PT1339855E - Melhoria da homogeneidade e da secreã†o de protenas recombinantes em sistemas de mamferos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MELHORIA DA HOMOGENEIDADE E DA SECREÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM SISTEMAS DE MEMÍFEROS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo para a melhoria da homogeneidade e/ou da secreção de uma proteína recombinante com interesse, expressa em células de mamíferos, por substituição da sequência do peptídeo sinal endógena do ADN que codifica a proteína com interesse pela do hGH humano. A invenção refere-se igualmente a vectores de expressão de ADN que contêm a sequência que codifica as referidas proteínas fundida com a sequência do peptídeo sinal do hGH e a células que acolhem os referidos vectores.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A secreção de proteínas é uma das mais importantes fontes da produção de proteínas no campo de biotecnologia. Este processo é composto pelos seguintes passos: primeiro, a deslocação através da membrana do retículo endoplasmático (ER) ; segundo, a N-glicosilação e dobragem na cavidade do ER; terceiro, a saída do ER; quarto, modificações no aparelho de Golgi; e finalmente, a libertação dos grânulos secretórios para o espaço extracelular (Sakaguchi 1997). 0 facto de uma proteína ser ou não segregada pelas células depende principalmente de a mesma poder ser deslocada através da membrana e de poder ser correctamente dobrada na cavidade do ER. A deslocação na membrana está obrigatoriamente acoplada a células de mamíferos. Depois da deslocação na membrana, os peptídeos nascentes são libertados no espaço da cavidade e dobrados com o auxílio 2 de diversos meios auxiliares e enzimas de dobragem. As proteínas dobradas de forma deficiente são aprisionadas no ER e não podem prosseguir para os compartimentos secretórios. Nos processos biotecnológicos em que tem lugar uma expressão maciça da proteína, a secreção pode representar um estrangulamento e limitar a velocidade de expressão.

Os peptídeos de sinal ou sequências leader estão localizados no términus amino de polipeptídeos nascentes. Têm como alvo proteínas para o trajecto secretório e são clivadas da cadeia nascente logo que sejam deslocadas na membrana endoplasmática do retículo. 0 peptídeo sinal consiste em três regiões: uma região polar no terminal amino (região N) , em que são frequentemente observados resíduos de aminoácido carregados positivamente; uma região hidrófoba central (região H) , com mais de 7-8 resíduos de aminoácidos hidrófobos; e uma região terminal carboxi (região C) , que inclui o sítio de clivagem do peptídeo sinal (Sakaguchi 1997). As regiões H eucarióticas são dominadas por Leu, com alguma ocorrência de Vai, Ala, Phe e Ile. A clivagem do peptídeo sinal da proteína madura tem lugar num sítio específico e a especificidade da clivagem reside no último resíduo da sequência de sinal (Nielsen et al., 1997) . Junto aos sítios de clivagem -3 e -1 a alanina é mais predominante. 0 sítio confere especificidade de processamento. Não são vistas quaisquer outras configurações específicas nas primeiras posições da proteína madura, em organismos eucarióticos (Nielsen et al., 1997). Por conseguinte, um peptídeo sinal "mau" pode promover mais do que uma clivagem específica, sendo o resultado uma expressão não homogénea da proteína; isto é, a proteína será expressa com diferentes aminoácidos N-terminais. 3

Uma vez que muitas proteínas são reguladas em condições fisiológicas, não é desejável a utilização de sinais reguladores naturais para superexpressão em sistemas de mamíferos. Por exemplo, nestes sistemas são utilizados promotores eficientes, tais como CMV e SV40, para controlar a expressão de proteínas de interesse recombinantes. Analogamente, seria vantajosa a utilização de peptídeos sinal eficazes, tais como SV40 e hGH poli-A, para superexprimir proteínas recombinantes segregadas, em vez das suas contrapartidas endógenas. 0 peptídeo sinal da hormona do crescimento humano (hGH) foi descrito como sendo eficaz na marcação da secreção de proteínas intracelulares ligadas a membranas e de proteínas segregadas por mecanismos diferentes dos que são comandados pelos peptídeos sinal.

