensaios de locus único. Ainda, o ensaio do presente invento não requer experimentação seriada para confirmar resultados positivos e reduz grandemente as pessoa-horas necessárias para determinar o estatuto de HPV de uma amostra. Os métodos do presente invento são portanto adaptáveis ao rastreio de um grande número de amostras relativamente ao ácido nucleico de subtipos específicos de HPV. Os referidos métodos permitem o rastreio de numerosas amostras em simultâneo, e.g. através da utilização de um formato de PCR em 96 alvéolos, mas mantém elevada especificidade e precisão.
Na literatura foi descrito um outro ensaio TaqMan para HPV que utiliza um formato de múltiplos fluoróforos (Josefsson et al., Journal of Clinicai Microbiology 37(3):490-96 (1999)). Este método utiliza uma mistura de sequências iniciadoras específicas e degeneradas para amplificar uma porção do gene EI numa série de subtipos de HPV. Foram usadas até três sondas por ensaio, cada uma das sondas compreendendo um fluoróforo diferente e cada uma das - 24 - ΡΕ1421200 sondas detectando o gene EI de um subtipo diferente de HPV. A sensibilidade do ensaio foi testada usando plasmideos contendo DNA de HPV e não em amostras clinicas.
Josefsson et al. descreve uma sensibilidade substancialmente reduzida na detecção do DNA de HPV18 quando múltiplas sondas fluorescentes, cada uma delas especifica para um subtipo diferente de HPV, foram usadas em simultâneo comparativamente com um ensaio de sonda única. De forma semelhante, a detecção de HPV35 foi também reduzida quando uma mistura de sondas de HPV16, HPV33 e HPV35 foram usadas, comparativamente com uma sonda única para HPV35. Ainda, foi observada uma redução de sensibilidade com números elevados de cópias quando se usa um ensaio de múltiplas sondas para detectar HPV16 e HPV31. 0 método do presente invento utiliza uma pluralidade de sondas fluorescentes, cada uma das sondas compreendendo um fluoróforo que emite energia numa única emissão máxima relativamente a outro fluoróforo usado no ensaio particular. Os ensaios aqui proporcionados são altamente específicos e são capazes de detectar menos de dez cópias de DNA genómico de HPV em três loci.
As linearidade e sensibilidade de cada ensaio de PCR do presente invento foram confirmadas usando plasmideos específicos de loci, em concentrações que variam entre 10 e 106 cópias/reacção. Os ensaios de PCR multiplex para HPV6 (Fig.6), HPV11 (Fig.7), HPV16 (Fig.8) e HPV18 (Fig.9) foram 25 ΡΕ1421200 lineares dentro da gama de 10 a 106 cópias. A sensibilidade dos ensaios de PCR multiplex para HPV para HPV6 (Fig. 10), HPV11 (Fig.11), HPV16 (Fig.12) e HPV18 (Fig.13) foi também confirmada usando DNA virai isolado a partir de amostras clinicas humanas. A tremenda sensibilidade do ensaio, conforme demonstrado pelos métodos do presente invento, é critica no rastreio de amostras clínicas em que o número de cópias de HPV pode ser baixo. Devido às manifestações físicas da infecção por HPV serem muitas vezes não evidentes e o período de latência prolongado, a infecção com HPV pode não ser detectada até o doente ter sido diagnosticado com neoplasia cervical intra-epitelial (CIN) que, se deixada progredir sem tratamento, pode conduzir a carcinoma. Tipicamente, lesões de grau mais elevado (CIN2, CIN3 e carcinoma) estão associadas a elevado número de cópias de HPV, que podem ser detectadas por métodos tradicionais conhecidos na área. No entanto, muitos ensaios correntemente usados não são suficientemente sensíveis ou específicos para detectar um número baixo de copias de HPV. A tremenda sensibilidade é portanto crítica para a detecção precoce de HPV quando os números de cópias de HPV são baixos e a intervenção terapêutica tem probabilidade de ser mais eficaz. O presente invento está mais especificamente relacionado com um método para a detecção da presença de um subtipo de papilomavírus humano (HPV) numa amostra contendo ácido nucleico compreendendo: 26 ΡΕ1421200 amplificação de ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e de uma pluralidade de séries de oligonucleótidos para produzir uma pluralidadede de amplicões de PCR; em que cada série de oligonucleótidos consiste (a) numa sequência iniciadora de PCR discriminatória directa que híbrida com uma primeira sequência de um subtipo de HPV, (b) uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória que hibrida com uma segunda sequência do subtipo de HPV a jusante da primeira sequência e (c) uma sonda fluorescente marcada com uma molécula abafadora e um fluoróforo que emite energia num máximo de emissão único; a referida sonda hibrida com uma sequência do subtipo de HPV entre e a primeira e a segunda sequências; em que cada série de oligonucleótidos hibrida especificamente com um amplicão de HPV diferente derivado do mesmo subtipo de HPV; permitindo que a referida polimerase de ácidos nucleicos digira cada uma das sondas fluorescentes durante a amplificação para dissociar o referido fluoróforo da referida molécula abafadora; detecção de uma alteração da fluorescência quando da dissociação do fluoróforo e do abafador, a alteração de fluorescência correspondendo à ocorrência de amplificação de ácido nucleico; e 27 ΡΕ1421200 determinação de que a amostra é positiva para o subtipo de HPV se uma alteração da fluorescência for detectada em pelo menos dois máximos de emissão.
Numa realização preferida deste invento, cada uma das séries de oligonucleótidos da pluralidade de séries de oligonucleótidos é especifica de um único gene do subtipo de HPV a ser detectado. Por outras palavras, cada uma das séries de oligonucleótidos do método do presente invento híbrida com as sequências nucleotídicas derivadas de um único gene de HPV do mesmo subtipo. Por exemplo, as sequências iniciadoras oligonucleotídicas e a sonda de uma primeira série oligonucleotídica hibridam com o gene E6, as sequências iniciadoras oligonucleotídicas e a sonda de uma segunda série oligonucleotídica hibridam com o gene E7 e as sequências iniciadoras oligonucleotídicas e a sonda de uma terceira série oligonucleotídica hibridam com o gene Ll. Como resultado, é criada uma pluralidade de amplicões de PCR em que cada amplicão de PCR é específico de um único gene de HPV do subtipo de HPV a ser detectado.
