PT1249640E

PT1249640E - Transmissão hidráulica do tipo prato oscilante

Info

Publication number: PT1249640E
Application number: PT02006411T
Authority: PT
Inventors: Tsutomu Hayashi; Yoshihisa Kanno; Kenji Sakakibara; Nobuyuki Yakigaya
Original assignee: Honda Motor Co Ltd
Priority date: 2001-04-09
Filing date: 2002-03-21
Publication date: 2006-12-29
Also published as: CA2378021C; CN1380496A; CN1270105C; DE60213021D1; DE60213021T8; BR0201105A; MY134832A; EP1249640A3; BR0201105B1; EP1249640B1; ATE333060T1; CA2378021A1; JP3986764B2; US6698199B2; JP2002310061A; US20020170289A1; DE60213021T2; EP1249640A2

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO E COMPOSIÇÃO PARA TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE INFECÇÕES POR MICRORGANISMO RESISTENTE A ANTIBIÓTICO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO (a) Campo da Invenção A presente invenção refere-se a uma composição e utilizações para o tratamento de infecções microbianas resistentes a antibiótico pela administração de lactoferrina bovina ou da sua forma metabolizada, a lactoferricina, isoladamente ou em combinação com antibióticos ou outras familias de produtos antimicrobianos. (b) Descrição da Técnica Anterior

Utilização de Antibióticos em Produção Animal e Resistência

Dois factores importantes influenciam a emergência e a disseminação da resistência a antibióticos: genes de resistência transferíveis e pressão selectiva pela utilização de antibióticos. Para além dos hospitais com uma concentração de doentes propensos a infecções e da correspondente utilização de antibióticos, a produção animal é um segundo reservatório considerável de significativa utilização de antibióticos e resistência a antibióticos transferível. A produção animal 1 industrial mantém números elevados de animais num espaço comparativamente limitado e os surtos de infecções podem disseminar-se facilmente. Por razões técnicas verifica-se, frequentemente, uma medicação generalizada de todos os animais de um determinado rebanho ou manada, os animais encontram-se, igualmente, sob stress de transporte quando enviados de centros de criação para explorações para engorda. A profilaxia com antibióticos em larga escala é uma consequência.

Ao longo de várias décadas, os agentes antimicrobianos foram utilizados como promotores de crescimento, especialmente na produção de porcos e aves domésticas. A utilização de promotores de crescimento origina 4-5% de peso corporal adicional nos animais que os recebem, em comparação com os controlos. São utilizadas, deste modo, quantidades muito mais elevadas de antibióticos do que as utilizadas em aplicações médicas: na Dinamarca em 1994, foram utilizados 24 kg do glicopéptido vancomicina para terapia humana, enquanto que foram utilizados 24.000 kg do glicopéptido avoparcina semelhante em alimentação animal. De 1992 a 1996, a Austrália importou, em média, 582 kg de vancomicina por ano para objectivos médicos e 62.642 kg de avoparcina por ano para produção animal. A vancomicina e a avoparcina possuem o mesmo modo de acção; resistência a uma pode conferir resistência à outra. As bases biológicas do efeito de promoção do crescimento encontram-se longe de serem compreendidas; de acordo com os dados da Suécia, este efeito pode ser principalmente demonstrado sob condições sub-óptimas de desempenho animal. O facto da utilização de antibióticos na agricultura resultar na transferência de microrganismos resistentes a antibióticos e genes de resistência transferíveis para humanos 2 foram já discutidos há quase 30 anos, especialmente no que respeita a promotores do crescimento. Presentemente, foi referido que não deve haver qualquer utilização de antibióticos como promotores de crescimento se estes forem, igualmente, utilizados em quimioterapia humana e/ou se estes forem selectivos para resistência cruzada contra antibióticos utilizados em humanos.

Durante os últimos 10 anos, os métodos de identificação moleculares de agentes microbianos patogénicos e dos seus genes de resistência tornaram-se um instrumento poderoso em pesquisa epidemiológica e têm fornecido provas muito mais conclusivas da disseminação da resistência a antibiótico, da produção animal para os humanos. Duas questões são, presentemente, objecto de discussão no seio da comunidade cientifica e da agroindústria: promotores de crescimento antimicrobianos e utilização veterinária de fluoroquinolona. Têm sido, frequentemente, objecto de dúvida o facto das concentrações comparativamente baixas de promotores de crescimento promoverem a selecção de resistência a antibióticos, transferível. Existem, no entanto, provas convincentes provenientes de dois conjuntos de estudos. O fornecimento de oxitetraciclina a galinhas demonstrou seleccionar para a resistência à tetraciclina mediada por plasmídeo em E. coli em galinhas. Foi demonstrada a transferência de E. coli resistente à tetraciclina das galinhas para os trabalhadores de explorações agrícolas. Em alguns paises, a oxitetraciclina foi substituída como aditivo alimentar pelo antibiótico estreptotricina, nourseotricina. Este antibiótico foi utilizado, em todo o país, unicamente em alimentação animal. 3

Em 1985, foi detectada resistência (mediada por um gene da acetiltransferase da estreptotricina codificado por um transposão) em E. Coli, a partir de intestino de porco e em produtos cárneos. Cerca de 1990, a resistência à nourseotricina tinha-se estendido a E. coli da flora intestinal a partir dos criadores de porcos, das suas famílias, cidadãos das comunidades municipais e doentes com infecções do tracto urinário. Em 1987, o mesmo determinante de resistência foi detectado em outros agentes patogénicos entéricos, incluindo Shigella que ocorre apenas em humanos.

Com a emergência e disseminação da resistência ao glicopéptido, os Enterococci tornaram-se um significativo objecto de interesse. Os Enterococci colonizam os intestinos dos humanos e de outros animais e adquirem, facilmente, genes de resistência a antibióticos, transferindo-os. Durante os últimos 5 anos, foram registados enterococos entre os cinco principais agentes patogénicos nosocomiais microbianos. Apesar de ser menos patogénico do que E. faecalis, E. faecium tem despertado uma atenção acrescida devido ao seu desenvolvimento de resistência a glicopéptidos. Em enterococos existem três genótipos conhecidos de resistência a glicopéptidos, transferível, sendo o grupo do gene vanA o mais amplamente disseminado. Estudos demonstrando a selecção de resistência a glicopéptidos mediada por vanA, transferível, em E. faecium, pela utilização do glicopéptido avoparcina como um promotor de crescimento em produção animal, chamaram, novamente, a atenção para a utilização de agentes antimicrobianos como promotores do crescimento. E. faecium resistente a glicopéptidos (GREF) pode atingir facilmente humanos através de produtos cárneos e, consequentemente, foi isolado GREF a partir de espécimes fecais de humanos não-hospitalizados. Foi encontrada uma estrutura comum do grupo de 4 genes vanA em vários GREF com origem ecológica diferente (humana, alimentar e animal), indicando uma disseminação frequente do vanA entre diferentes estirpes e, igualmente, entre diferentes plasmideos conjugativos. A utilização ergotrópica da avoparcina foi suspensa nos países Europeus entre 1995 e 1997. Quando se investigou o GREF no final de 1994, o líquido de descongelação da totalidade das carcaças de aves domésticas revelou-se significativamente contaminado. No final de 1997, foram encontrados GREF num número comparativamente baixo, em apenas 25% das amostras investigadas. Paralelamente, verificou-se uma redução da presença fecal de GREF em humanos, na comunidade: 12% no final de 1994 e 3,3% no final de 1997. Estas descobertas realçam o papel potencial de um reservatório da resistência a glicopéptidos, transferível, em produção animal, na disseminação a humanos. Com a disponibilidade da combinação de estreptograminas quinupristina/dalfopristina, as estreptograminas tonaram-se uma alternativa importante no tratamento de infecções com GREF (não E. faecalis) .

Até ao ano passado, não existia qualquer utilização médica de estreptograminas em hospitais alemães. No entanto, foi verificada resistência a estreptograminas em GREF, tanto a partir de doentes como de animais. A resistência é mediada pelo gene satA codificando para uma transferase de acetilo de estreptogramina. A disseminação de satA foi, provavelmente, impulsionada pela utilização do antibiótico estreptogramina, virginiamicina, como promotor de crescimento, durante mais de 20 anos. 5

Foi descrita uma redução na sensibilidade à fluoroquinolona em Salmonella typhimurium, a qual corresponde ao tempo de utilização da fluoroquinolona em medicina veterinária. Isto foi especialmente observado no Reino Unido para a estirpe DT 104 de S. typhimurium. Apesar das MIC'S da ciprofloxacina para estes isolados (0,25-1,0 mg/L) se encontrarem ainda abaixo dos limites clinicos para fluoroquinolonas para a resistência a ciprofloxacina (4 mg/L), o fracasso clinico da ciprofloxacina no tratamento de infecções com S. typhimurium apresentando MIC'S elevadas causa preocupação no que respeita à Salmonella spp. entérica. A resistência à fluoroquinolona em microrganismos é principalmente devida a mutações nas enzimas alvo (girase, topoisomerase IV de ADN) e, consequentemente, dissemina-se de um modo clonal com estirpes microbianas em particular afectadas. As bactérias entéricas desenvolvem resistência à quinolona através da aquisição gradual de mutações em determinadas posições no centro activo das enzimas alvo. A acumulação adicional destas mutações pela Salmonella spp. entérica irá, muito provavelmente originar resistência à quinolona num nivel elevado.

Um outro agente patogénico intestinal que tem o seu reservatório em animais, consiste em Campylobacter spp. A Campylobacter resistente à fluroquinolona pode ser isolada a partir de infecções humanas, de amostras fecais de galinhas e a partir de carne de galinha. Têm sido descritas diferentes frequências de isolados de Campylobacter resistentes à quinolona, provenientes de casos humanos de diarreia, originários de várias partes do mundo. As Campylobacter spp. são, obviamente, policlonais (várias estirpes contidas na flora intestinal do homem e de animais), comparáveis com E. coli. 6

Apesar das técnicas de tipagem molecular actualmente disponíveis se encontrarem disponíveis para Campylobacter, muito provavelmente devido à policlonalidade, as estirpes de Campylobacter resistentes à quinolona não têm sido seguidas até aos rebanhos de animais. A situação global em termos de prevenção e regulação da utilização e licenciamento destes compostos varia extraordinariamente no mundo inteiro. Em países em vias desenvolvimento, os quais são responsáveis por cerca de 25% da produção mundial de carne, as políticas que regulam a utilização veterinária de antibióticos encontram-se pouco desenvolvidas ou ausentes. Na China, são utilizados micélios em bruto como promotores de crescimento animal. Os problemas causados pela utilização inadequada de antibióticos têm consequências para além do país de origem. Os produtos cárneos são vendidos no mundo inteiro e as populações microbianas desenvolvem-se independentemente dos limites geográficos. A utilização de agentes antimicrobianos como promotores do crescimento tem associado um risco incalculável. Como resulta evidente da emergência da resistência à estreptogramina em enterococos, um composto ou classe de compostos que é presentemente utilizada como um promotor de crescimento pode tornar-se, no futuro, importante para a quimioterapia humana.