Por exemplo, o Documento W026562 descreve a secreção da proteína intracelular icIL-lra-II por fusão do peptídeo sinal de hGH à sequência da icIL-lra-II. A invenção refere-se a um processo para a expressão recombinante de uma proteína que tem a sequência de aminoácidos da icIL-lra-II natural num sistema de expressão de célula recombinante através da utilização de um vector que é uma fusão do peptídeo sinal de uma proteína secretória humana, de preferência o peptídeo sinal de hGH de 26 aminoácidos, fundido na estrutura de leitura apropriada com o ADN que codifica a icIL-lra-II. 0 processo compreende a produção de um vector de expressão que contém ADN que codifica a icIL-lra-II, tanto na forma de ADNc como de ADN genómico, fundido numa estrutura de leitura apropriada com o ADN que codifica o peptídeo sinal escolhido, de preferência o peptídeo sinal de hGH de 26 aminoácidos (figura 1, SEQ ID NO: 2). 0 vector de expressão é então inserido num 4 hospedeiro de expressão apropriado, tal como as células CHO. As células hospedeiras transformadas são depois cultivadas de uma forma que obrigue o vector de expressão a exprimir a sua proteína codificada, e a proteína icIL-lra-II expressa e segregada é então recolhida e purificada a partir do meio de cultura.

Morris et al. (1999) descrevem a utilização do peptídeo sinal de hGH para a secreção da proteína CDL40L, que existe na natureza predominantemente como uma molécula ancorada numa proteína. Diversos relatos têm mostrado que a forma solúvel da CD40L é biologicamente activa (Fanslow et al. 1994, Hollenbaugh et al. 1992 e Mazzei et al. 1995). Para a utilização de CD40L como um potencial agente terapêutico, foi desenvolvida a optimização de formas solúveis desta molécula. Neste trabalho foram comparadas a actividade de formas solúveis da CD40L e a actividade da região homóloga de TNF de CD40L multimerizada solúvel. As formas solúveis da CD40L foram preparadas por fusão de todo o domínio extracelular da CD40L humana ou da região da CD40L homóloga da sequência TNF com a sequência do peptídeo sinal de hGH. A forma multimerizada da CD40L foi preparada por fusão a um “zipper" de isoleucina (IZ). Os resultados mostraram que a multimerização aumenta a actividade da CD40L solúvel.

Pecceu et al. (1991) descrevem a utilização do peptídeo sinal de hGH para exprimir e segregar a forma madura de IL-1β. No corpo, após a síntese, a pró-IL-Ιβ permanece primariamente citosílica, até ser clivada e transportada para fora das células. 0 exame da sequência revela a ausência de um peptídeo sinal clássico hidrófobo N-terminal ou interno. A libertação da IL-Ιβ madura parece estar ligada ao processamento da clivagem do peptídeo ácido aspártico-alanina pelo enzima de conversão (ICE) (Dinarello 1996). Embora o ICE seja expresso constitutivamente na 5 maioria das células, nem todas as células processam a pró-IL-Ιβ nem segregam a IL-Ιβ madura. Por conseguinte, a secreção da IL-Ιβ madura está dependente da célula. Pecceu revela a utilização de um vector recombinante que contém apenas o ADN que codifica a forma madura da IL-Ιβ, sem qualquer peptídeo sinal, e um vector que contém o ADN que codifica a forma madura da IL-Ιβ ligado ao peptídeo sinal hGH. Os resultados mostram que apenas 52% da proteína são segregados utilizando o primeiro constructo, enquanto a utilização do constructo com o peptídeo sinal hGh tem como resultado 97% de secreção. 0 primeiro codão ATG para a iniciação da translação tem que ser identificado pelo equipamento de transcrição. Um codão ATG num contexto muito fraco provavelmente não é o ponto de partida para a translação. 0 contexto óptimo para a iniciação da translação em ARNms de mamíferos é um resíduo G que se segue ao codão ATG (posição +4 na região de codificação) e uma purina, de preferência A, três nucleótidos a montante (-3 na região não codificadora), esta sequência de consenso foi designada sequência de Kozak (Kozak 1996, 1999). 0 ARN mensageiro em que o primeiro codão ATG não tem os nucleótidos preferidos em ambas estas posições chave de flanco (uma sequência de Kozak "má" ou não óptima) têm a propriedade especial de iniciarem a translação no primeiro e segundo codões ATG, produzindo desta forma duas proteínas a partir de um ARN. 0 ATG no ponto de iniciação do peptídeo sinal hGH é seguido por G (na posição +3) necessário para a obtenção de uma sequência de Kozak óptima (figuras 1 e 2 e SEQ ID NO: 3), o que assegura o início da translação apenas no primeiro sítio ATG e a homogeneidade do produto. A proteína de ligação IL-18 (IL18-BP) foi purificada por afinidade a partir de urina humana, utilizando-se IL-18, 6 foi sequenciada e clonada. Descobriu-se que a IL-18 abole a actividade in vitro da citoquina pro-inflamatória IL-18 (Novick et al. 1999) . 0 ADN codifica um peptídeo sinal na sua parte do terminal N. Parte da sequência de Kozak codificada dentro do peptídeo sinal não é do contexto apropriado.