Numa realização alternativa deste invento, a sequência iniciadora de PCR discriminatória directa e a sequência iniciadora de PCR discriminatória reversa são específicas de um gene diferente do mesmo subtipo de HPV. Por exemplo, uma sequência iniciadora discriminatória directa híbrida com o gene E6 e uma sequência iniciadora discriminatória reversa híbrida com o gene E7. Como 28 ΡΕ1421200 resultado, pelo menos um amplicão de PCR compreende uma sequência de nucleótidos derivada de mais de um gene. A sonda oligonucleotídica específica do referido amplicão pode hibridar, por exemplo, com uma sequência de nucleótidos derivada do gene E6, uma sequência de nucleótidos derivada do gene E7 ou uma sequência de nucleótidos que cruza a fronteira E6/E7. A alteração na fluorescência pode ser detectada por um fluorómetro automático, projectado para realizar PCR Taq-Man, tendo as seguintes características: um método de excitação para excitar o fluoróforo da sonda fluorescente, um meio para aquecer e arrefecer as misturas de reacção de PCR e um meio para detectar uma alteração na fluorescência. Esta combinação de características, quando efectuada por único instrumento de PCR Taq-Man permite a detecção em tempo real de amplicões de PCR, o que permite a confirmação da amplificação do produto de PCR através do exame da cinética do aumento de fluorescência em tempo real. Os fluorómetros automáticos para a realização das reacções de PCR Taq-Man são conhecidos na área e podem ser adaptados para usar neste ensaio específico, por exemplo, o iCycler da Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) e o Mx4000 da Stratagene (La Jolla, CA).
Os métodos do presente invento foram realizados com um ABI PRISM® 7700 Sequence Detection Instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA). Este instrumento usa um espectrógrafo para separar a emissão de fluorescência 29 ΡΕ1421200 (baseado no comprimento de onda) num padrão de espaçamentos previsível através de uma câmara com um dispositivo carregado acoplado (CCD). Uma aplicação do Sequence Detection System da ABI PRISM®7700 colige os sinais fluorescentes da câmara CCD e aplica algoritmos na análise dos dados.
As polimerases de ácidos nucleicos para usar nos métodos do presente invento devem possuir actividade de exonuclease 5'-3'. São conhecidas várias polimerases adequadas, por exemplo, as polimerases Taq (Thermus aqua-ticus) , Tbr (Thermus brockianus) e Tth (Thermus thermo-philus) . A DNA polimerase TAQ é a polimerase preferida do presente invento. A actividade de exonuclease 5'-3' é caracterizada pela degradação de DNA de cadeia dupla encontrado durante a extensão da sequência iniciadora de PCR. Uma sonda fluorescente emparelhada com o amplicão será degradada de forma semelhante, libertando assim o fluoró-foro do oligonucleótido. Quando da dissociação do fluoró-foro e do abafador, a fluorescência emitida pelo fluoróforo deixa de ser abafada, o que resulta numa alteração detec-tável na fluorescência. Durante o crescimento exponencial do produto de PCR, a fluorescência especifica de amplicão aumenta até um ponto em que a aplicação da detecção da sequência, após aplicação de um algoritmo de múltiplos componentes ao espectro composto, pode distingui-lo da fluorescência de fundo de amostras que não amplificam. 0 ABI PRISM®7700 Sequence Detection Instrument também compreende uma aplicação de programa informático, o qual determina o ciclo de patamar (Ct) para as amostras (ciclo a 30 ΡΕ1421200 partir do qual esta fluorescência aumenta acima de um patamar pré-determinado). As amostras negativas por PCR possuem um Ct igual ao número total de ciclos realizados e as amostras positivas por PCR possuem um Ct inferior ao número total de ciclos realizados. O presente invento está relacionado com um método para a detecção da presença de um subtipo de papilomavírus humano (HPV) numa amostra contendo ácido nucleico. Numa realização preferida deste invento, o subtipo de HPV é seleccionado do grupo consistindo em: HPV6, HV11, HPV16 e HPV18.
Numa outra realização preferida do método do presente invento, o número de séries de oligonucleótidos é impar e a amostra é positiva para o subtipo de PV testado se uma alteração da fluorescência for detectada numa maioria dos fluoróforos.
Ainda numa outra realização preferida do método do presente invento para identificar a presença de um subtipo especifico de HPV numa amostra, o número de séries de oligonucleótidos é três. Uma amostra é determinada como sendo positiva para o subtipo de HPV se uma alteração da fluorescência for detectada em pelo menos dois fluoróforos. Amostras que sejam negativas em cada um dos três máximos de emissão associados a cada um dos fluoróforos são negativas para o subtipo de HPV. Este invento proporciona um método para a detecção da presença de um papilomavírus humano numa 31 ΡΕ1421200 amostra contendo ácido nucleico, em que o número de séries de oligonucleótidos é três e o subtipo de HPV é seleccio-nado do grupo consistindo em: HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18.
Numa outra realização preferida do método do presente invento, o número de séries de oligonucleótidos é três e as séries de oligonucleótidos hibridam especifica-mente com os genes E6, E7 e Ll de HPV. Uma amostra é positiva para o subtipo de HPV a ser testado se dois ou três dos genes E6, E7 ou Ll foram detectados.
As sondas oligonucleotídicas e sequências iniciadoras usadas no presente invento podem ser sintetizadas por uma série de métodos. Ver, e.g., Ozaki et al., Nucleic Acids Research 20:5205-5214 (1992); Agrawal et al., Nucleic Acids Research 18: 5419-5423 (1990). Por exemplo, as sondas oligonucleotídicas podem ser sintetizadas num sintetizador de DNA automático como seja o sintetizador de DNA ABI 3900 (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Químicas alternativas, e.g. resultantes em grupos não naturais, tais como fosforotioato, fosforamidato e similares, podem ser igualmente empregues desde que as eficiências de hibridação dos oligonucleótidos resultantes não seja adversamente afecta-da. O passo de amplificação por PCR usado no presente invento pode ser realizado por técnicas convencionais bem conhecidas na área (Ver, e.g., Sambrook, E.F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second 32 ΡΕ1421200
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Patente U.S. N° 4683202; e PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et ai., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1990) que são aqui incluídos como referência). As condições dos ciclos de PCR tipicamente consistem numa passo inicial de desnaturação, que pode ser realizado aquecendo a mistura de reacção de PCR até uma temperatura variando entre cerca de 80°C e cerca de 105°C, durante cerca de um minuto a cerca de 10 minutos. A desnaturação pelo calor é tipicamente seguida de uma série de ciclos, variando entre cerca de 20 e cerca de 50, cada um dos ciclos geralmente compreendendo um passo de desnaturação inicial, seguido de um passo de emparelhamento das sequências iniciadoras e concluindo com um passo de extensão da sequência iniciadora. A extensão enzimática das sequências iniciadoras pela polimerase de ácidos nucleicos, e.g. polimerase TAQ, produz cópias do molde que podem ser usadas como moldes em ciclos subsequentes.