Mecanismos de Resistência a Antibiótico em Microrganismo

Oral 0 tracto respiratório superior, incluindo o nariz, cavidade oral, nasofaringe e faringe contém uma ampla variedade de 7 microrganismos aeróbios e anaeróbios isentos de parede celular, Gram-positivos, Gram-negativos.

As populações de microflora oral não são estáticas. Estas variam em função da idade, condição hormonal, dieta e saúde global de um indivíduo. Para além disso são diariamente ingeridos ou inalados novos e diferentes micróbios. A composição exacta em termos de espécies irá variar entre indivíduos e, ao longo do tempo, no mesmo indivíduo. Podem ser cultivadas, aproximadamente, 300 ou mais espécies diferentes, a partir de apenas bolsas periodontais e podem ser recuperadas até 100 espécies, a partir de um único local.

Esses microcosmos microbianos fornecem uma excelente oportunidade para a transferência de genes de resistência a antibióticos. A flora microbiana normal do corpo humano actua como um reservatório para essas características de resistência. Foi demonstrada a permuta de genes entre espécies orais e urogenitais de microrganismos e entre microrganismos orais divergentes sob condições laboratoriais. A utilização profiláctica de antibióticos previamente a muitos processos dentários e para doenças periodontais ou infecções de abcesso oral que não evidenciaram necessitar de terapia com antibióticos, contribuem para o reservatório de resistência. As β-lactamas, tetraciclinas e metronidazole são os antibióticos mais frequentemente recomendados e receitados. Os macrólidos, clindamicina e fluoroquinolonas são raramente utilizados, enquanto que os aminoglicósidos não são normalmente recomendados. 8

Resistência a Antibióticos de Beta-Lactama A resistência enzimática aos antibióticos de beta-lactama é, frequentemente, devida a uma enzima, beta-lactamase, a qual hidrolisa amidas, amidinas e outras ligações entre carbono e azoto, inactivando o antibiótico. Foram identificadas mais de 190 beta-lactamases únicas, em microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos do tracto oral. A primeira beta-lactamase, num microrganismo oral comum, foi descrita num plasmídeo em Haemophilus influenzae, no inicio dos anos 1970. Este continha a beta-lactamase TEM-1 inicialmente descrita em E. coli. A enzima TEM-1 foi encontrada em H. parainfluenzae e H. paraphrohaemolyticus e pode ser encontrada em espécies comensais de Haemophilus. A beta-lactamase TEM-1 encontra-se normalmente associada com grandes plasmídeos conjugativos que são específicos para o género Haemophilus, o qual, igualmente, pode conter outros genes de resistência ao cloranfenicol, aminoglicósidos e tetraciclina.

Aproximadamente no mesmo periodo, Neisseria gonorrhoeae adquiriu a beta-lactamase TEM-1 em pequenos plasmídeos que podem ser mobilizados para outras estirpes, por transferência de plasmídeos para as estirpes. Estes encontram-se intimamente relacionados com um plasmídeo de H. Parainfluenzae, susceptível e com pequenos plasmídeos contendo beta-lactamase TEM de H. ducreyi e H. parainfluenzae. Foi colocada a hipótese de H. parainfluenzae poder ser a fonte ancestral mais provável para estes plasmídeos de beta-lactamase relacionados com TEM. Os plasmídeos deste grupo têm sido referidos periodicamente em Neisseria meningitidis, apesar de não terem sobrevivido isolados naturais para testes independentes. No entanto, os pequenos 9 plasmídeos contendo beta-lactamase de N. gonorrhoeae podem ser transferidos e mantidos em N. meningitidis por conjugação sob condições laboratoriais. A beta-lactamase TEM foi, igualmente, descrita em várias espécies comensais de Neisseria, encontrando-se, normalmente, em pequenos plasmideos geneticamente mais relacionados com o plasmideo RSF1010 de E. coli do que com o plasmideo gonocócico. Foram encontrados plasmideos semelhantes em Eikenella corrodens. Estes plasmideos semelhantes a RSF1010 podem conter genes que conferem resistência à sulfonamida ou à estreptomicina, isoladamente ou em combinação. Foram, igualmente, descritos plasmideos maiores de N. sicca multi-resistente, codificando para a resistência à tetraciclina, a vários aminoglicósidos e à beta-lactamases TEM. Isolados de Moraxella (Branhamella) catarrhalis multi-resistente, inicialmente referidos ao CDC para confirmação, foram anteriormente identificados como espécies comensais de Neisseria.

Foi descrita em H. influenzae uma segunda beta-lactamase ROB, num pequeno plasmideo que é praticamente idêntico a plasmideos contendo ROB que se encontram em vários agentes patogénicos microbianos estritamente animais, incluindo as espécies Actinobacillus e Pasteurella.

Mais recentemente, microrganismos Gram-negativos anaeróbios estritos, incluindo Bacteroides forsythus, Fusobacterium nucleatum, espécies de Prevotella, Porphyromonas asaccharolytica e espécies de Veillonella, demonstraram conter genes para β-lactamases. Foram apenas caracterizadas algumas enzimas e a posição genética (plasmideo vs. cromossoma) não foi, de um modo geral, determinada. 10 A resistência não-enzimática à penicilina em microrganismos naturalmente transformáveis (Haemophilus, Neisseria, Streptococcus) pode ser devida à substituição de partes dos genes codificando para proteínas de ligação da penicilina (PBP), os alvos da penicilina, por regiões correspondentes de espécies mais resistentes. Este mecanismo de resistência é menos comum do que é a resistência causada por beta-lactamases. Para N. meningitidis, estas regiões mais resistentes dos genes PBP encontram-se infimamente relacionadas com os genes de N. flavescens e N. cinera comensais. Um dos genes PBP, penA, demonstrou ser muito diferente, com 30 genes mosaico diferentes, encontrados entre os 78 isolados diferentes examinados. Os PBPs mosaicos em S. pneumoniae apresentam regiões de S. mitis, assim como de espécies estreptocócicas desconhecidas.

Um outro mecanismo de resistência não-enzimática, encontrado em S. aureus resistente à meticilina, consiste no gene mecA, um determinante genético que codifica para uma proteína adicional de ligação à penicilina de baixa afinidade, PBP2a, o qual se encontra num elemento de ADN com 30 a 40 kb que confere uma resistência intrínseca às beta-lactamas. Entre as 15 espécies diferentes de Staphylococcus pesquisadas para o gene mecA, 150 isolados de Staph. sciuri hibridaram com o gene. Uma vez que nem todos os Staph. sciuri são resistentes à penicilina, o homólogo de mecA Staph. sciuri pode desempenhar uma função fisiológica normal no seu hospedeiro natural não relacionada com a resistência à beta-lactama. 11

Resistência à tetraciclina

Foram descritos dezoito determinantes distinguíveis de resistência à tetraciclina o que indica, principalmente, dois mecanismos da resistência: efluxo e protecção de ribossomas. A distribuição dos diferentes determinantes Tet varia amplamente, o que se relaciona, em parte, com a facilidade da transferência de determinantes Tet particulares, entre vários isolados e géneros. 0 gene Tet B apresenta a mais ampla gama de hospedeiros entre os genes de efluxo de Gram-negativos e foi identificado em várias espécies orais. Tanto Actinomyces actinomycetemcomitans como Treponema denticola foram associados com doença periodontal. 0 determinante TetB encontra-se em plasmídeos conjugativos em espécies de Actinobacillus e de Haemophilus. 0 plasmídeo contendo tet (B) de A. actinomycetemcomitans era transferível para H. influenzae. 0 determinante TetB não era móvel no pequeno número de isolados de Moraxella e Treponema examinados.

Recentemente, foram encontrados os genes de Gram-positivos mediados por efluxo [tet (K) e tet (L) ] em alguns microrganismos Gram-negativos orais. A Haemophilus aphrophilus, isolada de doentes periodontais nos anos 1990, continha o gene tet (K). Alguns isolados de V. parvula demonstraram conter tet (L) ou tet (Q); no entanto, a maioria dos isolados examinados contém o gene tet (M). Os estreptococos orais podem conter múltiplos genes tet diferentes, tendo tet (M), tet (Q), tet (K) e tet (L) sido todos encontrados em estreptococos, isoladamente ou em combinação. Recentemente, foram encontrados outros genes de protecção ribossómica [tet (U) , tet (S) e tet (T) ] em enterococos. O Tet (S) foi encontrado em Streptococcus milleri e foram isolados estreptococos resistentes à tetraciclina que não contêm qualquer dos genes tet conhecidos. O Tet (M) , que produz uma proteína 12 associada aos ribossomas, encontra-se amplamente distribuído tanto em géneros Gram-positivos como Gram-negativos. 0 gene tet (Q) de protecção ribossómica foi inicialmente encontrado em Bacteroides do cólon e tem sido normalmente encontrado em espécies anaeróbias Gram-negativas que se encontram relacionadas com Bacteroides, tais como Prevotella. Alguns isolados de V. parvula demonstraram conter tet (Q); no entanto, a maioria dos isolados caracterizado contém tet (M). Mitsuokella e Capnocytophaga orais contêm, igualmente, tet (Q).

Outros Mecanismos de Resistência A resistência ao metronidazole foi descrita em microrganismos orais, mas a base genética não é conhecida. Em Bacteroides do cólon, foram descritos e sequenciados quatro genes, nimA, nimB, nimC e nimD. Estes encontram-se localizados quer no cromossoma, quer em vários plasmídeos, conferindo uma gama de resistência. Os genes nim codificam provavelmente para uma redutase do 5-nitroimidazole que reduz enzimaticamente 5-nitroimidazole a um derivado 5-amino.

Foram caracterizadas enzimas que acetilam, fosforilam ou adenilam aminoglicósidos em S. pneumoniae, outros estreptococos, estafilococos e, mais recentemente, em espécies comensais de Neisseria e de Haemophilus. Um isolado de Campylobacter ochraceus demonstrou ser resistente a aminoglicósidos, cloranfenicol e tetraciclina.

Isolados precoces de S. pneumoniae resistente à eritromicina continham a classe Erm B de metilases de ARNr, que 13 modifica um único resíduo de adenina no ARN 23S, conferindo resistência a macrólidos, lincosamidas e estreptogramina B. As metilases de ARNr foram identificadas em A. actinomycetemcomitans e Campylobacter rectus. Em ambas as espécies, as metilases de ARNr encontram-se associadas com elementos conjugativos que podem ser transferidos para Enterococcus faecalis e a partir de A. actinomycetemcomitans para H. influenzae. Muitos outros microrganismos orais foram descritos como sendo resistentes à eritromicina ou à clindamicina. OS microrganismos que constituem a flora oral são reservatórios de características importantes de resistência a antibióticos. A sua emergência reflecte a utilização excessiva e a utilização indevida de antibióticos e o seu potencial para a transferência destas características para outras espécies mais patogénicas.