IL-18BP leader ATG A + 1 +4

Kozak consenso ATG G + 1 +4

Hormona de crescimento ATG G humano leader +1 +4

Existe, por conseguinte, uma necessidade de se criar um processo ou um sistema que permita a secreção de uma proteína de interesse em geral e permita a secreção de IL-18BP em particular, como proteínas homogéneas e/ou em grandes quantidades, em células de mamíferos.

RESUMO DA INVENÇÃO A invenção fornece um processo aperfeiçoado para a produção de uma IL-18BP recombinante homogénea expressa em diferentes sistemas de mamíferos e ou a secreção efectiva da mesma, compreendendo a substituição da sequência endógena de peptídeo sinal do ADN que codifica a IL-18BP pela de hGH. A invenção fornece também um vector de expressão para melhorar a homogeneidade e/ou a secreção de uma IL-18BP recombinante homogénea expressa num sistema de mamífero, 7 compreendendo a sequência do peptídeo sinal do hGH ligada ao ADN que codifica a IL-18BP.

Num aspecto, a presente invenção fornece o referido vector, que codifica a sequência de Kozak óptima que assegura a translação apenas a partir de um codão de iniciação. Parte da referida sequência está incluída na codificação para o peptídeo sinal hGH, assegurando assim uma clivagem precisa do peptídeo sinal da proteína madura.

Numa forma de realização da presente invenção, o vector inclui o gene que codifica a IL-18BP. 0 referido vector permite a produção de IL-18BP homogénea (começando com Thr-Pro-Val).

Num seu outro aspecto, a invenção fornece células capazes de crescerem em meio isento de soro e capazes de produzir pelo menos 4 picogramas de IL-18B/célula/24 horas, de preferência pelo menos 11,8 picograma/célula/24 horas, e mais preferivelmente cerca de 12 picograma/célula/24 horas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 mostra a sequência genómica que codifica o peptídeo sinal hGH e a sequência de aminoácido que sofreu translação. A figura 2 mostra a sequência de Kozak presente no consenso e no peptídeo sinal hGH. A figura 3 descreve os primers usados para a fusão da sequência do peptídeo sinal hGH (sem o seu intrão) com a sequência IL-18BP. 8

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à produção e à secreção de uma IL-18BP recombinante, utilizando-se a sequência de peptideo sinal do hGH em vez da sequência natural do peptideo sinal. A invenção também fornece um vector de expressão que contém o ADN que codifica a IL-18BP, tanto na forma do ADNc como do ADN genómico, fundido na estrutura de leitura apropriada com o ADN que codifica o peptideo sinal hGH. 0 vector de expressão é então inserido num hospedeiro de expressão apropriado, isto é, em células de mamíferos. As células hospedeiras transformadas são depois cultivadas de uma forma que obriga o vector de expressão a exprimir a sua IL-18BP codificada, e a IL-18BP expressa e segregada é depois isolada e purificada. A expressão da IL-18BP pode ser estável ou transiente.

Embora as células CHO sejam as células hospedeiras preferidas, podem ser utilizadas outras células de mamíferos, tais como células COS, células HEK293, etc. Os peritos na técnica estão perfeitamente familiarizados com as técnicas para a criação de vectores de expressão, para a sua inserção em sistemas de expressão, e a selecção de clones que exprimem a proteína pretendida, incluindo as técnicas de amplificação.

Como será reconhecido pelos peritos na técnica, os tipos de promotores utilizados para controlar a transcrição das proteínas recombinantes podem ser quaisquer dos que são funcionais nas células hospedeiras. Os exemplos de promotores funcionais em células de mamíferos incluem o anterior promotor SV40, promotor tardio de adenovirus, promotor de timidina cinase de herpes simplex (HSV), promotor LTR de sarcoma de Rous (RSV), promotor anterior imediato de citomegalovirus humano (CMV), promotor LTR de 9 vírus do tumor mamário de rato (MMTV), promotor de interferona β, promotor de proteína de choque térmico 70 (hsp 70), assim como muitos outros bem conhecidos na técnica. Estes promotores podem ser ou constitutivos ou reguláveis. São preferidos os promotores constitutivos, em virtude de não ser necessário um passo de tratamento extra, tal como variação de temperatura, adição de agentes químicos ou indutores, etc., para a expressão a partir de promotores constitutivos. Numa forma de realização mostrou-se que pode ser obtida uma produtividade superior controlando-se a expressão com o promotor CMV, em comparação com o promotor SV40.

