PT1392823E - Genes de dessaturases e utilizações destes - Google Patents

Description

ΕΡ 1 392 823/PT DESCRIÇÃO "Genes de dessaturases e utilizações destes"

Campo Técnico 0 presente invento refere-se à identificação e ao isolamento de genes que codificam enzimas (i.e. Δ5-dessaturase de Saprolegnia diclina, e Δβ-dessaturase de Saprolegnia diclina) envolvidas na síntese de ácidos gordos polinsaturados e a utilizações destes. Em particular, a Δ5-dessaturase catalisa a conversão, por exemplo, de ácido di-homo-Y-linolénico (DGLA) em ácido araquidónico (AA) e ácido (n-3)-eicosatetraenóico (20:4n-3) em ácido eicosapentaenóico (20:5n-3). A delta-6-dessaturase catalisa a conversão, por exemplo, de ácido α-linolénico (ALA) em ácido estearidónico (STA). Os produtos convertidos podem então ser utilizados como substratos na produção de outros ácidos gordos polinsaturados (PUFA). 0 produto ou outros ácidos gordos polinsaturados podem ser adicionados a composições farmacêuticas, composições nutricionais, rações animais bem como outros produtos tais como cosméticos.

Informação Antecedente

As dessaturases são críticas na produção de ácidos gordos polinsaturados de cadeia longa que possuem muitas funções importantes. Por exemplo, os ácidos gordos polinsaturados (PUFA) são importantes componentes da membrana plasmática de uma célula, onde se encontram na forma de fosfolípidos. Servem também como precursores das prostaciclinas, eicosanóides, leucotrienos e prostaglandinas de mamífero. Adicionalmente, os PUFA são necessários para o desenvolvimento correcto do cérebro de crianças em desenvolvimento bem como para a formação e reparação de tecidos. À luz do significado biológico dos PUFA, estão a ser feitas tentativas para os produzir, bem como intermediários conduzindo à sua produção, de um modo eficiente. Várias enzimas estão envolvidas na biossíntese de PUFA para além da A5-dessaturase e Δβ-dessaturase. Por exemplo, a elongase (elo) catalisa a conversão de ácido γ-linolénico 2

ΕΡ 1 392 823/PT (GLA) em ácido di-homo-Y-linolénico (DGLA) e de ácido estearidónico (18:4n-3) em ácido (n-3)-eicosatetraenóico (20:4n-3). O ácido linoleico (LA, 18:2-Δ9,12 ou 18:2n-6) é produzido a partir de ácido oleico (18:1 — Δ9) através de uma ál2-dessaturase. GLA (18:3-Δ6,9,12) é produzido a partir de ácido linoleico através de uma Δβ-dessaturase.

Deve observar-se que os animais não podem dessaturar para além da posição Δ9 e portanto não podem converter o ácido oleico em ácido linoleico. De igual modo, o ácido a-linolénico (ALA, 18:3-Δ9,12, 15) não pode ser sintetizado por mamíferos. No entanto, o ácido α-linolénico pode ser convertido em ácido estearidónico (STA, 18:4-ΔΑ6,9,12,15) através de uma Δβ-dessaturase (ver publicação PCT WO 96/13591 e The Faseb Journal, Resumos, Parte I, Resumo 3093, página A532 (Experimental Biology 98, San Francisco, CA, 18-22 de Abril de 1998); ver também Patente U.S. No. 5552306), seguido de alongamento para ácido (n-3)-eicosatetraenóico (20;4 — Δ8,11,14,17) em mamíferos e algas. Este ácido gordo polinsaturado (i.e., 20:4-Δ8,11,14,17) pode então ser convertido em ácido eicosapentaenóico (EPA, 20:5-Δ5, 8, 11, 14, 17) através de uma A5-dessaturase, tal como a do presente invento. Outros eucariotas, incluindo fungos e plantas, têm enzimas que dessaturam no carbono 12 (ver publicação PCT WO 94/11516 e Patente U.S. No. 5443974) e no carbono 15 (ver publicação PCT WO 93/11245) . Os principais ácidos gordos polinsaturados dos animais são portanto derivados da dieta e/ou de dessaturação e alongamento do ácido linoleico ou do ácido α-linolénico. Tendo em vista estas dificuldades, é de interesse significativo isolar os genes envolvidos na síntese de PUFA a partir de espécies que produzam naturalmente estes ácidos gordos e expressar estes genes num sistema microbiano, vegetal, ou animal que possa ser alterado para proporcionar a produção de quantidades comerciais de um ou mais PUFA.

Um dos PUFA de cadeia longa mais importantes, observados acima, é o ácido araquidónico (AA) . O AA encontra-se em fungos filamentosos e pode também ser purificado a partir de tecidos de mamífero incluindo o fígado e as glândulas supra-renais. Tal como observado acima, a produção de AA a partir de ácido di-homo-Y-linolénico é catalisada por uma Δ5- 3 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ dessaturase. ΕΡΑ é outro PUFA de cadeia longa importante. 0 EPA encontra-se em fungos e também em óleos marinhos. Tal como observado acima, o EPA é produzido a partir de ácido (n-3)-eicosatetraenóico e é catalisado por uma Δδ-dessaturase. À luz da discussão acima, existe uma clara necessidade das enzimas A5-dessaturase e Δβ-dessaturase, dos genes respectivos codificando estas enzimas, bem como de métodos recombinantes de produção destas enzimas. Adicionalmente, existe a necessidade de óleos contendo niveis de PUFA além dos naturalmente presentes bem como aqueles enriquecidos em novos PUFA. Tais óleos apenas podem ser produzidos através de isolamento e expressão dos genes da Δδ-dessaturase e Δβ-dessaturase .

SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento inclui uma sequência nucleotidica isolada ou um fragmento compreendendo ou complementar a pelo menos 90% de uma sequência nucleotidica compreendendo SEQ ID N0:13 (Figura 2) ou SEQ ID NO:19 (Figura 4). Em particular, a sequência nucleotidica isolada pode ser representada por SEQ ID NO:13 ou SEQ ID NO:19. Estas sequências podem codificar uma dessaturase funcionalmente activa que utiliza um ácido gordo polinsaturado como substrato.

Além disso, o presente invento engloba uma sequência nucleotidica isolada compreendendo ou complementar a uma sequência nucleotidica codificando um polipéptido possuindo actividade de dessaturase e possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos consistindo em SEQ ID NO:20.

As sequências nucleotidicas podem ser derivadas, por exemplo, de um fungo tal como Saprolegnia diclina (SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:19). O presente invento inclui também proteínas ou polipéptidos purificados codificados pelas sequências nucleotidicas referidas acima.

Adicionalmente, o presente invento inclui um polipéptido purificado que dessatura ácidos gordos polinsaturados no 4

ΕΡ 1 392 823/PT carbono 5 ou no carbono 6 e tem pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos das proteínas purificados de SEQ ID NO:14 ou SEQ ID NO:20.

Além disso, o presente invento engloba também um método de produção de uma dessaturase (i.e., Δ5 ou Δ6). Este método compreende os passos de: a) isolamento da sequência nucleotídica seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 13; b) construção de um vector compreendendo: i) a sequência nucleotídica isolada operativamente ligada a ii) uma sequência reguladora; e c) introdução do vector numa célula hospedeira durante um tempo e sob condições suficientes para expressão da Δό-dessaturase ou Δβ-dessaturase, conforme apropriado. A célula hospedeira pode ser, por exemplo, uma célula eucariótica ou uma célula procariótica. Em particular, a célula procariótica pode ser, por exemplo, E. coli, Cianobactérias ou B. subtilis. A célula eucariótica pode ser, por exemplo, uma célula de mamífero não humano, uma célula de insecto, uma célula vegetal ou uma célula fúngica (p.ex., uma célula de levedura tal como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida sps., Lipomyces starkey, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces sps., Hansenula sps., Trichoderma sps. ou Pichia sps.).

Adicionalmente, o presente invento engloba também um vector compreendendo: a) uma sequência nucleotídica seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:19 operativamente ligada a b) uma sequência reguladora. O invento inclui também uma célula hospedeira não humana compreendendo este vector. A célula hospedeira não humana pode ser, por exemplo, uma célula eucariótica ou uma célula procariótica. As células eucarióticas e células procarióticas adequadas são tal como definidas acima.

Além disso, o presente invento inclui também uma célula vegetal, planta ou tecido vegetal compreendendo o vector acima, em que a expressão da sequência nucleotídica do vector resulta na produção de pelo menos um ácido gordo polinsaturado pela célula vegetal, planta ou tecido vegetal. O ácido gordo polinsaturado pode ser, por exemplo, seleccionado a partir do grupo que consiste em AA, EPA, GLA e 5 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ STA, dependendo de se a sequência nucleotídica codifica uma Δ5 ou Δβ-dessaturase.

Adicionalmente, o presente invento engloba também uma planta transgénica compreendendo o vector acima, em que a expressão da sequência nucleotídica do vector resulta na produção de um ácido gordo polinsaturado em sementes da planta transgénica.

Também, o invento inclui uma célula de mamífero não humano compreendendo o vector acima em que a expressão da sequência nucleotídica do vector resulta na produção ou níveis alterados de AA, EPA, GLA ou STA quando a célula é criada num meio de cultura compreendendo um ácido gordo seleccionado a partir do grupo que consiste em LA, ALA, DGLA e ESP.

Adicionalmente, o presente invento inclui um método (i.e., "primeiro" método) para a produção de um ácido gordo polinsaturado compreendendo os passos de: a) isolamento da sequência nucleotídica de SEQ ID NO:19; b) construção de um vector compreendendo a sequência nucleotídica isolada; c) introdução do vector numa célula hospedeira sob tempo e condições suficientes para expressão da enzima Δ5-dessaturase; e d) exposição da enzima A5-dessaturase expressa a um ácido gordo polinsaturado substrato para converter o substrato num ácido gordo polinsaturado produto. 0 ácido gordo polinsaturado substrato pode ser DGLA ou 20:4n-3 e o ácido gordo polinsaturado produto pode ser AA ou EPA, respectivamente. Este método pode ainda compreender o passo de exposição do ácido gordo polinsaturado produto a uma elongase para converter o ácido gordo polinsaturado produto noutro ácido gordo polinsaturado (i.e., "segundo" método). Neste método contendo o passo adicional (i.e., "segundo" método), o ácido gordo polinsaturado produto pode ser AA ou EPA, e o "outro" ácido gordo polinsaturado pode ser ácido adrénico ou ácido (n-3)-docosapentaenóico, respectivamente. 0 método contendo o passo adicional pode ainda compreender um passo de exposição do outro ácido gordo polinsaturado a uma dessaturase adicional para converter o outro ácido gordo polinsaturado num ácido gordo polinsaturado final (i.e., "terceiro" método). 0 ácido gordo polinsaturado final pode 6

ΕΡ 1 392 823/PT ser ácido (n-6)-docosapentaenóico ou ácido docosa-hexaenóico (DHA) .

Adicionalmente, o presente invento inclui um método para produção de um ácido gordo polinsaturado compreendendo os passos de: a) isolamento da sequência nucleotidica representada por SEQ ID NO:13; b) construção de um vector compreendendo a sequência nucleotidica isolada; c) introdução do vector numa célula hospedeira durante um tempo e sob condições suficientes para expressão da enzima Δ6- dessaturase; e d) exposição da enzima Δβ-dessaturase expressa a um ácido gordo polinsaturado substrato para converter o substrato num ácido gordo polinsaturado produto. 0 ácido gordo polinsaturado substrato pode ser LA ou ALA, e o ácido gordo polinsaturado produto pode ser GLA ou STA, respectivamente. Este método pode ainda incluir o passo de exposição do ácido gordo polinsaturado produto a uma elongase para converter o ácido gordo polinsaturado produto noutro ácido gordo polinsaturado. Neste método contendo o passo adicional, o ácido gordo polinsaturado produto pode ser GLA ou STA, e o "outro" ácido gordo polinsaturado pode ser DGLA ou ácido eicosatetraenóico (ETA), respectivamente. 0 método contendo o passo adicional pode ainda compreender um passo de exposição do outro ácido gordo polinsaturado a uma dessaturase adicional para converter o outro ácido gordo polinsaturado num ácido gordo polinsaturado final. 0 ácido gordo polinsaturado final pode ser AA ou EPA.

Deve observar-se que a cada sequência nucleotidica e de aminoácidos aqui referida foi atribuído um determinado número de identificação da sequência. A Listagem de Sequências (que se encontra aqui) lista cada uma dessas sequências e o seu número correspondente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras 6-15 não fazem parte do presente invento. A Figura 1 ilustra a via biossintética dos ácidos gordos e os papéis da A5-dessaturase e da Δβ-dessaturase nesta via. 7

ΕΡ 1 392 823/PT A Figura 2 ilustra a sequência nucleotidica codificando a Δβ-dessaturase de Saprolegnia diclina (ATCC 56851) (SEQ ID NO:13). A Figura 3 ilustra a sequência de aminoácidos da Δβ-dessaturase de Saprolegnia diclina (ATCC 56851) (SEQ ID NO:14). A Figura 4 ilustra a sequência nucleotidica codificando a A5-dessaturase de Saprolegnia diclina (ATCC 56851) (SEQ ID NO:19). A Figura 5 ilustra a sequência de aminoácidos da Δ5-dessaturase de Saprolegnia diclina (ATCC 56851) (SEQ ID NO:2 0) . A Figura 6 ilustra a sequência nucleotidica codificando a A5-dessaturase de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) (SEQ ID NO:28). A Figura 7 ilustra a sequência de aminoácidos da Δ5-dessaturase de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) (SEQ ID NO:2 9) . A Figura 8 ilustra a sequência nucleotidica codificando a á5-dessaturase de Thraustochytrium aureum (BICC7091) (SEQ ID NO:30). A Figura 9 ilustra a sequência de aminoácidos traduzida da A5-dessaturase de Thraustochytrium aureum (HICC7091) (SEQ ID NO:31). A Figura 10 ilustra a sequência nucleotidica codificando a Δβ-dessaturase de Thraustochytrium aureum (BICC7091) (SEQ ID NO:32). A Figura 11 ilustra a sequência de aminoácidos traduzida da Δβ-dessaturase de Thraustochytrium aureum (BICC7091) (SEQ ID NO:33). 8

ΕΡ 1 392 823/PT A Figura 12 ilustra a identidade da sequência de aminoácidos da A5-dessaturase entre os clones pRAT-2a e pRAT-2c. A Figura 13 ilustra a identidade da sequência de aminoácidos da Δβ-dessaturase entre os clones pRAT-la e pRAT-lb.

A Figura 14 ilustra a sequência nucleotidica codificando o gene da A5-dessaturase de Isochrysis galbana CCMP1323 (SEQ ID NO:34). A Figura 15 ilustra a sequência de aminoácidos traduzida da A5-dessaturase de Isochrysis galbana CCMP1323 (SEQ ID NO:35).

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento refere-se à sequência nucleotidica e de aminoácidos traduzida de um gene da A5-dessaturase derivado de Saprolegnia diclina e um gene da Δβ-dessaturase derivado de Saprolegnia diclina. Além disso, o presente invento inclui também utilizações destes genes e das enzimas codificadas por estes genes. Por exemplo, os genes e correspondentes enzimas podem ser utilizados na produção de ácidos gordos polinsaturados tais como, por exemplo, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenóico, e/ou ácido adrénico que podem ser adicionados a composições farmacêuticas, composições nutricionais e a outros produtos com valor.

Os Genes de Δδ-Dessaturase, os Genes de Δβ-Dessaturase, e Enzimas Codificadas por Estes

Tal como observado acima, as enzimas codificadas pelos genes da A5-dessaturase e os genes da Δβ-dessaturase do presente invento são essenciais na produção de ácidos gordos polinsaturados altamente saturados possuindo um comprimento superior a 20 e 18 carbonos, respectivamente. A sequência nucleotidica do gene da A5-dessaturase de Saprolegnia diclina isolado é mostrada na Figura 4, e a sequência de aminoácidos da correspondente proteina purificada é mostrada na Figura 5. A sequência nucleotidica do gene da Δβ-dessaturase de 9

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Saprolegnia diclina isolado é mostrada na Figura 2, e a sequência de aminoácidos da correspondente proteína purificada é mostrada na Figura 3.

Como exemplo da importância dos genes do presente invento, os genes da A5-dessaturase isolados convertem DGLA em AA ou convertem ácido eicosatetraenóico em EPA. AA, por exemplo, não pode ser sintetizado sem os genes da Δ5-dessaturase e as enzimas codificadas por estes. 0 gene da Δ6-dessaturase isolado do presente invento converte, por exemplo, ácido linoleico (18:2n-6) em ácido γ-linoleico (GLA) e ácido γ-linolénico (GLA) em ácido estearidónico (STA) .

Deve observar-se que o presente invento engloba também sequências nucleotídicas (e as correspondentes proteínas codificadas) possuindo sequências compreendendo ou complementares a pelo menos 90% dos nucleótidos na sequência (i.e., possuindo identidade de sequência) com SEQ ID NO: 19 (i.e., a sequência nucleotídica do gene da á5-dessaturase de Saprolegnia diclina), SEQ ID NO:13 (i.e., a sequência nucleotídica do gene da Δβ-dessaturase de Saprolegnia diclina. (Todos os inteiros entre 90% e 100% são também considerados estarem dentro do âmbito do presente invento em relação à percentagem de identidade). Tais sequências podem ser derivadas a partir de fontes humanas bem como outras fontes não humanas (p.ex., C. elegans ou ratinho). O invento inclui também um polipéptido purificado que dessatura ácidos gordos polinsaturados na posição do carbono 5 ou na posição do carbono 6 e tem pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com as sequências de aminoácidos (i.e., SEQ ID NO: 14 (mostrada na Figura 3) e SEQ ID NO:20 (mostrada na Figura 5) ) das proteínas acima observadas que são, por sua vez, codificadas pelas sequências nucleotídicas acima descritas. Todos os inteiros entre 90-100% de semelhança ou identidade estão também incluídos dentro do âmbito do invento. 0 termo "identidade" refere-se ao parentesco de duas sequências numa base nucleótido-a-nucleótido ao longo de uma determinada janela ou segmento de comparação. Assim, a identidade é definida como o grau de identidade, 10

ΕΡ 1 392 823/PT correspondência ou equivalência entre as mesmas cadeias (sentido ou anti-sentido) de dois segmentos de ADN. A "percentagem de identidade de sequência" é calculada através da comparação de duas sequências alinhadas de modo óptimo ao longo de uma determinada região, determinação do número de posições nas quais ocorre a base idêntica em ambas as sequências para dar o número de posições coincidentes, divisão do número de tais posições pelo número total de posições no segmento a comparar e multiplicação do resultado por 100. 0 alinhamento óptimo de sequências pode ser conduzido através do algoritmo de Smith & Waterman, Appl. Math. 2: 482 (1981), através do algoritmo de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), através do método de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85: 2444 (1988) e através de programas de computador que implementam os algoritmos relevantes (p.ex., Clustal Macaw Pileup (http: //cmgm.stanford.edu/ biochem218/llMultiple.pdf; Higgins et al., CABIOS. 5L151-153 (1989)), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information; Altschul et al., Nucleic Acids Research 25: 3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI) ou GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WI). (Ver Patente U.S. No. 5912120.)

Para fins do presente invento, "complementaridade" é definida como o grau de parentesco entre dois segmentos de ADN. É determinada através da medição da capacidade da cadeia com sentido de um segmento de ADN para hibridar com a cadeia anti-sentido do outro segmento de ADN, sob condições apropriadas, para formar uma dupla hélice. Na dupla hélice, a adenina surge numa cadeia, a timidina surge na outra cadeia. Semelhantemente, sempre que se verifica guanina numa cadeia, verifica-se citosina na outra. Quanto maior for o parentesco entre as sequências nucleotidicas de dois segmentos de ADN, maior a capacidade para formar dúplexes híbridos entre as cadeias dos dois segmentos de ADN. "Semelhança" entre duas sequências de aminoácidos é definida como a presença de uma série de resíduos de aminoácidos idênticos bem como conservados em ambas as sequências. Quanto mais elevado o grau de semelhança entre as 11 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ sequências de aminoácidos, mais elevada a correspondência, identidade ou equivalência das duas sequências. ("Identidade entre duas sequências de aminoácidos é definida como a presença de uma série de resíduos de aminoácidos exactamente semelhantes ou invariantes em ambas as sequências). As definições de "complementaridade", "identidade" e "semelhança" são bem conhecidos dos vulgares peritos na técnica. "Codificado por" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma sequência polipeptídica, em que a sequência polipeptídica ou uma porção desta contém uma sequência de aminoácidos de pelo menos 3 aminoácidos, de preferência pelo menos 8 aminoácidos, e ainda de preferência pelo menos 15 aminoácidos de um polipéptido codificado pela sequência de ácido nucleico. 0 presente invento engloba também uma sequência nucleotídica isolada que codifica actividade de dessaturase de PUFA e que é hibridável, sob condições moderadamente rigorosas, com um ácido nucleico possuindo uma sequência nucleotídica compreendendo ou complementar à sequência nucleotídica compreendendo SEQ ID NO:13 (mostrada na Figura 2), SEQ ID NO: 19 (mostrada na Figura 4) . Uma molécula de ácido nucleico é "hibridável" com outra molécula de ácido nucleico quando uma forma de cadeia simples da molécula de ácido nucleico se pode ligar a outra molécula de ácido nucleico sob as condições apropriadas de temperatura e força iónica (ver Sambrook et ai., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edição (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)). As condições de temperatura e força iónica determinam o "rigor" da hibridação. A "hibridação" requer que que dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares. No entanto, dependendo do rigor da hibridação, podem ocorrer desemparelhamentos entre as bases. 0 rigor adequado para hibridação de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementação. Tais variáveis são bem conhecidas na técnica. Mais especificamente, quanto maior for o grau de semelhança ou homologia entre duas sequências nucleotídicas, maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos possuindo essas sequências. Para híbridos 12 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ de mais de 100 nucleótidos de comprimento, foram derivadas equações para calcular a Tm (ver Sambrook et ai., supra) . Para hibridação com ácidos nucleicos mais curtos, a posição dos desemparelhamentos torna-se mais importante, e o comprimento do oligonucleótido determina a sua especificidade (ver Sambrook et ai., supra).

Tal como aqui se utiliza, um "fragmento ou sequência de ácido nucleico isolado" é um polímero de ARN ou ADN que é de cadeia simples ou dupla, contendo opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas. Um fragmento de ácido nucleico isolado na forma de um polímero de ADN pode ser constituído por um ou mais segmentos de ADNc, ADN genómico ou ADN sintético. (Um "fragmento" de um polinucleótido especificado refere-se a uma sequência polinucleotídica que compreende uma sequência contígua de aproximadamente pelo menos cerca de 6 nucleótidos, de preferência pelo menos cerca de 8 nucleótidos, de maior preferência pelo menos cerca de 10 nucleótidos, ainda de preferência pelo menos cerca de 15 nucleótidos, e ainda de maior preferência pelo menos cerca de 25 nucleótidos idênticos ou complementares a uma região da sequência nucleotídica especificada). Os nucleótidos (habitualmente verificados na sua forma 5'-monofosfato) são referidos através da sua designação de letra única como se segue: "A" para adenilato ou desoxiadenilato (para ARN ou ADN, respectivamente), "C" para citidilato ou desoxicitidilato, "G" para guanilato ou desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G) , "Y" para pirimidinas (C ou T) , "K" para G ou T, "H" para A ou C ou T, "I" para inosina, e "N" para qualquer nucleótido.

Os termos "fragmento ou subfragmento que é funcionalmente equivalente" e "fragmento ou subfragmento funcionalmente equivalente" são aqui utilizados alternadamente. Estes termos referem-se a uma porção ou subsequência de um fragmento de ácido nucleico isolado no qual a capacidade para alterar a expressão génica ou produzir um certo fenótipo é mantida quer o fragmento ou subfragmento codifique ou não uma enzima activa. Por exemplo, o fragmento ou subfragmento pode ser utilizado no desenho de construções quiméricas para produzir o fenótipo desejado numa planta 13

ΕΡ 1 392 823/PT transformada. Construções quiméricas podem ser desenhadas para utilizar em co-supressão ou anti-sentido através da ligação de um fragmento ou subfragmento de ácido nucleico desta, que codifique ou não uma enzima activa, na orientação apropriada relativamente a uma sequência promotora vegetal.

Os termos "homologia", "homólogo", "substancialmente semelhante" e "correspondendo substancialmente" são aqui utilizados alternadamente. Referem-se a fragmentos de ácidos nucleicos em que as alterações numa ou mais bases nucleotidicas não afectam a capacidade do fragmento de ácido nucleico para mediar a expressão génica ou produzir um certo fenótipo. Estes termos referem-se também a modificações dos fragmentos de ácido nucleico do presente invento tais como deleção ou inserção de um ou mais nucleótidos que não alteram substancialmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucleico resultante relativamente ao fragmento inicial, não modificado. Entenda-se portanto, tal como os peritos na técnica apreciarão, que o invento engloba mais de uma sequência exemplar especifica. "Gene" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína especifica, incluindo sequências reguladoras antes (sequências não codificadoras a 5') e após (sequências não codificadoras a 3') a sequência de codificação. "Gene nativo" refere-se a um gene tal como verificado na natureza com as suas próprias sequências reguladoras. Em contraste, "construção quimérica" refere-se a uma combinação de fragmentos de ácido nucleico que normalmente não são verificados juntos na natureza. Concordantemente, uma construção quimérica pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de um modo diferente do normalmente verificado na natureza. (0 termo "isolado" significa que a sequência é removida do seu ambiente natural).

Um gene "estranho" refere-se a um gene normalmente verificado no organismo hospedeiro mas que é introduzido no 14

ΕΡ 1 392 823/PT organismo hospedeiro através de transferência génica. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos num organismo não nativo ou construções quiméricas. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma através de um procedimento de transformação. "Sequência de codificação" refere-se a uma sequência de ADN que codifica para uma sequência de aminoácidos especifica. "Sequências reguladoras" referem-se a sequências nucleotidicas localizadas a montante (sequências não codificadoras a 5'), dentro, ou a jusante (sequências não codificadoras a 3') de uma sequência de codificação, e que influenciam a transcrição, o processamento ou a estabilidade do ARN, ou a tradução da sequência de codificação associada. As sequências reguladoras podem incluir, mas não se limitam a, promotores, sequências líder da tradução, intrões, e sequências de reconhecimento de poliadenilação. "Promotor" refere-se a uma sequência de ADN capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou de ARN funcional. A sequência promotora consiste em elementos a montante proximais e mais distais, os últimos elementos frequentemente referidos como estimuladores. Concordantemente, um "estimulador" é uma sequência de ADN que pode estimular a actividade promotora e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para estimular o nível ou especificidade de tecido de um promotor. As sequências promotoras podem também ser localizadas dentro das porções transcritas dos genes, e/ou a jusante das sequências transcritas. Os promotores podem ser derivados na sua totalidade de um gene nativo, ou ser constituídos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores verificados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de ADN sintéticos. É entendido pelos peritos na técnica que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos celulares, ou em diferentes estádios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Os promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos celulares na maior parte das vezes são vulgarmente referidos como "promotores constitutivos". Novos promotores de vários tipos úteis em células vegetais estão constantemente a ser descobertos; 15

ΕΡ 1 392 823/PT numerosos exemplos podem ser verificados na compilação de Okamuro e Goldberg, (1989) Biochemistry of Plants 15: 1-82. É ainda reconhecido que uma vez que na maioria dos casos os limites exactos das sequências reguladoras não foram completamente definidos, os fragmentos de ADN de alguma variação podem ter actividade promotora idêntica.

Um "intrão" é uma sequência interveniente num gene que não codifica uma porção da sequência proteica. Assim, tais sequências são transcritas em ARN mas são então excisadas e não traduzidas. 0 termo é também utilizado para as sequências de ARN excisadas. Um "exão" é uma porção da sequência de um gene que é transcrita e é verificada no ARN mensageiro maduro derivado do gene, mas não é necessariamente uma parte da sequência que codifica o produto génico final. A "sequência lider de tradução" refere-se a uma sequência de ADN localizada entre a sequência promotora de um gene e a sequência de codificação. A sequência lider de tradução está presente no ARNm totalmente processado a montante da sequência de início da tradução. A sequência líder de tradução pode afectar o processamento do transcrito primário em ARNm, a estabilidade do ARNm ou a eficiência da tradução. Exemplos das sequências líder de tradução foram descritos (Turner, R. e Foster, G. D. (1995) Molecular Bíotechnology 3: 225).