Utilização de Antibióticos no Controlo de Doenças Vegetais

Uma ampla variedade de culturas de plantas comestíveis e plantas ornamentais é susceptível a doenças causadas por microrganismos. Nos anos 1950, imediatamente após a introdução de antibióticos na medicina humana, foi reconhecido o potencial destes "fármacos milagrosos" para controlar doenças de plantas. Infelizmente, logo que a emergência da resistência a antibióticos depreciou o milagre em contexto clínico, a resistência limitou, igualmente, o valor dos antibióticos na protecção de colheitas. Nos últimos anos, a utilização de antibióticos em plantas e o seu impacto potencial na saúde 14 humana, foi observada em vários paises uma emergência de resistências. A Resistência à Estreptomicina Ocorre em Agentes Patogénicos Vegetais

Os estudos não revelaram a resistência à oxitetraciclina em microrganismos patogénicos para plantas mas identificaram determinantes de resistência à tetraciclina em microrganismos não-patogénicos de pomar. Foram descritos dois tipos geneticamente distintos de resistência à estreptomicina: uma mutação pontual no gene cromossómico rpsL, que impede a estreptomicina de se ligar ao seu alvo ribossómico (MIC> 1.000 mg/mL); ou inactivação da estreptomicina pela fosfotransferase, uma enzima codificada por strA e strB (MIC 500-750 mg/mL) . Os genes strA e strB encontram-se, normalmente, presentes em elementos genéticos móveis e foram identificados em, pelo menos, 17 microrganismos ambientais e clínicos que colonizam nichos diversos.

Uma vez que os antibióticos se encontram entre os pesticidas mais caros utilizados por produtores de frutos e hortaliças e que a sua eficácia biológica é limitada, muitos produtores utilizam sistemas de previsão de doença com base na meteorologia, para assegurar que os antibióticos são aplicados apenas quando for provável que estes apresentem o máximo de eficácia. Os produtores podem, igualmente, limitar a utilização de antibiótico plantando variedades resistentes às doenças e, em alguns casos, utilizando controlo biológico (aplicação de microrganismos saprofíticos que são antagónicos para os microrganismos patogénicos). Apesar destes esforços para reduzir 15 a dependência do produtor em relação aos antibióticos, estes produtos químicos permanecem uma parte integrante do controlo de doenças, especialmente para a produção de maçã, pêra, nectarina e pêssego.

Aspectos Especiais da Utilização de Antibiótico em Plantas

Apesar da utilização de antibióticos em plantas ser insignificante em relação à utilização total, a aplicação de antibióticos em agroecossistemas apresenta circunstâncias únicas que podem ter influência sobre o aumento e a persistência de genes de resistência no ambiente.

Em regiões de produção de maçã, pêra, nectarina ou pêssego de elevada densidade, são aplicados antibióticos em centenas de hectares de pomares praticamente contíguos. A década passada testemunhou um aumento dramático na plantação de variedades e porta-enxertos de maçã que são susceptíveis à doença microbiana devastadora, fogo bacteriano. Isto criou uma situação análoga aos contextos clínicos em que os doentes imunitariamente comprometidos são alojados em condições de sobrelotação contextos associados com a proliferação e a disseminação de genes de resistência a antibiótico.

Em segundo lugar, a pureza dos antibióticos utilizados na protecção de colheitas é desconhecida. Os reagentes e os antibióticos de qualidade veterinária demonstraram conter genes de resistência a antibióticos da Streptomyces spp produtora. Os antibióticos de qualidade vegetal não serão, provavelmente, mais puros do que os utilizados para tratar animais e podem, por si, ser uma origem de genes de resistência a antibióticos em 16 agroecosistemas. Os genes que foram amplificados a partir de antibióticos, otrA e aphE, são diferentes dos genes de resistência strA e strB que foram descritos em microrganismos associados a plantas. Deste modo, pode suceder que os antibióticos de qualidade vegetal sejam uma origem potencial de genes de resistência no ambiente, mas não se encontrem, necessariamente, presentes e activos em microrganismos patogénicos para plantas. A evolução dos microrganismos resistentes a antibióticos está a ultrapassar a descoberta de novos produtos antimicrobianos. O Papel das Concentrações Selectivas de Antibiótico na Evolução da Resistência Antimicrobiana

Um único gene codificando a beta-lactamase TEM-1 comum (ou TEM-2), hidrolizando a ampicilina, foi modificado de diferentes formas de modo a que presentemente a enzima seja já capaz de inactivar a terceira geração de cefalosporinas ou monobactamas. As modificações num gene codificando uma proteína de ligação à penicilina (PBP2) em Streptococcus pneumoniae provocaram a terrível ameaça da resistência à beta-lactama no agente patogénico microbiano mais comum no tracto respiratório. Quando os "novos" genes TEM ou PBP envolvidos na resistência foram sequenciados, foi frequentemente determinado que se encontravam presentes no gene várias mutações, sugerindo que tivesse ocorrido uma evolução críptica. Este facto implica que cada um dos eventos mutacionais "prévios" foi, de facto, seleccionado e que o enriquecimento resultante do clone microbiano que os contém favoreceu o aparecimento de novas mutações 17 seleccionáveis. Na maioria dos casos, os testes convencionais de susceptibilidade aos antibióticos, aumentando a concentração minima inibitória (MIC) do organismo apenas num valor muito modesto, não permitiram detectar mutações precoces. Dessa forma, a utilização do antibiótico de selecção não foi descontinuada e a mutação foi seleccionada. Não só os clinicos, como, igualmente, os microbiólogos negligenciaram frequentemente a importância da "resistência de baixo nível", uma vez que foi assumido que os mutantes apresentando MICs baixas não eram seleccionáveis, tendo em consideração as elevadas concentrações de antibiótico atingíveis durante os tratamentos.

Em qualquer dosagem, os antibióticos criam gradientes de concentração, resultantes de factores farmacocinéticos, tais como a taxa de eliminação da distribuição no tecido. Muito provavelmente, as populações microbianas estão a enfrentar uma ampla variedade de concentrações de antibiótico após cada administração do fármaco. Por outro lado, a variabilidade espontânea das populações microbianas pode fornecer uma ampla possibilidade de variantes resistentes potencialmente seleccionáveis. Qual é a concentração de antibiótico capaz de seleccionar uma destas variantes resistentes? A resposta é simples: qualquer concentração de antibiótico é potencialmente selectiva para uma variante resistente, se for capaz inibir a população susceptível mas não a variante contendo um mecanismo de resistência. Por outras palavras, uma concentração de antibiótico selectiva (SAC) é tal, se exceder a concentração mínima inibitória (MIC) da população susceptível, mas não a da correspondente (mesmo se muito próxima) à população 18 variante. Se as MICs tanto das populações susceptíveis como das variantes forem ultrapassadas, não se verifica qualquer selecção, sendo igualmente verdadeiro se a concentração de antibiótico for inferior às MICs de ambas as populações. Consequentemente, a selecção de uma variante em particular pode ocorrer numa gama muito limitada de concentrações. A variação continua de concentrações de antibiótico pode apresentar semelhanças com um dispositivo receptor que "selecciona" uma emissão em particular numa determinada frequência de rádio. Abaixo ou Acima dessa frequência, a emissão é perdida. 0 "vale" entre as MICs das populações susceptiveis e das variantes resistentes é "o sinal de frequência" reconhecido pela SAC.

Devido à competição natural de populações microbianas num habitat fechado, o "sinal" é imediatamente amplificado. 0 mutante adaptado apresenta uma velocidade de reprodução intensiva, preferencial, às custas da população mais susceptivel, originando uma modificação quantitativa da cultura, como pode ser previsto pela 'selecção periódica'. A via acima proposta sobre o efeito das SACs foi testada em laboratório, utilizando culturas mistas de populações microbianas susceptiveis e resistentes. Uma cultura densa de uma estirpe de Escherichia coli contendo uma beta-lactamase TEM-1 selvagem foi misturada com os seus derivados homogénicos (obtidos por mutagénese dirigida) contendo as beta-lactamases TEM-12 (uma única substituição de aminoácido em relação à enzima TEM-1) e TEM-10 (uma única substituição de aminoácido em relação a TEM-12). As proporções relativas das três estirpes foram 90:9:1 da população total. A mistura foi incubada durante 4 h 19 com diferentes concentrações de antibiótico e a composição da população total foi, então, analisada por subcultura. Numa concentração de cefotaxima muito baixa, 0,008 \iq/mL, TEM-12 (MIC convencional=0,06 μρ/ιτΛ) iniciou a ser seleccionado em relação a TEM-1 (MIC=0,03 μρ/ιτΛ) , atingindo uma selecção máxima (cerca de 80% da população total) a 0,03 μρ/ιιϋΐ e foi, novamente, substituído por TEM-1 a 0,06 μρ/ιτΛ. Neste ponto, TEM-1 foi substituído por TEM-10 (MIC=0,25 μρ/πϋΐ) a 0,12 μρ/πΛ. Como previsto, TEM-12 foi seleccionado apenas dentro de uma estreita gama de concentrações. Consequentemente, as baixas concentrações de antibiótico seleccionam de um modo eficiente mutantes resistentes de baixo nível. Estando esta população enriquecida, esta pode servir como uma nova fonte de variantes genéticas secundárias (por exemplo, TEM-10 pode dar a origem a TEM-12), que foram posteriormente seleccionadas em relação à população predominante em novos (mais elevados) intervalos de concentração. Foram obtidos resultados semelhantes quando populações mistas de Streptococcus pneumoniae susceptível e resistente foram desafiadas com diferentes concentrações baixas de beta-lactama: foram seleccionadas estirpes resistentes intermédias a partir da população susceptível predominante, apenas em concentrações discretas de baixo nível. A selecção com concentrações elevadas de antibiótico dará apenas origem a variantes resistentes de nível elevado. No entanto, ao longo dos tratamentos, as concentrações de baixo nível, em particular nos designados fármacos de actuação prolongada, ocorrem com uma frequência mais elevada do que as de nível elevado, tanto em termos de tempo (duração) como de espaço (diferentes localizações colonizadas no corpo humano) e, consequentemente, o seu poder selectivo total é certamente 20 superior. Qualquer tratamento produz uma concentração de antibiótico de baixo nivel potencialmente selectiva para o microrganismo resistente. A microbiologia tem estado mais preocupada com os mecanismos de resistência do que com a genética de populações ou os processos evolutivos que originam o aparecimento e disseminação de resistência antimicrobiana. Chegou o momento para propor produtos evolutivos, servindo medidas suportadas cientificamente de contra os danos na saúde ambiental produzidos pelos antibióticos. A população resistente (R) será eficientemente seleccionada em relação à susceptivel (S) numa gama curta de concentrações selectivas (neste caso, 0,1-0,2 μg/mL). As concentrações abaixo ou acima desta gama são não-selectivas. Uma baixa concentração (0,01 μρ/ηϋΐ) irá seleccionar tanto populações S como R; uma concentração mais elevada (2 μρ/ΐΓύΟ) irá "contra-seleccionar" tanto S como R. Em ambos os casos, o poder selectivo das populações R é muito baixo A selecção tem lugar em concentrações particulares (concentrações de antibiótico selectivas ou SACS).