Em células de mamíferos, três elementos definem o sinal de poliadenilação do núcleo, isto é, o hexanucleótido AAUAAA altamente conservado, que se encontra 10 a 30 nucleótidos a montante do sítio de clivagem, um elemento menos altamente conservado, rico em U ou em GU, localizado a jusante do sítio de clivagem, e o próprio sítio de clivagem, que se torna o ponto de poli (A) -adição e é, por conseguinte, designado genericamente como o sítio poli(A) (Zhao et al. 1999). Sequências adicionais fora deste núcleo restauram factores reguladores ou mantêm o sinal do núcleo numa estrutura aberta e acessível. Foram criados diferentes vectores de expressão para a expressão heteróloga para conter sinais de poliadenilação eficientes, tais como sinais de poliadenilação SV40 e hGH. Numa forma de realização preferida é produzido IL-18BP utilizando-se o sinal de poliadenilação da hormona do crescimento humano.

Em particular, a presente invenção refere-se a um vector de expressão que contém o ADN de IL-18BP fundido ao ADN que codifica o peptídeo sinal de hGH, e a células hospedeiras transfectadas com este vector de expressão. 10 A sequência de ADN do peptídeo sinal hGH utilizado pode ser ou a sequência genómica que inclui o intrão (figura 1: SEQ ID NO: 1) ou a sequência de ADNc do peptídeo sinal, excluindo o intrão.

De acordo com a presente invenção, é possível exprimir a IL-18BP de forma homogénea e eficaz num sistema de expressão de mamífero, utilizando-se o peptídeo sinal de hGH.

Além disso, a invenção refere-se a células de mamífero que exprimem e seqregam eficientemente o recombinante homogéneo IL-18BP utilizando o peptídeo sinal hGH.

Num outro aspecto, a invenção refere-se a células que segregam eficientemente o recombinante homólogo de IL-18BP, de acordo com a invenção, que são capazes de ser cultivadas e produzidas num meio isento de soro (SFM). Mais concretamente, numa forma de realização preferida, células de acordo com a invenção provaram produzir entre 4 e 11,8 e também cerca de 12 picogramas de IL-18BP/célula/24 horas, tanto em condições com soro como isentas de soro. A invenção será agora ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: estabelecimento do clone S10-21 produtor de IL-18BP O ADN do peptídeo sinal natural da proteína IL-18BP codifica para uma sequência de Kozak não óptima, visto que a posição +4 é A e não G, por conseguinte foi substituído 11 pelo peptídeo sinal hGH, que exibe uma sequência de Kozak óptima (fiqura 2, SEQ ID NO: 3) . 0 fraqmento de ADN que codifica o peptídeo sinal hGH fundido com a proteína IL-18BP foi introduzido num vector de expressão de mamífero, sob o controle do promotor SV-40 e do sinal de poliadenilação.

Para a preparação do vector de expressão, o peptídeo sinal hGH (sem o seu intrão, ver a figura 1) foi fundido directamente com o ADNc que codifica para a proteína hlL-18BP matura (variante A, número de acesso AF110799 na base de dados pública NCBI) por PCR (a figura 3 descreve os primers usados). 0 peptídeo sinal hGH (sem o seu intrão) foi amplificado por PCR utilizando-se pXGH5 (Selden et al. 1986) como padrão e dois primers, a) um primer que contém sequências do início de hGHsp (5'hGH-IL-18BP primer "fusion out" SEQ ID NO:4), e b) um primer que codifica sequências da extremidade do hGHsp e sequências que codificam os primeiro 19 nucleótidos do ADNc de IL-18BP madura (3'hGH-IL-18BP primer "fusion in" SEQ ID NO:5). 0 ADNc que codifica para a IL18-BP madura foi amplificado por PCR utilizando-se um plasmídeo que codifica o ADNc de IL-18BP, como padrão, e dois primers, a) um primer que codifica sequências que se sobrepõem à extremidade do peptídeo sinal hGH e ao início do ADNc de IL-18BP madura (o 5'hGH-IL-18BP primer "fusion in" SEQ ID NO: 6) e b) um primer que contém a extremidade da sequência do ADNc da IL-18BP (o 3'hGH-IL-18BP primer "fusion out" SEQ ID NO:7). 12