As "sequências não codificadoras a 3'" referem-se a sequências de ADN localizadas a jusante de uma sequência de codificação e incluem sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências codificando sinais reguladores capazes de afectar o processamento do ARNm ou a expressão do gene. 0 sinal de poliadenilação é habitualmente caracterizado por afectar a adição de tractos de ácido poliadenílico à extremidade 3' do precursor de ARNm. A utilização de diferentes sequências não codificadoras a 3' é exemplificada por Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1: 671-680. O "transcrito de ARN" refere-se ao produto resultante da transcrição catalisada por ARN-polimerase de uma sequência de ADN. Quando o transcrito de ARN é uma cópia complementar 16

ΕΡ 1 392 823/PT perfeita da sequência de ADN, é referido como o transcrito primário ou pode ser uma sequência de ARN derivada de processamento pós-transcrição do transcrito primário e é referido como o ARN maduro. "ARN mensageiro (ARNm)" refere-se ao ARN que está sem intrões e que pode ser traduzido em proteína pela célula. "ADNc" refere-se a um ADN que é complementar e sintetizado a partir de um molde de ARNm utilizando a enzima transcriptase inversa. 0 ADNc pode ser de cadeia simples ou convertido na forma de cadeia dupla utilizando o fragmento de Klenow da ADN-polimerase I. ARN "com sentido" refere-se a um transcrito de ARN que inclui o ARNm e pode ser traduzido em proteína dentro de uma célula ou in vitro. "ARN anti-sentido" refere-se a um transcrito de ARN que é complementar a todo ou parte de um transcrito primário ou ARNm alvo e que bloqueia a expressão de um gene alvo (Patente U.S. No. 5107065). A complementaridade de um ARN anti-sentido pode ser com qualquer parte do transcrito específico do gene, i.e., na sequência não codificadora a 5', sequência não codificadora a 3', intrões, ou sequência de codificação. "ARN funcional" refere-se a ARN anti-sentido, ARN ribozima, ou outro ARN que possa não ser traduzido mas que tenha ainda um efeito em processos celulares. Os termos "complemento" e "complemento inverso" são aqui utilizados alternadamente em relação aos transcritos de ARNm, e pretende-se que definam o ARN anti-sentido da mensagem. O termo "ARN endógeno" refere-se a qualquer ARN que é codificado por qualquer sequência de ácido nucleico presente no genoma do hospedeiro antes da transformação com a construção recombinante do presente invento, de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, i.e., introduzido através de meios recombinantes, mutagénese, etc. 0 termo "de ocorrência não natural" significa artificial, não consistente com o que é normalmente verificado na natureza. O termo "operativamente ligado" refere-se à associação de sequências de ácido nucleico num único fragmento de ácido nucleico de modo a que a função de uma seja regulada pela outra. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma sequência de codificação quando é capaz de regular a 17

ΕΡ 1 392 823/PT expressão dessa sequência de codificação (i.e., que a sequência de codificação está sob o controlo transcricional do promotor). As sequências de codificação podem estar operativamente ligadas a sequências reguladoras numa orientação com sentido ou anti-sentido. Noutro exemplo, as regiões complementares de ARN do invento podem estar operativamente ligadas, directamente ou indirectamente, a 5' do ARNm alvo, ou a 3' do ARNm alvo, ou dentro do ARNm alvo, ou uma primeira região complementar está a 5' e o seu complemento a 3' do ARNm alvo. 0 termo "expressão", tal como aqui se utiliza, refere-se à produção de um produto final funcional. A expressão de um gene envolve a transcrição do gene e a tradução do ARNm numa proteína precursora ou madura. "Inibição anti-sentido" refere-se à produção de transcritos de ARN anti-sentido capazes de suprimir a expressão da proteína alvo. "Co-supressão" refere-se à produção de transcritos de ARN com sentido capazes de suprimir a expressão de genes estranhos ou endógenos idênticos ou substancialmente semelhantes (Patente U.S. No. 5231020).

Proteína "madura" refere-se a um polipéptido processado após a tradução; i.e. um do qual foram removidos quaisquer pré-péptidos ou pró-péptidos presentes no produto de tradução primário. A proteína "precursora" refere-se ao produto primário de tradução do ARNm; i.e., com pré-péptidos e pró-péptidos ainda presentes. Os pré-péptidos e pró-péptidos podem ser, mas não se limitam a, sinais de localização intracelular. "Transformação estável" refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico para um genoma de um organismo hospedeiro, incluindo tanto genomas nucleares como organelares, resultando em hereditariedade geneticamente estável. Em contraste, a "transformação transiente" refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico para o núcleo, ou organelo contendo ADN, de um organismo hospedeiro resultando em expressão génica sem integração ou hereditariedade estável. Os organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são referidos como organismos "transgénicos". O método preferido de 18

ΕΡ 1 392 823/PT transformação celular do arroz, milho e outras monocotiledóneas é a utilização de tecnologia de transformação por partículas aceleradas ou "canhão de genes" (Klein et al., (1987) Nature (London) 327: 70-73; Patente U.S. No. 4945050), ou um método mediado por Agrobacterium utilizando um plasmídeo Ti apropriado contendo o transgene (Ishida Y. et ai., 1996, Nature Biotech. 14: 745-750). O termo "transformação" tal como aqui se utiliza refere-se tanto à transformação estável como à transformação transiente. O ADN recombinante padrão e as técnicas de clonagem molecular aqui utilizadas são bem conhecidos na técnica e estão descritos mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (adiante "Sambrook"). O termo "recombinante" refere-se a uma combinação artificial de dois segmentos de outro modo separados da sequência, p.ex., através de síntese química ou através da manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos através de técnicas de engenharia genética. "PCR" ou "Reacção em Cadeia da Polimerase" é uma técnica para a síntese de grandes quantidades de segmentos de ADN específicos, consiste numa série de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Tipicamente, o ADN de cadeia dupla é desnaturado com calor, os dois iniciadores complementares aos limites 3' do segmento alvo são ligados a baixa temperatura e depois prolongados a uma temperatura intermédia. Um conjunto destes três passos consecutivos é referido como um ciclo. A reacção em cadeia da polimerase (PCR) é uma poderosa técnica utilizada para amplificar ADN milhões de vezes, através de replicação repetida de um molde, num curto período de tempo (Mullis et al., "Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol." 51: 263-273 (1986); Erlich et al. , Pedido de Patente Europeia 50424; Pedido de Patente Europeia 84796; Pedido de Patente Europeia 258017, Pedido de Patente Europeia 237362; Mullis, Pedido de Patente Europeia 201184, Mullis et al. , 19

ΕΡ 1 392 823/PT

Patente U.S. No. 4683202/ Erlich, Patente U.S. No. 4582788/ e Saiki et al. , Patente U.S. No. 4683194). O processo utiliza conjuntos de oligonucleótidos específicos sintetizados in vitro para iniciar a síntese de ADN. O desenho dos iniciadores é dependente das sequências de ADN que se deseja analisar. A técnica é realizada através de muitos ciclos (habitualmente 20-50) de fusão do molde a elevada temperatura, permitindo que os iniciadores se liguem a sequências complementares dentro do molde e depois repliquem o molde com ADN-polimerase.

Os produtos das reacções de PCR são analisados através de separação em géis de agarose seguida de coloração com brometo de etídio e visualização com transiluminação de UV. Alternativamente, podem ser adicionados dNTP radioactivos à PCR para incorporar um marcador nos produtos. Neste caso os produtos de PCR são visualizados através de exposição do gel a película de raios x. A vantagem acrescida da radiomarcação de produtos de PCR é que os níveis de produtos de amplificação individuais podem ser quantificados.

Os termos "construção recombinante", "construção de expressão" e "construção de expressão recombinante" são aqui utilizados alternadamente. Estes termos referem-se a uma unidade funcional de material genético que pode ser inserida no genoma de uma célula utilizando metodologia padrão bem conhecida de um perito na técnica. Tal construção pode ser ela própria utilizada em conjunto com um vector. Se for utilizado um vector então a escolha do vector está dependente do método que será utilizado para transformar plantas hospedeiras tal como é bem conhecido dos peritos na técnica. Por exemplo, pode ser utilizado um vector plasmídico. O perito está bem ciente dos elementos genéticos que têm de estar presentes no vector para transformar com sucesso, seleccionar e propagar células hospedeiras compreendendo qualquer um dos fragmentos de ácido nucleico isolados do invento. O perito reconhecerá também que diferentes eventos de transformação independentes resultarão em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones et al., (1985) EMBO J. 4: 2411-2418/ De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218: 78-86), e assim que múltiplos eventos têm de ser pesquisados para obter linhas apresentando o nível e padrão 20

ΕΡ 1 392 823/PT de expressão desejados. Tal pesquisa pode ser alcançada através de análise Southern do ADN, análise Northern da expressão do ARNm, análise Western da expressão proteica, ou análise fenotípica.

Produção das Enzimas Δδ-Dessaturase e das Enzimas Δ6-Dessaturase

Uma vez isolado o gene codificando qualquer uma das enzimas dessaturases, este pode então ser introduzido numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica através da utilização de um vector ou construção. 0 vector, por exemplo, um bacteriófago, cosmídeo ou plasmídeo, pode compreender a sequência nucleotidica codificando uma das enzimas Δ5-dessaturase, ou a enzima Δβ-dessaturase, bem como qualquer sequência reguladora (p.ex., promotor) que seja funcional na célula hospedeira e seja capaz de desencadear a expressão da dessaturase codificada pela sequência nucleotidica. A sequência reguladora está numa associação operativa com ou operativamente ligada à sequência nucleotidica. (Tal como observado acima, uma sequência reguladora é referida como estando "operativamente ligada" a uma de codificação se a sequência reguladora afectar a transcrição ou expressão da sequência de codificação). Promotores adequados incluem, por exemplo, os dos genes codificando álcool-desidrogenase, gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase, fosfoglucoisomerase, fosfoglicerato-cinase, fosfatase ácida, T7, TPI, lactase, metalotioneina, citomegalovirus imediato inicial, proteína ácida do soro de leite, glucoamilase, e promotores activados na presença de galactose, por exemplo, GAL1 e GAL10. Adicionalmente, sequências nucleotídicas que codificam outras proteínas, oligossacáridos, lípidos, etc. podem também ser incluídas dentro do vector bem como outras sequências reguladoras tais como um sinal de poliadenilação (p.ex., o sinal poli-A do antigénio T de SV40, ovalbumina ou hormona de crescimento bovina). A escolha de sequências presentes na construção é dependente dos produtos de expressão desejados bem como da natureza da célula hospedeira.

Tal como observado acima, uma vez construído o vector, pode então ser introduzido na célula hospedeira de escolha através de métodos conhecidos dos vulgares peritos na técnica 21

ΕΡ 1 392 823/PT incluindo, por exemplo, transfecção, transformação e electroporação (ver "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed., Vol. 1-3, ed. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). A célula hospedeira é então cultivada sob condições adequadas que permitam a expressão dos genes conduzindo à produção do PUFA desejado, que é então recuperado e purificado.

Exemplos de células hospedeiras procarióticas adequadas incluem, por exemplo, bactérias tais como Escherichia coli, Bacillus subtilis bem como cianobactérias tais como Spirulina sps. (i.e., cianófitas) . Exemplos de células hospedeiras eucarióticas adequadas incluem, por exemplo, células de mamífero, células vegetais, células de levedura tais como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Lipomyces starkey, Candida sps. tais como Yarrowia (Candida) lipolytica, Kluyveromyces sps., Pichia sps., Trichoderma sps. ou Hansenula sps., ou células fúngicas tais como células de fungos filamentosos, por exemplo, Aspergillus, Neurospora e Penicillium. De preferência, são utilizadas células de Saccharomyces cerevisiae (fermento de padeiro). A expressão numa célula hospedeira pode ser alcançada de um modo transiente ou estável. A expressão transiente pode ocorrer a partir de construções introduzidas que contêm sinais de expressão funcionais na célula hospedeira, mas cujas construções não se replicam e raramente se integram na célula hospedeira, ou quando a célula hospedeira não está em proliferação. A expressão transiente pode também ser alcançada através da indução da actividade de um promotor regulável operativamente ligado ao gene de interesse, embora tais sistemas indutíveis exibam frequentemente um baixo nível basal de expressão. A expressão estável pode ser alcançada através da introdução de uma construção que se possa integrar no genoma do hospedeiro ou que se replique autonomamente na célula hospedeira. A expressão estável do gene de interesse pode ser seleccionada através da utilização de um marcador seleccionável localizado ou transfectado com a construção de expressão, seguido de selecção de células expressando o marcador. Quando a expressão estável resulta de integração, o local de integração da construção pode ocorrer aleatoriamente dentro do genoma do hospedeiro ou pode ser dirigido através 22

ΕΡ 1 392 823/PT da utilização de construções contendo regiões de homologia com o genoma do hospedeiro suficientes para direccionar a recombinação para o locus do hospedeiro. Quando as construções são dirigidas a um locus endógeno, todas ou algumas das regiões reguladoras da transcrição e da tradução podem ser proporcionadas pelo locus endógeno.

Pode também ser utilizado um mamífero não humano transgénico para expressar a enzima ou enzimas de interesse (i.e., uma ou mais das A5-dessaturases, uma ou mais das Δ6-dessaturases, ou uma combinação destas), e finalmente o ou os PUFA de interesse. Mais especificamente, uma vez criada a construção acima descrita, esta pode ser inserida no pró-núcleo de um embrião. 0 embrião pode então ser implantado numa fêmea receptora. Alternativamente, pode também ser utilizado um método de transferência nuclear (Schnieke et al. , Science 278: 2130-2133 (1997)). A gestação e o nascimento são então permitidos (ver, p.ex., Patente U.S. No. 5750176 e Patente U.S. No. 5700671). Amostras de leite, tecido ou outro fluido da descendência devem então conter níveis alterados de PUFA, em comparação com os níveis normalmente verificados no animal não transgénico. As gerações subsequentes podem ser monitorizadas quanto à produção dos níveis alterados ou aumentados de PUFA e assim incorporação do gene codificando a enzima dessaturase desejada nos seus genomas. O mamífero não humano utilizado como hospedeiro pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste, por exemplo, num ratinho, rato, coelho, porco, cabra, ovelha, cavalo e vaca. No entanto, pode ser utilizado qualquer mamífero não humano desde que tenha a capacidade para incorporar ADN codificando a enzima de interesse no seu genoma.

Para expressão de um polipéptido dessaturase, regiões de início e terminação da transcrição e da tradução funcionais são operativamente ligadas ao ADN codificando o polipéptido dessaturase. As regiões de início e terminação da transcrição e da tradução são derivadas de uma variedade de fontes não exclusivas, incluindo o ADN a expressar, genes conhecidos ou suspeitos de serem capazes de expressão no sistema desejado, vectores de expressão, síntese química, ou de um locus endógeno numa célula hospedeira. A expressão num tecido 23 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ vegetal e/ou parte de planta apresenta certas eficiências, particularmente quando o tecido ou parte é um que é colhido anteriormente, tal como semente, folhas, frutos, flores, raízes, etc. A expressão pode ser dirigida a essa localização na planta através da utilização de uma sequência reguladora específica tal como as da Patente U.S. Nos. 5463174, 4943674, 5106739, 5175095, 5420034, 5188958 e 5589379. Alternativamente, a proteína expressa pode ser uma enzima que produza um produto que possa ser incorporado, directamente ou após mais modificações, numa fracção fluida da planta hospedeira. A expressão de um gene de dessaturase, ou transcritos anti-sentido de dessaturase, pode alterar os níveis de PUFA específicos, ou derivados destes, verificados em partes de plantas e/ou tecidos vegetais. A região de codificação do polipéptido dessaturase pode ser expressa por si própria ou com outros genes, para produzir tecidos e/ou partes de planta contendo proporções mais elevadas dos PUFA desejados ou nos quais a composição do PUFA se assemelha mais intimamente à do leite materno humano (Prieto et al., publicação PCT WO 95/24494). A região de terminação pode ser derivada da região 3' do gene a partir do qual a região de iniciação foi obtida ou a partir de um gene diferente. É conhecido um grande número de regiões de terminação que se verificaram ser satisfatórias numa variedade de hospedeiros do mesmo ou de diferentes géneros e espécies. A região de terminação é habitualmente seleccionada como questão de conveniência em vez de ser devida a qualquer propriedade em particular.

Tal como observado acima, também pode ser utilizada uma planta (p.ex., Glycine max (soja) ou Brassica napus (colza)) ou tecido vegetal como hospedeiro ou célula hospedeira, respectivamente, para expressão da enzima dessaturase que pode, por sua vez, ser utilizada na produção de ácidos gordos polinsaturados. Mais especificamente, os PUFA desejados podem ser expressos em sementes. Os métodos de isolamento de óleos de sementes são conhecidos na técnica. Assim, além de proporcionar uma fonte de PUFA, os componentes de óleos de sementes podem ser manipulados através da expressão do gene de dessaturase, bem como talvez de outros genes de dessaturases e genes de elongases, para proporcionar óleos de sementes que possam ser adicionados a composições 24

ΕΡ 1 392 823/PT nutricionais, composições farmacêuticas, rações animais e cosméticos. Novamente, um vector que compreende uma sequência de ADN codificando a dessaturase operativamente ligada a um promotor, será introduzido no tecido vegetal ou planta durante um tempo e sob condições suficientes para expressão do gene de dessaturase. 0 vector pode também compreender um ou mais genes que codificam outras enzimas, por exemplo, Δ4-dessaturase, elongase, A12-dessaturase, A15-dessaturase, Δ17-dessaturase, e/ou ál9-dessaturase. 0 tecido vegetal ou planta pode produzir o substrato relevante (p.ex., DGLA (no caso de Δδ-dessaturase), ALA (no caso de Δβ-dessaturase), etc.) sobre o qual actuam as enzimas ou pode ser introduzido no tecido vegetal, célula vegetal ou planta um vector codificando enzimas que produzem tais substratos. Adicionalmente, o substrato pode ser vaporizado em tecidos vegetais expressando as enzimas apropriadas. Utilizando estas várias técnicas, pode-se produzir PUFA (p.ex., ácidos gordos insaturados n-6 tais como AA, ou ácidos gordos n-3 tais como EPA ou STA) através da utilização de uma célula vegetal, tecido vegetal ou planta. Deve observar-se também que o invento engloba também uma planta transgénica compreendendo o vector acima descrito, em que a expressão da sequência nucleotídica do vector resulta na produção de um ácido gordo polinsaturado, por exemplo, nas sementes da planta transgénica. A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas a partir de transformantes individuais de protoplastos vegetais ou de vários explantes transformados é bem conhecida na técnica (Weissbach e Weissbach, Em: "Methods for Plant Molecular Biology", (Eds.), Academic Press, Inc. San Diego, CA, (1988)). Este processo de regeneração e crescimento inclui tipicamente os passos de selecção de células transformadas, cultura das células individualizadas através dos estádios habituais de desenvolvimento embrionário até ao estádio de plântula enraizada. Os embriões e sementes transgénicos são regenerados de forma semelhante. Os rebentos enraizados transgénicos resultantes são a partir dai plantados num meio de crescimento de plantas apropriado tal como solo. 0 desenvolvimento ou a regeneração de plantas contendo o gene estranho, exógeno que codifica uma proteína de interesse 25 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ é bem conhecido na técnica. De preferência, as plantas regeneradas são auto-polinizadas para proporcionar plantas transgénicas homozigóticas. De outro modo, o pólen obtido a partir das plantas regeneradas é cruzado com plantas criadas a partir de sementes de linhas agronomicamente importantes. Reciprocamente, o pólen de plantas destas importantes linhas é utilizado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgénica do presente invento contendo um polipéptido desejado é cultivada utilizando métodos bem conhecidos de um perito na técnica.

Existe uma variedade de métodos para a regeneração de plantas a partir de um tecido vegetal. 0 método de regeneração particular dependerá do tecido vegetal de partida e da espécie vegetal particular a regenerar. Métodos para transformar dicotiledóneas, principalmente através da utilização de Agrobacterium tumefadens, e obtenção de plantas transgénicas foram publicados para algodão (Patente U.S. No. 5004863, Patente U.S. No. 5159135, Patente U.S. No. 5518908) ; soja ( (Patente U.S. No. 5569834, Patente U.S. No. 5416011, McCabe et al., Bio/Technology 6: 923 (1988), Christou et al., Plant Physiol. 87 : 671-674 (1988)); Brassica (Patente U.S. No. 5463174); amendoim (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15: 653-657 (1996), McKently et al., Plant Cell Rep. 14: 699-703 (1995)); papaia; e ervilha (Grant et al., Plant Cell Rep. 15: 254-258, (1995)). A transformação de monocotiledóneas utilizando electroporação, bombardeamento de partículas, e Agrobacterium foi também relatada. A transformação e regeneração de plantas foram alcançadas em espargos (Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 84: 5354, (1987)); cevada (Wan e Lemaux, Plant Physiol 104: 37 (1994)); Zea mays (Rhodes et al. , Science 240: 204 (1988), Gordon-Kamm et al. , Plant Cell 2: 603-618 (1990), Fromm et al. , Bio/Technology 8: 833 (1990), Koziel et al. , Bio/Technology 11: 194, (1993), Armstrong et al., Crop Science 35: 550-557 (1995)); aveia (Somers et al., Bio/Technology 10: 15 89 (1992)); dáctilo (Horn et al., Plant Cell Rep. 1: 469 (1988)); arroz (Toriyama et al., Theor Appl. Genet. 205: 34, (1986); Part et al., Plant Mol. Biol. 32: 1135-1148, (1996); Abedinia et al., Aust. J. Plant Physiol. 26

ΕΡ 1 392 823/PT 24: 133-141 (1997); Zhang e Wu, Theor. Appl. Genet. 76: 835 (1988) ; Zhang et al. Plant Cell Rep. 7: 379, (1988); Battraw e Hall, Plant Scl. 86: 191-202 (1992); Christou et al.,

Bio/Technology 9: 957 (1991)); centeio (De la Pena et al. ,

Nature 325: 274 (1987)); cana-de-açúcar (Bower e Birch, Plant J. 2: 409 (1992)); festuca-alta (Wang et al., Bio/Technology 10: 691 (1992)), e trigo (Vasil et al. , Bio/Technology 10: 667 (1992); Patente U.S. No. 5631152).

Ensaios da expressão génica baseados na expressão transiente de construções de ácidos nucleicos clonados foram desenvolvidos através da introdução de moléculas de ácido nucleico em células vegetais através de tratamento com polietilenoglicol, electroporação, ou bombardeamento de partículas (Marcotte et al. , Nature 335: 454-457 (1988); Marcotte et al. , Plant Cell 1: 523-532 (1989); McCarty et al. , Cell 66: 895-905 (1991); Hattori et ai., Genes Dev. 6: 609-618 (1992); Goff et al., EMBO J. 9: 2517-2522 (1990)).

Os sistemas de expressão transiente podem ser utilizados para dissecar funcionalmente construções génicas (ver geralmente, Maliga et al., "Methods in Plant Molecular Biology", Cold Spring Harbor Press (1995)). Entenda-se que qualquer uma das moléculas de ácido nucleico do presente invento pode ser introduzida numa célula vegetal de um modo permanente ou transiente em combinação com outros elementos genéticos tais como vectores, promotores, estimuladores etc.

Além dos procedimentos acima discutidos, os executantes estão familiarizados com os materiais de recurso padrão que descrevem condições e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (p.ex., moléculas de ADN, plasmídeos, etc.), geração de organismos recombinantes e a pesquisa e o isolamento de clones, (ver por exemplo, Sambrook et al. , "Molecular

Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1989) ; Maliga et al. , "Methods in Plant Molecular Biology", Cold Spring Harbor Press (1995); Birren et al. , "Genome Analysis: Detecting Genes, 1", Cold Spring Harbor, New York (1998); Birren et al. , "Genome Analysis: Analyzing DNA, 2", Cold Spring Harbor, New York (1998); "Plant Molecular 27 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ

Biology: A Laboratory Manual", eds. Clark, Springer, New York (1997)).

Os substratos que podem ser produzidos pela célula hospedeira naturalmente ou transgenicamente, bem como as enzimas que podem ser codificadas através de sequências de ADN presentes no vector que é subsequentemente introduzido na célula hospedeira, são mostrados na Figura 1.

Tendo em vista o de cima, o presente invento engloba um método de produção de enzimas dessaturase (i.e., Δ5 ou Δ6) compreendendo os passos de: 1) isolamento da sequência nucleotidica do gene codificando a enzima dessaturase; 2) construção de um vector compreendendo a referida sequência nucleotidica operativamente ligada a uma sequência reguladora e 3) introdução do referido vector numa célula hospedeira durante um tempo e sob condições suficientes para a produção da enzima dessaturase.

No que respeita às dessaturases os ácidos gordos polinsaturados podem ser produzidos através da expressão de um ácido à enzima de modo a que a dessaturase converta o ácido num ácido gordo polinsaturado. Por exemplo, quando 20:3n-6 é exposto a uma enzima Δδ-dessaturase, é convertido em AA. 0 AA pode então ser exposto a elongase que alonga o AA em ácido adrénico (i.e., 22:4n-6). Alternativamente, a Δ5-dessaturase pode ser utilizada para converter 20:4n-3 em 20:5n-3 que pode ser exposto a elongase e convertido em ácido (n-3)-docosapentaenóico. 0 ácido (n-3)-docosapentaenóico pode então ser convertido em DHA através da utilização de Δ4-dessaturase. Assim, a Δδ-dessaturase pode ser utilizada na produção de ácidos gordos polinsaturados que podem ser utilizados, por sua vez, para determinados fins benéficos.

No que respeita ao papel da Δβ-dessaturase, o ácido linoleico pode ser exposto à enzima de modo a que a enzima converta o ácido em GLA. Uma elongase pode então ser utilizada para converter o GLA em DGLA. 0 DGLA pode então ser convertido em AA através da exposição do DGLA a uma Δ5-dessaturase. Como outro exemplo, o ALA pode ser exposto a uma Δβ-dessaturase para converter o ATA em STA. 0 STA pode então ser convertido em 20:4n-3 através da utilização de uma 28

ΕΡ 1 392 823/PT elongase. Subsequentemente, o 20:4n-3 pode ser convertido em EPA através da exposição do 20:4n-3 a uma A5-dessaturase. Assim, a Δβ-dessaturase pode ser utilizada na produção de PUFA que pode ter propriedades vantajosas ou pode ser utilizada na produção de outros PUFA.

Utilizações dos Genes de A5-Dessaturases, Genes de Δ6-Dessaturases, e Enzimas Codificadas por Estes

Tal como observado acima, os genes de dessaturase isolados e as enzimas dessaturase codificadas por estes podem ter muitas utilizações. Por exemplo, o gene e a correspondente enzima podem ser utilizados indirectamente ou directamente na produção de ácidos gordos polinsaturados, por exemplo, a Δδ-dessaturase pode ser utilizada na produção de AA, ácido adrénico ou EPA. A delta-6-dessaturase pode ser utilizada indirectamente ou directamente na produção de GLA, DGLA, STA ou 20:4n-3. (Pretende-se que "directamente" englobe a situação onde a enzima converte directamente o ácido noutro ácido, o último do qual é utilizado numa composição (p.ex., a conversão de DGLA em AA) . Pretende-se que "indirectamente" englobe a situação onde um ácido é convertido noutro ácido (i.e., um intermediário da via) através da dessaturase (p.ex., DGLA em AA) e depois o último ácido é convertido noutro ácido através da utilização de uma enzima não dessaturase (p.ex., AA em ácido adrénico através da elongase ou através da utilização de outra enzima dessaturase (p.ex., AA em EPA através da A17-dessaturase) . Estes ácidos gordos polinsaturados (i.e., os produzidos directamente ou indirectamente através da actividade da enzima dessaturase) podem ser adicionados a, por exemplo, composições nutricionais, composições farmacêuticas, cosméticos, e rações animais, os quais estão todos englobados pelo presente invento. As composições nutricionais, composições farmacêuticas e aplicações veterinárias descritas nos seguintes parágrafos não fazem parte do invento reivindicado.

Composições Nutricionais 0 presente invento inclui composições nutricionais. Tais composições, para fins do presente invento, incluem qualquer alimento ou preparação para consumo humano incluindo para 29

ΕΡ 1 392 823/PT consumo entérico ou parentérico, que quando tomados pelo corpo (a) servem para alimentar ou acumular em tecidos ou fornecer energia e/ou (b) manter, restaurar ou suportar um estado nutricional ou função metabólica adequado. A composição nutricional do presente invento compreende pelo menos um óleo ou ácido produzido directamente ou indirectamente através da utilização do gene de dessaturase, de acordo com o presente invento, e pode estar numa forma sólida ou liquida. Adicionalmente, a composição pode incluir macronutrientes ediveis, vitaminas e minerais em quantidades desejadas para uma determinada utilização. A quantidade de tais ingredientes variará dependendo de se se pretende que a composição seja para utilizar com bebés saudáveis normais, crianças ou adultos possuindo necessidades especiais tais como as que acompanham certas condições metabólicas (p.ex., distúrbios metabólicos).

Exemplos de macronutrientes que podem ser adicionados à composição incluem mas não se limitam a gorduras ediveis, hidratos de carbono e proteínas. Exemplos de tais gorduras ediveis incluem mas não se limitam a óleo de coco, óleo de soja, e monoglicéridos e diglicéridos. Exemplos de tais hidratos de carbono incluem mas não se limitam a glicose, lactose edível e amido hidrolisado. Adicionalmente, exemplos de proteínas que podem ser utilizados na composição nutricional do invento incluem mas não se limitam a proteínas de soja, soro de leite electrodialisado, leite magro electrodialisado, soro de leite ou hidrolisados destas proteínas.

Em relação a vitaminas e minerais, podem ser adicionados os seguintes às composições nutricionais do presente invento: cálcio, fósforo, potássio, sódio, cloreto, magnésio, manganésio, ferro, cobre, zinco, selénio, iodo e Vitaminas A, E, D, C, e o complexo B. Outras dessas vitaminas e minerais podem ser adicionados.

Os componentes utilizados nas composições nutricionais do presente invento serão de origem semi-purifiçada ou purificada. Por semi-purifiçado ou purificado entenda-se um 30 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ material que foi preparado através de purificação de um material natural ou através de síntese.

Exemplos de composições nutricionais do presente invento incluem mas não se limitam a fórmulas infantis, suplementos dietéticos, substituintes dietéticos, e composições de reidratação. Composições nutricionais de particular interesse incluem mas não se limitam às utilizadas para suplementação entérica e parentérica para bebés, fórmulas especiais para bebés, suplementos para idosos, e suplementos para aqueles com dificuldades gastrointestinais e/ou má absorção. A composição nutricional do presente invento pode ser adicionada a alimentos mesmo quando a suplementação da dieta não é necessária. Por exemplo, a composição pode ser adicionada a alimentos de qualquer tipo incluindo mas não se limitando a margarinas, manteigas modificadas, queijos, leite, iogurte, chocolate, doces, aperitivos, óleos de saladas, óleos de cozinha, gorduras de cozinha, carne, peixe e bebidas.