Tratamento de Mastites

Staphylococcus aureus, é um importante agente patogénico humano e animal que causa infecção superficial, dérmica, dos tecidos moles, endocardite e bacteremia com a formação de abscesso metastático e várias doenças mediadas por toxinas incluindo gastroenterite, sindrome da pele escaldada e sindrome 21 do choque tóxico. Este microrganismo é, igualmente, a causa mais comum da mastite bovina que é uma doença que causa perdas importantes na produção de leite. São, igualmente, isolados coliformes (Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp citrobacter spp) , Streptococci (S. agalactiae, S. dysgalactia, S. uberis, enterococos) e Pseudomonas spp, a partir da mastite bovina. É geralmente aceite que estes agentes patogénico são capazes de produzir muitos factores de virulência. S. aureus é capaz de produzir uma gama de toxinas e hemolisinas. Durante a infecção da glândula mamária, S. aureus adere ao epitélio glandular, sendo seguida por corrosão, invasão local e uma reacção inflamatória exudativa difusa, acompanhada por sintomas sistémicos.

Apesar do progresso na terapia antimicrobiana, o tratamento e prevenção da infecção estafilocócica permanece um problema clinico. Os antibióticos de β-lactama são as melhores armas contra os estafilococos. No entanto, a utilização generalizada de antibióticos de β-lactama têm originado um aumento dramático de estirpes de S. aureus produtoras de β-lactamase. Esta bactéria, por exemplo, é capaz de produzir quatro tipos (A, B, C e D) de enzimas hidroliticas de β-lactama (β-lactamase), as quais permitem que esta seja resistente a antibióticos de β-lactama. Presentemente, 80 a 90% dos S. aureus isolados em hospitais e cerca de 75% dos isolados de infecções intramamárias bovinas produzem β-lactamase. Esta enzima contribui para a patogénese da infecção de S. aureus e reduz a eficácia da profilaxia com antibióticos. Os bovinos demonstram uma fraca resposta clinica e bacteriológica ao antibiótico padrão, na mastite estafilocócica. Quando a infecção aguda parece responder a terapia com antibióticos, pode ocorrer a doença crónica com 22 recaídas, caracterizada por longos períodos de quiescência entre episódios de doença aguda. Este fenómeno torna difícil o controlo das infecções com S. aureus, existindo informação limitada sobre a possível defesa do hospedeiro contra este agente patogénico, durante a infecção.

Os produtos e os métodos da presente invenção envolvem compostos substancialmente não-tóxicos disponíveis em grandes quantidades através de métodos sintéticos ou recombinantes. A LF e a LFC apresentam actividade microbicida ou bacteriostática quando administrado ou aplicado como o único agente antimicrobiano. Esses compostos, idealmente, são úteis em terapias de combinação com outros agentes antimicrobianos, em particular quando são fornecidos efeitos de potenciação. A lactoferrina (LF) tem 80 kDa e a lactoferricina (LFC) é um hidrolisado de pepsina da LF. A lactoferrina é uma glicoproteína que se liga ao ferro encontrada no leite de muitas espécies incluindo humana e bovina. Esta encontra-se, igualmente, presente em fluidos exócrinos tais como a bílis, a saliva e as lágrimas. Tanto as células epiteliais mamárias como as polimorfonuleares podem libertar esta proteína. A migração de leucócitos para o leite durante a infecção é acompanhada por um aumento espectacular da concentração da LF no leite. Tem sido considerado que a presença da LF em grânulos específicos dos neutrófilos e a sua libertação na reacção inflamatória desempenha um papel na imunomodulação. A LF demonstrou, igualmente, ligar-se ao ADN, o que pode originar a activação transcricional de diversas moléculas. Muitos relatos identificam a LF como um factor importante na defesa do hospedeiro contra infecção e inflamação excessiva. Esta proteína na sua forma limitada em ferro, demonstrou inibir o crescimento de muitos 23 microrganismos patogénicos. Foi demonstrada a capacidade da LF promover o crescimento de Bifidobacterium spp., independentemente do seu nivel de ferro. A ligação do ferro nos meios é o mecanismo melhor conhecido, pelo qual a LF induz inibição do crescimento do microrganismo. A bacteriostase de microrganismos Gram-negativos mediada por LF pode, igualmente, envolver a sua interacção com o lipido A de lipopolissacáridos (LPS) e com proteínas formadoras de poros (porinas) da membrana externa alterando a integridade e a permeabilidade da parede microbiana. Foi sugerido que a ligação da LF ao ácido lipoteicóico aniónico de Staphylococcus epidermidis reduzia a carga negativa permitindo uma maior acessibilidade da lisozima ao peptidoglicano. Não foram descritos outros mecanismos antimicrobianos da LF ou LFC em agentes patogénicos Gram positivos da mastite bovina. 0 documento WO 98/40401 reivindica composições para o tratamento de infecções e superar a resistência, utilizando péptidos catiónicos tais como lactoferricina B, isoladamente ou em combinação com antibióticos. O documento EP 629347 divulga a utilização de hidrolizado de lactoferrina e, pelo menos, um antibiótico, para o tratamento contra bactérias leveduras e fungos. A relação entre microrganismo, hospedeiro e antibiótico pode ser muito complexa. Um antibiótico deve combinar uma boa actividade antimicrobiana com a capacidade para trabalhar em associação com os sistemas de defesa do hospedeiro. No entanto, a determinação in vitro da susceptibilidade do microrganismo a um antibiótico não tem em consideração as suas interacções com as defesas do hospedeiro e os seus parâmetros farmacodinâmicos, tais como o efeito pós-antibiótico no microrganismo. O objectivo do presente trabalho foi investigar os efeitos fisiológicos da apo-lactoferrina bovina ou do seu hidrolizado de pepsina 24 (lactoferricina) isoladamente ou em combinação com antibióticos tradicionais sobre estirpes microbianas isoladas da glândula mamária bovina, tanto Gram-positivas (S. aureus) como Gram-negativas (E. coli e K. pneumioniae) . Os resultados indicam que lactoferrina pode afectar as células estafilocócicas e aumentar a actividade inibitória de um antibiótico comum em vários graus.

Seria altamente desejável a disponibilidade de um meio para reverter a resistência a antibióticos de microrganismos resistentes a antibióticos, no tratamento e/ou na prevenção de infecções causadas por estes microrganismos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objectivo da presente invenção consiste em fornecer meios para contrariar o desenvolvimento e de reverter a resistência a antibióticos de microrganismos resistentes a antibióticos, no tratamento e/ou na prevenção de infecção causada por estes microrganismos.

Um objectivo da presente invenção consiste em fornecer formulações de fármacos eficientes, de forma a tratar e prevenir de doenças infecciosas causadas por microrganismos patogénicos resistentes a antibióticos em animais, incluindo o ser humano. Um outro objectivo consiste em fornecer uma nova utilização para tratar e prevenir doenças microbianas e potenciar a eficácia de antibióticos, incluindo estados associados com estas ou resultantes destas, num indivíduo, pela utilização de LF ou LFC, isoladamente ou em combinação com um antibiótico. A invenção é baseada na descoberta que LF e LFC apresentam efeitos microbicidas e inibitórios do crescimento directos sobre alguns 25 microrganismos resistentes a antibióticos e que LF e LFC apresentam, inesperadamente, a capacidade de reverter a resistência a antibióticos de microrganismos resistentes a antibióticos. A invenção é baseada, igualmente, na descoberta que LF e LFC, em combinação com antibióticos, fornecem efeitos microbicidas/inibitórios do crescimento, aditivos e sinergísticos, quando utilizado simultaneamente.

De acordo com um aspecto da invenção, é fornecida uma utilização para tratamento de uma infecção microbiana resistente a antibióticos que compreende o passo de administração de LF ou LFC, numa quantidade suficiente para a eficácia terapêutica, a um indivíduo que sofra de uma infecção microbiana resistente a antibióticos. Esta pode ser praticada quando qualquer espécie microbiana resistente a antibióticos susceptível a LF ou a LFC se encontra envolvida na infecção.

Um segundo aspecto da invenção fornece um tratamento de uma infecção microbiana resistente a antibióticos pela administração simultânea de LF ou LFC, numa quantidade suficiente para uma eficácia terapêutica em combinação e de um ou mais antibióticos, a microrganismos resistentes a antibióticos que não são susceptiveis aos efeitos directos microbicidas/inibitórios do crescimento de LF ou LFC, a um indivíduo que apresenta uma infecção microbiana resistente a antibióticos.

Para a administração simultânea com antibióticos, a LF ou LFC destina-se a ser administrada numa quantidade eficaz no aumento da susceptibilidade ao antibiótico de uma espécie microbiana resistente ao antibiótico envolvida na infecção, ou a potenciar os efeitos do antibiótico. A LF ou a LFC destina-se, igualmente, a ser administrada numa quantidade eficaz para 26 reverter a resistência a antibióticos de espécies microbianas resistentes a antibióticos envolvidas na infecção. A LF ou LFC e os antibióticos destinam-se, cada um, a serem administrados em quantidades que seriam suficientes para a eficácia terapêutica na administração isolada ou podem ser destinados a serem administrados em quantidades inferiores às terapêuticas.

Um outro aspecto da invenção fornece um tratamento de infecções microbianas resistentes a antibióticos com LF ou LFC e um ou mais antibióticos, em quantidades sinergísticas.

Para além disso, a invenção fornece um método de eliminação ou inibição do crescimento de microrganismos resistentes a antibióticos, compreendendo fazer contactar o microrganismo com a LF ou LFC, isoladamente, ou em combinação com outro agente antimicrobiano. Este método pode ser praticado em várias utilizações in vitro tais como a utilização na preparação de alimentos, descontaminação de fluidos e superfícies ou para esterilizar equipamento cirúrgico e outro equipamento médico e dispositivos implantáveis, incluindo articulações protéticas. Estes métodos podem, em conformidade, ser utilizados na esterilização in situ de dispositivos invasivos internos tais como linhas intravenosas e cateteres, que são, frequentemente, focos de infecção ou na esterilização de meios de cultura in vitro de tecidos.

De acordo com a presente invenção, é fornecido um método de prevenção e/ou tratamento de infecções causadas por microrganismos resistentes a antibióticos ou de uma superfície, compreendendo o tratamento de uma superfície com uma quantidade eficiente de LF ou LFC, isoladamente ou em combinação com um antibiótico, em que a quantidade de LF ou LFC é eficaz para 27 reverter substancialmente a resistência dos microrganismos resistentes a antibióticos.

Um aspecto da invenção fornece um método de tratamento de bactérias resistentes a antibióticos, afectando, directamente, a expressão génica e a secreção de exoproteinas pela LF ou LFC, isoladamente ou em combinação com um ou mais antibióticos.

Um outro aspecto da invenção consiste em fornecer um método de desinfecção e/ou prevenção da infecção causada por microrganismos resistentes a antibióticos.