As reacções de PCR com "iniciação a quente" ("hot start") podem ser usadas conjuntamente com os métodos do presente invento para eliminar falsas iniciações e a geração de amplicões não específicos. Com este objectivo, numa realização preferida deste invento, a polimerase de ácidos nucleicos é AmpliTaq Gold DNA Polymerase e as condições dos ciclos de PCR incluem uma reacção de PCR com "iniciação a quente". A referida polimerase está inactiva até à activação, a qual pode ser conseguida por incubação dos componentes da reacção de PCR a 95°C, durante 33 ΡΕ1421200 aproximadamente 10 minutos, antes dos ciclos de PCR. Os métodos de PCR compreendendo um passo de incubação inicial semelhante são conhecidos na área como ensaios de PCR com "iniciação a quente".
De preferência, as sondas oligonucleotidicas usadas no presente invento são na gama entre cerca de 20 e cerca de 40 nucleótidos de comprimento. Mais de preferência, a sonda oligonucleotidica é na gama entre cerca de 18 e cerca de 30 nucleótidos de comprimento. Mais de preferência, a sonda oligonucleotidica é na gama entre cerca de 24 e cerca de 30 nucleótidos de comprimento. A sequência precisa e o comprimento de uma sonda oligonucleotidica usada no invento depende, em parte, da natureza do polinucleótido alvo a que ela se liga. A localização da ligação e o comprimento podem variar para se conseguir propriedades adequadas de emparelhamento e fusão para uma realização particular.
De preferência, o nucleótido terminal 3' da sonda oligonucleotidica é bloqueado ou tornado incapaz de extensão por uma polimerase de ácidos nucleicos. Tal bloqueio é convenientemente realizado por fosforilação do nucleótido terminal 3', uma vez que a DNA polimerase pode adicionar nucleótidos apenas a um hidroxilo 3' e não a um fosfato 3'.
De preferência, as sequências iniciadoras de HPV e as sondas usadas no presente invento não partilham 34 ΡΕ1421200 homologia completa com outros subtipos de HPV. Cada uma das sequências iniciadoras do presente invento deverá ser projectada de forma a que a homologia 3' não exista em pelo menos um nucleótido ou mais. Tal projecção das sequências iniciadoras reduzirá substancialmente a hipótese do emparelhamento da sequência iniciadora com o subtipo de HPV errado e evitará a extensão da sequência iniciadora se ocorrer o emparelhamento com um tipo de HPV que não era o pretendido, uma vez que a DNA polimerase TAQ apenas prolonga uma sequência iniciadora a partir do extremo 3' e requer que o extremo 3' esteja adequadamente emparelhado. É igualmente preferido que cada uma das sondas contenham desemparelhamentos ao longo do comprimento do oligonucleótido de forma a destabilizarem a ligação do oligonucleótido a alvos não específicos. Um mínimo de um desemparelhamento ao longo do comprimento da sonda oligonu-cleotídica é suficiente para discriminar entre os loci. Devido à sonda usada no presente invento ser apenas hidrolisada e detectada quando ligada ao segmento de DNA que está a ser amplificado, a ligação não específica da sonda a uma sequência de DNA que não está a ser amplificada não é detectada.
Com esta finalidade, o presente invento utiliza um par de sequências iniciadoras para a amplificação por PCR do ácido nucleico de HPV, em que tanto as sequências iniciadoras de PCR directa como reversa são discriminatórias. Numa realização preferida do invento, as sequên- 35 ΡΕ1421200 cias nucleotídicas do par de sequências iniciadoras são seleccionadas do grupo consistindo em: SEQ ID NO:1 e SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 e SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:7 e SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:35. É facilmente aparente para os familiarizados com a matéria que sequências iniciadoras oligonucleotidicas podem ser projectadas, as quais selectivamente amplificam genes de HPV de um subtipo especifico. As referidas sequências iniciadoras oligonucleotidicas podem ter o mesmo comprimento das aqui descritas ou podem ser na gama de 12-45 nucleótidos. Mais de preferência, o comprimento das sequências iniciadoras oligonucleotidicas do presente invento é na gama de 18-30 nucleótidos. Mais de preferência, o comprimento das sequências iniciadoras oligonucleotidicas do presente invento é na gama de 19-29 nucleótidos. É igualmente preferido que cada uma das sondas Taq-Man contenha desemparelhamentos ao longo do comprimento do oligonucleótido de forma a destabilizarem a ligação do oligonucleótido a alvos não específicos. Um mínimo de um desemparelhamento ao longo do comprimento da sonda oligonucleotídica é suficiente para discriminar entre os loci. Devido às sondas usadas no presente invento serem apenas hidrolisadas e detectadas quando ligadas ao segmento 36 ΡΕ1421200 de DNA que está a ser amplificado, a ligação não específica da sonda a uma sequência de DNA que não está a ser amplificada não é detectada.
Com esta finalidade, o presente invento utiliza uma sonda oligonucleotídica compreendendo uma sequência de nucleótidos específica de um único subtipo de HPV. A referida sonda oligonucleotídica pode ligar-se a amplicões específicos de HPV resultantes da amplificação por PCR de DNA virai usando sequências oligonuclotídicas específicas. Numa realização preferida do invento, a referida sonda oligonucleotídica compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada do grupo consistindo em: SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID N0:21, SEQ ID NO:24, SEQ ID N0:27, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:36. 0 presente invento também está relacionado com as referidas sondas oligonu-cleotídicas compreendendo ainda um fluoróforo e uma molécula abafadora.
Os fluoróforos usados no presente invento podem ser ligados à sonda em qualquer local da sonda, incluindo o extremo 5', o extremo 3' ou uma posição interna relativamente aos extremos, i.e. o referido fluoróforo pode ser ligado a qualquer um dos nucleótidos compreendendo a sequência específica de nucleótidos capaz de hibridar com o gene específico de HPV que a sonda foi projectada para detectar. Numa realização preferida deste invento, o fluoróforo é ligado ao nucleótido terminal 5' da sequência 37 ΡΕ1421200 de nucleótidos específica e o abafador é ligado ao nucle-ótido terminal 3' da sequência de nucleótidos específica.
De preferência, os fluoróforos são corantes orgânicos fluorescentes, modificados para se ligarem ao carbono 3' ou ao carbono 5' terminal da sonda através de um grupo de ligação. De preferência, as moléculas abafadoras são igualmente corantes orgânicos, os quais podem ou não ser fluorescentes, dependendo da realização do invento. Por exemplo, numa realização preferida do invento, a molécula abafadora é não fluorescente. De um modo geral, quer a molécula abafadora seja fluorescente ou simplesmente liberte a energia transferida do repórter por decaimento não irradiante, a banda de absorção do abafador deverá substancialmente sobrepor-se à banda de emissão fluorescente da molécula repórter. AS moléculas abafadoras não fluorescentes que absorvem energia a partir de moléculas repórter excitadas, mas que não libertam a energia por irradiação, são aqui referidas como "abafadores escuros", "moléculas abafadoras escuras", "abafadores não fluorescentes" ou "moléculas abafadoras não fluorescentes".