Numa concretização preferida do presente invento, a composição nutricional é um produto nutricional entérico, de preferência, um produto nutricional entérico para adultos ou pediátrico. Esta composição pode ser administrada a adultos ou crianças experimentando stress ou possuindo necessidades especiais devido a estados de doença crónicos ou agudos. A composição pode compreender, para além de ácidos gordos polinsaturados produzidos de acordo com o presente invento, macronutrientes, vitaminas e minerais tal como descrito acima. Os macronutrientes podem estar presentes em quantidades equivalentes às presentes no leite humano ou com base na energia, i.e., com base nas calorias. Métodos para formulação de fórmulas entéricas e parentéricas líquidas ou sólidas são bem conhecidos na técnica. (Ver também os Exemplos abaixo). A fórmula entérica, por exemplo, pode ser esterilizada e subsequentemente utilizada numa base pronta-a-comer (PC) ou armazenada num líquido concentrado ou pó 0 pó pode ser preparado através de liofilização da fórmula preparada tal 31

ΕΡ 1 392 823/PT como indicado acima, e reconstituição desta através de reidratação do concentrado. Fórmulas nutricionais de adulto e pediátricas são bem conhecidas na técnica e estão comercialmente disponíveis (p.ex., Similac®, Ensure®, Jevity® e Alimentum® de Ross Products Division, Abbott Laboratories, Columbus, Ohio) . Um óleo ou ácido produzido de acordo com o presente invento pode ser adicionado a qualquer uma destas fórmulas. A densidade de energia das composições nutricionais do presente invento, quando na forma líquida, pode variar de cerca 0,6 Kcal a cerca de 3 Kcal por ml. Quando na forma sólida ou em pó, os suplementos nutricionais podem conter de cerca de 1,2 a mais de 9 Kcal por grama, de preferência cerca de 3 a 7 Kcal por grama. Em geral, a osmolalidade de um produto líquido deve ser inferior a 700 mOsm e, de preferência, inferior a 660 mOsm. A fórmula nutricional pode incluir macronutrientes, vitaminas, e minerais, tal como observado acima, além dos PUFA produzidos de acordo com o presente invento. A presença destes componentes adicionais ajuda à ingestão individual dos requisitos diários mínimos destes elementos. Adicionalmente ao fornecimento de PUFA, pode também ser desejável adicionar zinco, cobre, ácido fólico e antioxidantes à composição. Crê-se que estas substâncias reforçam um sistema imunitário em stress e proporcionarão portanto mais benefícios ao indivíduo recebendo a composição. Uma composição farmacêutica pode também ser suplementada com estes elementos.

Numa concretização mais preferida, a composição nutricional compreende, além de antioxidantes e pelo menos um PUFA, uma fonte de hidratos de carbono em que pelo menos 5 porcento em peso do hidrato de carbono é oligossacárido indigestível. Numa concretização ainda mais preferida, a composição nutricional compreende adicionalmente proteína, taurina, e carnitina.

Tal como observado acima, os PUFA produzidos de acordo com o presente invento, ou derivados destes, podem ser adicionados a um substituto ou suplemento dietético, particularmente uma fórmula infantil, para pacientes sujeitos 32 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ a alimentação intravenosa ou para prevenção ou tratamento de malnutrição ou outras condições ou estados de doença. Como antecedente, deve observar-se que o leite materno humano tem um perfil de ácidos gordos compreendendo de cerca de 0,15% a cerca de 0,36% como DHA, de cerca de 0,03% a cerca de 0,13% como EPA, de cerca de 0,30% a cerca de 0,88% como AA, de cerca de 0,22% a cerca de 0,67% como DGLA, e de cerca de 0,27% a cerca de 1,04% como GLA. Assim, ácidos gordos tais como AA, EPA e/ou ácido docosa-hexaenóico (DHA), produzidos de acordo com o presente invento, podem ser utilizados para alterar, por exemplo, a composição de fórmulas infantis para melhor replicar o teor de PUFA do leite materno humano ou alterar a presença de PUFA normalmente verificados num leite de mamífero não humano. Em particular, uma composição para utilizar num suplemento farmacológico ou alimentar, particularmente um substituto ou suplemento do leite materno, compreenderá de preferência um ou mais de AA, DGLA e GLA. De preferência, o óleo compreenderá de cerca de 0,3 a 30% de AA, de cerca de 0,2 a 30% de DGLA, e/ou de cerca de 0,2 a cerca de 30% de GLA.

Composições nutricionais parentéricas compreendendo de cerca de 2 a cerca de 30 porcento em peso de ácidos gordos calculados como triglicéridos estão englobadas pelo presente invento. A composição preferida tem cerca de 1 a cerca de 25 porcento em peso da composição total de PUFA como GLA (Patente U.S. No. 5196198). Outras vitaminas, particularmente vitaminas solúveis em gordura tais como vitamina A, D, E e L-carnitina podem ser opcionalmente incluídas. Quando desejado, um conservante tal como alfa-tocoferol pode ser adicionado numa quantidade de cerca de 0,1% em peso.

Adicionalmente, as razões de AA, DGLA e GLA podem ser adaptadas a uma determinada utilização final. Quando formulada como suplemento ou substituinte do leite materno, uma composição que compreende um ou mais de AA, DGLA e GLA serão proporcionados numa razão de cerca de 1:19:30 a cerca de 6:1:0,2, respectivamente. Por exemplo, o leite materno de animais pode variar nas razões de AA: DGLA: GLA de 1:19:30 a 6:1:0,2, o que inclui razões intermédias que são de preferência de cerca de 1:1:1, 1:2:1, 1:1:4. Quando produzidos juntos numa célula hospedeira, o ajuste da taxa e 33

ΕΡ 1 392 823/PT da percentagem de conversão de um substrato precursor tal como GLA e DGLA em AA podem ser utilizados para controlar precisamente as razões de PUFA. Por exemplo, pode ser utilizada uma taxa de conversão de 5% a 10% de DGLA em AA para produzir uma razão de AA para DGLA de cerca de 1:19, enquanto uma taxa de conversão de cerca de 75% a 80% pode ser utilizada para produzir uma razão de AA para DGLA de cerca de 6:1. Portanto, num sistema de cultura celular ou num animal hospedeiro, a regulação do momento, da extensão e da especificidade da expressão da dessaturase, bem como a expressão de outras dessaturases e elongases, pode ser utilizada para modular os níveis e razões de PUFA. Os PUFA/ácidos produzidos de acordo com o presente invento (p.ex., AA e EPA) podem então ser combinados com outros PUFA/ácidos (p.ex., GLA) nas concentrações e razões desej adas.

Adicionalmente, os PUFA produzidos de acordo com o presente invento ou células hospedeiras contendo-os podem também ser utilizados como suplementos de rações animais para alterar a composição de ácidos gordos do tecido ou leite do animal para uma mais desejável para consumo humano ou animal.

Composições Farmacêuticas O presente invento engloba também uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais dos ácidos e/ou óleos resultantes produzidos utilizando os genes de dessaturase aqui descritos, de acordo com os métodos aqui descritos. Mais especificamente, uma tal composição farmacêutica pode compreender um ou mais ácidos e/ou óleos bem como um transportador, adjuvante ou veículo padrão bem conhecido, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, tal como, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, água, etanol, polióis, óleos vegetais, um agente humectante ou uma emulsão tal como emulsão de água/óleo. A composição pode estar na forma líquida ou sólida. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um comprimido, cápsula, líquido ou pó ingerível, injectável ou unguento ou creme tópico. Uma fluidez correcta pode ser mantida, por exemplo, através da manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e através da utilização de tensioactivos. Pode também ser 34

ΕΡ 1 392 823/PT desejável incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio e semelhantes. Além de tais diluentes inertes, a composição pode também incluir adjuvantes, tais como agente humectantes, agentes emulsionantes e de suspensão, agentes adoçantes, agentes aromatizantes e agentes perfumantes.

As suspensões, para além dos compostos activos, podem compreender agentes de suspensão tais como, por exemplo, álcoois isostearilicos etoxilados, polioxietileno-sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonite, agar-agar e tragacanto ou misturas destas substâncias.

Formas de dosagem sólidas tais como comprimidos e cápsulas podem ser preparadas utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, os PUFA produzidos de acordo com o presente invento podem ser comprimidos com bases de comprimidos convencionais tais como lactose, sacarose, e amido de milho em combinação com aglomerantes tais como goma-arábica, amido de milho ou gelatina, agentes desintegrantes tais como amido de batata ou ácido algínico, e um lubrificante tal como ácido esteárico ou estearato de magnésio. Podem ser preparadas cápsulas através de incorporação destes excipientes numa cápsula de gelatina juntamente com antioxidantes e o ou os PUFA relevantes. Os componentes antioxidante e PUFA devem ajustar-se às linhas orientadoras apresentadas acima.

Para administração intravenosa, os PUFA produzidos de acordo com o presente invento ou derivados destes podem ser incorporados em formulações comerciais tais como Intralipids™. O perfil típico de ácidos gordos do plasma de adultos normais compreende 6,64 a 9,46% de AA, 1,45 a 3,11% de DGLA, e 0, 02 a 0, 08% de GLA. Estes PUFA ou os seus precursores metabólicos podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros PUFA para alcançar um perfil normal de ácidos gordos num paciente. Quando desejado, os componentes individuais das formulações podem ser proporcionados individualmente, na forma de estojo, para utilização simples ou múltipla. Uma dosagem típica de um determinado ácido gordo é de 0,1 mg a 20 g (até 100 g) 35

ΕΡ 1 392 823/PT diariamente e é de preferência de 10 mg a 1, 2, 5 ou 10 g diariamente.

Vias de administração possíveis das composições farmacêuticas do presente invento incluem, por exemplo, entéricas (p.ex., oral e rectal) e parentérica. Por exemplo, uma preparação líquida pode ser administrada, por exemplo, oralmente ou rectalmente. Adicionalmente, uma mistura homogénea pode ser completamente dispersa em água, misturada sob condições estéreis com diluentes fisiologicamente aceitáveis, conservantes, tampões ou propulsores para formar um spray ou inalante. A via de administração dependerá, como é claro, do efeito desejado. Por exemplo, se a composição estiver a ser utilizada para tratar pele áspera, seca, ou envelhecida, para tratar pele ferida ou queimada, ou para tratar pele ou cabelo afectados por uma doença ou condição, pode talvez ser aplicada topicamente. A dosagem da composição a administrar ao paciente pode ser determinada por um vulgar perito na técnica e depende de vários factores tais como o peso do paciente, a idade do paciente, o estado imunitário do paciente, etc.

Em relação à forma, a composição pode ser, por exemplo, uma solução, uma dispersão, uma suspensão, uma emulsão ou um pó estéril que é então reconstituído. 0 presente invento inclui também o tratamento de vários distúrbios através da utilização de composições farmacêuticas e/ou nutricionais aqui descritas. Em particular, as composições do presente invento podem ser utilizadas para tratar restenose após angioplastia. Além disso, os sintomas de inflamação, artrite reumatóide, asma e psoríase podem também ser tratados com as composições do invento. A evidência indica também que os PUFA podem estar envolvidos no metabolismo do cálcio; assim, as composições do presente invento podem, talvez, ser utilizadas no tratamento ou prevenção de osteoporose e de pedras no rim ou no tracto urinário.

Adicionalmente, as composições do presente invento podem também ser utilizadas no tratamento de cancro. Mostrou-se que 36

ΕΡ 1 392 823/PT as células malignas possuem composições alteradas de ácidos gordos. Mostrou-se que a adição de ácidos gordos atrasa o seu crescimento, causa morte celular e aumenta a sua susceptibilidade a agentes quimioterapêuticos. Além disso, as composições do presente invento podem também ser úteis para tratar caquexia associada a cancro.

As composições do presente invento podem também ser utilizadas para tratar diabetes (ver Patente U.S. No. 4826877 e Horrobin et al. , Am. J. Clin. Nutr. Vol. 57 (Supl.) 732S-737S). Foi demonstrado um metabolismo e composição de ácidos gordos alterados em animais diabéticos.

Além disso, as composições do presente invento, compreendendo PUFA produzidos directamente ou indirectamente através da utilização das enzimas dessaturase, podem também ser utilizadas no tratamento de eczema, na redução da pressão sanguínea, e na melhoria dos registos dos exames de matemática. Adicionalmente, as composições do presente invento podem ser utilizadas em inibição da agregação de plaquetas, indução de vasodilatação, redução dos níveis de colesterol, inibição da proliferação do músculo-liso e de tecido fibroso da parede dos vasos (Brenner et al., Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 83, pág. 85-101, 1976), redução ou prevenção de hemorragia gastrointestinal e outros efeitos secundários de fármacos anti-inflamatórios não esteróides (ver Patente U.S. No. 4666701), prevenção ou tratamento de endometriose e síndroma pré-menstrual (ver Patente U.S. No. 4758592), e tratamento de encefalomielite miálgica e fadiga crónica após infecções virais (ver Patente U.S. No. 5116871).

Outras utilizações das composições do presente invento incluem a utilização no tratamento de SIDA, esclerose múltipla, e distúrbios inflamatórios da pele, bem como para manutenção da saúde geral.

Adicionalmente, a composição do presente invento pode ser utilizada para fins cosméticos. Pode ser adicionada a composições cosméticas preexistentes de modo a que a mistura seja formada ou possa ser utilizada como uma única composição. 37

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Aplicações Veterinárias

Deve notar-se que as composições farmacêuticas e nutricionais acima descritas podem ser utilizadas em ligação com animais (i.e., domésticos ou não domésticos), uma vez que os animais experimentam muitas das mesmas necessidades e condições que os humanos. Por exemplo, os óleos ou ácidos do presente invento podem ser utilizados em suplementos de rações animais ou de aquacultura, substituintes de rações animais, vitaminas para animais ou em unguentos tópicos para animais. 0 presente invento pode ser ilustrado através da utilização dos seguintes exemplos não limitantes:

Exemplo 1

Desenho de Oligonucleótidos Degenerados para o Isolamento de Dessaturases a partir de Fungos e Construção de uma

Biblioteca de ADNc A análise da composição de ácidos gordos de Saprolegnia diclina (S. diclina) (ATCC 56851) revelou a presença de uma quantidade considerável de ácido araquidónico (ARA, 20:4n-6) e ácido eicosapentanóico (EPA, 20:5n-3). Assim, pensou-se que este organismo continha uma Δβ-dessaturase activa capaz de converter o ácido linoleico (LA, 18:2n-6) em ácido gama-linolénico (GLA, 18:3n-6), e uma A5-dessaturase activa que converteria ácido di-homo-gama-linolénico (DGLA, 20:3n-6) em ácido araquidónico (ARA, 20:4n-6) (Figura 1). Adicionalmente, pensou-se que S. diclina também continha uma A17-dessaturase capaz de dessaturar ARA em EPA. 0 objectivo foi assim tentar isolar estes genes de dessaturase previstos a partir de S. diclina e eventualmente verificar a funcionalidade através de expressão num hospedeiro alternativo.

Para isolar genes codificando enzimas dessaturase funcionais, foi construída uma biblioteca de ADNc para S. diclina. Culturas de Saprolegnia diclina (ATCC 56851) foram criadas em meio de dextrose de batata Difco #336 (Difco 38

ΕΡ 1 392 823/PT

Laboratories, Detroit, Michigan) à temperatura ambiente durante 4 dias com agitação constante. Os micélios foram colhidos por filtração através de várias camadas de gaze de queijo, e as culturas esmagadas em azoto liquido utilizando um pilão e almofariz. ARN total foi purificado a partir destas utilizando o estojo Qiagen RNeasy Maxi (Qiagen, Valência, CA) de acordo o protocolo do fabricante. 0 ARNm foi isolado a partir do ARN total de cada organismo utilizando resina de celulose oligo-dT. 0 estojo de construção de bibliotecas pBluescript II XR (Stratagene, La Jolla, CA) foi então utilizado para sintetizar ADNc de cadeia dupla que foi então clonado direccionalmente (5' EcoRI/3' Xhol) no vector pBluescript II SK( + ) . A biblioteca de S. diclina continha aproximadamente 2,5*106 clones com um tamanho de inserção médio de aproximadamente 700 pb. O ADN genómico de culturas produtoras de PUFA de S. diclina foi isolado através de esmagamento da cultura em azoto liquido e purificado utilizando o Qiagen Genomic DNA Extraction Kit (Qiagen, Valência, CA). A abordagem tomada foi desenhar oligonucleótidos degenerados (i.e., iniciadores) que representam motivos de aminoácidos que são conservados em dessaturases conhecidas. Estes iniciadores podem ser utilizados numa reacção de PCR para identificar um fragmento contendo as regiões conservadas nos genes de dessaturase previstos de fungos. Uma vez que as únicas dessaturases fúngicas identificadas são os genes de Δδ-dessaturase e Δβ-dessaturase de Mortierella alpina (números de acesso Genbank AF067650, AB020032, respectivamente), sequências de dessaturase de plantas bem como de animais foram tidas em consideração durante o desenho destes iniciadores degenerados. As sequências conhecidas da Δδ-dessaturase e Δβ-dessaturase dos seguintes organismos foram utilizadas para o desenho destes iniciadores degenerados: Mortierella alpina, Borago officinalis, Helíanthus annuus, Brassica napus, Dictyostelium discoideum, Rattus norvegicus, Mus musculus, Homo sapiens, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana, e Ricinus communis. Os iniciadores degenerados utilizados foram como se segue utilizando o programa CODEHOP Blockmaker (http: //blocks.fhcrc.org/codehop.html): 39

ΕΡ 1 392 823/PT A. Motivo proteico 1 (SEQ ID NO:53):

NH3-VYDVTEWVKRHPGG-COOH

Iniciador RO 834 (SEQ ID NO:l): 5’-GTBTAYGAYGTBACCGARTGGGTBAAGCGYCAYCCBGGHGGH-3' B. Motivo proteico 2 (SEQ ID NO:54):

NH3-GASANWWKHQHNVHH-COOH

Iniciador R0835 (Directo) (SEQ ID NO:2): 5’-GGHGCYTCCGCYAACTGGTGGAAGCAYCAGCAYAACGTBCAYCAY-3'

Iniciador R0836 (Inverso) (SEQ ID NO:3) 5’-RTGRTGVACGTTRTGCTGRTGCTTCCACCAGTTRGCGGARGCDCC-3' C. Motivo proteico 3 (SEQ ID NO:55):

NH3-NYQIEHHLFPTM-COOH

Iniciador R0838 (Inverso) (SEQ ID NO:4) 5'-TTGATRGTCTARCTYGTRGTRGASAARGGVTGGTAC-3'

Adicionalmente foram desenhados mais dois iniciadores com base na 2a e 3a "Caixa de histidinas" conservadas verificadas em Δβ-dessaturases conhecidas. Estes foram:

Iniciador R0753 (SEQ ID NO:5) 5’-CATCATCATNGGRAANARRTGRTG-3’

Iniciador R0754 (SEQ ID NO:6) 5’-C TAC TAC TAC TACAYCAYACNTAYACNAAY-3’ A degenerescência do código para as sequências oligonucleotidicas foi: B=C,G,T; H=A,C,T; S=C,G; R=A,G; V=A,C,G; Y=C,T; D=A+T+C; N=A,C,G ou T/U, desconhecido ou outro 40

ΕΡ 1 392 823/PT

Exemplo 2

Isolamento de Sequências Nucleotídicas de Δβ-Dessaturase de Saprolegnia diclina (ATCC 56851) ARN total de Saprolegnia diclina (ATCC 56851) foi isolado utilizando o método de cloreto de lítio (Hoge, et al., Exp. Mycology (1982) 6: 225-232). Cinco pg do ARN total foram transcritos de forma reversa, utilizando o sistema de Pré-amplificação Superscript (LifeTechnologies, Rockville, MD) e o iniciador oligo (dT) 12-i8 fornecido com o estojo, para gerar a primeira cadeia de ADNc.

Para isolar o gene da Δβ-dessaturase, várias permutas e combinações dos oligonucleótidos degenerados acima mencionados foram utilizadas nas reacções de PCR. Dos vários conjuntos de iniciadores experimentados, os únicos iniciadores a dar bandas distintas foram R0834/R0838. A amplificação por PCR foi realizada num volume de 100 μΐ contendo: 2 μΐ do molde da primeira cadeia de ADNc, Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KC1 50 mM, MgCÍ2 1,5 mM, 200 μΜ de cada desoxirribonucleótido-trifosfato e 2 pmole de cada iniciador. Os ciclos térmicos foram realizados a duas temperaturas de ligação diferentes, 42°C e 45°C, e estas duas reacções de PCR foram combinadas, separadas num gel de agarose a 1,0%, e a banda de »1000 pb foi purificada utilizando o QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valência, CA). As extremidades desencontradas nestes fragmentos foram "preenchidas" utilizando ADN-polimerase T4 (LifeTechnologies, Rockville, MD) de acordo com as especificações do fabricante, e estes fragmentos de ADN foram clonados no vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os plasmídeos recombinantes foram transformados em células supercompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA), e os clones foram sequenciados.

Foram assim isolados dois clones que mostraram homologia de sequência com as Δβ-dessaturases identificadas anteriormente. Estes clones são descritos como se segue: a. O Clone #20-2 foi parcialmente sequenciado e a sequência de aminoácidos deduzida de 702 pb mostrou 30,2% de identidade 41 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ com a Δβ-dessaturase de Mortierella alpina como a correspondência de registo mais elevado numa pesquisa TfastA. b. 0 Clone #30-1 foi parcialmente sequenciado, e a sequência de aminoácidos deduzida de 687 pb mostrou 48,5% de identidade da sequência de aminoácidos com a Δβ-dessaturase de Mortierella alpina como a correspondência de registo mais elevado numa pesquisa TfastA. Estas duas sequências também se sobrepunham uma à outra indicando que pertenciam a uma única putativa Δβ-dessaturase de S. dlcllna. Esta nova sequência de Δβ-dessaturase foi então utilizada para desenhar iniciadores para recuperar a extremidade 3' e 5' do gene da Δβ-dessaturase inteiro da biblioteca de ADNc gerada através do ARNm de S. dlcllna.

Para isolar a extremidade 3', foi realizada amplificação por PCR utilizando ADN plasmidico purificado a partir da biblioteca de ADNc como molde e os oligonucleótidos R0923 (SEQ ID NO : 7 ) ( 5 ' -CGGTGCAGTGGTGGAAGAACAAGCACAAC-3 ' ) e R0899 (SEQ ID NO: 8) ( 5 ' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGC-3 ' ) . O oligonucleótido R0923 foi desenhado com base no fragmento #20-2 desta putativa Δβ-dessaturase, e o oligonucleótido R0899 correspondia à sequência do vector pBluescript II SK(+) utilizado para preparação da biblioteca de ADNc. A amplificação foi realizada utilizando 10 pmol de cada iniciador e a Taq PCR Master Mix (Qiagen, Valência, CA) . As amostras foram desnaturadas inicialmente a 94 °C durante 3 minutos, seguidas de 30 ciclos do seguinte: 94°C durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto, 72°C durante 2 minutos. Um ciclo final de extensão a 72°C durante 10 minutos foi realizado antes da reacção ter terminado. Os fragmentos de PCR foram separados num gel de agarose a 0,8% e purificados em gel utilizando o Qiagen Gel Extraction Kit. As extremidades desencontradas nestes fragmentos foram "preenchidas" utilizando ADN-polimerase T4 (LifeTechnologies, Rockville, MD) de acordo com as especificações do fabricante, e estes fragmentos de ADN foram clonados no vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os plasmideos recombinantes foram transformados em células supercompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA), e clones foram sequenciados. O clone sd2-2 continha uma inserção de 958 pb que foi identificada como contendo a extremidade 3' do putativo gene de Δ6 com base na 42

ΕΡ 1 392 823/PT homologia de sequência com Δβ-dessaturases conhecidas e a presença do codão de terminação "TAA" e uma cauda Poli-A.

Para isolar a extremidade 5' desta Δβ-dessaturase de Saprolegnia diclina, o oligonucleótido R0939 (SEQ ID NO: 9) (5'-CGTAGTACTGCTCGAGGAGCTTGAGCGCCG-3') foi desenhado com base na sequência do fragmento #30-1 identificado anteriormente. Este oligonucleótido foi utilizado em combinação com R0898 (SEQ ID NO:10) (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG-3') (desenhado com base na sequência do vector pBluescript SK(+)) para amplificar por PCR a extremidade 5' da Δβ-dessaturase da biblioteca de ADNc. Neste caso, foi utilizado o estojo de PCR de ADNc Advantage-GC (Clonetech, Paio Alto, CA) para superar problemas de amplificação por PCR que ocorrem com regiões ricas em GC, previsto estarem presentes na extremidade 5' desta Δβ-dessaturase. As condições de ciclos térmicos foram como se segue: O molde foi inicialmente desnaturado a 94°C durante 1 minuto, seguido de 30 ciclos de (94°C durante 30 segundos, 68°C durante 3 minutos], e finalmente um ciclo de extensão a 68°C durante 5 minutos. Os produtos de PCR assim obtidos foram clonados no vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo o mesmo protocolo como descrito acima. Foi assim obtido o clone sd21-2 que continha uma inserção de 360 pb que continha o putativo local de inicio "ATG" da nova Δβ-dessaturase. A sequência de aminoácidos deduzida deste fragmento, quando alinhada com Δβ-dessaturases conhecidas mostrou 37-45% de identidade.

Este novo gene de Δβ-dessaturase foi isolado na sua totalidade através de amplificação por PCR utilizando a biblioteca de ADNc de S. diclina ou de ADN genómico de S. diclina como molde, e os seguintes oligonucleótidos: a. R0951 (SEQ ID NO:ll) (5'-TCAACAGAATTCATGGTCCAGGGGCAAAAGGCCGAGAAGATCTCG-3') que continha a sequência desde a extremidade 5' do clone sd21-2 bem como um local EcoRI (sublinhado) para facilitar a clonagem num vector de expressão de levedura b. RO960 (SEQ ID NO:12) (5’-ATACGTAAGCTTTTACATGGCGGGAAACTCCTTGAAGAACTCGATCG-3') que continha a sequência desde a extremidade 3' do clone sd2-2 43 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ incluindo ο codão de terminação bem como um local HindIII (sublinhado) para clonagem num vector de expressão. A amplificação por PCR foi realizada utilizando 200 ng do molde de plasmideo da biblioteca de ADNc, 10 pmoles de cada iniciador e a Taq PCR Master Mix (Qiagen, Valência, CA) , ou 200 ng de ADN genómico, 10 pmoles de cada iniciador, e o estojo de PCR de ADNc Advantage-GC (Clonetech, Paio Alto, CA) . As condições de ciclos térmicos foram como se segue: o molde foi inicialmente desnaturado a 94°C durante 1 minuto, seguido de 30 ciclos de (94°C durante 30 segundos, 68 °C durante 3 minutos), e finalmente um ciclo de extensão a 68°C durante 5 minutos. O produto de PCR assim obtido foi digerido com EcoRI/HindIII e clonado no vector de expressão de levedura pYX242 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para gerar os clones pRSPl (derivado de ADN genómico) e pRSP2 (derivado da biblioteca) que foram então sequenciados e utilizados para estudos de expressão. A inserção do gene inteiro da Δβ-dessaturase foi de 1362 pb (SEQ ID NO:13, Figura 2) de comprimento e, começando com o primeiro ATG, continha um enquadramento de leitura aberto codificando 453 aminoácidos. (A sequência nucleotidica codificando a A6-dessaturase foi depositada como plasmideo pRSPl na American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 sob os termos do Tratado de Budapeste a 23 de Janeiro de 2001 e foi concedido o número de acesso PTA-2829.) A sequência de aminoácidos do gene inteiro (SEQ ID NO:14, Figura 3) continha regiões de homologia com as A6-dessaturases de Mortierella alpina, Caenorhabditis elegans e Borago officinalis. Continha também as três "caixas de histidina" conservadas verificadas em todas as dessaturases ligadas à membrana conhecidas (Okuley, et al. (1994) The Plant Cell 6: 147-158). Estas estavam presentes nas posições de aminoácidos 171-176, 208-212 e 391-395. Tal como com outras A6-dessaturases ligadas à membrana, o terceiro motivo de caixa de Histidina (HXXHH) na Δ6-dessaturase de S. diclina foi verificado ser QXXHH. Esta sequência também continha um domínio do citocromo b5 na extremidade 5'. Este domínio do citocromo b5 é verificado em várias enzimas dessaturase ligadas à membrana, e pensa-se que o citocromo b5 funcione como um dador de electrões nestas 44

ΕΡ 1 392 823/PT enzimas. A presença deste domínio pode ser vantajosa quando se expressa a dessaturase em sistemas heterólogos para produção de PUFA. Uma vez que a utilização proposta deste gene é para a reconstrução da via biossintética dos PUFA em plantas, a composição de bases deste gene pode ser importante. (Sabe-se que alguns genes recombinantes mostram fraca expressão devido a variações na sua composição em bases em comparação com a do hospedeiro. 0 teor global de G+C deste gene foi de 59%, que está próximo do das dessaturases de M. alpina que foram expressas com sucesso em plantas).

Exemplo 3

Isolamento das Sequências Nucleotídicas de A5-Dessaturase de Saprolegnia diclina (ATCC 56851)

Saprolegnia diclina (ATCC 56851) produz tanto ácido araquidónico (ARA, 20:4n-6) como ácido eicosapentanóico (EPA, 20:5n-3); assim, pensou-se ter, talvez, uma A5-dessaturase que pudesse converter o ácido di-homo-gama-linolénico (DGLA, 20:3n-6) em ácido araquidónico (ARA, 20:4n-6).

Tal como com o isolamento da Δβ-dessaturase, para o isolamento da A5-dessaturase de S. diclina, várias combinações dos iniciadores degenerados foram utilizadas em reacções de PCR, utilizando a primeira cadeia de ADNc como molde. A combinação de iniciadores, R0753 e R0754, gerou uma banda distinta de 588 pb utilizando as seguintes condições de PCR: 2 μΐ do molde da primeira cadeia de ADNc, Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 μΜ de cada desoxirribonucleótido-trifosfato, 2 pmole de cada iniciador e 1 U de ADNc-polimerase (Clonetech, Paio Alto, CA), num volume reaccional final de 50 μΐ. Os ciclos térmicos foram realizados como se segue: uma desnaturação inicial a 94°C durante 3 minutos, seguida de 35 ciclos de: desnaturação a 94°C durante 30 segundos, ligação a 60°C durante 30 segundos e extensão a 72°C durante 1 minuto. Este foi seguido de uma extensão final a 72°C durante 7 minutos, e a reacção foi terminada a 4°C. Este fragmento assim gerado foi clonado (clone #18-1), sequenciado e, quando traduzido, mostrou 43% de identidade da sequência de aminoácidos com a Δ5-dessaturase de Mortierella alpina (acesso Genbank #AF067654) 45

ΕΡ 1 392 823/PT e 38,7% de identidade com a A5-dessaturase de Dictyostelium discoideum (acesso Genbank #AB029311). O segundo fragmento de PCR foi identificado utilizando os iniciadores R0834 e R0838 na reacção descrita no Exemplo 2. Este fragmento, de aproximadamente 1000 pb de comprimento, foi clonado (Clone #20-8) e a sequência de aminoácidos deduzida derivada de 775 pb mostrou 42% de identidade com a A5-dessaturase de Dictyostelium discoideum (acesso Genbank #AB029311). Estas duas sequências, #18-1 e #20-8, sobrepunham-se uma à outra indicando que pertenciam a uma única putativa A5-dessaturase de S. diclina. Estas sequências foram então utilizadas para desenhar iniciadores para recuperar a extremidade 3' e a 5' do novo gene de A5-dessaturase da biblioteca de ADNc gerada a partir do ARNm de S. diclina.