De acordo com a presente invenção é, igualmente, fornecida uma composição para a prevenção e/ou o tratamento de infecções causadas por microrganismos resistentes a antibióticos de uma superfície ou um indivíduo, compreendendo uma quantidade eficiente de LF ou LFC, em combinação com um antibiótico seleccionado de ampicilina, cefazolina, neomicina e novobiocina e penincilina, em associação com um veículo aceitável, em que a quantidade de LF ou LFC é eficaz para reverter substancialmente a resistência dos microrganismos resistentes a antibióticos.

De acordo com a presente invenção, é fornecida a utilização de LF ou LFC, como uma composição, como acima definido, para o tratamento, desinfecção e/ou prevenção de infecções causadas por microrganismos resistentes a antibióticos ou para a produção de um medicamento para utilização anteriormente citada. 0 microrganismo resistente a antibióticos pode ser seleccionado do grupo consistindo em Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Enterococcus, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Listeria, 28

Erysipelothrix, Propionibacterium, Eubacterium, Corynobacterium, Mycoplasma, Ureaplasma, Streptomyces, Haemophilus, Nesseria, Eikenellãf Moraxellus, Actinobacillus, Pasteurella, Bacteroides, Fusomicroorganism, Prevotella, Porphyromonas, Veillonella, Treponema, Mitsuokella, Capnocytophaga, Campylobacter, Klebsiella, Shigella, Proteus e Vibriae.

Os antibióticos podem ser seleccionados do grupo consistindo em aminoglicósidos, vancomicina, rifampina, lincomicina, cloranfenicol e o fluoroquinol, penicilina, beta-lactamas, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, mezlocilina, nafcilina, oxacilina, piperacilina, ticarcilina, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefuroxima, cefalexina, cefalotina, imipenem, aztreonam, gentamicina, netilmicina, tobramicina, tetraciclinas, sulfonamidas, macrólidos, eritromicina, claritromicina, azitromicina, polimixina B, ceftiofur, cefazolina, cefapirina e clindamicina.

De acordo com a presente invenção, é fornecida uma composição para contrariar o desenvolvimento de estirpes de bactérias resistentes a antibióticos num indivíduo ou em superfícies, com uma quantidade eficiente de LF ou LFC isoladamente ou em combinação com antibiótico, em que a quantidade de LF ou LFC afecta a indução do gene de resistência. São abaixo definidos os termos seguintes, para o objectivo da presente invenção. 0 termo "superfície" pretende significar qualquer superfície incluindo, sem restrição, uma parede, um chão, um tecto, um dispositivo médico, um elemento de mobiliário médico, um dispositivo cirúrgico, uma prótese, uma órtese, um contentor 29 de distribuição de fluido biológico, (e.g. saco de sangue, frasco de gotas oftálmicas), um dispositivo de processamento de alimentos, um dispositivo colector de alimentos e um tubo. 0 termo "indivíduo" pretende significar um humano, um animal, ou uma planta.

No que respeita à lactoferrina ou à lactoferricina, o termo "quantidade eficaz" pretende significar uma quantidade eficaz para aumentar a susceptibilidade do microrganismo ao antibiótico e/ou ao agente antimicrobiano, quando utilizada em combinação com um antibiótico e/ou um agente antimicrobiano contra microrganismos resistentes a antibióticos e, no que respeita a um antibiótico ou a outro agente antimicrobiano, significa, pelo menos, uma quantidade do antibiótico ou do agente antimicrobiano que produz efeitos microbicidas ou inibitórios do crescimento, quando administrada em conjunto com aquela quantidade de lactoferrina ou de lactoferricina. A lactoferrina ou lactoferricina ou o antibiótico ou outros agentes antimicrobianos, ou ambos, podem ser administrados numa quantidade abaixo do nivel necessário para a eficácia monoterapêutica contra microrganismos resistentes a antibióticos. 0 termo "veiculo farmaceuticamente aceitável" pretende significar qualquer veiculo adequado para a administração a um indivíduo por qualquer via de administração, tal como intravenosa, intramamária, subcutânea, intraperitoneal, tópica, intraocular, intratraqueal, transpulmonar ou via transdérmica. Esses veiculos incluem, sem limitação, um meio aquoso, um meio lipidico, uma solução em aerossol, um fármaco nebulizado, um fluido de irrigação, uma solução de lavagem (para, e.g., lavagem 30 ou feridas), uma solução fisiológica (e.g., solução salina a 0,9%, gotas auriculares, gotas oftálmicas, tampão citrato salino, tampão fosfato salino), um sistema de distribuição de longa duração (e.g. lipossomas), um fluido biológico (e.g. sangue, soro, plasma), uma mistura alimentar, um liquido alimentar (e.g. leite, água, água mineral, água gaseificada), um diluente farmacêutico aceitável ou adjuvante. O termo "agente antimicrobiano" pretende significar qualquer agente incluindo, sem limitação, um antibiótico, uma bacteriocina, um lantibiótico, um desinfectante, uma substância inibitória do crescimento aceitável, não-antibiótica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 ilustra o crescimento de S. aureus ATCC 25923 em MHB, na presença de lactoferrina (LF) ou lactoferricina (LFC) bovina, isoladamente ou em combinação com penicilina G (PG); A FIG. 2 ilustra o crescimento de S. aureus PC 1 em MHB, na presença de lactoferrina (LF) ou lactoferricina (LFC) bovina, isoladamente ou em combinação com penicilina G (PG; A FIG. 3 ilustra os efeitos da lactoferrina (LF) , isoladamente ou em combinação com eritromicina, sobre o crescimento de S. aureus SHY97-3906 após 18 h de incubação; A FIG. 4 ilustra os efeitos da lactoferrina, isoladamente ou em combinação com neomicina, sobre o crescimento de Escherichia coli SHY97-3923, após 18 h de incubação; 31 A FIG. 5 ilustra os efeitos da lactoferricina (LFC), isoladamente ou em combinação com cefazolina ou neomicina, sobre o crescimento de Escherichia coli SHY97-3923; A FIG. 6 ilustra o efeito inibitório do crescimento da lactoferrina, isoladamente ou em combinação com diferentes concentrações de neomicina em Klebsiella pneumoniae SHY99-723; A FIG. 7 ilustra os efeitos da lactoferricina (LFC), isoladamente ou em combinação com cefazolina ou neomicina em Klebsiella pneumoniae SHY99-723; A FIG. 8 ilustra micrografias de transmissão electrónica de secções finas de S. aureus ATCC 25923 cultivada em placas de MHA e marcada com ferritina policatiónica. As células não tratadas de controlo foram obtidas após cultura em meios isentos de fármaco (A) . As células foram expostas a penicilina G 0,0078 μρ/πΛ (B) ou lactoferrina bovina 9,1 μρ/rnL (C) , isoladamente ou numa combinação das respectivas concentrações de ambos os compostos (D) ; A FIG. 9 ilustra micrografias de transmissão electrónica de secções finas de S. aureus SHY97-4320 cultivada em placas de MHA e marcada com ferritina policatiónica. As células não tratadas de controlo foram obtidas após cultura em meios isentos de

fármaco (A) . As células foram expostas a penicilina G 8 μρ/rnL (B) ou lactoferrina bovina 1 mg/mL (C) , isoladamente ou numa combinação das respectivas concentrações de ambos os compostos (D) ; 32 A FIG. 10 ilustra micrografias de transmissão electrónica de secções finas de S. aureus PC 1 cultivada durante 4 h em MHB e marcada com ferritina policatiónica. As células não tratadas de controlo foram obtidas após cultura em meios isentos de fármaco (A) . As células foram expostas a penicilina G 8 μρ/mL (B) ou lactoferricina bovina 16 μρ/mL (C) , isoladamente ou numa combinação das respectivas concentrações de ambos os compostos (D) ; (Barra, 1 μιη) ; A FIG. 11 ilustra micrografias de transmissão electrónica de secções finas de S. aureus PC 1 cultivada durante 4 h em MHB e marcada com ferritina policatiónica. As células não tratadas de controlo foram obtidas após cultura em meios isentos de fármaco (A) . As células foram expostas a penicilina G 8 μρ/mL (B) ou lactoferricina bovina 16 μρ/mL (C) , isoladamente ou numa combinação das respectivas concentrações de ambos os compostos (D); (Barra, 0,5 μιη) ; A FIG. 12 mostra micrografias de transmissão electrónica de secções finas de S. aureus SHY97-4320 após 4 h de crescimento em MHB, marcada com ferritina policatiónica e aglutinina de gérmen de trigo-ouro. As células foram cultivadas com lactoferrina bovina 1 mg/mL em combinação com penicilina G (8 μρ/mL) (A,

Barra = 1 μιη; B, Barra = 0,25 μιη) . O controlo é mostrado em C (Barra = 0,25 μιη) ; A FIG. 13 mostra a actividade da β-lactamase medida como Δθϋ486 nm/min nas estirpes SHY97-4320 e PC 1 de S. aureus, após 4 h de incubação a 37 °C com penicilina G 8 μρ/mL (PG) e 33 lactoferrina bovina 1 mg/mL (LF) , isoladamente ou em combinação. Os valores são médias de três experiências independentes; A FIG. 14 mostra a actividade da β-lactamase da estirpe PC de S. aureus 1, após 4- e 22 h de incubação com penicilina G (PG, 8 μρ/ιτΛ) e lactof erricina bovina (LFC, 32 μρ/ηϋΐ ou 64 μρ/ιτΛ) , isoladamente ou em combinação. Os valores são médias de três experiências independentes; A FIG. 15 mostra a actividade da β-lactamase medida como AOD486 nm/min nas estirpes SHY97-4320 (A) e PC 1 (B) de S. aureus após 4 h e 22 h de incubação a 37 °C com penicilina G 8 μρ/ιτΛ (PG) e lactoferrina humana 1 mg/mL (LF), isoladamente ou em combinação (PG + LF). Os valores são médias de três experiências independentes; A FIG. 16 mostra a actividade da β-lactamase medida como AOD486 nm/rnin nas estirpes SHY97-4320 de S. aureus, após 30 e 60 min de pré-incubação com lactoferrina bovina 1 mg/mL e expostas a penicilina G 8 μρ/mL (PG) durante 4 h de incubação a 37 °C. Os valores são médias de três experiências independentes; e A FIG. 17 mostra SDS-PAGE de proteínas de células inteiras de S. aureus SHY97-4320 após 4 h de crescimento em MHB (linha 1), MHB + penicilina G 8 μρ/mL (linha 2), MHB + lactoferrina 1 mg/mL (linha 3) e MHB + combinação das mesmas concentrações de ambos os compostos (linha 4) . Os marcadores de massa molecular encontram-se indicados à esquerda. 34

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se às utilizações de lactoferrina (LF) ou lactoferricina (LFC) como agentes antimicrobianos, isoladamente ou em combinação com antibiótico, para tratar infecções causadas por microrganismo, resistentes a antibióticos. Os métodos e os materiais descritos na invenção são novos e não eram conhecidos dos especialistas na técnica. 0 método e os materiais são utilizados para tratar indivíduos que sofrem de infecções microbianas resistentes a antibióticos. Muito particularmente, a presente invenção refere-se a produtos de potenciação da eficácia clinica de antibióticos, tanto para tratar como para prevenir doenças infecciosas causadas por microrganismos patogénicos resistentes a antibióticos. Os produtos da presente invenção contêm lactoferrina e a sua forma metabolizada, a lactoferricina e apresentam um efeito potenciador notável sobre a eficácia de antibióticos.