Na literatura estão descritos vários pares de fluoróforo-abafador. Ver, e.g. Pesce et al., editores, Fluorescence Spectroscopy, Mareei Dekker, New York, (1970); e similares. A literatura também inclui referências que fornecem listas exaustivas de moléculas fluorescentes e não fluorescentes e as suas propriedades ópticas relevantes, e.g. Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic 38 ΡΕ1421200
Molecules, 2nd Edition, Academic Press, New York, (1971). Ainda, existem extensas instruções na literatura para a modificação com moléculas repórter e abafadoras para a ligação covalente via grupos reactivos comuns que podem ser adicionados a um oligonucleót ido. Ver, e.g. Pat. U.S. N° 4351760.
Exemplos de pares de fluoróforo-abafador podem ser seleccionados entre corantes de xanteno, incluindo corantes de fluoresceina e rodamina. Muitas formas adequadas destes compostos estão disponíveis comercialmente com substituintes nos seus grupos fenilo, que podem ser usados para a ligação ou como a função de ligação para a associação a um oligonucleótido. Um outro grupo de compostos fluorescentes são as naftilaminas, tendo um grupo amina na posição alfa ou beta. Estão incluídos entre tais compostos naftilamino 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, 1-anilino-8-naftaleno sulfonato e 2-p-touidinil-6-naftaleno sulfonato. Outros corantes incluem 3-fenil-7-isocianatocu-marina, acridinas, tais como 9-isotiocianatoacridina e laranja de acridina; N-(p-(2-benzoxazolil)fenil))maleimida; benzoxadiazoles, stilbenos, pirenos e similares.
De preferência, as moléculas de fluoróforo e abafador são seleccionadas entre os corantes de fluores-ceína e de rodamina. Estes corantes e metodologias de ligação para a sua ligação a oligonucleótidos são conhecidas. Ver, e.g. Marshall, Histochemical J. 7:299-303 (1975); e Pat. U.S. N° 5188934. Numa realização preferida deste 39 ΡΕ1421200 invento, os fluoróforos são seleccionados do grupo consistindo em: 6-carboxi-fluoresceina (FAM), 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (JOE) e 5-tetracloro-fluoresceina (TET).
Numa realização preferida deste invento, a molécula de abafador é não fluorescente. Uma molécula de abafador preferida do presente invento é Black Hole Quencher™ 1 (BHQ1), um abafador não fluorescente desenvolvido por Biosearch Technologies (Novato, CA) . Numa realização preferida, os fluoróforos são seleccionados do grupo consistindo em: FAM, JOE e TET e a molécula de abafador é BHQ1.
De preferência, são empregues grupos de ligação comerciais que podem ser ligados a um oligonucleótido durante a síntese, e.g. disponível da Clontech Laboratories (Paio Alto, Calif.). 0 presente invento está relacionado com um método para a detecção da presença de HPV6 numa amostra contendo ácido nucleico compreendendo: amplificação do ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e três séries de oligonucleót idos ; a primeira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória 40 ΡΕ1421200 como descrito em SEQ ID NO:l, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO: 2 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 3, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a segunda série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:4, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:5 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 6, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a terceira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:7, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO: 8 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 9, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; digestão das sondas com a polimerase de ácidos nucleicos para digerir cada uma das sondas durante a amplificação de forma a dissociar o referido fluoróforo da referida molécula abafadora; 41 ΡΕ1421200 detecção de uma alteração da fluorescência quando da dissociação do fluoróforo do abafador, a alteração da fluorescência correspondendo à ocorrência de amplificação de ácido nucleico; e determinação de que a amostra é positiva para o subtipo de HPV6 se uma alteração da fluorescência for detectada com pelo menos duas sondas.
Numa realização preferida do método para a detecção da presença de HPV6 numa amostra descrita atrás, o fluoróforo da primeira série de oligonucleótidos é FAM, o fluróforo da segunda série de oligonucleótidos é JOE e o fluoróforo da terceira série de oligonucleótidos é TET. 0 presente invento ainda está relacionado com um método para a detecção da presença de HPV11 numa amostra contendo ácido nucleico compreendendo: amplificação do ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e três séries de oligonucleótidos; a primeira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:10, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:11 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 12, a referida sonda 42 ΡΕ1421200 marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a segunda série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:13, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:14 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 15, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a terceira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:16, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:17 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 18, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; digestão das sondas com a polimerase de ácidos nucleicos para digerir cada uma das sondas durante a amplificação de forma a dissociar o referido fluoróforo da referida molécula abafadora; detecção de uma alteração da fluorescência quando da dissociação do fluoróforo do abafador, a alteração da 43 ΡΕ1421200 fluorescência correspondendo à ocorrência de amplificação de ácido nucleico; e determinação de que a amostra é positiva para o subtipo de HPV11 se uma alteração da fluorescência for detectada com pelo menos duas sondas.
Numa realização preferida do método para a detecção da presença de HPV6 numa amostra descrita atrás, o fluoróforo da primeira série de oligonucleótidos é FAM, o fluróforo da segunda série de oligonucleótidos é JOE e o fluoróforo da terceira série de oligonucleótidos é TET. 0 presente invento ainda está relacionado com um método para a detecção da presença de HPV16 numa amostra contendo ácido nucleico compreendendo: amplificação do ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e três séries de oligonucleótidos; a primeira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:19, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:20 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 21, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; 44 ΡΕ1421200 a segunda série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:22, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:23 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 24, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a terceira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:25, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:26 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 27, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; digestão das sondas com a polimerase de ácidos nucleicos para digerir cada uma das sondas durante a amplificação de forma a dissociar o referido fluoróforo da referida molécula abafadora; detecção de uma alteração da fluorescência quando da dissociação do fluoróforo do abafador, a alteração da fluorescência correspondendo à ocorrência de amplificação de ácido nucleico; e 45 ΡΕ1421200 determinação de que a amostra é positiva para o subtipo de HPV16 se uma alteração da fluorescência for detectada com pelo menos duas sondas.