Para isolar a extremidade 3' desta putativa Δ5-dessaturase, foi realizada amplificação por PCR utilizando ADN plasmidico purificado a partir da biblioteca de ADNc, como molde e os oligonucleótidos R0851 (SEQ ID NO:15) (5' — CCATCAAGACGTACCTTGCGATC-3') e R08 99 (SEQ ID NO:8) (5 * — AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGC-3'). O oligonucleótido R0851 foi desenhado com base no fragmento #18-1 desta putativa Δ5-dessaturase, e o oligonucleótido R0899 correspondeu à sequência do vector pBluescript II SK(+). A amplificação foi realizada utilizando 200 ng do ADN plasmidico molde, 10 pmoles de cada iniciador e a Taq PCR Master Mix (Qiagen, Valência, CA) . As amostras foram desnaturadas inicialmente a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos do seguinte: 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto. Um ciclo de extensão final a 72°C durante 7 minutos foi realizado antes da reacção ter terminado. Os fragmentos de PCR foram clonados no vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 2. Os plasmideos recombinantes foram transformados para células supercompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA), e os clones foram sequenciados. O clone sdl2-ll continha uma inserção de 648 pb que continha a extremidade 3' do putativo gene de Δ5 com base na homologia de sequências com A5-dessaturases conhecidas e a presença do codão de terminação "TAA" e uma cauda poliA. 46

ΕΡ 1 392 823/PT A extremidade 5' desta A5-dessaturase de Saprolegnia diclina foi isolada utilizando os iniciadores R0941 e R0898. 0 oligonucleótido R0941 (SEQ ID NO:16) (51 — GCTGAACGGGTGGTACGAGTCGAACGTG-3') foi desenhado com base na sequência do fragmento #20-8 identificado anteriormente. Este oligonucleótido foi utilizado em combinação com R0898 (SEQ ID NO:10) (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG-3') (desenhado com base na sequência do vector pBluescript II SK(+)) numa reacção de amplificação por PCR utilizando o ADN plasmidico da biblioteca de ADNc como molde. Aqui o estojo de PCR de ADNc Advantage-GC (Clonetech, Paio Alto, CA) foi utilizado de acordo com o protocolo do fabricante, e as condições de ciclos térmicos foram como se segue: uma desnaturação inicial foi realizada a 94°C durante 1 minuto, seguida de 30 ciclos de (desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, ligação e extensão a 68°C durante 3 minutos), e um ciclo de extensão final a 68 °C durante 5 minutos. Estes produtos de PCR foram purificados, clonados no vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA), e sequenciados tal como descrito acima. O clone sd24-l foi identificado como contendo uma inserção de 295 pb que continha o putativo local de inicio "ATG" da nova A5-dessaturase. A análise da sequência de aminoácidos deduzida deste fragmento mostrou regiões de elevada homologia com Δδ-dessaturases conhecidas e também a presença de um domínio do citocromo b5. O gene inteiro da A5-dessaturase foi isolado através de amplificação por PCR utilizando ADN genómico de S. diclina como molde e os seguintes oligonucleótidos: a. R0953 (SEQ ID NO:17) (5 ' -ACGAGAGAATTCATGGCCCCGCAGACGGAGCTCCGCCAGCGC-3 ' ) que continha a sequência da extremidade 5' do clone sd24-l bem como um local EcoRI (sublinhado) para facilitar a clonagem num vector de expressão de levedura; e b. R0956 (SEQ ID NO:18) (5'-AAAAGACTCGAGTTAGCCCATGTGGATCGTGGCGGCGATGCCCTGC-3') que

continha a sequência da extremidade 3' do clone sdl2-ll incluindo o codão de terminação bem como um local Xho I (sublinhado) para clonagem num vector de expressão. 47

ΕΡ 1 392 823/PT

As condições para a amplificação por PCR do gene "inteiro" foram semelhantes às descritas para a amplificação da Δ6-dessaturase a partir de ADN genómico (Exemplo 2) . 0 produto de PCR assim obtido foi digerido com EcoRI/Xhol e clonado no vector de expressão de levedura pYX242 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mostrou-se que o clone pRSP3 (derivado de ADN genómico) continha uma inserção de 1413 pb e foi utilizado para estudos de expressão. 0 gene inteiro de 1413 pb (SEQ ID NO: 19, Figura 4) da putativa A5-dessaturase de S. diclina continha um enquadramento de leitura aberto codificando 471 aminoácidos (SEQ ID NO:20, Figura 5). (A sequência nucleotidica codificando a A5-dessaturase foi depositada (como plasmideo pRSP3) na American Type Culture Collection, 10810 University Boulevard, Manassas, VA 20110 sob os termos do Tratado de Budapeste a 23 de Janeiro de 2001 e foi concedido o número de acesso PTA-2928.) Esta proteína traduzida mostrou 40,5% de identidade global com a A5-dessaturasae de Mortierella alpina (acesso Genbank #AF067654) e 39,5% de identidade com a Δ5-dessaturase de Dictyostelium discoideum (acesso Genbank #AB022097). Continha também as três "caixas de histidina" conservadas nas posições de aminoácidos 186-190, 223-228, 406-410. Tal como a A6-dessaturase, esta sequência também continha um domínio de citocromo b5 na extremidade 5'. O teor global de G+C deste gene foi de 61,5%.

Exemplo 4

Expressão de Genes de Dessaturase de S. diclina em Fermento de Padeiro O clone pRSP2, que consistiu na Δδ-dessaturase inteira clonada em PYX242 (Invitrogen, Carlsbad, CA), e o clone pRSP3, que consistiu no gene inteiro da Delta5-dessaturase em pYX242, foram transformados na estirpe 334 competente de Saccharomyces cerevisiae. A transformação de levedura foi realizada utilizando o Alkali-Cation Yeast Transformation Kit (BIO 101, Vista, CA) de acordo com as condições especificadas pelo fabricante. Os transformantes foram seleccionados quanto a auxotrofia de leucina em meios sem leucina (DOB (-Leu)) . Para detectar a actividade específica de dessaturase destes 48

ΕΡ 1 392 823/PT clones, os transformantes foram criados na presença de 50 μΜ de substratos específicos de ácidos gordos tal como listado abaixo: a. Ácido esteárico (18:0) (a conversão em ácido oleico indicaria a actividade de A9-dessaturase) b. Ácido oleico (18:1) (conversão em ácido linoleico indicaria actividade de ál2-dessaturase) c. Ácido linoleico (18:2n-6) (a conversão em ácido alfa-linolénico indicaria actividade de A15-dessaturase e a conversão em ácido gama-linolénico indicaria actividade de Δβ-dessaturase) d. Ácido alfa-linolénico (18:3n-3) (a conversão em ácido estearidónico indicaria actividade de Δβ-dessaturase) e. Ácido di-homo-gama-linolénico (20:3n-6) (a conversão em ácido araquidónico indicaria actividade de A5-dessaturase). A estirpe de controlo negativo foi S. cerevisiae 334 contendo o vector pYX242 inalterado, e estes foram criados simultaneamente. As culturas foram agitadas vigorosamente (250 rpm) e criadas durante 48 horas a 24°C na presença de 50 μΜ (concentração final) dos vários substratos. As células foram sedimentadas e sujeitas vórtice em metanol; foi adicionado clorofórmio juntamente com tritridecanoína (como padrão interno). Estas misturas foram incubadas durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente ou a 4°C de um dia para o outro. A camada de clorofórmio foi extraída e filtrada através de um filtro Whatman com 1 g de sulfato de sódio anidro para remover particulados e água residual. Os solventes orgânicos foram evaporados a 40°C sob uma corrente de azoto. Os lípidos extraídos foram então derivados em ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME) para análise de cromatografia gasosa (GC) através da adição de 2 ml de hidróxido de potássio 0,5 N em metanol a um tubo fechado. As amostras foram aquecidas até 95°C-100°C durante 30 minutos e arrefecidas até à temperatura ambiente. Aproximadamente foram adicionados 2 ml de trifluoreto de boro a 14% em metanol e o aquecimento repetido. Após a mistura de lípidos extraídos 49

ΕΡ 1 392 823/PT arrefecer, 2 ml de água e 1 ml de hexano foram adicionados para extrair o FAME para análise através de GC. A percentagem de conversão foi calculada dividindo o produto produzido pela soma de (o produto produzido + o substrato adicionado) e depois multiplicando por 100. A Tabela 1 representa a actividade enzimática dos genes isolados com base na percentagem de conversão de substrato adicionado. O clone pRSPl que continha o gene da Δ6-dessaturase de S. díclína converteu 28% do substrato 18:2n-6 em 18:3n-3, bem como 37% do substrato 18:3n-3 em 18:4n-3. Isto confirma que o gene codifica uma Δβ-dessaturase. Não houve fundo (conversão não especifica de substrato) neste caso. (Todas as tabelas aqui referidas são apresentadas após o Resumo da Divulgação). O clone pRSP3 que continha o gene da Δδ-dessaturase de S. díclína foi capaz de converter 27% do substrato 20:3n-6 adicionado em 20:4n-6, indicando que a enzima que codifica é uma Δδ-dessaturase. Também neste caso, não foi detectada conversão de substrato de fundo. Estes dados indicam que dessaturases com diferente especificidade de substrato podem ser expressas num sistema heterólogo e podem também ser utilizadas para produzir ácidos gordos polinsaturados. A Tabela 2 representa ácidos gordos de interesse como percentagem dos lípidos totais extraídos de S. cerevisiae 334 com o plasmídeo indicado. Não estava presente glicose no meio de crescimento. Foi utilizada cromatografia gasosa de afinidade para separar os respectivos lípidos. Foi empregue GC/MS para identificar os produtos. A partir desta tabela, é aparente que os substratos adicionados exogenamente, quando adicionados na forma livre foram tomados pela levedura recombinante e incorporados nas suas membranas. No clone de levedura contendo o gene de Δβ-dessaturase (pRSPl), GLA (γ-18:3) foi identificado como novo PUFA quando foi adicionado LA (18:2) como substrato, e foi detectado ácido araquidónico em levedura contendo o gene de Δδ-dessaturase (pRSP3) quando foi adicionado DGLA (20:3) como substrato. 50 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ

Exemplo 5

Co-Expressão de Dessaturases de S. diclina com Elongases

Os plasmideos pRSPl (Δ6) e pRSP3 (Δ5) foram individualmente co-transformados com pRAE73-A3, um clone que contém o gene da Elongase Humana (SEQ ID NO:21) no vector de expressão de levedura pYES2, em levedura tal como descrito no Exemplo 4. Este gene de elongase catalisa alguns dos passos de alongamento na via dos PUFA. Os co-transformantes foram seleccionados em meio mínimo sem leucina nem uracilo (DOB(-Leu-Ura)). A Tabela 3 mostra que quando foram adicionados 50 μΜ do substrato LA (18:2n-6), a Δβ-dessaturase converteu este substrato em GLA (18:3n-6) e a elongase foi capaz de adicionar dois carbonos a GLA para produzir DGLA (20:3n-6). A percentagem de conversão do substrato no produto final através destas enzimas co-transformadas é de 26,4%, sem fundo observado a partir do controlo negativo. Semelhantemente, as enzimas co-transformadas podem actuar em ALA (18:3n-3) para finalmente formar (20:4n-3) com uma percentagem de conversão de 34,39%. Assim, a Δβ-dessaturase de S. diclina foi capaz de produzir um produto num sistema de expressão heterólogo que podia ser ainda utilizado por outra enzima heteróloga da via biossintética de PUFA para produzir o PUFA esperado. A Tabela 4 mostra resultados da experiência de co-transformação de pRSP3(Δ5)/Elongase Humana. Neste caso, o GLA (18:3n-6) substrato foi convertido em DGLA (20:3n-6) através de elongase humana e este foi ainda convertido em ARA (20:4n-6) através da acção da A5-dessaturase de S. diclina. A percentagem de conversão do substrato no produto final através destas enzimas co-transformadas é de 38,6%, sem fundo observado a partir do controlo negativo. O outro substrato testado neste caso foi STA (18:4n-3) que foi eventualmente convertido em EPA (20:5n-3) através da acção concertada das duas enzimas. Resultados semelhantes foram observados quando o pRSPl e o pRSP3 foram co-transformados com um gene de elongase derivado de M. alpina 51

ΕΡ 1 392 823/PT (pRPB2) (SEQ ID NO:22), e mostrou-se que ambos os genes eram funcionais na presença um do outro (ver Tabela 3 e Tabela 4).

Exemplo 6 (comparativo)

Isolamento de Sequências Nucleotidicas de A5-Dessaturase de Thraustochytrium aureum (ATCC 34303)

Para isolar putativos genes de dessaturase, foi isolado ARN total tal como descrito no Exemplo 2. Aproximadamente 5 pg foram transcritos de forma inversa utilizando o sistema de Pré-amplificação SuperScript (LifeTechnologies, Rockville, MD) tal como mostrado no Exemplo 2 para produzir a primeira cadeia de ADNc. Utilizando os iniciadores degenerados R0834 (SEQ ID NO:l) e 838 (SEQ ID NO: 4) desenhados com o programa de produção de blocos numa reacção de 50 μΐ, os seguintes componentes foram combinados: 2 μΐ do molde da primeira cadeia de ADNc, Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 μΜ de cada desoxirribonucleótido-trifosfato, 2 pmole de concentração final de cada iniciador e ADNc-polimerase (Clonetech, Paio Alto, CA) . Os ciclos térmicos foram realizados como se segue: uma desnaturação inicial a 94°C durante 3 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, ligação a 60°C durante 30 segundos e extensão a 72°C durante 1 minuto. Isto foi seguido de uma extensão final a 72°C durante 7 minutos. Duas bandas desvanecidas de aproximadamente 1000 pb foram separadas num gel de agarose a 1%, excisadas, e purificadas com QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valência, CA) . As extremidades foram preenchidas com ADN-polimerase T4 e os fragmentos terminados de forma cega clonados em PCR-Blunt como descrito no Exemplo 2. A sequenciação dos clones obtidos identificou a sequência parcial de 680 pb do clone 30-9 cuja tradução de 226 aminoácidos tinha 31,5% de identidade com a Δ6-dessaturase de peixe-zebra adulto (número de acesso Genbank AW281238). Um grau semelhante de homologia de aminoácidos (29,6%-28,7%) foi verificado com a A6-dessaturase humana (número de acesso Genbank AF126799) , A6-dessaturase de Physcomitrella patens (musgo) (número de acesso Genbank AJ222980), Δδ-esfingolipido-dessaturase de Brassica napus (colza) (número de acesso Genbank AJ224160), e Δδ-dessaturase humana (número de acesso ATCC 203557, número de acesso 52 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ

Genbank AF199596) . Uma vez que houve um razoável grau de homologia de aminoácidos com dessaturases conhecidas, procurou-se um gene inteiro codificando uma potencial dessaturase para determinar a sua actividade quando expresso em levedura.

Para isolar a extremidade 3' do gene, 10 pmol de iniciador R0936 (SEQ ID NO:23) (5'— GTCGGGCAAGGCGGAAAAGTACCTCAAGAG-3') e de iniciador do vector R0899 (SEQ ID NO:8) foram combinados numa reacção com 100 ng de plasmídeo purificado a partir da biblioteca de ADNc de T. ãureum num volume reaccional de 100 μΐ em Taq PCR Master Mix (Qiagen, Valência, CA) . As condições dos ciclos térmicos foram como se segue: uma fusão inicial a 94 °C durante 3 minutos seguida de 30 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto, e 72°C durante 2 minutos. Isto foi seguido de um passo de extensão de 10 minutos a 72°C. Várias bandas, incluindo o tamanho previsto de 1,2 kb, foram separadas num gel de agarose a 1% e purificadas tal como afirmado anteriormente. Também tal como descrito anteriormente, as extremidades dos fragmentos foram terminadas de forma cega, clonadas em PCR-Blunt e sequenciadas. O fragmento #70-2 de aproximadamente 1,2 kb foi sequenciado e continha um enquadramento de leitura aberto e um codão de terminação, que se sobrepunha ao fragmento 30-9.

Para isolar a extremidade 5' do gene, R0937 (SEQ ID NO:24) (5’-AAACCTGTAGACAATGTGGAGGGGCGTGGG-3') e R0899 (SEQ ID NO: 8) foram utilizados numa reacção de PCR de 50 μΐ com o estojo de PCR de ADNc Advantage-GC (Clonetech, Paio Alto, CA) , de acordo com o protocolo do fabricante, com 100 ng de ADN plasmídico purificado da biblioteca e 10 pmol de cada iniciador. As condições dos ciclos térmicos foram como se segue: Foi realizada uma desnaturação inicial a 94°C durante 1 minuto, seguido de 30 ciclos de (desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, ligação e extensão a 68°C durante 3 minutos), e um ciclo de extensão final a 68°C durante 5 minutos. Uma banda de aproximadamente 500 pb, no intervalo do tamanho esperado, foi purificada em gel, terminada de forma cega e clonada em PCR-Blunt tal como anteriormente descrito. O clone 95-2 continha um enquadramento de leitura aberto com um codão de inicio. Este fragmento também se sobrepunha com o 53

ΕΡ 1 392 823/PT clone 30-9, indicando que eram de facto pedaços do mesmo gene.

Para isolar o gene inteiro, foram desenhados iniciadores com locais de restrição a 5' e 3' (sublinhado) com EcoRI e Xhol, respectivamente, como se segue: o iniciador a 5' R0972 (SEQ ID NO:25) (5’— ATACTTGAATTCATGGGACGCGGCGGCGAAGGTCAGGTGAAC-3') , o iniciador a 3', R0949 (SEQ ID NO:26) (5’— CTTATACTCGAGCTAAGCGGCCTTGGCCGCCGCCTGGCC-3') e o iniciador a 3' RO950 (SEQ ID NO:27) (51 -CTTATACTCGAGTAAATGGCTCGCGAGGCGAAGCGAGTGGC-3'). Foram utilizados dois iniciadores para a extremidade 3' do gene na tentativa de isolamento inicial uma vez que o iniciador R0949, contendo o codão de terminação tinha um teor de GC de 66%, enquanto o iniciador alternativo RO950, que estava fora do codão de terminação, tinha apenas um teor de GC de 56%. Uma reacção de PCR de 50 μΐ com R0972/R0949 e RO972/950 foi efectuada com o estojo de PCR de ADNc Advantage-GC (Clonetech, Paio Alto, CA) sob condições idênticas anotadas no parágrafo anterior. Apenas o conjunto de iniciadores RO972/950 produziu uma banda de aproximadamente 1,6 kb. A utilização de ADN genómico como molde (sob condições idênticas com 100 ng de alvo) produziu também uma banda de tamanho semelhante. Os fragmentos foram separados num gel de agarose, purificado em gel, terminado de forma cega e clonado em PCR-Blunt tal como anteriormente descrito. Os fragmentos foram avaliados através de sequenciação, e vários clones foram cortados com EcoRI/Xhol para excisar o gene inteiro, ligados a pYX242 EcoRI/Xhol que tinha sido tratado com fosfatase alcalina de camarão (Roche, Indianapolis, IN) com o estojo de ligação Rapid (Roche, Indianapolis, IN) . O clone 99-3, designado pRTA4, continha o gene inteiro de 1317 pb (SEQ ID NO:28, Figura 6) e um enquadramento de leitura aberto de 439 aa (SEQ IN NO: 29, Figura 7). (A sequência nucleotidica codificando a A5-dessaturase foi depositada com a ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 sob os termos do Tratado de Budapeste a 23 de Janeiro de 2001 e foi concedido o número de acesso PTA-2927) . Este gene continha três caixas de histidina nos aminoácidos número 171-175, 208-212, e 376-380. A extremidade 5' do gene, quando traduzida, mostra também homologia com o citocromo b5. 54

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Exemplo 7 (comparativo)

Expressão do Gene de Dessaturase de T. aureum em Fermento de

Padeiro 0 clone pRTA4 contendo o gene inteiro foi transformado para o hospedeiro de levedura S. cerevisiae 334 e plaqueado em meio selectivo tal como descrito no Exemplo 4. As culturas foram criadas a 24 °C durante 48 horas em meio mínimo sem leucina com 50 μΜ de ácido gordo livre exógeno adicionado como substrato tal como mostrado na Tabela 5. A única conversão de um substrato foi de DGLA (20:3n-6) em ARA (20:4n-6). A conversão de 23,7% do DGLA adicionado indica que este gene codifica para uma A5-dessaturase. A Tabela 6 mostra alguns dos ácidos gordos em percentagem do lípido extraído do hospedeiro de levedura. Para a actividade de A5-dessaturase, não houve fundo (detecção de ARA observada no controlo negativo contendo o plasmídeo de expressão de levedura, PYX242.)

Exemplo 8 (comparativo)

Co-Expressão do Gene de Dessaturase de T. aureum com

Elongases O plasmídeo pRTA4 foi co-transformado com uma enzima adicional na via dos PUFA, pRAE73-A3 que contém o qene da elongase humana no vector de expressão de levedura pYES2 tal como descrito no Exemplo 4, e os co-transformantes foram seleccionados em meio mínimo sem leucina nem uracilo. A Tabela 7 mostra que quando foram adicionados 100 μΜ do substrato DGLA, a A5-dessaturase produziu activamente ARA, ao qual a elongase foi capaz de adicionar dois carbonos para produzir ADA. A percentagem de conversão de A5-dessaturase de T. aureum, que consiste tanto em ARA como em ADA (produtos), foi de 16,7%, sem fundo observado a partir do controlo negativo.

Tendo em vista os resultados acima, a A5-dessaturase de T. aureum é capaz de produzir um produto num sistema de 55

ΕΡ 1 392 823/PT expressão heterólogo que pode ser utilizado através de uma enzima heteróloga adicional na via biossintética dos PUFA para produzir o PUFA esperado.

Exemplo 9 (comparativo)

Isolamento das Sequências Nucleotidicas de A5-dessaturase de Thraustochytrium aureum BICC7091 (T7091)

Um candidato a dessaturase parcial foi isolado utilizando a combinação de iniciadores degenerados de R0834/R0838, listada no Exemplo 1. 0 ADN genómico foi preparado a partir de Thraustochytrium aureum BICC7091 (Biocon índia Ltd., Bangalore, índia) utilizando o estojo DNeasy plant maxi (Qiagen, Valência, CA). 0 ADNg de T7091 foi amplificado com os iniciadores R0834 (5'-GTB TAY GAY GTB ACC GAR TGG GTB AAG CGY CAY CCB GGH GGH-3') (SEQ ID N0:1) e R0838 (5'-CAT GGT VGG RAA SAG RTG RTG YTC RAT CTG RTA GTT-3') (SEQ ID NO:36). A amplificação por PCR foi realizada num volume de 100 μΐ contendo: 5 μΐ de ADNg de T7091 isolado, mistura de dNTP 0,2 M, 50 pM de cada iniciador, 10 μΐ de tampão 10χ e 1,0 U de ADNc-polimerase. As condições do termociclador em Perkin Elmer 9600 foram como se segue: 94°C durante 3 min, depois 35 ciclos de 94°C durante 30 seg., 60°C durante 30 seg., e 72°C durante 1 min. A PCR foi seguida de uma extensão adicional a 72°C durante 7 minutos. A mistura amplificada por PCR foi corrida num gel de agarose a 1,0% e fragmentos amplificados por PCR de aproximadamente 1,2 Kb e 1,4 Kb foram purificados em gel utilizando o Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valência, CA). As extremidades desencontradas nestes fragmentos foram preenchidas utilizando ADN-polimerase T4 (LifeTechnologies, Rockville, MD) , os fragmentos isolados foram clonados no vector pCR-Blunt (Invitrogen, Co., Carlsbad, CA) , e os plasmídeos recombinantes foram transformados em células supercompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Foram preparados e sequenciados vinte e quatro clones utilizando o Sequenciador de ADN ABI 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA) . As sequências traduzidas foram utilizadas como consultas para pesquisar a base de dados GenEmbl (Genetics Computer Group (GCG) (Madison, WI)), 56 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ utilizando ο algoritmo tFastA (uma pesquisa Pearson e Lipman da semelhança entre uma sequência proteica de consulta e qualquer grupo de sequências nucleotidicas). Um fragmento génico, T7091B2, foi ainda procurado porque tinha identidade com dessaturases conhecidas. T7091B2 tinha 26,8% de identidade em 362 aminoácidos com a A5-dessaturase humana (número de acesso GenBank AF226273).

Para isolar as extremidades 3' e 5', novos iniciadores foram desenhados com base na sequência interna de T7091B2. A biblioteca de ADNc de T7091, que contém aproximadamente 2χ107 clones com um tamanho médio de inserção de 1 Kb, foi amplificada por PCR utilizando os novos iniciadores e um iniciador do vector. Os iniciadores que produziram mais sequências 5' e 3' com os iniciadores do vector R0898 (5'-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CGA CGG CCA G-3') (SEQ ID NO: 10) e R0899 (5'-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGC-3') (SEQ ID NO:8) foram RO1065 (5'-CGA CAA GAG GAA GAG TGT CCA AAT C-3’) (SEQ ID NO: 37) e RO10 64 (5'-CGC CTT CAA GAG TTT TTG TAC GGA ATT GGG-3’) (SEQ ID NO: 38), respectivamente, para o clone T7091B2. Dois novos iniciadores foram desenhados com base nas sequências 5' e 3' de T7091B2: a. RO1097 (5’-CTT GTA CCA TGG GTC GCG GAG CAC AGG GAG-3) (SEQ ID NO: 39), que tem um local de restrição Ncol adicionado (sublinhado) b. RO10 98 (5' -TGA AGC TTA CTC GCT CTT GGC AGC TTG GCC-3') (SEQ ID NO:40), que tem um local de restrição HindIII adicionado (sublinhado)

Este novo gene de A5-dessaturase foi isolado na sua totalidade através de amplificação por PCR, utilizando ADNg de T. aureum 7 091. A PCR foi realizada num volume de 50 μΐ contendo: 1 μΐ de ADNg de T7091 isolado, mistura de dNTP 0,2 μΜ, 50 pM de cada iniciador, 5 μΐ de tampão 10*, 1,5 μΐ de MgS04 50 mM, e 0,5 U de ADN-polimerase Taq. As condições do termociclor em Perkin Elmer 9600 foram como se segue: 94°C durante 3 min, depois 30 ciclos de 95°C durante 45 seg., 55°C durante 30 seg., e 68°C durante 2 min. A mistura amplificada 57 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ por PCR foi corrida num gel, um fragmento amplificado de aproximadamente 1,3 Kb foi purificado em gel, e o fragmento isolado foi clonado no vector pYX242 {Ncol/EcoRV) . Dois clones, designados como pRAT-2a e 2c, foram preparados e sequenciados. (0 plasmideo pRAT-2c foi depositado na American

Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 em _ de Janeiro de 2002 sob os termos do Tratado de Budapeste e foi-lhe concedido o número de depósito ATCC ) . As sequências eram diferentes em quatro aminoácidos (Figura 12), e a sequência traduzida tinha 67,4% de identidade em 436 aminoácidos com a A5-dessaturase de T. aureum (ATCC34303) (ver Exemplo 6).

Exemplo 10 (comparativo)

Isolamento de Sequências Nucleotidicas de A6-dessaturase de Thraustochytrium aureum BICC7091 (T7091)

Trezentos e setenta e três moldes da biblioteca de ADNc de T7091 foram sequenciados para determinar a viabilidade da biblioteca. As sequências traduzidas foram utilizadas como consultas para pesquisar a base de dados GenEmbl utilizando o algoritmo tFastA. O clone 602187281R1 (ou clone 281 para abreviar) tinha identidade com várias dessaturases conhecidas. As extremidades 5' e 3' do clone de EST foram sequenciadas para desenhar iniciadores para amplificação. Os iniciadores RO1107 (5'-TTT AAC CAT GGG CCG CGG CGG CGA GAA AAG-3') (SEQ ID NO: 41), que têm um local de restrição Ncol adicionado (sublinhado), e RO1108 (5’-GGG AAG AAG CTT TCT ACT GCG CCT TGG CTT TCT TTG-3') (SEQ ID NO:42), que tem um local de restrição HindiII adicionado (sublinhado), foram utilizados para amplificar por PCR o ADNg de T7091. A PCR foi realizada num volume de 50 μΐ com ADN-polimerase Taq tal como acima. A mistura amplificada por PCR foi corrida num gel, um fragmento amplificado de aproximadamente 1,3 Kb foi purificado em gel, e o fragmento isolado foi clonado no vector pYX242{Ncol/EcoRV) . Dois clones, designados como pRAT-la e lb, foram preparados e sequenciados. As sequências foram diferentes num aminoácido (Figura 13) , e a sequência traduzida tinha 25% de identidade em 430 aminoácidos com a A5-dessaturase humana. (O plasmideo 58

ΕΡ 1 392 823/PT pRAT-la foi depositado na American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 a _ de

Janeiro de 2002 sob os termos do Tratado de Budapeste e foi-lhe concedido o número de depósito ATCC _).