Numerosos aspectos adicionais e vantagens da invenção tornar-se-ão evidentes aos especialistas na técnica tendo em consideração a seguinte descrição detalhada da invenção que presentemente descreve as suas formas de realização preferidas. A presente invenção refere-se, igualmente, a métodos de prevenção e tratamento de doenças microbianas em mamíferos, incluindo seres humanos e plantas e desinfecção de dispositivos cirúrgicos, próteses ou equipamento de processamento alimentar. A infecção microbiana resistente a antibióticos, aqui como utilizado, abrange estados associados com ou resultantes de infecções microbianas resistentes a antibióticos. Estes estados incluem sepsia resistente a antibióticos e um ou mais dos estados associados com esta, incluindo bacteremia, febre, 35 hipertensão, choque, acidose metabólica, coagulação intravascular disseminada e distúrbios de coagulação relacionados, anemia, trombocitopenia, leucopenia, dificuldade respiratória do adulto e distúrbios pulmonares relacionados, falha renal e distúrbios renais relacionados, doença hepatobiliar e distúrbios do sistema nervoso central e mastite. Estes estados incluem, igualmente, a translocação do microrganismo resistente a antibióticos a partir do tubo digestivo e a concomitante libertação de endotoxina. Os microrganismos resistentes a antibióticos são das seguintes espécies: Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Enterococcus, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, histeria, Erysipelothrix, Propionibacterium, Eubacterium, Corynobacterium, Mycoplasma, Ureaplasma, Streptomyces, Haemophilus, Nesseria, Eikenella, Moraxellus, Actinobacillus, Pasteurella, Bacteroides, Fusomicroorganism, Prevotella, Porphyromonas, Veillonella, Treponema, Mitsuokella, Capnocytophaga, Campylobacter, Klebsiella, Shigella, Proteus, Vibriae.

Entre os microrganismos resistentes a antibióticos, as espécies microbianas mais importantes, envolvidas na sepsia são Estafilococos, Estreptococos e Enterococos, mas pode encontrar-se envolvido qualquer microrganismo resistente a antibióticos.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a LF ou a LFC podem ser administradas, isoladamente, numa quantidade suficiente para a eficiência terapêutica, a um indivíduo sofrendo de uma infecção envolvendo microrganismos susceptiveis a LF- ou LFC-, ou utilizadas como desinfectantes de dispositivos cirúrgicos e de processamento alimentar. Quando utilizado para descrever a administração de LF ou LFC isoladamente, o termo 36 significa "quantidade suficiente para a eficácia terapêutica" uma quantidade de LF ou LFC que fornece efeitos microbicidas ou inibitórios do crescimento quando administradas sob a forma de uma dose terapêutica. A invenção utilizou qualquer das formas de LF ou LFC conhecidas na técnica, incluindo as purificadas de neutrófilos ou leite, LF ou LFC recombinantes, fragmentos de LF ou LFC, variantes de LF ou LFC e péptidos de derivados de LF ou LFC. Este aspecto da invenção é baseado na descoberta que LF ou LFC têm actividade microbicida ou inibitória do crescimento directa contra alguns microrganismos resistentes a antibióticos. É, igualmente, aqui demonstrado que a LF ou a LFC têm efeitos directos, microbicidas ou inibitórios do crescimento sobre diferentes fases do crescimento de diferentes microrganismos resistentes a antibióticos. As fases de crescimento são a fase L (fase de crescimento Latente) e a fase S (fase de crescimento Exponencial) . É, igualmente, expectável que a LF ou a LFC exerçam efeitos microbicidas/inibitórios do crescimento directos em Mycoplasma e Ureaplasma, isentos de parede celular, microrganismos envolvidos clinicamente em infecções respiratórias e urogenitais. Para além disso, mais de 100 subespécies de Mycoplasma constituem o contaminante principal de culturas in vitro de tecidos.

Um outro aspecto da invenção consiste em LF ou LFC poderem actuar através de mecanismos diferentes sobre os microrganismos, como sobre a parede celular, tanto de microrganismos Gram-positivos como Gram-negativos. A LF ou a LFC podem-se ligar a receptores de superfície (e.g. receptores do tipo de ligação de heparina, receptores do tipo de ligação de fibronectina, receptores do tipo de ligação de proteina A ou receptores do tipo de ligação de anticorpos, proteínas de ligação de lipopolissacáridos) na parede celular, que inibem a ligação a 37 células de mamífero. Se for permitido que a LF ou a LFC atinjam o interior da membrana citoplasmática interna, a natureza anfipática da LF ou da LFC pode permitir que estas penetrem na membrana citoplasmática e exerçam um efeito microbicida. Deste modo, os agentes que actuam sobre ou interrompem as paredes celulares do microrganismo tais como antibióticos, detergentes ou tensioactivos, anticorpos anti-peptidoglicano, anticorpos anti-ácido lipoteicóico e lisosimas, podem potenciar a actividade da LF ou da LFC, permitindo o acesso à membrana citoplasmática interna. Se LF ou LFC entrarem adicionalmente no interior das células, o mecanismo da acção da LF ou da LFC pode ocorrer pela inibição da transcrição do plasmídeo ou do gene responsável pela resistência apresentada pelo microrganismo resistente a antibióticos. A LF ou a LFC podem ser utilizadas, igualmente, para tratar ou prevenir infecções microbianas causadas por microrganismos resistentes a antibióticos, pela administração simultânea de LF ou LFC numa quantidade suficiente para a eficácia terapêutica em combinação e um ou mais antibióticos em quantidades suficientes para a eficácia terapêutica em combinação. Este aspecto da invenção contempla a administração simultânea de LF ou LFC com qualquer antibiótico ou combinações de antibióticos, incluindo antibióticos de beta-lactama, com ou sem inibidores da beta-lactamase, aminoglicósidos, tetraciclinas, sulfonamida e trimetoprim, vancomicina, macrólidos, fluoroquinolonas e quinolonas, polimixinas e outros antibióticos.

Esta característica da invenção é baseada na descoberta que a administração de LF ou LFC melhora a eficácia terapêutica de antibióticos, e.g. pelo fornecimento de benefícios na redução do preço de terapia com antibióticos e/ou na redução do risco de 38 respostas tóxicas a antibióticos. É aqui demonstrado que a LF ou a LFC fazem baixar a concentração minima de antibióticos necessária para inibir o crescimento in vitro de microrganismos resistentes a antibióticos, de 0 a 24 horas de cultura. 0 efeito microbicida ou inibidor do crescimento da LF ou da LFC pode ser directo ou indirecto. Este aspecto da invenção encontra-se directamente ligado à descoberta adicional de que a administração de LF ou LFC pode reverter a resistência a antibióticos do microrganismo resistente a antibióticos. É aqui demonstrado que a LF ou a LFC reduzem a concentração minima inibitória de antibióticos de um nivel dentro da gama clinicamente resistente para um nivel dentro da gama clinicamente susceptível. A LF ou a LFC demonstram, consequentemente, converter um microrganismo normalmente resistente a antibióticos num microrganismo susceptível a antibióticos.

Uma vez que a LF ou a LFC são encontradas numa grande parte da nutrição humana, sem desencadear resposta imunitária após absorção oral, os produtos da invenção podem ser utilizados como conservantes alimentares. A LF ou a LFC podem ser utilizadas quando misturadas com alimentos, e.g., suplementadas com leite, iogurte, leite desnatado em pó, leite fermentado com microrganismos de ácido láctico, chocolates, rebuçados, bebidas em pó e qualquer outro comestível ao qual a LF ou a LFC possam ser adicionadas a alimentos como conservante. A LF ou a LFC podem ser, igualmente, utilizadas em combinação com outros conservantes, corantes e excipientes alimentares. A invenção inclui a diluição de LF ou LFC em água ou noutra solução aquosa, meios lipídicos naturais ou sintéticos, contendo, cada um, diferentes concentrações e combinações de sais ou produtos glicídicos. Essa combinação de LF ou LFC, isoladamente ou com 39 outros conservantes contém uma quantidade eficaz do composto activo em conjunto com uma quantidade adequada da veiculo, de modo a fornecer a forma apropriada de administração ao hospedeiro.

Numa das formas de realização muito preferidas da invenção, as concentrações minimas inibitórias são de 1 mg/mL para a LF e de 12,5 μρ/ηΛ para a LFC.

Uma das vias de administração da LF ou da LFC é a oral. A administração da LF ou da LFC é, de um modo preferido, realizada com uma composição farmacêutica compreendendo a LF ou a LFC e um diluente, adjuvante ou veiculo farmacêuticos aceitáveis. A LF ou a LFC podem ser administradas na ausência ou em conjunto com tensioactivos conhecidos, outros agentes quimioterapêuticos ou agentes antimicrobianos conhecidos adicionais.

De acordo com o aspecto da sinergia eficaz da invenção ou da potenciação após administração simultânea de LF ou LFC com um ou mais antibióticos, podem ser obtidos de várias formas. A LF ou a LFC podem converter microrganismos resistentes a antibióticos em microrganismos susceptiveis a antibiótico ou, de outra forma, melhorar a susceptibilidade a antibióticos desses microrganismos. Pelo contrário, a LF ou a LFC podem potenciar antibióticos, tais como um antibiótico que actua sobre a parede celular ou a membrana celular do microrganismo, que pode converter microrganismos resistentes à LF ou à LFC em microrganismos susceptiveis à LF ou à LFC. Alternativamente, tanto a LF ou a LFC como o antibiótico podem co-potenciar a actividade do outro agente. A LF ou LFC e o antibiótico podem ter um efeito terapêutico quando ambos são fornecidos em doses abaixo das quantidades suficientes para a eficácia terapêutica. 40

Quer a LF ou a LFC, quer os antibióticos podem ser administrados sistemicamente ou topicamente. As vias de administração sistémica incluem oral, injecção intravenosa, intramuscular ou subcutânea, intraocular ou retrobulbar, intratecal, intraperitoneal, intrapulmonarmente, pela utilização de fármacos em aerossol ou nebulizados ou transférmica. A via tópica inclui a administração sob a forma de pomadas, gotas oftálmicas, gotas auriculares ou fluidos de irrigação. A LF ou a LFC, isoladamente ou em combinação com antibióticos, podem ser, igualmente, distribuídas através de diferentes sistemas de distribuição, de longa duração ou de degradação rápida.

Uma vantagem fornecida pela presente invenção consiste na capacidade de fornecer tratamento eficaz para um microrganismo resistente a antibióticos, pela melhoria da eficácia terapêutica de antibióticos contra este microrganismo. Uma vez que a sua toxicidade sistémica ou o preço proibitivo limitam a utilização de alguns antibióticos, baixando a concentração de antibiótico necessária para a eficácia terapêutica reduz a toxicidade e/ou o custo do tratamento e, deste modo, permite uma mais ampla utilização do antibiótico.