Numa realização preferida do método para a detecção da presença de HPV6 numa amostra descrita atrás, o fluoróforo da primeira série de oligonucleótidos é FAM, o fluróforo da segunda série de oligonucleótidos é JOE e o fluoróforo da terceira série de oligonucleótidos é TET. 0 presente invento ainda está relacionado com um método para a detecção da presença de HPV18 numa amostra contendo ácido nucleico compreendendo: amplificação do ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e três séries de oligonucleótidos; a primeira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:28, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:29 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO:30, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a segunda série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória 46 ΡΕ1421200 como descrito em SEQ ID N0:31, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:32 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO:33, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a terceira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:34, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:35 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO:36, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; digestão das sondas com a polimerase de ácidos nucleicos para digerir cada uma das sondas durante a amplificação de forma a dissociar o referido fluoróforo da referida molécula abafadora; detecção de uma alteração da fluorescência quando da dissociação do fluoróforo do abafador, a alteração da fluorescência correspondendo à ocorrência de amplificação de ácido nucleico; e determinação de que a amostra é positiva para o subtipo de HPV18 se uma alteração da fluorescência for detectada com pelo menos duas sondas. - 47 - ΡΕ1421200
Numa realização preferida do método para a detecção da presença de HPV6 numa amostra descrita atrás, o fluoróforo da primeira série de oligonucleótidos é FAM, o fluróforo da segunda série de oligonucleótidos é JOE e o fluoróforo da terceira série de oligonucleótidos é TET.
Tendo descrito realizações preferidas do invento com referência aos desenhos juntos, deve ser entendido que o invento não está limitado às realizações especificas e que várias alterações e modificações podem ser efectuadas pelos familiarizados com a matéria, sem afastamento do âmbito do invento como definido nas reivindicações apensas.
Os exemplos que se seguem ilustram, mas não limitam o invento. EXEMPLO 1
Projecção de sequências iniciadoras discriminatórias para HPV
As sequências iniciadoras de PCR foram pro-jectadas para cada um dos subtipos de HPV usando Primer Express v. 1.0 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). As sequências nucleotidicas especificas de gene para as grelhas de leitura abertas dos loci Ll, E6 e E7 dos subtipos HPV6a, HPVôb, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33 e 48 ΡΕ1421200 HPV45 foram alinhadas usando ClustalW v.1.7 (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany) e um computador pessoal Power Macintosh G4 (Apple Computer). 0 ficheiro de alinhamentos no formato Phylip foi então importado para o módulo de Allelic Discrimination da aplicação Primer Express e o subtipo de HPV específico foi marcado.
Seleccionaram-se pares de sequências iniciadoras que preenchiam os seguintes critérios: Tm = 59-61°C, tamanho do amplicão: 100-250 pb, teor GC entre 20-80%, um resíduo de guanosina ou citosina na posição 3'-terminal e a base discriminatória dentro das três bases do extremo 3'. A base discriminatória é o resíduo que é único para o subtipo de HPV específico, na posição específica, e actua de forma a discriminar o subtipo de HPV de entre os outros presentes no alinhamento. Foram seleccionados vários pares de sequências iniciadoras de forma a que as sequências iniciadoras directas e reversas fossem discriminatórias (ver FIGURA 1).
As sequências iniciadoras foram analisadas relativamente ao facto de serem únicas e à formação de dímeros de sequências iniciadoras através de Amplify v.1.2 da Macintosh (William Engels, Genetics department, University of Wisconsin). Para cada um dos loci foi seleccionado um par de sequências iniciadoras óptimo em que não houve aparente formação de dímeros e cada uma das 49 ΡΕ1421200 sequências iniciadoras previu-se emparelhar com apenas uma sequência dos loci alvos. Uma vez definido um amplicão por um par de sequências iniciadoras, foi projectada uma sonda oligonucleotidica duplamente marcada que obedecia aos seguintes critérios: Tm = 68-70°C, comprimento <30 nt, segmentos não superiores a três nucleótidos iguais, nenhum resíduo de guanosina no extremo 5' e mais resíduos de citosina do que resíduos de guanosina (ver FIGURA 1). A reactividade cruzada prevista, para cada par de sequências iniciadoras e sonda, com outros subtipos conhecidos de HPV foi avaliada por pesquisa BLAST de cada sequência contra a base de dados GenBank. A maior parte das sequências das sequências iniciadoras e sondas são alvos únicos para o HPV específico para o qual foram desenhadas e não partilham qualquer homologia com outros subtipos de HPV. A sequência iniciadora reversa HPV6L1 partilha alguma homologia com HPV3, HPV26, HPV28 e HPV70. A sonda TaqMan HPV6L1 partilha alguma homologia com HPV45, HPV54, HPV59, HPV66 e HPV83. A sequência iniciadora reversa HPVE6 partilha homologia com HPV11. A sequência iniciadora reversa HPV6E7 partilha alguma homologia com HPV2. A sonda TaqMan HPV6E7 partilha alguma homologia com HPV11, HPV42, HPV44, HPV55 e HPV74. A sonda directa HPV11L1 partilha alguma homologia com HPV6. A sonda TaqMan HPV11L1 partilha alguma homologia com HPVAE8, HPV6, HPV27, HPV31, HPV34, HPV55, HPV64 e HPV71. A sequência iniciadora reversa HPV11E6 partilha alguma homologia com HPV57. A sonda TaqMan 50 ΡΕ1421200 HPV11E6 partilha alguma homologia com HPV6. A sequência iniciadora directa HPV11E7 partilha alguma homologia com HPV6, HPV13, HPV44, HPV55 e HPV74. A sonda TaqMan HPV11E7 partilha alguma homologia com HPV6 e HPV13. A sequência iniciadora directa HPV16L1 partilha alguma homologia com HPV68. A sequência iniciadora reversa HPV16L1 partilha alguma homologia com HPV35, HPV35H, HPV42 e HPV52. A sonda TaqMan HPV16L1 partilha alguma homologia com HPV7, HPV10, HPV35 e HPV35H. A sequência iniciadora reversa HPV18E6 partilha alguma homologia com HPV85. A sequência iniciadora directa HPV18E7 partilha alguma homologia com HPV6 e HPV39. A sonda TaqMan HPV18E7 partilha alguma homologia com HPV59.