Exemplo 11 (comparativo)

Expressão de Genes de Dessaturase de Γ. aureum 7091 em

Fermento de padeiro

Os clones pRAT-2a e pRAT-2c, que consistiram na Δ5-dessaturase inteira clonada em pYX242 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , e os clones pRAT-la e pRAT-lb, que consistiram no gene de Δβ-dessaturase inteiro em pYX242, foram transformados em Saccharomyces cerevisiae 334 competente. A transformação da levedura foi realizada utilizando o Alkali-Cation Yeast Transformation Kit (BIO 101, Vista, CA) . Os transformantes foram seleccionados quanto a auxotrofia de leucina em meio sem leucina (DOB(-leu)). Como a sequência traduzida do ADNc de pRAT-1 não tinha uma forte identidade com qualquer dessaturase particular conhecida, vários substratos de ácido gordo foram testados para determinar a actividade da enzima expressa. Para detectar a actividade especifica de dessaturase dos clones pRAT-la e pRAT-lb, os transformantes foram criados na presença de 100 μΜ de substratos de ácido gordo específicos tal como listado abaixo: a. Ácido linoleico (LA, 18:2n-6) (a conversão em ácido α-linolénico indicaria actividade de Δΐδ-dessaturase e a conversão em ácido γ-linolénico indicaria actividade de Δβ-dessaturase) . b. Ácido α-linolénico (ALA, 18:3n-3) (a conversão em ácido estearidónico indicaria actividade de Δβ-dessaturase). c. Ácido ωβ-eicosadienóico (EDA, 20:2n-6) (a conversão em ácido di-homo-y-linolénico indicaria actividade de Δ8-dessaturase). d. Ácido di-homo-y-linolénico (DGLA, 20:3n-6) (a conversão em ácido araquidónico indicaria actividade de Δ5-dessaturase). 59

ΕΡ 1 392 823/PT Ο substrato para os clones de pRAT-2 foi 100 μΜ de DGLA. S. cerevisiae 334 contendo o vector pYX242 inalterado foi utilizada como controlo negativo. Tanto pRAT-la como pRAT-2c foram também co-transformados para S. cerevisiae 334 com pRAE-73-A3 (i.e., um vector contendo a enzima elongase humana que converte ácidos gordos 18C em ácidos gordos 20C, SEQ ID NO: 21) (ver Exemplo 5) . Os substratos para os clones pRAT-la/pRAE-73-A3 foram LA e ALA, e os substratos para os clones pRAT-2c/pRAE-7 3-A3 foram LA, ALA, e GLA. As culturas foram criadas durante 48 horas a 24°C, em meio selectivo, na presença de um determinado substrato. As análises de ácidos gordos foram efectuadas tal como delineado no Exemplo 4. A Tabela 8 inclui um exemplo da produção de AA através da estirpe 334 (pRAT-2c) vs. através da estirpe de controlo 334 (pYX242). A quantidade de AA produzida foi de 22,98% vs. nenhuma quantidade detectável na estirpe de controlo. A estirpes 334(pRAT-2a) também não teve qualquer quantidade detectável de AA produzida (dados não mostrados). As quatro diferenças de aminoácidos entre os dois clones (Figura 12, ver sublinhado) tornaram a enzima expressa a partir da estirpe 334(pRAT-2a) inactiva. A actividade de Δδ-dessaturase do clone pRAT-2c foi ainda detectada quando co-expressa com pRAE-73-A3 na presença de GLA. A Tabela 9 é os resultados da análise de ácidos gordos das estirpes 334(pRAT-la) e 334(pYX242) expressa na presença dos substratos LA, ALA, EDA, e DGLA. A Δβ-dessaturação de LA produzirá GLA, a Δδ-dessaturação de EDA produzirá DGLA, e a A5-dessaturação de DGLA produzirá AA. Todas as três actividades foram detectadas a partir de ambas as estirpes contendo o gene de T7091 vs. a estirpe de controlo. Com base nas taxas de conversão, esta enzima é uma Δβ-dessaturase activa, que se pode comportar como uma Δ5 ou Δδ-dessaturase, dados os substratos correctos. No entanto, as taxas de conversão destes substratos nos seus respectivos ácidos gordos dessaturados são baixas, em comparação com os substratos para uma Δβ-dessaturação. A única diferença de aminoácidos entre os dois clones (Figura 13, ver sublinhado) não teve qualquer efeito na actividade enzimática (dados não mostrados). As percentagens de conversão são mostradas na 60

ΕΡ 1 392 823/PT caixa inferior da Tabela 9. A actividade de Δβ-dessaturase foi ainda detectada quando pRAT-la foi co-expressa com pRAE-73-A3 na presença de LA ou ALA. As percentagens de conversão não foram calculadas para a experiência de co-expressão, uma vez que é difícil determinar se a produção dos novos ácidos gordos é devida à actividade da dessaturase, ou elongase, ou à combinação das duas enzimas.

Foram explorados dois métodos diferentes de isolamento de um novo gene para identificar genes de dessaturase de T. aureum 7091. Estes métodos conduziram ao isolamento dos genes da A5-dessaturase e da Δβ-dessaturase de T7091. Na presença destes genes e dos substratos apropriados, S. cerevisiae produziu ácidos gordos dessaturados a um nivel muito mais elevado que a estirpe de controlo. A co-transformação das construções contendo o gene de T7091B2 (pRAT-2c) e o gene de elongase humana (pRAE-73-A3) em levedura resultou na conversão do substrato GLA em AA. Esta experiência confirmou que a enzima expressa a partir de pRAT-2c tem de dessaturar o DGLA (produzido através da elongase) em AA. A co-transformação das construções contendo o gene "281" (pRAT-la) e o gene de elongase humana (pRAE-73-A3) em levedura resultou na conversão do substrato LA em DGLA. Esta experiência confirmou que a enzima expressa a partir de pRAT-la deve dessaturar LA em GLA.

Exemplo 13 (comparativo)

Isolamento da Sequência Nucleotídica de A5-dessaturase a partir de Isochrysis galbana 1323

Um candidato a dessaturase parcial foi isolado utilizando a combinação de iniciadores degenerados de R0834/R0838, listada no Exemplo 1. 0 ADN genómico foi preparado a partir de Isochrysis galbana CCMP1323 (Provasoli-Guillard National Center for the Culture of Marine Phytoplankton (CCMP), West Boothbay Harbor, MA) utilizando o estojo DNeasy plant maxi (Qiagen, Valência, CA). 0 ADNg de I. galbana foi amplificado com os iniciadores R0834 (5'-GTB TAY GAY GTB ACC GAR TGG GTB AAG CGY CAY CCB GGH GGH-3' ) (SEQ ID NO:1) e RO838 (5'-CAT GGT VGG RAA SAG RTG RTG YTC RAT CTG RTA GTT-3') (SEQ ID NO:10). A PCR foi realizada num volume de 50 61

ΕΡ 1 392 823/PT μΐ contendo: 1 μΐ de ADNg de I. galbana isolado, 0,2 μΜ de mistura de dNTP, 50 pM de cada iniciador, 5 μΐ de tampão 10χ, 1,5 μΐ de MgSCN 50 mM, e 0,5 U de ADN-polimerase Taq. As condições de termociclador em Perkin Elmer 9600 foram como se segue: 94°C durante 3 min, depois 30 ciclos de 95°C durante 45 seg., 55°C durante 30 seg., e 68°C durante 2 min. A mistura amplificada por PCR foi corrida num gel de agarose a 1,0%, e um fragmento amplificado de aproximadamente 1,1 Kb foi purificado em gel utilizando o Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valência, CA). As extremidades desencontradas do fragmento foram preenchidas utilizando ADN-polimerase T4 (LifeTechnologies, Rockville, MD) , o fragmento isolado foi clonado no vector pCR-Blunt (Invitrogen, Co., Carlsbad, CA), e os plasmideos recombinantes foram transformados para células supercompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Foram preparados e sequenciados seis clones utilizando um Sequenciador de ADN ABI 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Todas as sequências foram a mesma. A sequência traduzida do fragmento isolado tinha 47,5% de identidade em 335 aminoácidos com a A5-dessaturase de T. aureum (ATCC 34303) no clone pRTA4 (Exemplo 6), e 45,3% de identidade em 278 aminoácidos com a A5-dessaturase de T. aureum BICC7091 no clone pRAT-2c (Exemplo 9).

Para isolar as extremidades 5' e 3', foram desenhados novos iniciadores com base na sequência interna do fragmento isolado de I. galbana. Para a extremidade do iniciador 5' do gene foi utilizado R01235 (5'-CGA AGT TGG TGA AGA TGT AGG TGC CG-3' ) (SEQ ID NO: 43), enquanto R01232 (5'-GAG CGA CGC GTA CAA CAA CTT TCA CGT-3') (SEQ ID NO: 44) foi utilizado para a extremidade 3' do gene. Foram utilizados aproximadamente 1,4 pg de ARN total, de acordo com as orientações do fabricante, com a amplificação Rapid das extremidades do ADNc ou RACE com o estojo GeneRacer™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) e a enzima Superscript II™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) para transcrição reversa para produzir o ADNc alvo. Para a amplificação inicial das extremidades, foi utilizado o seguinte protocolo de ciclos térmicos num Perkin Elmer 9600: fusão inicial a 94°C durante 2 minutos; seguido de 5 ciclos de 94°C durante 30 segundos e 72°C durante 3 minutos; 10 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 70°C durante 30 segundos, e 72°C durante 62

ΕΡ 1 392 823/PT 3 minutos; e 20 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 68°C durante 30 segundos e 72 °C durante 3 minutos; seguido de uma extensão de 72°C durante 10 minutos. Esta primeira reacção de PCR foi efectuada com 10 pMol de R01235 ou R01232 e iniciador 5' GeneRacer™ (5'-CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA-3’) (SEQ ID NO:45), ou iniciador 3’ GeneRacer™ (5'-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G-3') (SEQ ID NO: 46), respectivamente, com 1 μΐ de Thermozyme™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 1 μΐ de ADNc num volume final de 50 μΐ, de acordo com as orientações do fabricante.

Foi realizada uma reacção interna com 2 μΐ da reacção inicial, 10 pmol do iniciador interno R01234 (5'-AGC TCC AGG TGA TTG TGC ACG CGC AG-3') (SEQ ID NO:47) ou R01233 (5’-GAC TTT GAG AAG CTG CGC CTC GAG CTG-3’) (SEQ ID NO:48) e 30 pmol do iniciador 5' interno GeneRacer™ (5’-GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3') (SEQ ID NO: 49) e iniciador 3' interno GeneRacer™ (5'-CGC TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG-3’) (SEQ ID NO:50), respectivamente, e Platinum Taq™ PCRx (Clonetech, Paio Alto, CA) utilizando MgS04 de acordo com o protocolo do fabricante. Os parâmetros de ciclos térmicos foram como se segue num Perkin Elmer 9600: fusão inicial a 94°C durante 2 minutos; seguido de 5 ciclos de 94°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos; 5 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 70°C durante 2 minutos; 20 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos e 68°C durante 2 minutos; seguido de uma extensão de 68°C durante 10 minutos. A análise em gel de agarose dos produtos de PCR mostrou uma banda em torno de 800 pares de bases para as reacções 5' e uma banda de aproximadamente 1,2 quilobases para a reacção 3'. A clonagem subsequente em pCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA), a transformação em células competentes ToplO (Invitrogen, Carlsbad, CA) , e a sequenciação, revelaram um enquadramento de leitura aberto com um codão de iniciação e um de terminação.

Os iniciadores RO1309 (5'-ATG ATG GAA TTC ATG GTG GCA GGC AAA TCA GGC GC-3') (SEQ ID NO:51) e RO1310 (5'-AAT AAT GTC GAC CTA GTG CGT GTG CTC GTG GTA GG-3') (SEQ ID NO:52) com locais de restrição adicionados para clonagem (ver FcoRI e Sal I sublinhados, respectivamente) foram utilizados para isolar um gene inteiro. Tal como mostrado acima, 10 pmol dos 63 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ iniciadores RO1309 e 1310 foram utilizados com Platinum Taq™ PCRx (Clonetech, Paio Alto, CA) utilizando MgSCú de acordo com o protocolo do fabricante, com 2 μΐ do ADNc como alvo. Os parâmetros dos ciclos térmicos foram como se segue: fusão inicial a 94°C durante 2 minutos; seguido de 5 ciclos de 94°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos; 5 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 70°C durante 2 minutos; 20 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos e 68°C durante 2 minutos; seguido de uma extensão de 68°C durante 10 minutos. O único produto da reacção foi purificado em gel utilizando o estojo de purificação em gel QiaQuick (Qiagen,

Valência, CA), cortado com EcoRI e Sal I, ligado ao ADN linearizado de pYX242 EcoRI/Xhol com o estojo de ligação

Rapid (Roche, Indianapolis, IN), e designado pRIG-1. O clone pRIG-1 continha um gene inteiro de 1329 pb (SEQ ID NO: 34; Figura 14) e um enquadramento de leitura aberto de 442 aminoácidos (SEQ ID NO:35; Figura 15) . (O plasmideo pRIG-1 foi depositado na American Type Culture Collection, 10801

University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 em _ de Janeiro de 2002 sob os termos do Tratado de Budapeste e foi-lhe concedido o número de depósito ATCC _).

Exemplo 13 (comparativo)

Expressão do Gene de Dessaturase de I. qalbana em Fermento de

Padeiro O clone pRIG-1 contendo o gene inteiro foi transformado para o hospedeiro de levedura S. cerevisiae 334 e plaqueado em meio selectivo tal como descrito no Exemplo 4. As culturas foram criadas a 24 °C durante 48 horas em meio mínimo sem leucina, com 50 μΜ de ácidos gordos livres exógenos adicionados como substrato tal como mostrado na Tabela 10. A conversão dos substratos foi ETA (20:4n-3) em EPA (20:5n-3) e DGLA (20:3n-6) em AA (20:4n-6). A conversão de 45,4% em ARA e a conversão de 59, 75% em EPA indicam que este gene codifica para uma A5-dessaturase. A Tabela 10 mostra alguns dos ácidos gordos como percentagem do lipido extraído a partir do hospedeiro de levedura. Para a actividade de A5-dessaturase, houve pouco ou nenhum fundo (detecção de ARA ou EPA observada no controlo negativo contendo o plasmideo de expressão de levedura, pYX242.) 64

ΕΡ 1 392 823/PT

Exemplo 14 (comparativo)

Co-Expressão do Gene de Dessaturase de I. galbana com

Elongases 0 plasmideo pRIG-1 pode ser co-transformado com uma enzima adicional na via de PUFA, tal como pRAE-73-A3 que contém o gene da elongase humana no vector de expressão de levedura pYES2 tal como descrito no Exemplo 4, e os co-transformantes seleccionados em meio mínimo sem leucina nem uracilo. Substratos tais como DGLA ou ETA podiam ser adicionados de modo a que a A5-dessaturase produzisse activamente ARA ou EPA, aos quais a elongase é capaz de adicionar dois carbonos para produzir ADA ou 3-DPA. Portanto, a A5-dessaturase de I. galbana podia produzir um produto num sistema de expressão heterólogo que pode ser utilizado por uma enzima heteróloga adicional na via biossintética dos PUFA, para produzir o PUFA esperado.

As seguintes composições nutricionais não fazem parte do invento reivindicado e são descritas por razões comparativas.

Composições Nutricionais

Os PUFA descritos na Descrição Detalhada podem ser utilizados em vários suplementos nutricionais, formulações infantis, substitutos nutricionais e outras soluções nutricionais.

I. FORMULAÇÕES INFANTIS A. Isomil® Fórmula de Soja com Ferro:

Utilização: Como bebida para bebés, crianças e adultos com uma alergia ou sensibilidade a leite de vaca. Um alimento para pacientes com distúrbios pelos quais a lactose deve ser evitada: deficiência em lactase, intolerância à lactose e galactosemia.

Características: - Isolado de proteínas de soja para evitar sintomas de alergia ou sensibilidade às proteínas do leite de vaca. 65

ΕΡ 1 392 823/PT - Formulação sem lactose para evitar diarreia associada à lactose. - Baixa osmolalidade (240 mOs/kg de água) para reduzir o risco de diarreia osmótica.

Hidratos de carbono duplos (xarope de milho e sacarose) desenhados para aumentar a absorção de hidratos de carbono e reduzir o risco de exceder a capacidade de absorção do intestino danificado. 1,8 mg de Ferro (como sulfato ferroso) por 100

Calorias para ajudar a prevenir a deficiência em ferro. - Níveis recomendados de vitaminas e minerais. Óleos vegetais para proporcionar os níveis recomendados de ácidos gordos essenciais. - Cor branca láctea, consistência semelhante à do leite e aroma agradável.

Ingredientes: (Pareve) 85% de água, 4,9% de xarope de milho, 2,6% de açúcar (sacarose), 2,1% de óleo de soja, 1,9% de isolado de proteínas de soja, 1,4% de óleo de coco, 0,15% de citrato de cálcio, 0,11% de fosfato de cálcio tribásico, citrato de potássio, fosfato de potássio monobásico, cloreto de potássio, monoglicéridos e diglicéridos, lecitina de soja, carragenano, ácido ascórbico, L-metionina, cloreto de magnésio, fosfato de potássio dibásico, cloreto de sódio, cloreto de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinco, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de cálcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloridrato de cloreto de tiamina, riboflavina, cloridrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganésio, iodeto de potássio, filoquinona, biotina, selenito de sódio, vitamina D3 e cianocobalamina. B. Isomil® DF Fórmula de Soja para Diarreia:

Utilização: Como alimento de curto prazo para a gestão dietética da diarreia em bebés e crianças pequenas.

Características: - Primeira fórmula infantil a conter fibras dietéticas adicionadas de fibra de soja especificamente para a gestão da diarreia. 66

ΕΡ 1 392 823/PT - Mostrado clinicamente que reduzia a duração de fezes moles e aguadas durante diarreia moderada a grave em bebés.

Nutricionalmente completa para satisfazer as necessidades nutricionais do bebé.

Isolado de proteínas de soja com L-metionina adicionada satisfaz ou excede um requisito infantil de todos os aminoácidos essenciais. - Formulação sem lactose para evitar diarreia associada à lactose. - Baixa osmolalidade (240 mOsm/kg de água) para reduzir o risco de diarreia osmótica.

Hidratos de carbono duplos (xarope de milho e sacarose) desenhados para aumentar a absorção de hidratos de carbono e reduzir o risco de exceder a capacidade de absorção do intestino danificado. - Satisfaz ou excede os níveis de vitaminas e minerais recomendados pelo Committee on Nutrition of the American Academy of Pediatrics e necessário para a Infant Formula Act. 1,8 mg de ferro (como sulfato ferroso) por 100 Calorias para ajudar a prevenir a deficiência em ferro. Óleos vegetais para proporcionar os níveis recomendados de ácidos gordos essenciais.

Ingredientes: (Pareve) 86% de água, 4,8% de xarope de milho, 2,5% de açúcar (sacarose), 2,1% de óleo de soja, 2,0% de isolado de proteínas de soja, 1,4% de óleo de coco, 0,77% de fibra de soja, 0,12% de citrato de cálcio, 0,11% de fosfato de cálcio tribásico, 0,10% de citrato de potássio, cloreto de potássio, fosfato de potássio monobásico, monoglicéridos e diglicéridos, lecitina de soja, carragenano, cloreto de magnésio, ácido ascórbico, L-metionina, fosfato de potássio dibásico, cloreto de sódio, cloreto de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinco, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de cálcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloridrato de cloreto de tiamina, riboflavina, cloridrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganésio, iodeto de potássio, filoquinona, biotina, selenito de sódio, vitamina D3 e cianocobalamina. 67

ΕΡ 1 392 823/PT C. Isomil® SF Fórmula de Soja Sem Sacarose com Ferro:

Utilização: Como bebida para bebés, crianças e adultos com uma alergia ou sensibilidade a proteínas do leite de vaca ou uma intolerância à sacarose. Um alimento para pacientes com distúrbios pelos quais se deve evitar a lactose e a sacarose.

Características: - Isolado de proteínas de soja para evitar sintomas de alergia ou sensibilidade às proteínas do leite de vaca. - Formulação sem lactose para evitar diarreia associada à lactose (a fonte de hidratos de carbono é Polímeros de Glicose Polycose®) . - Sem sacarose para o paciente que não pode tolerar sacarose. - Baixa osmolalidade (180 mOsm/kg de água) para reduzir o risco de diarreia osmótica. 1,8 mg de ferro (como sulfato ferroso) por 100 Calorias para ajudar a prevenir a deficiência em ferro. - Níveis recomendados de vitaminas e minerais. Óleos vegetais para proporcionar os níveis recomendados de ácidos gordos essenciais. - Cor branca láctea, consistência semelhante à do leite e aroma agradável.

Ingredientes: (Pareve) 75% de água, 11,8% de amido de milho hidrolisado, 4,1% de óleo de soja, 4,1% de isolado de proteínas de soja, 2,8% de óleo de coco, 1,0% de amido de milho modificado, 0,38% de fosfato de cálcio tribásico, 0,17% de citrato de potássio, 0,13% de cloreto de potássio, monoglicéridos e diglicéridos, lecitina de soja, cloreto de magnésio, ácido ascórbico, L-metionina, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, cloreto de colina, carragenano, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinco, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de cálcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloridrato de cloreto de tiamina, riboflavina, cloridrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganésio, iodeto de potássio, filoquinona, biotina, selenito de sódio, vitamina D3 e cianocobalamina. 68

ΕΡ 1 392 823/PT D. Isomil® 20 Fórmula de Soja com Ferro e Pronta a Comer, 20 Cal/f1 oz.:

Utilização: Quando é desejado um alimento de soja.

Ingredientes: (Pareve) 85% de água, 4,9% de xarope de milho, 2,6% de açúcar (sacarose), 2,1% de óleo de soja, 1,9% de isolado de proteínas de soja, 1,4% de óleo de coco, 0,15% de citrato de cálcio, 0,11% de fosfato de cálcio tribásico, citrato de potássio, fosfato de potássio monobásico, cloreto de potássio, monoglicéridos e diglicéridos, lecitina de soja, carragenano, ácido ascórbico, L-metionina, cloreto de magnésio, fosfato de potássio dibásico, cloreto de sódio, cloreto de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinco, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de cálcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloridrato de cloreto de tiamina, riboflavina, cloridrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganésio, iodeto de potássio, filoquinona, biotina, selenito de sódio, vitamina D3 e cianocobalamina. E. Similac® Fórmula Infantil:

Utilização: Quando é necessária uma fórmula infantil: se for tomada a decisão de descontinuar a amamentação antes de 1 ano de idade, se for necessário um suplemento à amamentação ou como alimento de rotina se não for adoptada a amamentação.

Caracteristicas: - Proteína de qualidade e quantidade apropriadas para um bom crescimento; desnaturada com calor, o que reduz o risco de perda de sangue entérica associada ao leite. - Gordura de uma mistura de óleos vegetais (duplamente homogeneizada), proporcionando o ácido linoleico essencial que é facilmente absorvido.

Hidratos de carbono como lactose em proporção semelhante à do leite humano. - Baixa carga de soluto renal para minimizar o stress em órgãos em desenvolvimento. - Formas em Pó, Líquido Concentrado e Pronta a Comer. 69

ΕΡ 1 392 823/PT

Ingredientes: (-D) Água, leite magro, lactose, óleo de soja, óleo de coco, monoglicéridos e diglicéridos, lecitina de soja, ácido ascórbico, carragenano, cloreto de colina, taurina, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinco, niacinamida, sulfato ferroso, pantotenato de cálcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, cloridrato de cloreto de tiamina, riboflavina, cloridrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganésio, filoquinona, biotina, selenito de sódio, vitamina D3 e cianocobalamina. F. Similac® NeoCare Fórmula para Bebés Prematuros com Ferro:

Utilização: Para as necessidades nutricionais especiais dos bebés prematuros após alta hospitalar. Similac NeoCare é uma fórmula nutricionalmente completa desenvolvida para proporcionar aos bebés prematuros calorias, proteínas, vitaminas e minerais extra necessários para promover o crescimento de recuperação e suportar o desenvolvimento.

Caracteristicas:

Reduz a necessidade de suplementação calórica e vitamínica. Mais calorias (22 Cal/fl oz) que as fórmulas de termo padrão (20 Cal/fl oz).

Mistura de gorduras altamente absorvidas, com triglicéridos de cadeia média. (MCToil) para ajudar a satisfazer as necessidades digestivas especiais dos bebés prematuros. Níveis mais elevados de proteínas, vitaminas e minerais por 100 calorias para prolongar o suporte nutricional iniciado no hospital. - Mais cálcio e fósforo para melhor mineralização óssea.

Ingredientes: -D Sólidos de xarope de milho, leite magro, lactose, concentrado de proteína do soro de leite, óleo de soja, óleo de açafroa rico em oleico, óleo de coco fraccionado (triglicéridos de cadeia média), óleo de coco, citrato de potássio, fosfato de cálcio tribásico, carbonato de cálcio, ácido ascórbico, cloreto de magnésio, cloreto de potássio, cloreto de sódio, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, cloreto de colina, palmitato de ascorbilo, L-carnitina, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinco, niacinamida, tocoferóis mistos, citrato de sódio, pantotenato 70

ΕΡ 1 392 823/PT de cálcio, sulfato cúprico, cloridrato de cloreto de tiamina, palmitato de vitamina A, beta-caroteno, riboflavina, cloridrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganésio, filoquinona, biotina, selenito de sódio, vitamina D3 e cianocobalamina. G. Similac Natural Care Fortificante do Leite Humano Pobre em Ferro Pronto a Usar, 24 Cal/fl oz.:

Utilização: Concebida para ser misturada com leite humano ou para ser dada alternativamente com leite humano a bebés de baixo peso à nascença.

Ingredientes: -D Água, leite magro, amido de milho hidrolisado, lactose, óleo de coco fraccionado (triglicéridos de cadeia média), concentrado de proteínas do soro do leite, óleo de soja, óleo de coco, fosfato de cálcio tribásico, citrato de potássio, cloreto de magnésio, citrato de sódio, ácido ascórbico, carbonato de cálcio, monoglicéridos e diglicéridos, lecitina de soja, carragenano, cloreto de colina, m-inositol, taurina, niacinamida, L-carnitina, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinco, cloreto de potássio, pantotenato de cálcio, sulfato ferroso, sulfato cúprico, riboflavina, palmitato de vitamina A, cloridrato de cloreto de tiamina, cloridrato de piridoxina, biotina, ácido fólico, sulfato de manganésio, filoquinona, vitamina D3, selenito de sódio e cianocobalamina. Vários PUFA deste invento podem ser substituídos e/ou adicionados às fórmulas infantis descritas acima e a outras fórmulas infantis conhecidas daqueles na técnica.

II. FORMULAÇÕES NUTRICIONAIS A. ENSURE®

Utilização: ENSURE é um alimento líquido pobre em resíduos concebido principalmente como suplemento nutricional oral a utilizar com ou entre refeições ou, nas quantidades apropriadas, como substituto de refeições. ENSURE não tem lactose nem glúten, e é adequada para utilização em dietas modificadas, incluindo dietas pobres em colesterol. Embora 71

ΕΡ 1 392 823/PT seja principalmente um suplemento oral pode ser dado através de tubo.

Condições do Paciente: - Para pacientes em dietas modificadas - Para pacientes idosos em risco nutricional - Para pacientes com perda de peso involuntária - Para pacientes a recuperar de doença ou cirurgia - Para pacientes que necessitam de uma dieta pobre em resíduos

Ingredientes: -D Água, Açúcar (Sacarose), Maltodextrina (Milho), Caseinatos de Cálcio e Sódio, Óleo de Açafroa Rico em Oleico, Isolado de Proteínas de Soja, Óleo de Soja, Óleo de Colza, Citrato de Potássio, Fosfato de Cálcio Tribásico, Citrato de Sódio, Cloreto de Magnésio, Fosfato de Magnésio Dibásico, Aroma Artificial, Cloreto de Sódio, Lecitina de Soja, Cloreto de Colina, Ácido Ascórbico, Carragenano, Sulfato de Zinco, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-tocoferilo, Goma de Gelano, Niacinamida, Pantotenato de Cálcio, Sulfato de Manganésio, Sulfato Cúprico, Palmitato de Vitamina A, Cloridrato de Cloreto de Tiamina, Cloridrato de Piridoxina, Riboflavina, Ácido Fólico, Molibdato de Sódio, Cloreto de Crómio, Biotina, Iodeto de Potássio, Selenato de Sódio. B. BARRAS ENSURE®:

Utilização: As BARRAS ENSURE são uma nutrição completa e equilibrada para utilização como suplemento entre ou com refeições. Proporciona uma alternativa deliciosa, rica em nutrientes, a outras refeições ligeiras. As BARRAS ENSURE contêm <1 g de lactose/barra e aroma de Chocolate Fudge Brownie e não tem glúten. (0 sabor Honey Graham Crunch contém glúten).

Condições dos Pacientes: - Para pacientes que necessitem de calorias, proteínas, vitaminas e minerais extra.

Especificamente útil para pessoas que não tomem calorias nem nutrientes suficientes. 72 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ

Para pessoas que têm a capacidade de mastigar e engolir. - Não deve ser utilizado por ninguém com alergia a amendoim ou qualquer tipo de alergia a frutos secos.

Ingredientes: Honey Graham Crunch — Xarope de Milho Rico em Frutose, Isolado de Proteínas de Soja, Açúcar Mascavado, Mel, Maltodextrina (Milho), Arroz Crocante (Arroz Branqueado, Açúcar (Sacarose), Sal (Cloreto de Sódio) e Malte), Farelo de Aveia, Óleos de Semente de Algodão e de Soja Parcialmente Hidrogenados, Polissacáridos de Soja, Glicerina, Concentrado de Proteínas do Soro do Leite, Polidextrose, Frutose, Caseinato de Cálcio, Cacau em Pó, Aromas Artificiais, Óleo de Colza, Óleo de Açafroa Rico em Oleico, Leite Magro em Pó, Soro do Leite em Pó, Lecitina de Soja e Óleo de Milho. Fabricado numa instalação que processa frutos secos.