Entre os antibióticos que podem ser utilizados, isoladamente ou em diferentes combinações com outros antibióticos e/ou com a LF ou a LFC encontram-se vancomicina, rifampina, lincomicina, cloranfenicol e o fluoroquinol, penicilina, beta-lactamas, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, mezlocilina, nafcilina, oxacilina, piperacilina, ticarcilina, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefuroxima, cefalexina, cefalotina, imipenem, aztreonam, aminoglicósidos, gentamicina, netilmicina, tobramicina, neomicina, tetraciclinas, 41 sulfonamidas, macrólidos, eritromicina, claritromicina, azitromicina, polimixina B e clindamicina.

Os fragmentos biologicamente activos da LF ou da LFC incluem moléculas biologicamente activas que têm as mesmas sequências de aminoácido ou semelhantes que uma LF ou LFC natural humana ou bovina. As variantes biologicamente activas da LF ou da LFC incluem, igualmente, mas não são limitadas a proteínas de fusão híbridas recombinantes, compreendendo análogos da LF ou da LFC ou seus fragmentos biologicamente activos e, pelo menos, uma porção de, pelo menos, um outro polipéptido e formas poliméricas de variantes da LF ou da LFC. As formas de proteína de fusão podem ser concebidas de forma a facilitar processos de purificação. Os análogos biologicamente activos da LF ou da LFC incluem mas não são limitados a LF ou LFC em que um ou mais resíduos de aminoácido foram substituídos por um aminoácido diferente. A invenção fornece, igualmente, um método melhorado de tratamento in vitro de dispositivos, locais de trabalho, salas e líquidos contaminados com microrganismos resistentes a antibióticos, fazendo contactar o microrganismo com LF ou LFC, isoladamente, ou em combinação com um ou mais produtos antimicrobianos (e.g. antibióticos, detergentes). As quantidades de LF ou de LFC e dos produtos antimicrobianos utilizados são quantidades que são separadamente suficientes para apresentarem efeitos microbicidas/inibitórios do crescimento, ou quantidades suficientes para apresentarem efeitos microbicidas/inibitórios do crescimento aditivos ou sinergísticos. Estes métodos podem ser utilizados em várias aplicações in vitro, incluindo a esterilização de equipamento cirúrgico e outro equipamento médico e dispositivos implantáveis, incluindo uniões protéticas. 42

Estes métodos podem ser, igualmente, utilizados na esterilização in situ de dispositivos invasivos internos tais como linhas intravenosas e cateteres, que são frequentemente focos de infecção. A presente invenção refere-se em particular ao tratamento e prevenção de infecções microbianas, humanas e animais, por microrganismos resistentes a antibióticos. A eficácia terapêutica é baseada num resultado clinico bem sucedido e não requer que o agente antimicrobiano ou os agentes eliminem 100% dos organismos envolvidos na infecção. O sucesso depende de alcançar um nivel de actividade antimicrobiana no local da infecção que é suficiente para inibir o microrganismo de uma forma que faz pender o equilíbrio a favor do hospedeiro. Quando as defesas do hospedeiro se encontram maximamente eficazes, o efeito antimicrobiano necessário pode ser minimo. A redução da carga do organismo, mesmo por um log (um factor de 10) pode permitir que a própria defesa do hospedeiro controle a infecção. Para além disso, o aumento de um efeito microbiano/bacteriostático precoce pode ser mais importante do que o efeito microbicida/bacteriostático de longo termo. Estes eventos precoces são uma parte significativa e critica do sucesso terapêutico, uma vez que estes dão tempo para que os mecanismos de defesa do hospedeiro se activem. O aumento da taxa microbiana pode ser particularmente importante para infecções tais como meningite, infecções dos ossos ou das articulações. A presente invenção será mais facilmente compreendida em referência aos exemplos seguintes que são fornecidos para ilustrar a invenção e não para limitar o seu âmbito. 43

EXEMPLO I

Determinação da concentração minima inibitória (MIC) de antibióticos

Agentes Antimicrobianos A apo-lactoferrina bovina, novobiocina (quinolona semelhante a antibiótico) e o macrólido eritromicina foram adquiridos de Sigma Chemicals (St-Louis, Mo.) . A Penicilina G, ampicilina, cefazolina e neomicina foram adquiridas de Novopharm Limited (Toronto, ON, Canadá). A LF bovina (Besnier, Califórnia EUA) foi armazenada a -20 °C, numa concentração de 100 mg/mL em água. A lactoferricina foi isolada de LF bovina (Besnier, Califórnia EUA), de acordo com o procedimento descrito por Dionysius e Milne (1997, J. Dairy Sei. 80:667-674)) e foi mantida a -20 °C até à utilização. O péptido isolado foi enviado para o Biotecnology Research Institute (Montreal, QC, Canadá) para a sequenciação de aminoácidos que confirmou que este era LFC. Os stocks de antibióticos foram sempre preparados de novo e diluídos à concentração pretendida em placas de agar de Mueller Hinton (MHA) ou meio liquido (MHB). Foi utilizado um painel de discos de antibióticos (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville MD) , incluindo ampicilina (10 μρ), penicilina (10 u) , cefalotina (30 μρ) , neomicina (30 μρ) , tetraciclina (30 μg) , oxacilina (1 μρ), eritromicina (15 μg), sulfametoxazol (23,7 μρ)/trimetoprima (1,25 μρ) , novobiocina (30 μρ) , penicilina (10 u)/novobiocina (30 μρ) , pirlimicina (2 μρ) , gentamicina (10 μρ) , espectinomicina (100 μρ) , em ensaios de controlo de qualidade. 44

Estirpes bacterianas e Condições de crescimento

As estirpes ATCC 25923 e 6538 de Staphylococcus aureus e Escherichia coli ATCC 25922 foram obtidas da American Type Culture Collection. Os oito isolados de mastite clinica bovina de S. aureus (SHY97-3906,-3923, -4085, -4242, -4320 e -4343, RFT-1 e RFT-5) e um isolado de E. coli SHY97-3923-2 e um isolado de Kiebsiella pneumoniae SHY99-723-1, foram gentilmente fornecidos, respectivamente, pelo Laboratoire Provincial de Pathologie Animale de St-Hyacinthe e de Rock-Forest (Quebec, Canadá). As nove estirpes de S. aureus resistentes a antibióticos de β-lactama (PC 1, NCTC 9789, 2076, 22260, ST79/741, 3804, RN9, FAR8 e FAR10) foram obtidas da University

Vanderbilt School of Medicine (Nashville, Tennesse, EUA) . Todos os meios de cultura foram obtidos de Difco Laboratories (Detroit, MI) . As bactérias do stock congelado a -80 °C foram repicadas para placas de agar de soja triptica suplementado com sangue de ovelha desfibrinado a 5% (Quelab, Montreal, QC, Canadá) ou para placas de agar de infusão de Coração e Cérebro. As placas foram, seguidamente, incubadas durante 16 a 24 h a 37 °C. Para a maioria das experiências, as estirpes foram subcultivadas em placas de agar de Mueller Hinton (MHA) ou meio liquido (MHB) durante 16-20 h adicionais. As soluções aquosas dos produtos testados foram adicionadas por filtração através de uma montagem de filtração estéril (medida do poro 0,2 μιη, Fisher, Otava, Ontário).

As MICs foram determinadas, tanto por técnicas de macrodiluição (1 mL/tubo) como de microdiluição (100 μL/poço) em placas de microtitulação estéreis de 96 poços (International 45

Nunc, Napierville, II), em três experiências distintas, de acordo com o National Committee for Clinicai Laboratory Standards (1992 e 1999), em três experiências distintas. As diluições de 2 vezes em série em MHB, de LF, LFC, antibiótico ou da combinação de LF ou LFC com o antibiótico foram inoculadas com uma cultura durante a noite num inoculo final de 106 cfu/mL em MHB. 0 efeito da combinação da LF com o antibiótico sobre as MICs foi determinado adicionando LF 0,5 mg ou 1 mg/mL a cada diluição de antibiótico. A MIC foi definida como a concentração mais baixa de fármaco (a diluição mais elevada) que causou uma inibição completa do crescimento bacteriano, após uma incubação de 18 h. Foi, igualmente, determinado o efeito da combinação da LF ou da LFC com o antibiótico sobre a MIC pelo método do tabuleiro de damas utilizando placas de microtitulação de 96 poços. Cada diluição de antibiótico (50 μL) foi adicionada em série aos poços em linhas verticais, de cima (diluição mais baixa) para baixo. Foi adicionada lactoferrina ou LFC (50 μL) a 50 μL de cada diluição de antibiótico, tendo sido diluida em série da esquerdo (diluição mais baixa) para a direita. Após a inoculação, a concentração final de antibiótico de cima para baixo foi de 32 até 8, de 2 até 0,5, de 0,5 até 0,125 μρ/πΛ, respectivamente, para a penicilina, cefazolina e neomicina. Da esquerda para a direita, a concentração de LF ou de LFC foi, respectivamente, de 25 até 0,0244 mg/mL ou de 256 até 0,5 μg/mL num volume final de 100 μL/poço. As microplacas foram incubadas a 37 °C durante 24 h. O crescimento bacteriano foi medido opticamente a 540 nm, utilizando um equipamento Spectra Max 250 Microplate Spectrophotometer System de Molecular Device (Fisher Scientific, Otava, Canadá). Os tubos foram incubados a 37 °C, durante 18 h e o crescimento bacteriano foi medido por inspecção visual e opticamente a 540 nm, utilizando um espectrofotómetro 46 (Philips PU 8800; Pye Unican Ltd, Cambridge, UK) . A concentração inibitória fraccionária (FIC) foi calculada como descrito por Eliopoulos e Moellering (1991). FIC antibiótico a=MIC antibiótico a (na presença de antibiótico B) /MIC antibiótico A ίso 1 adamente .

índice de FIC —FIC antibiótico At FIC antibiótico B

Os efeitos dos antibióticos foram considerados sinergisticos ou indiferentes quando o índice de FIC foi, respectivamente, < 1 ou > 1.

Para o controlo de qualidade, foram realizados testes de susceptibilidade por difusão de disco, como recomendado pelo National Committee for Clinicai Laboratory Standards, para todas as estirpes, utilizando discos padrão de vários antibióticos. Após 18 h de incubação a 37 °C, foi medido o diâmetro da zona da inibição completa do crescimento bacteriano, em redor de cada disco. Os isolados foram classificados como sensíveis ou resistentes a um dado antibiótico, utilizando as orientações interpretativas recomendadas pelo fabricante.