Nenhuma das sequências inciadoras e sondas que foram projectadas partilham homologia completa com outros subtipos de HPV. As sequências iniciadoras não possuem homologia no extremo 3' em pelo menos um nucleótido ou mais, o que sugere que mesmo que emparelhassem com o subtipo de HPV errado não seriam prolongadas uma vez que a DNA polimerase Taq apenas faz extensão de uma sequência iniciadora a partir do extremo 3' e necessita que o extremo 3' esteja adequadamente emparelhado. As sondas TaqMan possuem desemparelhamentos ao longo do oligonucleótido, os quais destabilizam a ligação do oligonucleótido a alvos não específicos. Um único desemparelhamento ao longo da sonda oligonucleotídica é suficiente para discriminar entre loci. Ainda, a sonda apenas é hidrolisada e detectada quando ligada ao segmento de DNA que está a ser amplificado. A 51 ΡΕ1421200 ligaçao não específica da sonda a uma sequência de DNA que não está a ser amplificada não é detectada. EXEMPLO 2 Síntese e marcação de sequências iniciadoras e sondas oligonucleotídicas
As sequências iniciadoras oligonucleotídicas foram sintetizadas por encomenda e purificadas por HPLC de fase reversa pela Sigma Genosys (The Woodlands, TX) . As sondas oligonucleotídicas duplamemte marcadas foram sintetizadas por encomenda e purificadas por HPLC de fase reversa por Biosearch Technologies (Novato, CA). As sondas oligonucleotídicas fluorescentes para os loci Ll foram marcadas no extremo 5' com 6-carboxi-fluoresceina (FAM), as sondas oligonucleotídicas fluorescentes para os loci E6 foram marcadas no extremo 5' com 5-carboxi-4',5'-dicloro-27'-dimetoxifluoresceina (JOE) e as sondas oligonucleotídicas fluorescentes para os loci E7 foram marcadas no extremo 5' com 5-tetracloro-fluoresceina (TET), disponíveis na Molecular Probes (Eugene, OR) . Todas as sondas oligonucleotídicas foram marcadas no extremo 3' com BHQ1, um abafador não fluorescente desenvolvido por Biosearch Technologies (Novato, CA) . As sequências iniciadoras e as sondas liofilizadas foram reconstituídas em tampão TE IX pH 8,0 (Roche Molecular Biochemicals) e a concentração determinada por medição da DO a 260 nm num espectrofo- 52 ΡΕ1421200 tómetro Beckman 600DU e calculando a concentração usando o coeficiente de extinção molar específico de nucleótido. EXEMPLO 3
Optimização da reacção multiplex
As concentrações das sequências iniciadoras e sondas foram optimizadas de forma a três loci separados puderem ser detectados e amplificados simultaneamente, num único tubo de PCR, sem favorecimento de uma reacção relativamente a outra. As concentrações da sonda oligonucleotídica fluorescente foram optimizadas separadamente analisando o ciclo de patamar (Ct) e ÀRn de concentrações crescentes de sonda usando 100 cópias de DNA molde (cada um dos locus clonado num plasmídeo) no instrumento ABI PRISM®7700 Sequence Detection System.
As amostras foram amplificadas numa mistura de reacção de 50 μΐ contendo 25 μΐ da TaqMan Universal PCR 2X PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), concentração final 200 nM de cada sequência iniciadora, 100 cópias de DNA de plasmídeo molde, água tratada com DEPC (Ambion) e uma gama de concentrações (25-200 nM) de sondas oligonucleotídicas marcadas com fluorescência. As condições dos ciclos consistiram num passo inicial de 50°C durante 2 min, seguido de 95°C durante 10 minutos e 45 ciclos de 94°C durante 15 seg e 60°C durante 1 min. 53 ΡΕ1421200
Na TaqMan Universal PCR Master Mix está incluído dUTP (em vez de dTTP) e uracil-N-glicosilase (UNG) , uma enzima que é activada a 50°C e corta ácidos nucleicos contendo uracilo. Ver Longo et al. Gene 93:125-128 (1990). A UNG evita a reamplificação dos produtos de PCR contaminantes em experiências subsequentes.
Foi seleccionada uma concentração de cada sonda que apresentou o valor de Ct mais baixo (por exemplo HPV16L1; FIGURA 2 e um ARn ~ 1 (por exemplo HPV16L1; FIGURA 3). As concentrações de sequências iniciadoras foram optimizadas para cada locus, avaliando o Ct e ARn de cada combinação de concentrações das sequências iniciadoras num ensaio preciso de matriz, usando a concentração previamente determinada de sonda oligonucleotídica específica dos loci e dez cópias de DNA de plasmídeo molde. Foram seleccionadas as concentrações das sequências iniciadoras directa e reversa que apresentaram o Ct mais baixo (por exemplo HPV16L1; FIGURA 4) e o ARn máximo (por exemplo HPV16L1; Figura 5).
As sequências iniciadoras e sondas foram então testadas em conjunto com a adição de DNA polimerase AmpliTaq Gold (0, 75U/alvéolo, Applied Biosystems, Foster
City, CA) . A DNA polimerase suplementar foi adicionada porque a TaqMan Universal PCR Master Mix, que já continha DNA polimerase AmpliTaq Gold, foi optimizada para reacções 54 ΡΕ1421200 de cadeia dupla e não reacções de cadeia tripla. A DNA polimerase adicional suplementa a DNA polimerase na mistura mãe original 2X e reforça a reacção. A linearidade e sensibilidade de cada ensaio de PCR foram confirmadas usando plasmídeos específicos de loci em concentrações que variam entre 10 e 106 cópias/reacção. Os ensaios de PCR multiplex para HPV6 (FIGURA 6), HPV11 (FIGURA 7), HPV16 (FIGURA 8) e HPVl8 (FIGURA 9) foram lineares na gama de 10 a 106 cópias. A sensibilidade dos ensaios de PCR multiplex para HPV para HPV6 (FIGURA 10), HPVl 1 (FIGURA 11), HPVl6 (FIGURA 12) e HPVl8 (FIGURA 13) foi também confirmada usando DNA virai de HPV seriadamente diluído, isolado a partir de amostras clínicas humanas (ver EXEMPLO 5). EXEMPLO 4
Isolamento de DNA O DNA foi isolado a partir de amostras clínicas humanas usando o QIAamp DNA Spin Blood Kit de 96 alvéolos (Qiagen Inc., Valência, CA) de acordo com o protocolo do fabricante com as seguintes modificações: a quantidade de protease Qiagen foi aumentada para 0,5 mg/alvéolo em vez do recomendado 0,4 mg/alvéolo, a placa de filtros QIAamp foi centrifugada seca sobre um bloco de alvéolos quadrados limpo numa Centrífuga Sigma (Qiagen Inc., Valência, CA) 55 ΡΕ1421200 durante 10 min. a 6000 rpm e o DNA foi eluído com tampao de eluição pré-aquecido (70°C). EXEMPLO 5
Rastreio de amostras clínicas humanas
Uma mistura mãe contendo todos os componentes da reacção de PCR excepto o DNA molde foi preparada e aplicada em placas de reacção óptica de 96 alvéolos (46 μΐ/alvéolo, Applied Biosystems, Foster City, CA) para cada um dos tipos de HPV a ser testado. Quatro μΐ do DNA purificado foi adicionado a cada alvéolo contendo a mistura mãe de PCR multiplex e os alvéolos foram tapados com tampas ópticas de PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Após centrifugação a 3000 rpm durante 2 min numa centrífuga Sigma, a placa de PCR de 96 alvéolos foi transferida para o instrumento ABI PRISM®7700 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Os ciclos de PCR e a colheita de dados foi iniciada e controlada através de um molde previamente projectado que é específico de cada um dos subtipos de HPV. Quando completados os ciclos de PCR, os dados foram guardados electronicamente e a placa de amplificação rejeitada. Os dados foram então analisados usando a aplicação Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os patamares para cada camada de corante foram estabelecidos 56 ΡΕ1421200 manualmente; o patamar da camada de corante FAM foi estabelecido em 0,05, o patamar da camada de corante JOE foi estabelecido em 0,03 e a camada de corante TET foi estabelecida em 0,04. Os dados foram então exportados electronicamente para um ficheiro de texto delimitado por tabulações. O ficheiro de texto e o ficheiro contendo os nomes das amostras foi então importado para o livro de trabalho Microsoft EXCEL especifico do subtipo de HPV através de uma macro que testa os dados para se assegurar que são do tipo correcto. As fórmulas incluídas nas folhas de trabalho encerradas calculam a positividade do PCR para a camada de corante, baseado no ciclo de patamar de cada uma das amostras. Os dados das três camadas de corante foram então compilados pelo livro de trabalho, o qual calcula uma positividade de consenso para o PCR de HPV para cada amostra baseado nas regras estabelecidas atrás.