Vitaminas e Minerais: Fosfato de Cálcio Tribásico, Fosfato de Potássio Dibásico, Óxido de Magnésio, Sal (Cloreto de Sódio), Cloreto de Potássio, Ácido Ascórbico, Ortofosfato Férrico, Acetato de Alfa-tocoferilo, Niacinamida, Óxido de Zinco, Pantotenato de Cálcio, Gluconato de Cobre, Sulfato de Manganésio, Riboflavina, Beta-Caroteno, Cloridrato de Piridoxina, Mononitrato de Tiamina, Ácido Fólico, Biotina, Cloreto de Crómio, Iodeto de Potássio, Selenato de Sódio, Molibdato de Sódio, Filoquinona, Vitamina D3 e Cianocobalamina.

Proteína: Honey Graham Crunch - A fonte proteica é uma mistura de isolado de proteínas de soja e de proteínas do leite.

Isolado de proteínas de soja 74%

Proteínas do leite 26%

Gordura: Honey Graham Crunch - A fonte de gordura é uma mistura de óleos de semente de algodão e soja parcialmente hidrogenados, de colza, açafroa rico em oleico, e lecitina de so j a. 73

ΕΡ 1 392 823/PT Óleo de sementes de algodão e de soja parcialmente hidrogeneados 7 6% Óleo de colza 8% Óleo de açafroa rico em oleico 8% Óleo de milho 4%

Lecitina de soja 4%

Hidratos de carbono: Honey Graham Crunch - A fonte de hidratos de carbono é uma combinação de xarope de milho rico em frutose, açúcar mascavado, maltodextrina, mel, arroz crocante, glicerina, polissacárido de soja, e farelo de aveia.

Xarope de milho rico em frutose 24% Açúcar mascavado 21%

Maltodextrina 12%

Mel 11%

Arroz crocante 9%

Glicerina 9%

Polissacárido de soja 7%

Farelo de aveia 7% C. ENSURE® RICO EM PROTEÍNA:

Utilização: ENSURE RICO EM PROTEÍNA é um alimento líquido concentrado, rico em proteínas concebido para pessoas que necessitem de calorias, proteínas, vitaminas e minerais adicionais nas suas dietas. Pode ser utilizado como um suplemento nutricional oral com ou entre as refeições ou, nas quantidades apropriadas, como substituto de refeições. ENSURE RICO EM PROTEÍNA não tem lactose e glúten, e é adequado para utilização por pessoas a recuperar de cirurgia geral ou de fracturas da anca e por pacientes em risco de úlceras de pressão.

Condições dos Pacientes: - Para pacientes que necessitem de calorias, proteínas, vitaminas, e minerais adicionais, tais como pacientes a recuperar de cirurgia geral ou fracturas da anca, pacientes em risco de úlceras de pressão, e pacientes em dietas pobres em colesterol. 74

ΕΡ 1 392 823/PT

Características: - Pobre em gordura saturada - Contém 6 g de gordura total e <5 mg de colesterol por porção - Sabor rico e cremoso

Excelente fonte de proteínas, cálcio, e outras vitaminas e minerais essenciais - Para dietas pobres em colesterol - Sem lactose, facilmente digerido

Ingredientes:

Supremo de Baunilha: -D Água, Açúcar (Sacarose), Maltodextrina (Milho), Caseinatos de Cálcio e Sódio, Óleo de Açafroa Rico em Oleico, Isolado de Proteínas de Soja, Óleo de Soja, Óleo de Colza, Citrato de Potássio, Fosfato de Cálcio Tribásico, Citrato de Sódio, Cloreto de Magnésio, Fosfato de Magnésio Dibásico, Aroma Artificial, Cloreto de Sódio, Lecitina de Soja, Cloreto de Colina, Ácido Ascórbico, Carragenano, Sulfato de Zinco, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-tocoferilo, Goma de Gelano, Niacinamida, Pantotenato de Cálcio, Sulfato de Manganésio, Sulfato Cúprico, Palmitato de Vitamina A, Cloridrato de Cloreto de Tiamina, Cloridrato de Piridoxina, Riboflavina, Ácido Fólico, Molibdato de Sódio, Cloreto de Crómio, Biotina, Iodeto de Potássio, Selenato de Sódio, Filoquinona, Vitamina D3 e Cianocobalamina.

Proteína: A fonte de proteínas é uma mistura de duas proteínas de elevado valor biológico: caseína e soja. 85% 15%

Caseinatos de sódio e cálcio

Isolado de proteínas de soja

Gordura: A fonte de gordura é uma mistura de três óleos: de açafroa rico em oleico, colza e soja. Óleo de açafroa rico em oleico 40 Óleo de colza 30 Óleo de so j a 30 75

ΕΡ 1 392 823/PT Ο nível de gordura em ENSURE RICO EM PROTEÍNA satisfaz as linhas orientadoras da American Heart Association (AHA). Os 6 gramas de gordura em ENSURE RICO EM PROTEÍNA representam 24% das calorias totais, sendo 2,6% da gordura de ácidos gordos saturados e 7,9% de ácidos gordos polinsaturados. Estes valores estão dentro das linhas orientadoras de AHA de <30% das calorias totais da gordura, <10% das calorias de ácidos gordos saturados, e <10% das calorias totais de ácidos gordos polinsaturados.

Hidratos de carbono: ENSURE RICO EM PROTEÍNA contém uma combinação de maltodextrina e sacarose. A doçura suave e a variedade de aromas {vanilla supreme, chocolate royal, bagas selvagens e banana), mais os Pacotes de Aromas VARI-FLAVORS® em nozes, cereja, morango, limão e laranja, ajudam a prevenir a fadiga do aroma e ajudam à adesão do paciente.

Baunilha e outros aromas sem ser de chocolate:

Sacarose 60%

Maltodextrina 40%

Chocolate:

Sacarose 70%

Maltodextrina 30%

D. ENSURE® LIGHT

Utilização: ENSURE LIGHT é um alimento líquido pobre em gordura concebido para utilizar como suplemento nutricional oral com ou entre refeições. ENSURE LIGHT não tem lactose nem glúten, e é adequado para utilizar em dietas modificadas, incluindo dietas pobres em colesterol.

Condições dos pacientes: - Para pacientes de peso normal ou com excesso de peso que necessitam de nutrição extra num suplemento que contém 50% menos gordura e 20% menos calorias que ENSURE. - Para adultos saudáveis que não comem bem e necessitam de nutrição extra. 76

ΕΡ 1 392 823/PT

Características: - Pobre em gordura e gordura saturada - Contém 3 g de gordura total por porção e <5 mg de colesterol - Sabor rico e cremoso

Excelente fonte de cálcio e outras vitaminas e minerais essenciais - Para dietas pobres em colesterol - Sem lactose, facilmente digerível

Ingredientes:

French Vanilla: -D Água, Maltodextrina (Milho), Açúcar (Sacarose), Caseinato de Cálcio, Óleo de Açafroa Rico em Oleico, Óleo de Colza, Cloreto de Magnésio, Citrato de Sódio, Citrato de Potássio, Fosfato de Potássio Dibásico, Fosfato de Magnésio Dibásico, Aroma Natural e Artificial, Fosfato de Cálcio Tribásico, Gel de Celulose, Cloreto de Colina,

Lecitina de Soja, Carragenano, Sal (Cloreto de Sódio), Ácido Ascórbico, Goma de Celulose, Sulfato Ferroso, Acetato de

Alfa-tocoferilo, Sulfato de Zinco, Niacinamida, Sulfato de Manganésio, Pantotenato de Cálcio, Sulfato Cúprico, Cloridrato de Cloreto de Tiamina, Palmitato de Vitamina A, Cloridrato de Piridoxina, Riboflavina, Cloreto de Crómio, Ácido Fólico, Molibdato de Sódio, Biotina, Iodeto de

Potássio, Selenato de Sódio, Filoquinona, Vitamina D3 e Cianocobalamina.

Proteína: A fonte de proteína é caseinato de cálcio.

Caseinato de Cálcio 100%

Gordura: A fonte de gordura é uma mistura de dois óleos: de açafroa rico em oleico e de colza. 70 30 Óleo de açafroa rico em oleico Óleo de colza 77

ΕΡ 1 392 823/PT Ο nível de gordura em ENSURE LIGHT satisfaz as linhas orientadoras de American Heart Association (AHA). Os 3 gramas de gordura em ENSURE LIGHT representam 13,5% das calorias totais, sendo 1,4% da gordura de ácidos gordos saturados e 2,6% de ácidos gordos polinsaturados. Estes valores estão dentro das linhas orientadoras de AHA <30% das calorias totais de gordura, <10% das calorias de ácidos gordos saturados, e <10% das calorias totais de ácidos gordos polinsaturados.

Hidratos de carbono: ENSURE LIGHT contém uma combinação de maltodextrina e sacarose. O aroma de chocolate contém também xarope de milho. A doçura suave e a variedade de aromas (French vanilla, chocolate supreme, strawberry swirl) , mais os Pacotes de

Aromas VARI-FLAVORS® em nozes, cereja, morango, limão e laranja, ajudam a prevenir a fadiga do aroma e ajudam à adesão do paciente.

Baunilha e outros aromas sem ser de chocolate: 51% 49%

Sacarose

Maltodextrina

Chocolate: 47,0% 26, 5% 26, 5%

Sacarose

Xarope de Milho

Maltodextrina

Vitaminas e Minerais:

Uma porção de 8-fl-oz de ENSURE LIGHT proporciona pelo menos 25% da DDR para 24 vitaminas e minerais chave.

Cafeína: O aroma de chocolate contém 2,1 mg de cafeína/8 fl oz. E.ENSURE PLUS®

Utilização: ENSURE PLUS é um alimento líquido rico em calorias, pobre em resíduos para utilizar quando são necessárias calorias e nutrientes extra, mas uma concentração 78

ΕΡ 1 392 823/PT normal de proteínas. É concebido principalmente como suplemento nutricional oral para ser utilizado com ou entre refeições ou, em quantidades apropriadas, como substituto de refeições. ENSURE PLUS não tem lactose nem glúten. Embora seja principalmente um suplemento nutricional oral, pode ser dado através de tubo.

Condições dos Pacientes: - Para pacientes que necessitam de calorias e nutrientes extra, mas uma concentração normal de proteínas, num volume limitado. - Para pacientes que necessitam de ganhar ou manter um peso saudável.

Características: - Sabor rico e cremoso - Boa fonte de vitaminas e minerais essenciais

Ingredientes:

Baunilha: -D Água, Xarope de milho, Maltodextrina (Milho), Óleo de Milho, Caseinatos de Sódio e Cálcio, Açúcar (Sacarose), Isolado de Proteínas de Soja, Cloreto de Magnésio, Citrato de Potássio, Fosfato de Cálcio Tribásico, Lecitina de Soja, Aroma Natural e Artificial, Citrato de Sódio, Cloreto de Potássio, Cloreto de Colina, Ácido Ascórbico, Carragenano, Sulfato de Zinco, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-tocoferilo, Niacinamida, Pantotenato de Cálcio, Sulfato de Manganésio, Sulfato Cúprico, Cloridrato de Cloreto de Tiamina, Cloridrato de Piridoxina, Riboflavina, Palmitato de Vitamina A, Ácido Fólico, Biotina, Cloreto de Crómio, Molibdato de Sódio, Iodeto de Potássio, Selenito de Sódio, Filoquinona, Cianocobalamina e Vitamina D3.

Proteína: A fonte de proteínas é uma mistura de duas proteínas de elevado valor biológico: caseína e soja. 84% 16%

Caseinatos de sódio e cálcio Isolado de proteínas de soja 79 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ

Gordura: A fonte de gordura é óleo de milho. Óleo de milho 100%

Hidratos de Carbono: ENSURE PLUS contém uma combinação de maltodextrina e sacarose. A doçura suave e variedade de aromas (baunilha, chocolate, morango, café, manteiga e noz, e eggnog) , mais os Pacotes de Aroma VARI-FLAVORS® em nozes, cereja, morango, limão e laranja, ajudam a prevenir a fadiga do aroma e ajudam à adesão do paciente.

Aromas de baunilha, morango, manteiga e noz, e café:

Xarope de Milho 39%

Maltodextrina 38%

Sacarose 23%

Aromas de chocolate e eggnog: 36% 34% 30%

Xarope de milho

Maltodextrina

Sacarose

Vitaminas e Minerais:

Uma porção de 8-fl-oz de ENSURE PLUS proporciona pelo menos 15% da DDR para 25 Vitaminas e minerais chave.

Cafeína: O aroma de chocolate contém 3,1 mg de Cafeína/8 fl oz. O aroma de café contém uma quantidade vestigial de cafeína.

F. ENSURE PLUS® HN

Utilização: ENSURE PLUS HN é um alimento líquido nutricionalmente completo, rico em calorias, rico em azoto concebido para pessoas com grandes necessidades de calorias e proteínas ou tolerância ao volume limitada. Pode ser utilizado para suplementação oral ou para suporte nutricional total através de tubo. ENSURE PLUS HN não tem lactose nem glúten. 80 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ

Condições dos Pacientes: - Para pacientes com necessidades acrescidas de calorias e proteínas, tais como após cirurgia ou lesão. - Para pacientes com tolerância ao volume limitada e saciedade precoce.

Características: - Para nutrição suplementar ou total - Para alimentação oral ou por tubo - 1,5 CaVmL, - Rico em azoto - Caloricamente denso

Ingredientes:

Baunilha: -D Água, Maltodextrina (Milho), Caseinatos de Sódio e Cálcio, Óleo de Milho, Açúcar (Sacarose) , Isolado de Proteínas de Soja, Cloreto de Magnésio, Citrato de Potássio, Fosfato de Cálcio Tribásico, Lecitina de Soja, Aroma Natural e Artificial, Citrato de Sódio, Cloreto de Colina, Ácido Ascórbico, Taurina, L-Carnitina, Sulfato de Zinco, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-tocoferilo, Niacinamida, Carragenano, Pantotenato de Cálcio, Sulfato de Manganésio, Sulfato Cúprico, Cloridrato de Cloreto de Tiamina, Cloridrato de Piridoxina, Riboflavina, Palmitato de Vitamina A, Ácido Fólico, Biotina, Cloreto de Crómio, Molibdato de Sódio, Iodeto de Potássio, Selenito de Sódio, Filoquinona, Cianocobalamina e Vitamina D3. G. ENSURE® PÓ:

Utilização: ENSURE PÓ (reconstituído com água) é um alimento líquido pobre em resíduos concebido principalmente como suplemento nutricional oral para ser utilizado com ou entre refeições. ENSURE PÓ não tem lactose nem glúten, e é adequado para utilizar em dietas modificadas, incluindo dietas pobres em colesterol.

Condições dos Pacientes: - Para pacientes em dietas modificadas - Para idosos em risco nutricional 81

ΕΡ 1 392 823/PT - Para pacientes a recuperar de doença/cirurgia - Para pacientes que necessitem de uma dieta pobre em resíduos

Características: - Conveniente, fácil de misturar - Pobre em gordura saturada - Contém 9 g de gordura total e <5 mg de colesterol por porção - Rico em vitaminas e minerais - Para dietas pobres em colesterol - Sem lactose, facilmente digerível

Ingredientes: -D Xarope de Milho, Maltodextrina (Milho), Açúcar (Sacarose), Óleo de Milho, Caseinatos de Sódio e Cálcio, Isolado de Proteínas de Soja, Aroma Artificial, Citrato de Potássio, Cloreto de Magnésio, Citrato de Sódio, Fosfato de Cálcio Tribásico, Cloreto de Potássio, Lecitina de Soja, Ácido Ascórbico, Cloreto de Colina, Sulfato de Zinco, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-tocoferilo, Niacinamida, Pantotenato de Cálcio, Sulfato de Manganésio, Cloridrato de Cloreto de Tiamina, Sulfato Cúprico, Cloridrato de Piridoxina, Riboflavina, Palmitato de Vitamina A, Ácido Fólico, Biotina, Molibdato de Sódio, Cloreto de Crómio, Iodeto de Potássio, Selenato de Sódio, Filoquinona, Vitamina D3 e Cianocobalamina.

Proteína: A fonte de proteína é uma mistura de duas proteínas de elevado valor biológico: caseína e soja. 84% 16%

Caseinatos de sódio e cálcio

Isolado de proteínas de soja

Gordura: A fonte de gordura é óleo de milho. Óleo de milho 100%

Hidratos de carbono: ENSURE PÓ contém uma combinação de xarope de milho, maltodextrina e sacarose. A doçura suave de ENSURE PÓ, mais 82

ΕΡ 1 392 823/PT os Pacotes de Aromas VARI-FLAVORS® em nozes, cereja, morango, limão e laranja, ajuda a prevenir a fadiga do aroma e ajuda na adesão do paciente.

Baunilha: 35% 35% 30%

Xarope de milho Maltodextrina Sacarose H. PUDIM ENSURE®

Utilização: PUDIM ENSURE é um suplemento denso em nutrientes proporcionando uma nutrição equilibrada numa forma não liquida a utilizar com ou entre refeições. É apropriado para dietas de consistência modificada (p.ex., moles, em puré ou totalmente liquidas) ou para pessoas com dificuldade em engolir. PUDIM ENSURE não tem glúten.

Condições do paciente: - Para pacientes em dietas de consistência modificada (p.ex., moles, em puré ou totalmente liquidas) - Para pacientes com dificuldade em engolir

Caracteristicas: - Bom sabor, rico e cremoso - Boa fonte de vitaminas e minerais essenciais - Conveniente - não necessita refrigeração - Sem glúten

Perfil de nutrientes por 5 oz: 250 Calorias, 10,9% de Proteína, 34,9% de Gordura Total, 54,2% de Hidratos de carbono

Ingredientes:

Baunilha: -D Leite Magro, Água, Açúcar (Sacarose), Óleo de Soja Parcialmente Hidrogenado, Amido Alimentar Modificado, Sulfato de Magnésio, Lactilato de Estearoilo de Sódio, Fosfato de Sódio Dibásico, Aroma Artificial, Ácido Ascórbico, Sulfato de Zinco, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa- tocoferilo, Cloreto de Colina, Niacinamida, Sulfato de 83

ΕΡ 1 392 823/PT

Manganésio, Pantotenato de Cálcio, FD&C Yellow #5, Citrato de Potássio, Sulfato Cúprico, Palmitato de Vitamina A, Cloreto de Tiamina Cloridrato, Cloridrato de Piridoxina, Riboflavina, FD&C Yellow #6, Ácido Fólico, Biotina, Filoquinona, Vitamina D3 e Cianocobalamina.

Proteína: A fonte de proteínas é leite magro.

Leite magro 100%

Gordura: A fonte de gordura é óleo de soja hidrogenado. Óleo de soja hidrogenado 100%

Hidratos de carbono: PUDIM ENSURE contém uma combinação de sacarose e amido alimentar modificado. A doçura suave e a variedade de aromas (baunilha, chocolate, butterscotch, e tapioca) ajudam a prevenir fadiga do aroma. O produto contém 9,2 gramas de lactose por porção.

Baunilha e outros aromas sem ser de chocolate: 56% 27% 17%

Sacarose

Lactose

Amido alimentar modificado

Chocolate: 58% 26% 16%

Sacarose

Lactose

Amido alimentar modificado I. ENSURE® COM FIBRA:

Utilização: ENSURE COM FIBRA é um alimento líquido nutricionalmente completo contendo fibra concebido para pessoas que possam beneficiar de mais fibras dietéticas e nutrientes. ENSURE COM FIBRA é adequado para pessoas que não necessitem de uma dieta pobre em resíduos. Pode ser dado 84

ΕΡ 1 392 823/PT oralmente ou através de tubo, e pode ser utilizado como suplemento nutricional a uma dieta regular ou, em quantidades apropriadas, como substituto de refeições. ENSURE COM FIBRA não tem lactose nem glúten, e é adequado para utilizar em dietas modificadas, incluindo dietas pobres em colesterol.

Condições dos Pacientes: - Para pacientes que possam beneficiar de mais fibras dietéticas e nutrientes

Caracteristicas: - Nova fórmula avançada - pobre em gordura saturada, rica em vitaminas e minerais - Contém 6 g de gordura total e <5 mg de colesterol por porção - Sabor rico e cremoso - Boa fonte de fibra - Excelente fonte de vitaminas e minerais essenciais - Para dietas pobres em colesterol - Sem lactose nem glúten

Ingredientes:

Baunilha: -D Água; Maltodextrina (Milho), Açúcar (Sacarose), Caseinatos de Sódio e Cálcio, Fibra de Aveia, Óleo de Açafroa Rico em Oleico, Óleo de Colza, Isolado de Proteínas de Soja, Óleo de Milho, Fibra de Soja, Fosfato de Cálcio Tribásico, Cloreto de Magnésio, Citrato de Potássio, Gel de Celulose, Lecitina de Soja, Fosfato de Potássio Dibásico, Citrato de Sódio, Aromas Naturais e Artificiais, Cloreto de Colina, Fosfato de Magnésio, Ácido Ascórbico, Goma Celulósica, Cloreto de Potássio, Carragenano, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-tocoferilo, Sulfato de Zinco, Niacinamida, Sulfato de Manganésio, Pantotenato de Cálcio, Sulfato Cúprico, Palmitato de Vitamina A, Cloridrato de Cloreto de Tiamina, Cloridrato de Piridoxina, Riboflavina, Ácido Fólico, Cloreto de Crómio, Biotina, Molibdato de Sódio, Iodeto de Potássio, Selenato de Sódio, Filoquinona, Vitamina D3 e Cianocobalamina.

Proteína: A fonte de proteína é uma mistura de duas proteínas de elevado valor biológico - caseína e soja. 80% 85

ΕΡ 1 392 823/PT 80% 85 ΕΡ 1 392 823/PT 20%

Caseinatos de sódio e cálcio Isolado de proteínas de soja

Gordura: A fonte de gordura é uma mistura de três óleos: de açafroa rico em oleico, colza e milho. 40% 40% 20% Óleo de açafroa rico em oleico Óleo de colza Óleo de milho O nível de gordura em ENSURE COM FIBRA satisfaz as linhas orientadoras de American Heart Association (AHA). Os 6 gramas de gordura em ENSURE COM FIBRA representam 22% das calorias totais, sendo 2,01% da gordura de ácidos gordos saturados e 6,7% de ácidos gordos polinsaturados. Estes valores estão dentro das linhas orientadoras da AHA de <30% das calorias totais de gordura, <10% das calorias de ácidos gordos saturados, e <10% das calorias totais de ácidos gordos polinsaturados.

Hidratos de carbono: ENSURE COM FIBRA contém uma combinação de maltodextrina e sacarose. A doçura suave e variedade de aromas (baunilha, chocolate, e manteiga e noz), mais os Pacotes de Aromas VARI-FLAVORS® de nozes, cereja, morango, limão e laranja, ajudam a prevenir a fadiga do aroma e ajudam na adesão do paciente.

Baunilha e outros aromas sem ser de chocolate:

Maltodextrina 66%

Sacarose 25%

Fibra de Aveia 7%

Fibra de Soja 2%

Chocolate:

Maltodextrina 55%

Sacarose 36%

Fibra de Aveia 7%

Fibra de soja 2% 86

ΕΡ 1 392 823/PT

Fibra : A mistura de fibras utilizada em ENSURE COM FIBRA consiste em fibra de aveia e polissacárido de soja. Esta mistura resulta em aproximadamente 4 gramas das fibras dietéticas totais por lata de 8-fl. oz. A razão de fibras insolúveis para fibra solúveis é de 95:5.

Os vários suplementos nutricionais descritos acima e conhecidos de outros peritos na técnica podem ser substituídos e/ou suplementados com os PUFA produzidos de acordo com o presente invento. J. Oxepa™ Produto Nutricional

Oxepa é um produto nutricional entérico, caloricamente denso, pobre em hidratos de carbono concebido para a gestão dietética de pacientes com ou em risco de SDRA. Tem uma combinação única de ingredientes, incluindo uma mistura patenteada de óleos contendo ácido eicosapentaenóico (EPA de óleo de peixe), ácido γ-linolénico (GLA de óleo de borragem), e níveis elevados de antioxidantes.

Distribuição Calórica: A densidade calórica é elevada a 1,5 Cal/ml (355 Cal/8 fl oz), para minimizar o volume necessário para satisfazer as necessidade energéticas. A distribuição de Calorias em Oxepa é mostrada na Tabela A.

Tabela A. Distribuição Calórica de Oxepa por 8 fl por litro % de C oz. Calorias 355 1500 — Gordura (g) 22,2 93, 7 55, 2 Hidratos de carbono (g) 25 105, 5 28,1 Proteína (g) 14,8 62,5 16, 7 Água (g) 186 785 —

Gordura: - Oxepa contém 22,2 g de gordura por porção de 8-fl oz (93,7 g/1). 87

ΕΡ 1 392 823/PT - A fonte de gordura é uma mistura de óleos de 31,8% de óleo de colza, 25% de triglicéridos de cadeia média (MCT), 20% de óleo de borragem, 20% de óleo de peixe, e 3,2% de lecitina de soja. 0 perfil tipico de ácidos gordos de Oxepa é mostrado na Tabela B. - Oxepa proporciona uma quantidade equilibrada de ácidos gordos polinsaturados, monoinsaturados e saturados, tal como mostrado na Tabela VI. - Triglicéridos de cadeia média (MCT) -- 25% da mistura de gordura -- ajudam a esvaziar o estômago porque são absorvidos pelo tracto intestinal sem emulsionação através dos ácidos biliares.

Os vários componentes de ácidos gordos do produto nutricional Oxepa™ podem ser substituídos e/ou suplementados com os PUFA produzidos de acordo com este invento.

Tabela B. Perfil Típico de Ácidos Gordos Ácidos Gordos % Total g/8 fl oz*. * l-1 Capróico (6:0) 0, 2 0, 04 0,18 Caprílico (8:0) 14, 69 3,1 13, 07 Cáprico (10:0) 11, 06 2,33 9, 87 Palmítico (16:0) 5, 59 1,18 4,98 Palmitoleico 1,82 0,38 1, 62 Esteárico 1,94 0,39 1, 64 Oleico 24,44 5,16 21,75 Linoleico 16,28 3,44 14,49 a-Linolénico 3,47 0,73 3,09 γ-Linolénico 4, 82 1,02 4,29 Eicosapentaenóico 5, 11 1,08 4,55 n-3-Docosapentaenóico 0,55 0, 12 0,49 Docosa-hexaenóico 2,27 0,48 2,02 Outros 7,55 1,52 6,72

Os ácidos gordos igualam aproximadamente 95% da gordura total.

Tabela C. Perfil de Gordura de Oxepa. 55,2 31,44 g/1 % de calorias totais da gordura Ácidos gordos polinsaturados ΕΡ 1 392 823/PT 8 8 25,53 g/1 32,38 g/1 1,75:1 9,49 mg/8 f1 oz 40,1 mg/1 Ácidos gordos monoinsaturados Ácidos gordos saturados Razão de n-6 para n-3 Colesterol

Hidratos de carbono: - O teor de hidratos de carbono é de 25,0 g por porção de 8-fl-oz (105,5 g/1).

As fontes de hidratos de carbono são 45% de maltodextrina (um hidrato de carbono complexo) e 55% de sacarose (um açúcar simples), ambas as quais são facilmente digeríveis e absorvidas. - O teor rico em gordura e pobre em hidratos de carbono de Oxepa é concebido para minimizar a produção de dióxido de carbono (C02) . Os elevados níveis de C02 podem complicar o desmame em pacientes dependentes de ventilador. O baixo nível de hidratos de carbono pode também ser útil para aqueles pacientes que tenham desenvolvido hiperglicemia induzida por stress. - Oxepa não tem lactose.

Os hidratos de carbono dietéticos, os aminoácidos das proteínas, e a porção glicerol das gorduras podem ser convertidos em glicose dentro do corpo. Ao longo deste processo, os requisitos de hidratos de carbono dos tecidos dependentes de glicose (tais como o sistema nervoso central e os glóbulos vermelhos) são satisfeitos. No entanto, uma dieta sem hidratos de carbono pode conduzir a cetose, catabolismo excessivo de proteínas dos tecidos, e perda de fluido e electrólitos. Estes efeitos podem ser evitados através da ingestão diária de 50 a 100 g de hidratos de carbono digeríveis, se a tomada de calorias for adequada. O nível de hidratos de carbono em Oxepa é também suficiente para minimizar a gluconeogenése, se forem satisfeitas as necessidades energéticas.

Proteína: - Oxepa contém 14,8 g de proteína por porção de 8-fl oz (62,5 g/1). - A razão de calorias totais/azoto (150:1) satisfaz a necessidade de pacientes em stress. 89

ΕΡ 1 392 823/PT - Oxepa proporciona proteína suficiente para promover o anabolismo e a manutenção da massa corporal magra sem precipitar problemas respiratórios. As tomas ricas em proteína são uma preocupação em pacientes com insuficiência respiratória. Embora a proteína tenha pouco efeito na produção de CO2, uma dieta rica em proteína aumentará a actividade ventilatória. - As fontes de proteína de Oxepa são 86,8% de caseinato de sódio e 13,2% de caseinato de cálcio. - 0 perfil de aminoácidos do sistema proteico em Oxepa satisfaz ou excede o padrão para proteína de elevada qualidade definido pela National Academy de Sciences. * Oxepa não tem glúten.