Os fragmentos resultantes da amplificação PCR acima foram fundidos num terceiro PCR, por condensação das sequências que se sobrepõem presentes em ambos os fragmentos e utilizando-se dois primers, a) o primer 5'hGH-IL-18BP "fusion out", e b) o primer 3'hGH-IL-18BP "fusion out". 0 fragmento de ADN de PCR resultante foi clonado no vector de expressão de mamifero pSVE3 (Hartman et al. 1982), que codifica os sinais reguladores utilizados correntemente, o promotor SV40 e o sinal SV40 poli-A (os primers "fusion out" em 5' e 3' continham também sequências específicas de sítios de restrição necessárias para a clonagem). 0 plasmídeo construído (PSIL18BP) foi utilizado para transfectar células CHO (DHFR-) em conjunto com um plasmideo que continha o gene DHFR de rato como um marcador selectivo.

Os isolados individuais foram isolados em meio selectivo e ensaiados quanto à produção de IL-18BP por um ensaio ELISA.

Foram realizadas várias séries de amplificação de gene com concentrações crescentes de MTX. Após a amplificação, os clones foram isolados por limitação da diluição. Depois da sub-clonagem, o clone seleccionado S10-21 apresentava uma produtividade específica e estável de 1 picograma/célula/24 horas.

Exemplo 2: estabelecimento do clone 22C2-11 produtor de IL-18BP. 13 0 ADN do peptídeo sinal natural da proteína IL-18BP codifica para uma sequência de Kozak não óptima, visto que a posição +4 é A e não G, por conseguinte foi substituído pelo peptídeo sinal hGH, que exibe uma sequência de Kozak óptima (figura 2, SEQ ID NO: 3) . 0 fragmento de ADN que codifica o peptídeo sinal hGH fundido com a proteína IL-18BP foi introduzido num vector de expressão de mamífero, sob o controle do promotor CMV e do sinal de poliadenilação da hormona do crescimento humana.

Para a preparação do vector de expressão, o ADN que codifica o peptídeo sinal hGH (sem o seu intrão, ver a figura 1) foi fundido directamente com o ADNc que codifica para a proteína hIL-18BP madura (variante A, número de acesso AF110799) por PCR, utilizando o vector de expressão gerado no exemplo 1 (PSIL18BP) como um padrão e dois primers, a) o primer de avanço ACGCGTTCGACGCCACCATGGCTCCCGGACG (SEQ ID NO:8) compreendendo um sítio de restrição Sall, e em que as primeiras 21 bases codificam o ADNc do peptídeo sinal hGH, e b) o primer inverso CGGGATCCTCATTAACCCTGCTGCTGTGG (SEQ ID NO:9) compreendendo as últimas 18 bases de IL-18BP, dois codões stop e um sítio de restrição Bam Hl. 0 fragmento de ADN de PCR resultante foi inserido num vector de expressão de mamífero, utilizando técnicas de manipulação genética molecular conhecidas, em que o vector de mamífero compreende os sinais reguladores correntemente utilizados, que são usados para exprimir a IL-18BP: o promotor CMV e o sinal hGH poli-A (Ausubel et al., Currents Protocols in Molecular Biology, Greene Publications e Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 14 0 plasmídeo construído (pCMV-IL18bp2) foi utilizado para transfectar células CHO (DHFR-) em conjunto com um plasmídeo que continha o gene DHFR de rato como um marcador selectivo.

Os isolados individuais foram isolados em meio selectivo e ensaiados quanto à produção de IL-18BP por um ensaio ELISA.

Foram realizadas várias séries de amplificação de gene com concentrações crescentes de MTX (até 1000 nM) sobre isolados altamente produtores seleccionados. Depois da amplificação o MTX foi removido e os clones altamente produtores foram isolados por limitação da diluição e selecção da actividade. Depois da clonagem, os clones 22C2-11 seleccionados apresentavam uma produtividade específica elevada de 4 picograma/célula/24 horas e estabilidade no soro a 37°C. Descobriu-se que o clone 22C2-11 também crescia e produzia IL-18BP sob condições isentas de soro. A produtividade do clone 22C2-11 foi ensaiada a baixas temperaturas. A 32-33°C, tanto em condições com soro como sem soro, verificou-se que a produtividade aumentava para 11,8 picogramas de IL-18BP/célula/24 horas.