As FIGURAS 10-13 mostram a sensibilidade dos ensaios de PCR multiplex para HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18, respectivamente, usando DNA virai de HPV seriadamente diluído num fundo de DNA genómico humano e corrido no ensaio de PCR multiplex adequado. Após uma diluição de 100000 a 1000000 vezes (número de cópias aproximado de Ι-ΙΟ), o DNA virai foi ainda detectado. A detecção virai em números de cópias baixos foi linear ao longo da totalidade da gama de diluições. ΡΕ1421200 57
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Merck & Co., Inc.
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Li, Weili
DiCell, Anthony C.
<120> ENSAIOS DE PCR MULTIPLEX FLUORESCENTE PARA HPV USANDO MÚLTIPLOS FLUORÓFOROS
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<210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para LI de HPV6 <400> 1 gactcgtctc tttttgatcc caca 24
<210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para LI de HPV6 <400> 2 taggaaagga tgtccactta caccc 25
<210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência sonda para LI de HPV6 <400> 3 caacgtttgg tatgggcatg cacaggccta 30 <210> 4 58 ΡΕ1421200 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E6 de HPV6 <400> 4 taaaggtcct gtttcgaggc g 21 <210> <211> 5 23 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E6 de HPV6 <400> 5 tgacacaggt agcaccgaat tag 23 <210> <211> 6 27 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de PCR para E6 de HPV6 <400> 6 atccatatgc agcctgcgcg tgctgcc 27 <210> <211> 7 22 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E7 de HPV6 <400> 7 acgaagtgga cggacaagat tc 22 <210> <211> 8 22 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E7 de HPV6 <400> 8 tcccaacaga agctgttgca ct 22 <210> 9 59 ΡΕ1421200 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de PCR para E7 de HPV6 <400> 9 ctgtacactg cacaaccagt cgaacgttgc 30 <210> <211> 10 24 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para LI de HPV11 <400> 10 cctccaccaa atggtacact ggag 24 <210> <211> 11 24 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para LI de HPV11 <400> 11 cctccaccaa atggtacact ggag 24 <210> <211> 12 29 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de PCR para LI de HPV611 <400> 12 cagtcacagg ccattacctg tcagaaacc 29 <210> <211> 13 25 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E6 de HPV11 <400> 13 tttgcacact ctgcaaattc agtgc 25 <210> 14 60 ΡΕ1421200 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E6 de HPV6 <400> 14 ttgcagttct aagcaacagg cacacg 26 <210> <211> 15 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de PCR para E6 de HPV6 <400> 15 catatatctc tgcggtggtc agtgcattcc 30 <210> <211> 16 24 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E7 de HPV11 <400> 16 agctcagaag atgaggtgga caag 24 <210> <211> 17 22 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E7 de HPV11 <400> 17 tgcccagcaa aaggtcttgt ag 22 <210> <211> 18 26 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de PCR para E7 de HPV11 <400> 18 cactccacaa ccagtcggac gttgct 26 <210> 19 61 ΡΕ1421200 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para LI de HPV16 <400> 19 tccagataca cagcggctgg 20 <210> <211> 20 24 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para LI de HPV16 <400> 20 aataaaggat ggccactaat gccc 24 <210> <211> 21 27 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de PCR para LI de HPV16 <400> 21 aatggctgac cacgacctac ctcaaca 27 <210> <211> 22 22 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E6 de HPV16 <400> 22 gcgacccaga aagttaccac ag 22 <210> <211> 23 29 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E6 de HPV16 <400> 23 ccatctctat atactatgca taaatcccg 29 <210> 24 62 ΡΕ1421200 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de PCR para E6 de HPV16 <400> 24 tacctcacgt cgcagtaact gttgcttg 28 <210> <211> 25 22 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E7 de HPV16 <400> 25 agaaccggac agagcccatt ac 22 <210> <211> 26 23 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E7 de HPV16 <400> 26 gcccattaac aggtcttcca aag 23 <210> <211> 27 28 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de PCR para E7 de HPV16 <400> 27 cgcacaaccg aagcgtagag tcacactt 28 <210> <211> 28 19 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para LI de HPV18 <400> 28 ttggttcagg ctggattgc 19 <210> 29 63 ΡΕ1421200 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para LI de HPV18 <400> 29 gcttggcagg tttagaagac 20 <210> <211> 30 29 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de PCR para LI de HPV18 <400> 30 cctcgcaaac gttctgctcc atctgccac 29 <210> <211> 31 19 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E6 de HPV18 <400> 31 agctgggcac tatagaggc 19 <210> <211> 32 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E6 de HPV18 <400> 32 tgtgtttctc tgcgtcgttg g 21 <210> <211> 33 26 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de PCR para E6 de HPV18 <400> 33 ccattcgtgc tgcaaccgag cacgac 26 <210> 34 64 ΡΕ1421200 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E7 de HPV18 <400> 34 gaaccacaac gtcacacaat g 21 <210> <211> 35 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência iniciadora de PCR para E7 de HPV18 <400> 35 cagaaacagc tgctggaatg 20 <210> <211> 36 33 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de PCR para E7 de HPV18 <400> 36 tctgctgagc tttctactac tagctcaatt ctg 33
Lisboa, 5 de Fevereiro de 2007
Claims (6)
- ΡΕ1421200 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a detecção da presença de um subtipo de papilomavírus humano (HPV) numa amostra contendo ácido nucleico, compreendendo: (a) amplificação de ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e de uma pluralidade de séries de oligonucleótidos; em que cada série de oligonucleótidos consiste (i) numa sequência iniciadora de PCR discriminatória directa que híbrida com uma primeira sequência de um subtipo de HPV, (ii) uma sequência iniciadora de PCR discriminatória reversa que híbrida com uma segunda sequência do subtipo de HPV a jusante da primeira sequência e (iii) uma sonda fluorescente marcada com uma molécula abafadora e um fluoróforo que emite energia num máximo de emissão único; a referida sonda híbrida com uma sequência do subtipo de HPV entre a primeira e segunda sequências; em que cada série de oligonucleótidos híbrida especificamente com um amplicão de HPV diferente derivado do mesmo subtipo de HPV; (b) digestão pela a referida polimerase de ácidos 2 ΡΕ1421200 nucleicos de cada uma das sondas fluorescentes durante a amplificação para dissociar o referido fluoróforo da referida molécula abafadora; (c) detecção de uma alteração da fluorescência quando da dissociação do fluoróforo e do abafador, a alteração de fluorescência correspondendo à ocorrência de amplificação de ácido nucleico; e (d) determinação de que a amostra é positiva para o subtipo de HPV se uma alteração da fluorescência for detectada em pelo menos dois máximos de emissão. 2. 0 método da reivindicação 1, em que o número de séries de oligonucleótidos é impar e em que a amostra é positiva para o subtipo de HPV se uma alteração da fluorescência for detectada numa maioria dos máximos de emissão. 3. 0 método da reivindicação 2, em que o número de séries de oligonucleótidos é três. 4. 0 método da reivindicação 3, em que as séries de oligonucleótidos hibridam especificamente com os genes E6, E7 e Ll. 5. 0 método da reivindicação 1, em que o abafador não é fluorescente. 3 ΡΕ1421200 6. 0 método da reivindicação 3, em que os fluoróforos são FAM, JOE e TET e o abafador é BHQ1. 7. 0 método da reivindicação 1, em que o subti-po de HPV é seleccionado do grupo consistindo em: HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18. 8. 0 método da reivindicação 3, em que o subti-po de HPV é seleccionado do grupo consistindo em: HPV6, HPV11, HPV16 e HPV18.