Tabela 1

Expressão da Dessaturase de Saprolegnia diclina (ATCC 56851) em Fermento de Padeiro CLONE TIPO DE ACTIVIDADE ENZIMÁTICA % DE CONVERSÃO DO SUBSTRATO pRSPl Δ9 0 (18:0 em 18:ln-9)* (A6-dessaturase de s. Δ12 0 (18:1 em 18:2n-6) diclina) Δ15 0 (18:2n-6 em 18:3n-3) Δ6 28 (18:2n-6 em 18:3n-6) Δ6 37 (18:3n-3 em 18:4n-3) Δ5 0 (20:3n-6 em 20:4n-6) pRSP3 Δ9 0 (18:0 em 18:ln-9) (A5-dessaturase de s. Δ12 0 (18:1 em 18:2n-6) diclina) Δ15 0 (18:2n-6 em 18:3n-3) Δ6 0 (18:2n-6 em 18:3n-6) Δ6 0 (18:3n-3 em 18:4n-3) Δ5 27 (20:3n-6 em 20:4n-6) *acima da actividade endógena de Δ9

90EP 1 392 823/PT

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91 EP 1 392 823/PT Ácido Gordo em Percentagem dos Lípidos Totais Extraídos de Levedura

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92 EP 1 392 823/PT Ácido Gordo em Percentagem dos Lípidos Totais Extraídos de Levedura

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ΕΡ 1 392 823/PT

Tabela 5 (comparativo)

Expressão da Dessaturase de Thraustochytrium aureum (ATCC 34304) em

Fermento de Padeiro CLONE TIPO DE ACTIVIDADE ENZIMÁTICA O 0 CONVERSÃO DE SUBSTRATO PRTA4 Δ9 0 (18:0 em 18 : : ln-9)* (A5-dessaturase de Δ12 0 (18:1 em 18 : :2n-6) T. aureum) Δ15 0 (18:2n-6 em 18:3n-3) Δ6 0 (18:2n-6 em 18:3n-6) Δ6 0 (18:3n-3 em 18:4n-3) Δ5 23,7 (20:3n-6 em 20:4n-6) Δ17 0 (20:4n-6 em 2 0:5n-3) Δ19 0 (22:4n-6 em 22:5n-3) Δ4 0 (22:4n-6 em 22:5n-6) *acima da actividade Δ4 endógena de Δ9 0 (22:5n-3 em 22:6n-3)

94 ΕΡ 1 392 823/PT

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97 EP 1 392 823/PT

Perfis de ácidos gordos de levedura contendo pRAT-la, pYX242, pRAT-la/pRAE-73-A3, ou pYX242/pYES2, criada na co o Ό H 0 σι coo -H O mO co O -H 'Cti> Q) T5 CO O tí Q) CO CD H α

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ΕΡ 1 392 823/PT

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Abbott Laboratories Mukerji, Pradip Huang, Yung-Sheng Das, Tapas

Thurmond, Jennifer M.

Pereira, Suzette L.

<120> GENES DE DESSATURASES E UTILIZAÇÕES DESTES <130> 6763.PC.01 <140> Ainda não concedido <141> 2002-01-23 <150> Ainda não concedido <151> 2002-01-22 <150> US 09/769863 <151> 2001-01-25 <160> 55 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0834 <221> misc_feature <222> (3)...(3) <223> b = g ou c ou t/u na posição 3 <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> y = t/u ou c na posição 6 100

ΕΡ 1 392 823/PT <221> misc feature <222> (9) . . . (9) <223> y = t/u ou c : na posição 9 <221> misc feature <222> (12) ... (12) <223> b = g ou c ou t/u na posição <221> misc difference <222> (18) ... (18) <223> r = g ou a na posição i 18 <221> misc feature <222> (24) ... (24) <223> b = g ou c ou t/u na posição <221> misc feature <222> (30)...(30) <223> b = g ou c ou t/u na posição <221> misc feature <222> (33) ... (33) <223> y = t/u ou c na posição 33 <221> misc feature <222> (36) . . . (36) <223> y = t/u ou c na posição 36 <221> misc feature <222> (39) . . . (39) <223> h = a ou c ou t/u na posição <221> misc feature <222> (42) ... (42) <223> h = a ou c ou t/u na posição <4 0 0> 1 42 gtbtaygayg tbaccgartg ggtbaagcgy cayccbgghg gh <210> 2 <211> 45 101

ΕΡ 1 392 823/PT

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador Directo R0835 <221> misc_feature <222> (3)...(3) <223> h = a ou c ou t/u na posição 3 <221> misc feature <222> (6)...(6) <223> y = t/u ou c na posição 6 <221> misc_feature <222> (12)...(12) <223> y = t/u ou c na posição 12 <221> misc_feature <222> (27)...(27) <223> y = t/u ou c na posição 27 <221> misc_feature <222> (33)...(33) <223> y = tu ou c na posição 33 <221> misc_feature <222> (39) . . . (39) <223> b = g ou c ou t/u na posição 39 <221> misc_feature <222> (41)...(41) <223> y = t/u ou c na posição 41 <221> misc_feature <222> (45)...(45) <223> y = t/u ou c na posição 45 <400> 2 gghgcytccg cyaactggtg gaagcaycag cayaacgtbc aycay 45 <210> 3 102

ΕΡ 1 392 823/PT <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador Inverso R0836 <221> misc feature <222> (1) . . . (D <223> r = g ou a na posição 1 <221> misc feature <222> (4) . . . (4) <223> r = g ou a na posição 4 <221> misc feature <222> (7) . . . (7) <223> v = a ou g ou c na posição 7 <221> misc feature <222> (13)...(13) <223> r = g ou a na posição 13 <221> misc feature <222> (19) . . . (19) <223> r = g ou a na posição 19 <221> misc feature <222> (34) . . . (34) <223> r = g ou a na posição 34 <221> misc feature <222> (40) . . . (40) <223> r = g ou a na posição 40 <221> misc feature <222> (43) ... (43) <223> d = a ou g ou t/u na posição <4 0 0> 3 45 rtgrtgvacg ttrtgctgrt gcttccacca gttrgcggar gcdcc 103

ΕΡ 1 392 823/PT

<210> 4 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador Inverso R0838 <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> r = g ou a na posição 6 <221> misc_feature <222> (12)...(12) <223> r = g ou a na posição 12 <221> misc_feature <222> (15)...(15) <223> y = t/u ou c na posição 15 <221> misc_feature <222> (18)...(18) <223> r = g ou a na posição 18 <221> misc_feature <222> (21) ... (21) <223> r = g ou a na posição 21 <221> misc_feature <222> (24)...(24) <223> s = g ou c na posição 24 <221> misc_feature <222> (27)...(27) <223> r = g ou a na posição 27 <221> misc feature <222> (30)...(30) <223> v = a ou g ou c na posição 30 <400> 4 ttgatrgtct arctygtrgt rgasaarggv tggtac 36 104

ΕΡ 1 392 823/PT <210> <211> <212> <213> 5 24 ADN Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0753 <221> <222> <223> misc feature (10) ... (10) n = a ou g ou c ou posição 10 t/u, desconhecido, ou outro na <221> <222> <223> misc feature (13) ... (13) r = g ou a na posição 13 <221> <222> <223> misc feature (16) . . . (16) n = a ou g ou c ou posição 16 t/u, desconhecido, ou outro na <221> <222> <223> misc feature (18) . . . (19) r = g ou nas posições 18-19 <221> <222> <223> misc feature (22) ... (22) r = g ou a na posição 22 <400> 5 catcatcatn ggraanarrt grtg 24

<210> 6 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0754 105

ΕΡ 1 392 823/PT <221> misc_feature <222> (15)...(15) <223> y = t/u ou c na posição 15 <221> misc_feature <222> (18)...(18) <223> y = t/u ou c na posição 19 <221> misc_feature <222> (21) ... (21) <223> n = a ou g ou c ou t/u, desconhecido, ou outro na posição 21 <221> misc_feature <222> (24)...(24) <223> y = t/u ou c na posição 24 <221> misc_feature <222> (27)...(27) <223> n = a ou g ou c ou t/u, desconhecido, ou outro na posição 27 <221> misc_feature <222> (30)...(30) <223> y = t/u ou c na posição 30 <400> 6 ctactactac tacaycayac ntayacnaay 30

<210> 7 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0923 <400> 7 cggtgcagtg gtggaagaac aagcacaac 29 <210> 8 <211> 30 106

ΕΡ 1 392 823/PT

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0899 <400> 8 agcggataac aatttcacac aggaaacagc 30

<210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0939 <400> 9 cgtagtactg ctcgaggagc ttgagcgccg 30

<210> 10 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0898 <4 0 0> 10 cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca g 31

<210> 11 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0951 <4 0 0> 11 tcaacagaat tcatggtcca ggggcaaaag gccgagaaga tctcg 45 107

ΕΡ 1 392 823/PT

<210> 12 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador RO960 <4 0 0> 12 atacgtaagc ttttacatgg cgggaaactc cttgaagaac tcgatcg 47

<210> 13 <211> 1362 <212> ADN <213> Saprolegnia diclina <400> 13 atggtccagg ggcaaaaggc cgagaagatc tcgtgçgcga coatccgtga gcacaaccgc 60 caagacaacg cgtggategt gatccaccac aaggtgtacg aeatctcggc ctttgaggac 120 cacccgggcg gcgtcgtcat gttcacgcag gccggcgaag aegegacega tgcgttcgct 180 gtcifcccacc cgagcfccggc gctcaagctc ctcgagcagt actacgtcgg egacgtegac 240 eagtcgacgg cggccgtcga cacgtcgatc tcggacgagg tcaagaagag ccagtcggac 300 ttcattgcgt cgtaecgcaá gctgcgcctt çaagteaagc gectcggett gtacgactcg 360 agcaagctct actacctcta caagtgcgcc tcgacgctga geattgcgct tgtgtcggcg 420 gccaittgcc tccaetttga ctcgacggcc atgtacatgg tcgcggctgt catccfctggc 480 ctcttttacc agcagtgcgg ctggctcgcc catgactttc tgcaccacca agtgtttgag 540 aaceacttgt fcfcggcgacct cgtcggcgtc atggteggca acctctggca gggcttctcg 600 gtgcagfggt ggaagaacaa gcacaacacg caccatgcga tccccaacct ccacgegacg 660 cccgagatcg ccttocacgg cgacccggac atfcgacacga fcgccgattçt cgcgtggtcg ?20 cfccaagatgg cgcagcaegc ggtegactcg cccgtcgggc tcttcttcat gcgctaccaa 780 gcgtacctgt actttcccat cttgctcttt gcgcgtatct cgtgggtgafc ccagteggcc 840 atgtacgcct tetacaacgt tgggcccggc ggcacctttg acaaggtcca gtacccgctg 900 cfccgagcgcg ccggcctcct cctctactac ggctggaaec tcggccttgt gtacgcagcc 960 aacatgtcgc tgctccaagc ggctgcgttc ctctttgtga gccaggcgtc gtgcggect.c 1020 tfcccfccgcga tggfcctttag cgfccggcçac aacggcatgg aggfcctitga caaggacagc 1080 aagcccgatt tttggaaget geaagtgctc tcgacgcgca acgtgacgtc gtcgctctgg 1140 atcgactggt tcatgggcgg cctcaactac cagatcgacc accacttgtt cccgatggtg 1200 çcecggcaea acctcecggc gctcaacgtg efccgtcaagt cgctctgcaa gcagtacgac 1260 atcccatacc acgsgacggg cfctcatcgcg ggcatggccg aggtcgtcgt gcacctcgag 1320 egeafcctcga tcgagttctfc caaggagttt cccgccatgt aa 1362

<210> 14 <211> 453 <212> PRT <213> Saprolegnia diclina <400> 14 108

ΕΡ 1 392 823/PT fdet Vai Gin Gly Gin Lys Ala Glu Lys Ile Ser Trp Ala Thr Ile Arg 1 5 10 15 Glu His Asn Arg Gin Asp Asn Ala Trp Ile Vai Ile His His Lys Vai 20 25 30 Tyr Asp Ile Ser Alá Phe Glu Asp His Pro Gly Gly Vai Vai Met Phe 35 40 45 Thr Gin Ala Gly Glu Asp Ala Thr Asp Ala Phe Ala Vai Phe His Pro 50 55 60 Ser Ser Ala Leu Lys Leu Leu Glu Gin Tyr Tyr Vai Gly Asp Vai Asp 65 70 75 SÔ Gin Ser Thr Ala Ala Vai Asp Thr Ser Ile Ser Asp Glu Vai Lys Lys 85 90 95 Ser Gin Ser Asp Phe Ile Ala Ser Tyr Arg Lys Leu Arg Leu Glu VaX 100 105 110 Lys Arg Leu Gly Leu Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Lys 109

ΕΡ 1 392 823/PT 115 Cys Ala 130 Ser Thr fl ia 145 Fhe Asp Ser teu Phe Tyr Gin Gin Vai Phe Glu 180 Gly Asn Leu 195 Trp Asn Thr 210 His His Fhe 225 His Gly Asp Leu Lys Met Ala Met Arg Tyr Gin 200 Ile Ser Trp 275 Val Pro Gly 290 Gly Thr Gly 305 Leu Leu Leu Asn Met Ser Leu Ser Cys eiy Leu 340 Met Glu Val 355 Phe Vai Leu 370 Ser Thr Met 385 Gly Gly Leu Pro Arg His Asn Lys Gin Tyr Asp 420 Ala Glu Val 435 Val Glu Phe 450 Pro Ala

Leu Ser Ile 120 Ala Thr Ala 135 Met Tyr Gin 150 Cys Gly Trp 165 Asn His Leu Phe Gin Gly Phe Ser Ala Ile Fro 200 Asn Pro Asp 215 Ile Asp Gin 230 HiS Ala Val 245 Ala Tyr Leu Tyr Ile Gin Ser Ala Phe Asp Lys 280 Val Tyr Tyr 295 Gly Trp Leu 310 Gin Ala Ala 325 Phe Leu Ala Met Asp Lys Asp Ser Arg Asn Val 360 Thr Asn Tyr 375 Gin Ile Leu 390 Pro Ala Leu 405 Ile Fro Tyr His Val His Leu Glu Met 440

Leu Val Ser Ala 140 Met Val Ala 155 Ala Leu Ala 170 His Asp Gly 185 Asp Leu Val Val Gin Trp Trp Leu His Ala. Thr 220 Thr Met Pro 235 Ile Asp Ser 250 Pro Val Fhe 265 Pro Ile Leu Met Tyr Ala Phe Gin Tyr Fro Leu 300 Asn Leu Gly 315 Leu Ala Phe 330 Leu Fhe Val 345 Phe Ser Val Lys Fro Asp Phe Ser Ser Leu Trp 380 Asp His His 395 Leu Asn Val 410 Leu Val Glu 425 Thr Gly Phe Arg Ile Ser Ile 125 Ala Ile Cys Leu Val Ile Leu Gly 160 Fhe Leu His 175 His Gly Val 190 Met Val Lys 205 Asn Lys His Pro Glu Xle_ Ala Leu Ala Trp Ser 240 Gly Leu Phe 255 Phe Leu Phe 270 Ala Arg Tyr 285 Asn Val Gly Leu Glu Arg Ala val Tyr Ala Ala 320 Val Ser Gin 335 Ala Gly Bis 350 Asn Gly Trp 365 Lys Leu Gin lie Asp Trp Fhe Phe Pro Met Val 400 Lys Ser Leu 415 Cys Ile Ala 430 Gly Met Glu 445 Phe Phe Lys

<210> 15 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0851 23 110

ΕΡ 1 392 823/PT <400> 15 ccatcaagac gtaccttgcg ate

<210> 16 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0941 <4 0 0> 16 28 gctgaacggg tggtacgagt cgaacgtg

<210> 17 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0953 <4 0 0> 17 42 acgagagaat tcatggcccc gcagacggag ctccgccagc gc

<210> 18 <211> 46 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0956 <400> 18

aaaagactcg agttagccca tgtggatcgt ggcggcgatg ccctgc <210> 19 <211> 1413 <212> ADN <213> Saprolegnia diclina <4 0 0> 19 46 111

ΕΡ 1 392 823/PT atggccccgc ggcaagaagg atcattatcc cgcgagatgg ccgttcagcg cegtecgagt gttggcgagt cgcatgatgg atctttgcgc ctccacgtca gtegtcggcc cagcacgtcg gtcaacatgg gcattccagc caggacttoa gcgctctcga taccttccgc gccgagtttg gagtgeggct agacggagct cctttacatg gcggcaaggt tgctgctgca acaaggccga ttccgaectt acfctcaagaa tcgtgtttgc tgcagctcgc tgcacgactc gctfctgccat tgggccacca acggcgacat acátctacct ccgacaogtt cgtggatgge ttgccgtgct tcacgggctg acccatgcgg ccgccagcgc gcaggaggtc ctacgacgtg cgccggtcgc gtcgatcttg caagccggac gaacaacctc ggtcgccgge ggccgcggcg gtcgcacgcg ggactggttt catctacacg ccgccgcatc tccgecgctc cggctcgcac catgatcagc ccagatgccc gtacctcgcg cgacgaggcc cacgccgccg gcgcagcaca accgagtggg gaggccaccg aacaagtatg aogggcttct catccgcagg ctcgccttgt ctctttggcg tcgtacacca gccggcggct aacgfccgcgg gtgaaccgcc tatggcgtgc acgaacggcc tccaagtcgt atcaagacgt ttcaacttcc aagatggcgc tcgccgagac aeacggcggc ccaacaagca acaegtfccga agattggcac aeaaggagtg acggcttccc acggcatgca tctgccaggc acatgccgtt cgatggtgtc gctcggaccc aggtgttcca ttggcctcaa cgatccgogt tctgggcctt accttgogat aagtaagcca tccaggacga gccggtggcc 60 ctcggcctgg 120 ccccggcggc 180 çtcgtaccac 240 gtfccacgggc 300 ccgcaagcgç 360 gggcctefcgg 420 cttttegaet 480 gctgccgctg 540 cttccattac 600 atggctcaac 660 ggatcttccg 720 gcocatgtac 780 gttccgcatc 840 caacccgcac 800 ctaccgcgtg 960 cttcttcctc 1020 tgtctcgacc 1080 gtgggcagtc 1140 tcgcaggtca ggcgcgctca ccggcgatcg ttgccggact cagggcatcg agacgtcggt actaccaggt cgcccatcat ttacggcggc ccgccacgat cgactacgcc cgtgcaccac cgtcgacgtc gttcgttgcc ccacatgggc catggctcgt ggatgacgac gttccttgcc 1200 ttgttcccca gcgtgtcgca gtaecactac 1260 tgcaaggagt acaacatcaa gtacgccatc 1320 cacttgaagc aeetccgcaa catgggccag 1380 taa 1413

<210> 20 <211> 470 <212> PRT <213> Saprolegnía diclina <400> 20 112

ΕΡ 1 392 823/PT

Met Ala Pro Gin Thr Glu Leu Arg Gin Arg His Ala Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Thr Pxo Vai Ala Gly Lys Lys Ala Phe Thr Trp Gin Glu Vai Ala Gin 20 25 30 His Asn Thr Ala Ala Ser Ala Trp Ile Ile Ue Arg Gly Lys Val Tyr 35 40 45 Asp Vai Thr Glu Trp Ala Asn Lys His Pro Gly Gly Arg Glu Met Val 50 55 60 Leu Leu His Ala Gly Arg Glu Ala Thr Asp Thr Phe Asp Ser Tyr His 65 70 75 80 Pro Fhe ser Asp Lys Ala Glu Ser Ile Leu Asn Lys Tyr Glu Ile Gly 85 90 95 Thr Phe Thr Gly Pro Ser Glu Phe Pro Thr Phe Lys Pro Asp Thr Gly 100 105 110 Phe Tyr Lys Glu cys Arg Lys Arg Vai Gly Glu Tyr Fhe Lys Lys Asn 115 120 125 Asn Leu His Pro Gin Asp Gly Phe Pro Gly Leu Trp Arg Met Met Val 130 135 140 Vai Phe Ala Vai Ala Gly Leu Ala Leu Tyr Gly Met His Fhe Ser Thr 145 150 155 160 Xle Phe Ala Leu Gin Leu Ala Ala Ala Ala Leu Phe Gly Val Cys Gin 165 170 175 Ala Leu Pro Leu Leu His Vai Met His Asp Ser Ser His Ala Ser Tyr 180 185 190 Thr Asn Met Pro Phe Phe His Tyr Vai Val Gly Arg Phe Ala Met Asp 195 200 205 Trp Phe Ala Gly Gly Ser Met Vai Ser Trp Leu Asn Gin HiS Val Val 210 215 220 Gly His His Ile Tyr Thr Asn Vai Ala Gly Ser Asp Pro Aâp Leu Fro 225 230 235 240 Vai Asn Met Asp Gly Asp Ile Arg Arg Ile Val Asn Arg Gin Val Phe 245 250 255 Gin Pro Met Tyr Ala Phe Gin His Ile Tyr Leu Pro Pro Leu Tyr Gly 260 265 270 Vai Leu Gly Leu Lys Phe Arg Ile Gin Asp Phe Thr Asp Thr Phe Gly 275 280 285 Ser His Thr Asn Gly Pro Ile Arg Val Asn Pro His Aia Leu Ser Thr 290 295 300 Trp Met Ala Met Ile Ser Ser Lys Ser Phe Trp Ala Phe Tyr Arg Val 305 310 315 320 Tyr Leu Pro Leu Ala Vai Leu Gin Met Pro lie Lys Thr Tyr Leu Ala 325 330 335 Ile Phe Phe Leu Ala Glu Phe Vai Thr Gly Trp Tyr Leu Ala Phe Asn 340 345 350 Phe GXn Vai Ser His Vai Ser Thr Glu Cys Gly Tyr Fro Cys Gly Asp 113 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ 355 360 365 Glu Ala Lys Met Ala Leu Gin Asp Glu Trp Ala Vai Ser Gin Vai Lys 370 375 380 Thr Ser Vai Asp Tyr Ala His Gly Ser Trp Met Thr Thr Phe Leu Ala 385 390 395 400 Gly Ala Leu Asn Tyr Gin Vai Vai His His Leu Phe Pro Ser Vai Ser 405 410 415 Gin Tyr HÍS Tyr Pro Ala Ile Ala Pro Ile Ile Vai Asp Vai Cys Lys 420 425 430 Glu Tyr Asn Ile Lys Tyr Ala Ile Leu Pro Asp Phe Thr Ala Ala Phe 435 440 445 Vai Ala His Leu Lys His Leu Arg Asn Met Gly Gin Gin Gly Ile Ala 450 455 460 Ala Thr Ile His Met Gly 465 470

<210> 21 <211> 914 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 21 atggaacatt ttgatgcatc acttagtacc tatttcaagg cattgctagg ccctcgagat 60 actagagtaa aaggatggtt tcttctggac aattatatac ccacatttat ctgctctgtc 120 atatãtttac taattgtatg getgggacca aaatacatga ggaataaaca gccattet.ct 180 tgccggggga ttttagtggt gtataacctt ggacteacac tgctgtctct gtatafcgttc 240 tgtgagttag taacaggagt atgggaaggc aaatacaaet tcttctgtca gggcacacgc 300 accgcaggag aatcagatat gaagattatc cgtgtcctct ggtggtacta cttctccaaa 360 ctcatagaat ttatggacac tttcttcttc atcetgcgca agaacaacca ccagatcacg 420 gtcctgcacg tctaccacca fcgcctcgatg ctgaacatefc ggtggtttgt gatgaactgg 480 gtcccctgcg gccactctta ttttggtgec acacttaata gcttcatcca cgtcctcatg 540 tactcttact atggtttgtc gtcagtcect tccatgcgtc catacctctg gtggaagaag 600 tacatcactc aggggcagct gcttcagttt gtgctgaeaa tcatccagac cagctgcggg 660 gfccatctggc cgtgcaeatt ccctcttggt tggttgtatt tccagattgg atacattatfc 720 tccctgattg ctctcttcac aaacttctac attcagacct acaacaagaa aggggcctcc 780 cgaaggaaag accacctgaa ggaccaccag aatgggtccg tggctgctgt gaatggacac 840 accaacagct tttcacccct ggaaaacaat gtgaagccaa ggaagctgcg gaaggafctga 900 agtcaaagaa ttga 914

<210> 22 <211> 957 <212> ADN <213> Mortierella alpina <400> 22 114

ΕΡ 1 392 823/PT atggagtcga ttgcgccatt cctcccatca aagatgccgc aagatctgtt tatggacctt 60 gccacegcta tcggtgtccg ggccgcgccc tatgtcgatc ctctcgaggc cgegctggtg 120 gcccaggccg agaagtacat ccccacgatt gtccatcaca cgcgtgggtt cctggtcgcg 180 gtggagtcgc ctttggcccg tgagctgccg ttgatgaacc cgttccacgfc gctgttgatc 240 gtgctcgctt atttggtcac ggtctttgtg ggcatgcaga tcatgaagaa ctttgagcgg 300 ttcgaggtca agacgfctfcfcc gctecfcgcac aacttttgtc tggtctcgat cagcgcctac 360 atgtgcggtg ggatcctgta cgaggcttat caggccaacfc atggactgtt tgagaacgct 420 gctgatcata ccttcaaggg tcttcctatg gccaagatga tctggctctt ctacttctcc 480 aagatcatgg agtttgtcga caccatgatc afcggtccfcca agaagaaeaa ccgccagatc 540 tccttcttgc acgtttacca ccacagctcc atcttcacca tctggtggtt ggtcaccttt 600 gttgcaccca acggtgaagc ctacttctct gctgcgttga actegifccat ccatgtgatc 660 atgtacggct actacttctt gtcggccttg ggcttcaagc aggtgtcgtt catcaagttc 720 taçatcacgc gctcgcagat gaeaeagttc tgcatgatgt cggtccagtc ttccfcgggac 780 atgtacgcca tgaaggtcct tggccgcccc ggatacccct fcettcatcac ggctctgctt 840 tggttctaca tgtggaceat gctcggtctc ttctacaact tttacagaaa gaacgccaag 900 ttggccaagc aggccaaggc cgacgctgcc aaggagaagg caaggaagtt gcagtaa 957

<210> 23 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0936 <400> 23 gtcgggcaag gcggaaaagt acctcaagag 30

<210> 24 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0937 <400> 24 aaacctgtag acaatgtgga ggggcgtggg 30

<210> 25 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0972 42 115

ΕΡ 1 392 823/PT <4 Ο 0> 25 atacttgaat tcatgggacg cggcggcgaa ggtcaggtga ac

<210> 26 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0949 <400> 26 39 cttatactcg agctaagcgg ccttggccgc cgcctggcc

<210> 27 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador RO950 <400> 27 41 cttatactcg agtaaatggc tcgcgaggcg aagcgagtgg c

<210> 28 <211> 1320 <212> ADN <213> Thraustochytrium aureum <400> 28 116

ΕΡ 1 392 823/PT atgggacgcg gcggcgaagg tcaggtgaac agegcgeagg tggcacaagg cggtgcggga 60 acgcgaaaga cgatcctgat cgagggcgag gtctacgatg tcaecaactt taggcacccc 120 ggcgggtcga tcatcaagtt tctcacgacc gacggcaccg aggotgtgga cgcgacgaac 180 gcgtttcgcg agtttcactg ccggtcgggc aaggcggaaa agtacctcaa gagcctgccc 240 aagctcggcg cgccgagcaa gatgaagttt gaçgccaagg agcaggcccg gcgcgacgcg 300 atcacgcgág aetacgtcaa gctgcgcgag gagatggtgg ccgagggcct etteaagccc 360 gcgcccctcc acattgtcta caggtfctgcg qagatcgcag ccctgttcgc ggcctcgttc 420 tacetgtttt cgatgcgcgg aaacgtgttc gccacgctcg cggceatcgc agtegggggc 480 atcgcgcagg gccgctgegg etggctcatg cacgagtgcg gacacttctc gatgaccggg 540 taoatcccgc ttgacgtgeg cctgcaggag ctggtgtacg gcgtggggtg ctcgatgtcg 600 gcgagctggt ggcgcgttca gcacaacaag caccacgcga ccccgcagaa actcaagcac 6*60 gacgtcgacc tcgacaccct gccgctcgtt gegttcaacg agaagatcgc cgccaaggtg 720 cgccccggct cgttecaggc caagtggcte tcggcgcagg cgtacatttt tgcgccggtg 780 tcctgcttcc tggttggtct cttcfcggacc etgtttctgc acccgcgcca catgccgcgc 840 acgagccaet ttgctgagat ggccgccgtc gcggtgcgcg tcgtgggctg ggeggcgctc 900 atgcactcgt tegggtacag agggagcgac tcgttcggtc tctacatggc cacctttggc 960 tttggctgca cctacatctt caccaacttt gcggtcagcc acacgcacct cgacgtcacc 1020 gagccggacg agttcctgca ctgggtcgag tacgccgçgc tgeacacgaç caaçgtgtcc 1080 aacgactcgt ggttcatcac ctggtggatg tcgtacctca aetttcagat cgagcaccac 1140 ctctttccgt cgctgcccca getcaacgcc ccgcgcgtcg ccccgcgcgt ccgcgccctc 1200 ttcgagaagc acggcatggc ttacgacgag cgcccgtace ttaccgcgct tggcgacacg 1260 tttgccaacc tgcaçgccgt gggccaaaac gcgggceagg cggcggccaa ggccgcttag 1320

<210> 29 <211> 439 <212> PRT <213> Thraustochytrium aureum <400> 29

Met <51y Arg Gly Gly Glu Gly Gin Val Asn Ser Ala Gin Val Ala Gin 1 5 10 15 Gly Gly Ala Gly Thr Arg Lys Thr lie Leu Ile Glu Gly Glu Val Tyr 20 25 30 Asp Vai Thr Asn Phe Arg His Pro Gly Gly Ser Ile Ile Lys Phe Leu 35 40 45 Thr Thr Asp Gly Thr Glu Ala Vai Asp Ala Thr Asn Ala Phe Arg Glu 50 55 60 Phe Sis Cys Arg Ser Gly Lys Ala Glu Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Pro 65 70 75 80 Lys leu Gly Ala Pro Ser Lys Met Lys Phe Asp Ala Lys Glu Gin Ala 85 90 95 Arg Arg Asp Ala Ile Thr Arg Asp Tyr val Lys Leu Arg Glu Glu Met 100 105 110 Vai Ala Glu Gly Leu Phe Lys Pro Ala Pro Leu His Ile Val Tyr Arg 115 120 125 Phe Ala Glu Ile Ala Ala Leu Phe Ala Ala Ser Phe Tyr Leu Phe Ser 117