Os resultados indicaram que a utilização de um constructo que controla a expressão a partir do promotor CMV e do sinal hGH poli-A permitia uma expressão aumentada do IL-18BP, em comparação com os níveis de expressão controlados a partir do promotor SV40 e do sinal SV40 poli-A (exemplo D ·

Exemplo 3: purificação e análise do terminal N da IL-18BP produzida 15 A IL-18BP no sobrenadante de todas as células produtoras (S10-21 e 22C2-11, exemplos 1 e 2, respectivamente) foi purificada por cromatografia de imunoafinidade. A análise do terminal N da IL-18BP expressa com o peptideo sinal de hGH revelou apenas a espécie correcta da IL-18BP com a seguinte sequência de aminoácidos no terminal N: T P V S Q TTTAATASVR (SEQ ID NO:10). Estes resultados mostram que a IL-18 BP é produzida homogeneamente, a partir de diferentes vectores de expressão, por utilização do peptideo sinal hGH, em que, em contraste com o peptideo sinal natural IL-18BP, o sinal de Kozak é de contexto óptimo. 16

REFERÊNCIAS

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<11Q> APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N,V

<120> MELHORIA DA HOMOGENEIDADE E DA SECREÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM SISTEMAS DE MAMÍFEROS «130> IL/470 <1$G> IL/3.40HO <151:» 2000-12-05 <160> 10 <170> Pàtentin versien 3.1 <210> 1 -c211> 33S <212> ADN <2l3> Home sapieris <400> atggct I ac&g gtaagegecc etaaaatccc

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Lisboa, 30 de Junho de 2010

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo in vitro para a produção de uma proteína IL-18BP recombinante num sistema de mamífero, caracterizado por (i) a referida proteína IL-18BP recombinante exibir homogeneidade de aminoácidos no terminal N; e (ii) o referido processo compreender o passo de substituição da sequência endógena do peptídeo sinal do ADN que codifica a referida proteína IL-18BP pela do peptídeo sinal (hGH) da hormona de crescimento humana.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o sistema de mamífero compreende células CHO.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que as células CHO são cultivadas em meio suplementado com soro.

4. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que as células CHO são cultivadas em condições isentas de soro.

5. Utilização de : um vector de expressão para a produção in vitro de uma proteína IL-18BP recombinante num sistema de mamífero, caracterizada por (i) a referida proteína IL-18BP recombinante exibir homogeneidade de aminoácidos no terminal N; e (ii) o referido vector compreender o ADN que codifica a referida proteína IL-18BP fundido numa 2 estrutura de leitura apropriada com o ADN que codifica a sequência do peptídeo sinal de hGH.

6. Utilização de um vector de expressão de acordo com a reivindicação 5, que permite a expressão constitutiva da proteína IL-18BP.

7. Utilização de um vector de expressão de acordo com a reivindicação 5, em que a expressão do gene que codifica a proteína IL-18BP é regulada pelo promotor CMV.

8. Utilização de um vector de expressão de acordo com a reivindicação 5, em que a expressão do gene que codifica a proteína IL-18BP é regulada pelo sinal de poliadenilação da hormona de crescimento humana.

9. Célula que produz pelo menos 4 picogramas de IL- 18B/célula/24 horas, em que a referida célula acolhe um vector de expressão que compreende o ADN que codifica a referida proteína IL-18BP fundido numa estrutura de leitura apropriada com o ADN que codifica a sequência do peptídeo sinal de hGH.

10. Célula de acordo com a reivindicação 9, que produz cerca de 12 picogramas de IL-18B/célula/24 horas.

11. Célula de acordo com a reivindicação 9, que produz pelo menos 11,8 picogramas de IL-18B/célula/24 horas.

12. Célula de acordo com a reivindicação 9, capaz de crescer em meio isento de soro. 3

13. Célula de acordo com a reivindicação 12, que produz cerca < de 12 picogramas de IL-18B/célula/24 horas

• 14 . Célula de acordo com a reivindicação 12, que produz 11,8 picogramas de IL-18B/célula/24 horas.

15. Célula de acordo com a reivindicação 12, que produz pelo menos 11,8 picogramas de IL-18B/célula/24 horas. Lisboa, 30 de Junho de 2010