- 9. Um método de acordo com a reivindicação 1 para a detecção da presença de HPV6 numa amostra contendo ácido nucleico compreendendo: (a) amplificação do ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e três séries de oligonucleótidos; a primeira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID N0:1, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:2 e uma sonda como descrito em SEQ ID N0:3, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a segunda série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória 4 ΡΕ1421200 como descrito em SEQ ID NO:4, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:5 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 6, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a terceira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:7, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:8 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 9, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; (b) digestão das sondas com a polimerase de ácidos nucleicos para digerir cada uma das sondas durante a amplificação de forma a dissociar o referido fluoróforo da referida molécula abafadora; (c) detecção de uma alteração da fluorescência quando da dissociação do fluoróforo do abafador, a alteração da fluorescência correspondendo à ocorrência de amplificação de ácido nucleico; e (d) determinação de que a amostra é positiva para o subtipo de HPV6 se uma alteração da fluorescência for detectada com pelo menos duas sondas. 5 ΡΕ1421200
- 10. Um método de acordo com a reivindicação 1 para a detecção da presença de HPV11 numa amostra contendo ácido nucleico, compreendendo: (a) amplificação do ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e três séries de oligonucleótidos; a primeira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:10, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:11 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 12, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a segunda série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:13, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:14 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 15, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a terceira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória 6 ΡΕ1421200 como descrito em SEQ ID NO:16, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:17 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 18, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; (b) digestão das sondas com a polimerase de ácidos nucleicos para digerir cada uma das sondas durante a amplificação para dissociar o referido fluoróforo da referida molécula abafadora; (c) detecção de uma alteração da fluorescência quando da dissociação do fluoróforo do abafador, a alteração da fluorescência correspondendo à ocorrência de amplificação de ácido nucleico; e (d) determinação de que a amostra é positiva para o subtipo de HPV11 se uma alteração da fluorescência for detectada com pelo menos duas sondas.
- 11. Um método de acordo com a reivindicação 1 para a detecção da presença de HPV16 numa amostra contendo ácido nucleico, compreendendo: (a) amplificação do ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e três séries de oligonucleótidos; 7 ΡΕ1421200 a primeira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:19, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:20 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 21, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a segunda série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:22, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:23 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 24, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a terceira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:25, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:26 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 27, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; (b) digestão das sondas com a polimerase de ácidos nucleicos para digerir cada uma das sondas durante a 8 ΡΕ1421200 amplificaçao para dissociar o referido fluoróforo da referida molécula abafadora; (c) detecção de uma alteração da fluorescência quando da dissociação do fluoróforo do abafador, a alteração da fluorescência correspondendo à ocorrência de amplificação de ácido nucleico; e (d) determinação de que a amostra é positiva para o subtipo de HPV16 se uma alteração da fluorescência for detectada com pelo menos duas sondas.
- 12. Um método de acordo com a reivindicação 1 para a detecção da presença de HPV18 numa amostra contendo ácido nucleico, compreendendo: (a) amplificação do ácido nucleico na presença de uma polimerase de ácido nucleico e três séries de oligonucleótidos; a primeira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:28, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:29 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO:30, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; 9 ΡΕ1421200 a segunda série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID N0:31, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:32 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO: 33, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; a terceira série de oligonucleótidos consistindo numa sequência iniciadora de PCR directa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:34, uma sequência iniciadora de PCR reversa discriminatória como descrito em SEQ ID NO:35 e uma sonda como descrito em SEQ ID NO:36, a referida sonda marcada com BHQ1 no extremo 3' e com um fluoróforo no extremo 5', o referido fluoróforo sendo seleccionado do grupo consistindo em FAM, JOE e TET; (b) digestão das sondas com a polimerase de ácidos nucleicos para digerir cada uma das sondas durante a amplificação para dissociar o referido fluoróforo da referida molécula abafadora; (c) detecção de uma alteração da fluorescência quando da dissociação do fluoróforo do abafador, a alteração da fluorescência correspondendo à ocorrência de amplificação de ácido nucleico; e (d) determinação de que a amostra é positiva para 10 ΡΕ1421200 o subtipo de HPV18 se uma alteraçao da fluorescência for detectada com pelo menos duas sondas.
- 13. O método da reivindicação 9, 10, 11 ou 12, em que o fluoróforo da primeira série de oligonucleótidos é FAM, o fluoróforo da segunda série de oligonucleótidos é JOE e o fluoróforo da terceira série de oligonucleótidos é TET. Lisboa, 5 de Fevereiro de 2007
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