ΕΡ 1 392 823/PT 130 135 140 mt Arg Gly Asn Val Phe Ala Thr Leu Ala Ala Ile Ala Val Gly Gly 145 150 155 160 η© Ala Gin Gly Arg Cys Gly Trp Leu Met His Glu Cys Gly His Phe 165 170 175 Ser Met Thr Gly Tyr lie Pro Leu Asp Val Arg Leu Gin Glu Leu Val 180 185 190 Tyr Gly Vai Gly Cys Ser Met Ser Ala Ser Trp Trp Arg Val Gin His 195 200 205 Asn Lys His His Ala Thr Pro Gin Lys Leu Lys His Asp Val Asp Leu 210 215 220 Asp Thr Leu Pro Leu Val Ala Phe Asn Glu Lys lie Ala Ala Lys Val 225 230 235 240 Arg Pro Gly Ser Phe Gin Ala Lys Trp Ίλ%ΧΧ Ser Ala Gin Ala Tyr lie 245 250 255 Phe Ai cl Pro Val Ser Cys Phe Leu Val Gly Leu Phe Trp Thr Leu Phe 260 265 270 Leu Bis Pro Arg His Met Pro Arg Thr Ser His Phe Ala Glu Met Ala 275 280 285 Ale Vai 'Ala Val Arg Val Val Gly Trp ÂleU Ã2.C& Leu Mefc His Ser Ρίϊδ 230 295 300 Gly Tyr Ser Gly Ser Asp Ser Phe Gly Leu Tyr Met Ala Thr Phe Gly 305 310 315 320 Phe Gly Cys Thr Tyr lie Phe Thr Asn Phe Ala Val Ser His Thr His 325 330 335 Leu Asp Val Thr Glu Pro Asp Glu Phe Leu His Trp Val Glu Tyr Ala 340 345 350 Ala Leu His Thr Thr Asn Val Ser Asn Asp Ser Trp Phe ile Thr Trp 355 360 365 Trp Met Ser Tyr Leu Asn Phe Gin Ile Glu His His Leu Phe Pro Ser 370 375 380 Leu Pro Gin Leu Asn Ala Pro Arg Val Ala Pro Arg Val Arg Ala Leu 385 390 395 400 Phe Glu Lys His Gly Met Ala Tyr Asp Glu Arg Pro Tyr Leu Thr Ala 405 410 415 Leu Gly Asp Thr Phe Ala Asn Leu His Ala Val Gly GXn Asn Ala Gly 420 425 430 Gin Ala Ala Ala Lys AÍ cl Ala 435

<210> 30 <211> 1338 <212> ADN <213> Thraustochytrium aureum <400> 30 118 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ gaattcacca tgggfccgcgg agcacaggga gagccaaggc aggccacaga gctgaagagc 60 agcccaagtg agcagcgtaa ggfcgttgcfcc attgacgggc agctgtacga tgcaaccaac 120 ttcaggcatc ctggtggetc catcatcaaa tatttgtgca ccgatggcaa ggaggtagtt 180 gatgcaacçg aagcgtacaa ggagttecac tgçagatcct cgaaggcggt caagtacctc 240 aactccctgc caaagatcga cggcccaatc aagtacaaat acgacgcaaa ggagcaggct 300 cgccatgaca aactcacçag ggagtatgta gctctccgcg aacsgctcgfc caaggaggga, 360 tactttgacc ccagcccgct ccacattatc tacagatgog ccgagttggc agccatgtfce 420 gctctctcgt tctaccfctfct ctcettcaag ggtaacgtca tggccactat tgctgccafcc 480 gtgattgggg ggtgcgfcgca gggtcgttgt gggtggctca tgcstgaagc tggccactac 540 ageatgaccg gaaacatccc tgttgacttg cgccttcaag agtttttgta cggaattggg 600 tgtggcatga geggggcttg gtggagaagc cagcacaaca agcaccacgc caccccccaa 660 aagetcaago atgaegfctga tttggacaet cttcctcttg tcgcctggaa cgagaaaatt 720 gccegtcgcg tcaagccagg tagcttccag gcãaagtggc ttcatctcca gggatacatc 780 tttgceccag tctcctgcct fcctcgttggt ctcttctgga ctttgtactt gcatcctcgc 840 cacatgatcc gcaccaagcg caacttcgag atattttctg tcgctetgcg ctacgtatgc 900 tggttctcgc ttcttttgag catgggctac actgtcggag agtctctggg tctctatgtg 960 cttacttttg gacttggctg tacctacatc tttacgcalt ttgctgtaag ceacaccçac 1020 ttgccagtgt ccgaggagga cgagtacctg cactgggtcg agtacgctgc gctgcaeacc 1080 acgaacgttg ccatcgactc gtacgttgtc acctggctga fcgagcfcacct caactttcag 1140 atcgagcacc aettgttccc ttgctgcccg cagttccgcc accctgcaat ctcttctcgc 1200 gtcaagaaac ttttcgagga caatggtctg gtatacgacg cecgctcata cgteeaggcg 1260 ctcaaggata ecttcggcaa cctacacgaa gtgggcgtca acgctggcca agctgccaag 1320 agcgagtaag atctcgag 1338

<210> 31 <211> 439 <212> PRT <213> Thraustochytrium aureum <400> 31 119

ΕΡ 1 392 823/PT

Gly Arg Gly Ala Gin Gly Glu Pro Arg Gin Ala Thr Glu Leu Lys 1 5 10 X 15 Ser Ser Pro Ser Glu Gin Arg Lys Vai Leu Leu Ile Asp Gly Gin Leu 20 25 30 Tyr Asp Ala Thr Asn Phe Arg His Pro Gly Gly Ser Ile Ile Lys Tyr 35 40 45 Leu Cys Thr Asp Gly Lys Glu Vai Vai Asp Ala Thr Glu Ala Tyr Lys 50 55 60 Gla Pile Hls Cys Arg Ser Ser Lys Ala Vai Lys Tyr Leu Asn Ser Leu 65 70 75 80 Pr o Lys Ile Asp Gly Pro Ile Lys Tyr Lys Tyr Asp Ala Lys Glu Gin 85 90 95 Ala Arg His Asp Lys Leu Thr Arg Glu Tyr Vai Ala Leu Arg Glu Gin 100 105 110 Leu Vai Lys GÍu Gly Tyr Phe Asp Pro Ser Pro Leu His Ile Ile Tyr 115 120 125 Arg Cys Ala Glu Leu Ala Ma Met Phe Ala Leu Ser Phe Tyr Leu Phe 130 135 140 Ser Phe Lys Gly Asn Vai Met Ala Thr Ile Ala Ala Ile Vai Ile Gly 145 150 155 160 Gly Cys Vai Gin Gly Arg Cys Gly Trp Leu Met His Glu Ala Gly His 165 170 175 Tyr Ser Met Thr Gly Asn Ile Pro Vai Asp Leu Arg Leu Gin Glu Phe 180 185 ISO Leu Tyr Gly Ile Gly Cys Gly Met Ser Gly Ala Trp Trp Arg Ser Gin 195 200 205 HiS Asn Lys His His Ala Thr Pro Gin Lys Leu Lys His Asp Vai Asp 210 215 220 Leu Asp Thr Leu Pro Leu Vai Ala Trp Asn Glu Lys lie Ma Arg Arg 225 230 235 240 Vai Lys Pro Gly Ser Phe Gin Ala Lys Trp Leu His Leu Gin Gly Tyr 245 250 255 Ile Phe Ala Pro Vai Ser Cys Leu Leu Vai Gly Leu Phe Trp Thr Leu 260 265 270 Tyr Leu His Pro Arg His Met Ile Arg Thr Lys Arg Asn Phe Glu Ile 275 280 285 Phe Ser Vai Ala Leu Arg Tyr Vai Cys Trp Phe Ser Leu Leu Leu Ser 120

ΕΡ 1 392 823/PT 200 295 300 mt Gly Tyr Thr Vai Gly Glu Ser Leu Gly Leu Tyr Vai Leu Thr Phe 305 310 315 320 Gly Leu Gly Cys thr Tyr He Phe Thr His Phe Ala vai Ser His Thr 325 330 335 His Leu Pro Vai Ser Glu Glu Asp Glu Tyr Leu His Trp Vai Glu Tyr 340 345 350 Ala Ala Leu His Thr Thr Asn Vai Ala He Asp Ser Tyr Vai Vai Thr 355 360 365 Trp Leu Met Ser Tyr Leu Asn Phe Gin Xle Glu His His Leu Phe Pro 370 375 380 Cys Cys Pro Gin Phe Arg His Pro Ala Ile Ser Ser Arg Vai Lys Lys 385 390 395 400 Leu Phe Glu Asp Asn Gly Leu Vai Tyr Asp Ala Arg Ser Tyr Vai Gin 405 410 415 -AXs Leu Lys Asp Thr Phe Gly Asn Leu His Glu Vai Gly Vai Asn Ala 420 425 430 Gly Gin Ala Ala Lys Ser Glu 435

<210> 32 <211> 1381 <212> ADN <213> Thraustochytrium aureum <4 00> 32 ccatgggccg cggcggcgag aaaagcgagg tggaccaggfe gcagccacaa aagaccgagc 60 agctccagaa ggccaagtgg gaggatgttg ttcgcatcaa tggagtcgaa tacgacgtca 120 cggactatct eagaaaacae cctggtggca gcgtgatcaa gtacgggctt gcca&caeeg 180 gegctgatgc cacgtccctc tttgaagcgt tccacatgcg ctcaaagaag gctcagatgg 240 tgctcaagtc tctcccaaag cgtgctccgg tcctcgagafc ccagccaaac cagcttccag 300 aggageagae caaggaggcg gagatgctgc gtgattttaa a&aatttgag gatgagattc 360 gccgggatgg attgatggãa cctfcccttct ggcatcgcgc ttacagatta teagagcttg 420 taggtatgtt cacgetcggc ctctacctct tctcgttaaa cactcctctg tctattgctg 480 ctggtgtcct cgtccacggt ctctttggtg cattctgtgg atggtgccag catgaggcag 540 gccacggctc ctttttttac agcctttggt ggggcaagcg tgtacaggcc atgfctgatcg 600 ggtttggtct aggaacatcc ggcgacatgt ggaacatgafc gcacaaeaag cafccatgctg 660 ccacccaaaa ggttcatcac gaccttgaca ttgacacaac tccttttgta gctttcttca 720 acactgcatt tgagaaaaac agatggaagg gcttttccaa ggcttgggtc cgctttcagg 780 ctttcacgtt cafcfccctgtc accagcggca tgatcgtcat gefcgttctgg ctgttttttc 840 tccaccctcg ccgcgtcgit caaaagaaga actttgagga gggtttttgg atgctgtcga 800 gccacattgt gcgcacctat dtcttccacc ttgtgaccgg ctgggagagc ctcgcfcgcat 960 gctaccttgt tgggtattgg gcgtgcatgt gggtgtccgg fcatgtatfcfcg tttggocact 1020 tttcgctctc ccacactcat atggacattg tggaggcgga cgtgcataag aactgggtcs 1080 ggtacgctgt tgaccacact gttgacatca gcccatccaa cccgçtcgtg tgctgggtca 1140 tgggttaccfc caacatgcag aecafcccacc acttgtggcc tgccatgccc cagtaccaco 1200 aggtcgaggt ctcacgccgc fcttgeeatct tegccaaaaa acacggecte aactaccgcg 1260 tegtctctta ctttgaggct tggcgcctga tgctccaaaa tcttgctgac gtcggttccc 1320 actaccatga gaacggtgtc aagcgegcce caaagaaagc caaggcgcag tagaaagcta 1380 t 1381

<210> 33 <211> 456 <212> PRT 121 ΕΡ 1 392 823/ΡΤ <213> Thraustochytrium aureum <400> 33

Met Gly Arg Gly Gly Glu Lys Ser Glu Val ASp Gin Val Gin Pro Gin I 5 10 15 Lys Thr Glu Gin Leu Gin Lys Ala Lys Trp Glu Asp Val Val Arg lie 20 25 30 Asn Gly Val Glu Tyr Asp Vai Thr Asp Tyr Leu Arg Lys His Pro Gly 35 40 45 Gly Ser Val Tis Lys Tyr Gly Leu Ala Asn Thr Gly Ala Asp Ala Thr 50 55 60 Ser Leu Phe Glu Ala Phe His Met Arg Ser Lys Lys Ala Gin Met Val 65 70 75 80 Leu Lys Ser Leu Pro Lys Arg Ala Pro Val Leu Glu Ile Gin Pro Asn 85 90 95 Gin Leu Pro Glu Glu Gin Thr Lys Glu Ala Glu Met Leu Arg Asp Phe 100 105 110 Lys Lys Phe Glu Asp Glu lie Arg Arg Asp Gly Leu Met Glu Pro Ser 115 120 125 Phe Trp His Arg Ala Tyr Arg Leu Ser Glu Leu Val Gly Met Phe Thr 130 135 140 Leu Giy Leu Tyr Leu Phe Ser Leu Asn Thr Pro Leu Ser Ile Ala Ala 145 150 155 160 siy Vai Leu Val His Gly Leu Phe Gly Ala Phe Cys Gly Trp Cys Gin 165 170 175 fíis Glu Ala Gly His Gly Ser Phe Phe Tyr Ser Leu Trp Trp Gly Lys 180 185 190 Arg Val Gin Ala Met Leu Xle Gly Phe Gly Leu Gly Thr Ser Gly Asp 195 200 205 Met Trp Asn Met Met His Asn Lys His His Ala Ala Thr Gin Lys Val 210 215 220 His His Asp Leu Asp Ile Asp Thr Thr Pro Phe Val Ala Phe Phe Asn 225 230 235 240 Thr Ala Phe Glu Lys Asn Arg Trp Lys Gly Phe Ser Lys Ala Trp Val 245 250 255 Arg Phe Gin Ala Phe Thr Phe Ile Pro Val Thr Ser Gly Met Ile Val 260 265 270 Met Leu Phe Trp Leu Phe Phe Leu His Pro Arg Arg Val Val Gin Lys 275 280 285 Lys Asn Phe Glu Glu Gly Phe Trp Met Leu Ser Ser His ile Val Arg 290 295 300 Thr Tyr Leu Phe His Leu Val Thr Gly Trp Glu Ser Leu Ala Ala Cys 305 310 315 320 Tyr Leu Val Gly Tyr Trp Ala Cys Met Trp Val Ser Gly Met Tyr Leu 325 330 335 Phe Gly His Phe Ser Leu Ser His Thr His Met Asp Ile Val Glu Ala 340 345 350 Asp Val His Lys Asn Trp Val Arg Tyr Ala Val Asp His Thr Val Asp 355 360 365 Ile Ser Fro Ser Asn Pro Leu Val Cys Trp Val Met Gly Tyr Leu Asn 370 375 380 Met Gin Thr Ile His His Leu Trp Fro Ala Met Pro Gin Tyr His Gin 385 390 395 400 Val Glu Val Ser Arg Arg Phe Ala ile Phe Ala Lys Lys His Gly Leu 405 410 415 Asn Tyr Arg Val Val Ser Tyr Phe Glu Ala Trp Arg Lee Met Leu Gin 420 425 430 Asn Leu Ala Asp Val Gly Ser His Tyr HiS Glu Asn Gly Val Lys Arg 435 440 445 Ala Pro Lys Lys Ala Lys Ala Gin 122

ΕΡ 1 392 823/PT

<210> 34 <211> 1329 <212> ADN <213> Isochrysis galbana <400> 34 atggtggcag gcaaatcagg cgctgcggcg cacgtgactc acagctcgac attgcccegt 60 gagtaccatg gcgcgaccaa cgactcgcgc tctgaggcgg ccgacgtcac cgtctctagc 120

atcgafcgctg aaaaggagat gatcatcaac ggccgcgtgt afcgacgtgtc gteattfcgfcg ISO aagcggcacc caggtggctc ggtgatcaag ttccagcigg gcgccgacgc gagcgacgcg 240 tacaacaact ttcacgtccg ctccaagaag gcggacaaga tgctgtattc gctcccgfccc 300 cggccggccg aggccggcta cgcccaggac gacatctccc gcgactttga gaagctgcgc 360 etcgagctga aggaggaggg ctacttcgag cccaacctgg tgcaegtgag ctacaggtgt 420 gtggaggttc fctgccatgta ctgggctggc gtccagctca tctggtccgg gtactggttc 480 ctcggcgcga tcgtggccgg cattgcgcag ggccgctgcg gctggctcca gcatgagggrt 540 gggoactact cgctcaccgg caacatcaag atcgaccggc atctgcagat ggccatctat 600 gggcttggct gcggcatgtc gggctgctac tggcgcaaeç agcacaacaa gcaccacgcc 660 acgcçgcaga agctcgggac cgaccccgac ctgcagacga tgccgctggt ggccttccac 720 aagatcgtcg gcgccaaggc gcgaggcaag ggcaaggcgt ggctggcgtg gcaggcyccg 780 ctcttctttg gcgggatcat ctgctcgctc gtctctttcg gctggcagtt cgtgctccac 840 cccaaccacg cgctgcgcgt gcacaatcac ctggagctcg cgtacatggg cctgcggtac 900 gtgctgtggc accfcggcctt tggccacctc gggctgctga gctcgctccg cctgtacgcc 960 tfcttacgtgg ccgtgggegg eacçtacafcc ttcaccaact tcgccgtctc gcacacccac 1020 aaggacgtcg tcccgcccac caageaeatç tcgtgggcac tctactcggc caaccacacg 1080 accaactgct ccgactcgcc ctttgtcaac tggtggatgg cctacctcaa cfctccagatc 1140 gagcaccacc tcttcccgtc gatgccgcag tacaaccacc eeaagatcgc ccegcgggfcg 1200 cgcgegctcfc tegagaagca cggggtcgag tatgacgtcc ggccatacct ggagtgtttt 1260 cgggtcacgt acgtcaacct gctcgccgta ggcaacccgg agcacfeccta ccacgagcac 1320 acgoacfcag 1329

<210> 35 <211> 442 <212> PRT <213> Isochrysis galbana <400> 35 123

ΕΡ 1 392 823/PT

Met Vai Ala Gly Lys Ser Gly Ala Ala Ala His Vai Thr His Ser Ser 1 5 10 15 Thr Leu Pro Arg Glu Tyr His Gly Ala Thr Asn Asp Ser Arg Ser Glu 20 25 30 Ala Ala Asp Vai Thr Vai Ser Ser Ile Asp Ala Glu Lys Glu Met Ile 35 40 45 Ile Asn Gly Arg Vai Tyr Asp Vai Ser Ser Phe Vai Lys Arg His Fro 50 55 eo Gly Gly Ser Vai Ile Lys Phe Gin Leu Gly Ala Asp Ala Ser Asp Ala 65 70 75 80 Tyr Asn Asn Phe His Vai Arg Ser Lys Lys Ala Asp Lys Met Leu Tyr 85 90 95 Ser Leu Fro Ser Arg Pro Ala Glu Ala Gly Tyr Ala Gin Asp Asp Ile 100 105 110 Ser Arg Asp Phe Glu Lys Leu Arg Leu Glu Leu Lys Glu Glu Gly Tyr 115 120 125 Phe Glu Pro Asn Leu Vai His Vai Ser Tyr Arg Cys Vai Glu Vai Leu 130 135 140 Ala Met Tyr Trp Ala Gly Vai Gin Leu Ile Trp Ser Gly Tyr Trp Phe 124

ΕΡ 1 392 823/PT 145 150 155 160 Leu Gly Ala Ile Vai Ala Gly Ile Ala Gin Gly Arg Cys Gly Trp Leu 165 170 175 Gin His Glu Gly Gly His Tyr Ser Leu Thr Gly Asn Ile Lys Ile Asp 180 185 190 Arg His Leu Glu Met Ala Ile Tyr Gly Leu Gly Cys Gly Met Ser Gly 195 200 205 cys Tyr Trp Arg Asn Gin His Asn Lys His His Ala Thr Pro Gin Lys 210 215 220 Leu 61y Thr Asp Pro Asp Leu Gin Thr Met Pro Leu Val Ala. Phe His 225 230 235 240 Lys Ile Vai Gly Ala Lys Ala Arg Gly Lys Gly Ala Trp Leu Ala 245 250 255 Trp Gin Ala Pro Leu Phe Phe Gly Gly Ile Ile Cys Ser Leu Val Ser 260 265 270 Phe 61 y Trp Gin Phe Val Leu His Pro Asn His Ala Leu Arg Val His 275 280 285 Asn His Leu Glu Leu Ala Tyr Met Gly Leu Arg Tyr Val Leu Trp His 290 295 300 Leu Ala Phe Gly His Leu Gly Leu Leu Ser Ser Leu Arg Leu Tyr Ala 305 310 315 320 Phe Tyr Vai Ala Vai Gly Gly Thr Tyr Ile Phe Thr Asn Phe Ala Val 325 330 335 Ser His Thr His Lys Asp Val Val Pro Pro Thr Lys His Ile Ser Trp 340 345 350 Ala Leu Tyr Ser Ala Asn His Thr Thr Asn Cys Ser Asp Ser Pro Phe 355 360 365 Vai Asn Trp Trp Met Ala Tyr Leu Asn Phe Gin lie Glu His His Leu 370 375 380 Phe Pro Ser Met Pro Gin Tyr Asn His Pro Lys Ile Ala Pro Arg Val 385 390 395 400 Arg Ala Leu Phe Glu Lys Hís Gly Vai Glu Tyr Asp Val Arg Pro Tyr 4 OS 410 415 Leu Glu Cys Phe Arg Val Thr Tyr Val Asn Leu Leu Ala Val Gly Asn 420 425 430 Pro Glu His Ser Tyr His Glu His Thr His 435 440

<210> 36 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R0838 <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> ν = a ou g ou c na posição 7

ΕΡ 1 392 823/PT 125 <221> misc feature <222> (10)...(10) <223> r = g ou a na posição 10 <221> misc feature <222> (13)...(13) <223> s = g ou c na posição 13 <221> misc feature <222> (16) . . . (16) <223> r = g ou a na posição 16 <221> misc feature <222> (19) . . . (19) <223> r = g ou a na posição 19 <221> misc feature <222> (22) ... (22) <223> y = t/u ou c na posição 22 <221> misc feature <222> (25) . . . (25) <223> r = g ou a na posição 25 <221> misc feature <222> (31) ... (31) <223> r = g ou a na posição 31 <4 0 0> 36 catggtvggr aasagrtgrt gytcratctg rtagtt 36 <210> 37 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador RO1065 <4 0 0> 37 cgacaagagg aagagtgtcc aaatc 25 EP 1 392 823/PT 126 <210> 38 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 38 RO1064 cgccttcaag agtttttgta cggaattggg 30 <210> 39 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador RO1097 <400> 39 cttgtaccat gggtcgcgga gcacagggag 30 <210> 40 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador RO1098 <400> 40 tgaagcttac tcgctcttgg cagcttggcc 30 <210> 41 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador RO1107 <400> 41 127

ΕΡ 1 392 823/PT tttaaccatg ggccgcggcg gcgagaaaag 30

<210> 42 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador RO1108 <400> 42 gggaagaagc tttctactgc gccttggctt tctttg 36

<210> 43 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R01235 <400> 43 cgaagttggt gaagatgtag gtgccg 26

<210> 44 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R01232 <400> 44 gagcgacgcg tacaacaact ttcacgt 27

<210> 45 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador 23 128

ΕΡ 1 392 823/PT <4Ο0> 45 cgactggagc acgaggacac tga

<210> 46 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador 3' de GeneRacer <400> 46 25 gctgtcaacg atacgctacg taacg

<210> 47 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador Interno R01234 <400> 47 26 agctccaggt gattgtgcac gcgcag

<210> 48 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador R01233 <400> 48 gactttgaga agctgcgcct cgagctg

<210> 49 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial 27 129

ΕΡ 1 392 823/PT <22 0> <223> Iniciador 5' Interno <400> 49 ggacactgac atggactgaa ggagta 26

<210> 50 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador 3' Interno <400> 50 cgctacgtaa cggcatgaca gtg 23

<210> 51 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador RO1309 <400> 51 atgatggaat tcatggtggc aggcaaatca ggcgc 35

<210> 52 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador RO1310 <400> 52 aataatgtcg acctagtgcg tgtgctcgtg gtagg

<210> 53 <211> 14 <212> PRT 35 130

ΕΡ 1 392 823/PT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência Peptidica de Consenso <400> 53

Vai Tyr Asp Vai Thr Glu Trp Vai Lys Arg His Pro Gly Gly 1 S 10

<210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência Peptidica de Consenso <400> 54

Gly Ala Ser Ala Asn Trp Trp Lys His Gin His Asn Vai His His 1 5 10 15

<210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência Peptidica de Consenso <400> 55

Asn Tyr Gin Ile Gin His His Leu Phe Pro- Thr Met 15 10

Lisboa, 2012-02-28

Claims (27)

1. ΕΡ 1 392 823/PT 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Ácido nucleico isolado compreendendo ou complementar a uma sequência nucleotidica codificando um polipéptido possuindo actividade de dessaturase, em que a sequência de aminoácidos do referido polipéptido tem pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:20.
2. 2. Sequência nucleotidica isolada compreendendo ou complementar a pelo menos 90% da sequência nucleotidica seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:19.
3. 3. Sequência nucleotidica isolada da reivindicação 2 em que a referida sequência é seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:19.
4. 4. Sequência nucleotidica isolada da reivindicação 2 ou 3 em que a referida sequência codifica uma dessaturase funcionalmente activa que utiliza um ácido gordo polinsaturado como substrato.
5. 5. Sequência nucleotidica da reivindicação 4 em que SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 19 são derivadas de Saprolegnia diclina.
6. 6. Polipéptido purificado codificado pela referida sequência nucleotidica da reivindicação 1, 2 ou 3.
7. 7. Polipéptido purificado que dessatura ácidos gordos polinsaturados no carbono 5 e tem pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos consistindo em SEQ ID NO:20.
8. 8. Polipéptido purificado que dessatura ácidos gordos polinsaturados no carbono 6 e tem pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos consistindo em SEQ ID NO:14. ΕΡ 1 392 823/ΡΤ 2/4
9. 9. Método de produção de uma dessaturase compreendendo os passos de: a) isolamento de uma sequência nucleotidica seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO:19; b) construção de um vector compreendendo: i) a referida sequência nucleotidica isolada operativamente ligada a ii) uma sequência reguladora; c) introdução do referido vector numa célula hospedeira durante um tempo e sob condições suficientes para expressão da referida dessaturase.
10. 10. Vector compreendendo: a) uma sequência nucleotidica seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:19, operativamente ligada a b) uma sequência reguladora.
11. 11. Célula hospedeira não humana compreendendo o referido vector da reivindicação 10.
12. 12. Célula de mamífero não humano compreendendo o referido vector da reivindicação 10, em que a expressão da referida sequência nucleotidica do referido vector resulta na produção de níveis alterados de AA, EPA, GLA ou STA, quando a referida célula é criada num meio de cultura compreendendo pelo menos um ácido gordo seleccionado a partir do grupo que consiste em LA, ALA, DGLA e ESP.
13. 13. Célula vegetal, planta ou tecido vegetal compreendendo o referido vector da reivindicação 10, em que a expressão da referida sequência nucleotidica do referido vector resulta na produção de um ácido gordo polinsaturado através da referida célula vegetal, planta ou tecido vegetal.
14. 14. Célula vegetal, planta ou tecido vegetal da reivindicação 13 em que o referido ácido gordo polinsaturado é seleccionado a partir do grupo que consiste em AA, EPA, GLA e STA.
15. 15. Planta transgénica compreendendo o referido vector da reivindicação 10, em que a expressão da referida sequência nucleotidica do referido vector resulta na produção de um ΕΡ 1 392 823/PT 3/4 ácido gordo polinsaturado em sementes da referida planta transgénica.
16. 16. Método para produção de um ácido gordo polinsaturado compreendendo os passos de: a) isolamento de uma sequência nucleotidica consistindo em SEQ ID NO:19; b) construção de um vector compreendendo a referida sequência nucleotidica isolada; c) introdução do referido vector numa célula hospedeira durante um tempo e sob condições suficientes para expressão da enzima A5-dessaturase; e d) exposição da referida enzima A5-dessaturase expressa a um ácido gordo polinsaturado substrato para converter o referido substrato num ácido gordo polinsaturado produto.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o referido ácido gordo polinsaturado substrato é DGLA ou 20:4n-3 e o referido ácido gordo polinsaturado produto é AA ou EPA, respectivamente.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 16 compreendendo ainda o passo de exposição do referido ácido gordo polinsaturado produto a uma elongase para converter o referido ácido gordo polinsaturado produto noutro ácido gordo polinsaturado.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18 em que o referido ácido gordo polinsaturado produto é AA ou EPA e o referido outro ácido gordo polinsaturado é ácido adrénico ou ácido(n-3)-docosapentaenóico, respectivamente.
20. 20. Método da reivindicação 18 compreendendo ainda o passo de exposição do referido outro ácido gordo polinsaturado a uma dessaturase adicional para converter o referido outro ácido gordo polinsaturado num ácido gordo polinsaturado final.
21. 21. Método da reivindicação 20 em que o referido ácido gordo polinsaturado final é ácido(n-6)-docosapentaenóico ou ácido docosa-hexaenóico (DHA). ΕΡ 1 392 823/ΡΤ 4/4
22. 22. Método para produção de um ácido gordo polinsaturado compreendendo os passos de: a) isolamento de uma sequência nucleotidica consistindo em SEQ ID NO:13; b) construção de um vector compreendendo a referida sequência nucleotidica isolada; c) introdução do referido vector numa célula hospedeira durante um tempo e sob condições suficientes para expressão da enzima Δβ-dessaturase; e d) exposição da referida enzima Δβ-dessaturase expressa a um ácido gordo polinsaturado substrato para converter o referido substrato num ácido gordo polinsaturado produto.
23. 23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o referido ácido gordo polinsaturado substrato é LA ou ALA e o referido ácido gordo polinsaturado produto é GLA ou STA, respectivamente.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 22 compreendendo ainda o passo de exposição do referido ácido gordo polinsaturado produto a uma elongase para converter o referido ácido gordo polinsaturado produto noutro ácido gordo polinsaturado.
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 24 em que o referido ácido gordo polinsaturado produto é GLA ou STA e o referido outro ácido gordo polinsaturado é DGLA ou ETA, respectivamente.
26. 26. Método da reivindicação 24 compreendendo ainda o passo de exposição do referido outro ácido gordo polinsaturado numa dessaturase adicional para converter o referido outro ácido gordo polinsaturado num ácido gordo polinsaturado final.
27. 27. Método da reivindicação 26 em que o referido ácido gordo polinsaturado final é AA ou EPA. Lisboa, 2012-02-28