As MICs de penicilina G, isoladamente ou em combinações com LF 0,5 ou 1 mg/mL obtidas para várias estirpes de S. aureus são fornecidas na Tabela 1. Exceptuando a estirpe ATCC 25923 e a estirpe isolada do campo SHY97-3923, todas as outras estirpes, incluindo as duas estirpes clínicas de mastite (SHY97-3906 e SHY97-4320) foram resistentes à penicilina G com MICs de 0,5 a > 128 μρ/ηϋΐ. A difusão de disco padrão e um teste da cefinase confirmaram a resistência à penicilina e ampicilina e a produção 47 de β-lactamase nestas estirpes. A lactoferrina, isoladamente, demonstrou fraca actividade inibitória contra estas estirpes, com MICs superiores a 25 mg/mL. As MICs da LFC foram de 128 μρ/ιη]1 para ATCC 25923 e de 256 μρ/ιη]1 para as outras estirpes. A combinação entre a LF 0,5 mg/mL e a penicilina duplicou a actividade inibitória da penicilina em todas as estirpes testadas, excepto ATCC 25923 e SHY97-3906, que necessitaram de uma concentração de LF de 1 mg/mL (Tabela 1). A apreciação do indice de FIC indica efeitos sinergisticos entre a LF e a penicilina, novobiocina e eritromicina. A combinação da LF com penicilina aumentou a actividade inibitória da penicilina 2 e ã 2 vezes, respectivamente, nas estirpes ATCC 25923 e PC 1. Este aumento foi de quatro vezes nas estirpes SHY97-4320 e SHY97-3906 (Tabela 2). A actividade inibitória da LF foi aumentada de 16 a 64 vezes pela penicilina G (Tabela 2) . A combinação da LF com novobiocina aumentou a actividade inibitória da penicilina de 2 a 4 vezes em 7/10 (70%) das estirpes de S. aureus testadas, enquanto que a actividade da eritromicina foi aumentada na presença da LF de 2 a 16 vezes, na mesma percentagem de S. aureus. A lactoferrina é uma proteína importante quelante de ferro. Nesta experiência, é demonstrado que a LF apresenta uma baixa actividade antibacteriana contra S. aureus. Estas bactérias são capazes de crescer na presença de concentrações de ferro extremamente baixas (0,04 μΜ) . Foi observado que a LF bovina saturada com ferro a 16,2% demonstrou, igualmente, uma actividade inibitória do crescimento. Consequentemente, a adição de 5 μΜ de FeCl3 não afectou a actividade inibitória do crescimento da LF. Consequentemente, é evidente que a actividade 48 antibacteriana da LF contra S. aureus não é devida apenas à sua propriedade quelante do ferro. São utilizadas combinações de antibióticos no tratamento de doenças infecciosas para fornecer um largo espectro de cobertura, para reduzir a emergência de estirpes resistentes e toxicidade dos fármacos e, finalmente, para produzir efeitos sinergisticos ou aditivos entre antibióticos. Foi determinado que a combinação de penicilina G, novobiocina ou eritromicina com uma concentração relativamente baixa de LF bovina origina um aumento de actividade antibacteriana destes antibióticos contra a maioria das estirpes testadas. Na presença de uma baixa concentração relativa de LF bovina nos meios, o crescimento das estirpes de Estafilococos isoladas de mastite clinica bovina é inibido pela penicilina G numa maior extensão. Esta descoberta indicou que a combinação de penicilina e LF actua sinergisticamente contra estas estirpes. Em geral, os índices de FIC da penicilina e da eritromicina na presença da LF foram inferiores em estirpes produtoras de β-lactamase do que em estirpes não-produtoras de β-lactamase. Isto sugere que a LF pode reduzir a resistência a antibióticos.

EXEMPLO II

Efeito da lactoferrina/lactoferricina bovina e antibióticos sobre o crescimento bacteriano.

Foi determinado o efeito da LF ou da LFC em concentrações sub-MICs, isoladamente ou em combinação com sub-MICs de antibióticos, sobre a taxa de crescimento bacteriano de S. 49 aureus, E. coli e K. Pneumoniae, monitorizando culturas bacterianas em MHB pela O.D.6oo nm ou pela contagem de unidades formadoras de colónias por mL (cfu/mL). Foi utilizado um volume de 2,5 mL de culturas durante a noite em MHB, ajustado para 0,5-1 do padrão de McFarland em soro fisiológico, para inocular um volume final de 25 mL de MHB renovado contendo a concentração pretendida dos compostos testados. Todos os frascos foram, seguidamente, incubados a 37 °C, sob agitação (200 rpm) durante 9 h. Foram recolhidas alíquotas em cada hora, para determinar a turbidez da cultura, utilizando um espectrofotómetro Philips PU 8800 (Pye Unican Ltd, Cambridge, UK) . O efeito do antibiótico combinado sobre o crescimento bacteriano foi, igualmente, determinado utilizando as concentrações da LF na presença de diferentes concentrações de antibióticos. Resumidamente, um volume de 3 mL de MHB renovado contendo a concentração pretendida de fármacos foi ajustado para uma densidade óptica de 0,4 a 540 nm, após uma cultura durante a noite. A cultura foi, seguidamente, incubada a 37 °C, sob agitação (200 rpm) . Após incubação, as alíquotas foram removidas para determinar a turbidez da cultura (OD540nm) ou as cfu/mL. Foram adicionados 5 μΜ de FeCl3 aos meios, para determinar a influência do nível de ferro sobre a inibição do crescimento pelo composto em teste.

Os efeitos da penicilina G em combinação com LF ou LFC sobre a taxa de crescimento obtida para a estirpe ATCC 25923 de S. aureus e para a estirpe PC 1 produtora constitutiva de β-lactamase são apresentados nas Fig. 1 e 2. A sub-MIC da penicilina G, isoladamente, não afectou significativamente a taxa de crescimento da PC 1. O crescimento foi retardado pela LF, para a estirpe ATCC 25923 e pela LF e pela LFC,

isoladamente, para a estirpe PC 1. Quando foi utilizada LF 50 1 mg/mL, em combinação com sub-MIC de penicilina G de (1/4 a 1/16 da MIC), foram observadas reduções importantes da taxa de crescimento (P < 0,01) . Foi obtida inibição completa do crescimento quando a penicilina G foi combinada com LFC 32 μρ/ιτΛ (1/8 da MIC para a estirpe ATCC 25923) ou 64 μρ/ηϋΐ (1/8 da MIC para a PC 1) . No caso das estirpes clinicas SHY97-4242 e RFT-5 de S. aureus, não-produtoras de β-lactamase, a penicilina G reduziu, igualmente, o crescimento destas estirpes (P < 0,001). A actividade inibitória do crescimento da penicilina foi intensificada pela presença da LF (P < 0,01) . A adição de ferro aos meios não afectou a inibição do crescimento induzida pela combinação da penicilina com a LF.

Foi avaliado o efeito da eritromicina, novobiocina, LF, isoladamente, e a sua combinação, sobre o crescimento das estirpes ATCC 25923, SHY97-3906, -4242 e RFT-5 de S. aureus, após 4, 8 e 18 h de incubação. Isoladamente, a sub-MIC (9,1, 36, 6, 250 ou 500 μρ/ιτΛ) de LF não afectou o crescimento destes

microrganismos exceptuando a estirpe SHY97-3906 (P > 0,5). A estirpe SHY97-3906 foi afectada pela combinação de eritromicina e LF após 18 h de incubação (Fig. 3).

Foram, igualmente, avaliados os efeitos das combinações da LF ou da LFC com neomicina, sobre o crescimento dos isolados clínicos de E. coli SHY97-3923 e K. pneumoniae SHY99-723. Para a estirpe de E. coli, o efeito da neomicina sobre o crescimento bacteriano foi significativamente intensificado quando foi adicionado, respectivamente, LF 1 mg/mL (Fig. 4) ou LFC 16 μg/mL (1/16 da MIC; Fig. 5) aos meios. Foram encontrados resultados semelhantes para a estirpe de K. pneumoniae testada. A taxa de crescimento bacteriano desta estirpe com neomicina foi 51 reduzida 2 vezes quando foram adicionados, respectivamente, LF 0,5 mg/mL (Fig. 6) ou LFC 16 μg/mL (1/16 da MIC; Fig. 7) aos meios. A sinergia com a neomicina foi mais forte com a LFC do que com a LF.

Isoladamente, o antibiótico de β-lactama cefazolina (0,5 g) não foi capaz de reduzir o crescimento de E. coli SHY97-3923 (Fig. 5) . No entanto, este estabeleceu uma sinergia com a LFC, inibindo, completamente, o crescimento bacteriano.

EXEMPLO III

Efeito da lactoferrina/lactoferricina bovina e antibióticos sobre a morfologia da célula bacteriana.

Foram cultivadas células bacterianas durante a noite em MHA ou MHB contendo sub-MICs de penicilina G com ou sem LF ou LFC. Os microrganismos foram preparados para a microscopia electrónica de transmissão por fixação com glutaraldeido seguida de marcação com ferritina. Este método permite uma boa preservação do material capsular. Resumidamente, as células bacterianas cultivadas na presença ou ausência de antibióticos foram fixadas em tampão cacodilato (0,1 M, pH 7,0) contendo glutaraldeido a 5% (v/v) , durante 2 h a 20 °C. Os microrganismos fixados foram suspensos em tampão cacodilato e deixados reagir com a ferritina policatiónica (Sigma Chemicals, St-Louis, Mo; concentração final de O \—1 mg/mL) durante 30 min a 20 °C. reacção foi retardada por diluição 10 vezes com tampão e microrganismos foram centrifugados e lavados três vezes em tampão cacodilato. As células bacterianas foram, seguidamente, 52 imobilizadas em agar a 4% (p/v) , lavadas 5 vezes em tampão cacodilato e pós-fixadas com tetróxido de ósmio a 2% (p/v) durante 2 h. As lavagens foram repetidas como acima e as amostras foram desidratadas numa série graduada de lavagens de acetona. As amostras foram, seguidamente, lavadas duas vezes em óxido de propileno e embebidas em resina de Spurr de baixa viscosidade. As secções finas foram pós-coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo e examinadas com um microscópio electrónico (Philips 201) sob uma voltagem aceleradora de 60 kV. S. aureus SHY97-4320 e ATCC 25923 foram recolhidas, respectivamente, após 4 e 18 h de incubação, de forma a comparar o efeito sobre a morfologia celular das sub-MICs de penicilina G e de LF, isoladamente ou em combinação (Fig. 8 e 9) . Para a estirpe ATCC 25923, a sub-MIC de penicilina G (0,0078 μg/mL) induziu a formação de grandes estafilococos pseudomulticelulares arranjados simetricamente com dois planos de divisão e múltiplas paredes cruzadas (Fig. 8B) . Foram, igualmente, observados septos mais espessos com um aspecto irregular, após exposição a sub-MIC de penicilina G. A lactoferrina na concentração de 9,1 μρ/ηϋΐ não apresentou qualquer efeito óbvio sobre as células de S. aureus (Fig. 8C) . O efeito das sub-MICs de penicilina G e LF, em combinação, sobre a morfologia de S. aureus foi semelhante mas não idêntica ao observado para a penicilina G, isoladamente. De facto, foram formados estafilococos pseudomulticelulares arranjados assimetricamente, as paredes cruzadas eram mais espessas, irregulares e algumas vezes inexistentes (Fig. 8D) . Com este tratamento foram, igualmente, observadas células bacterianas irregulares em lise, assim como os fragmentos de parede celular e células com paredes rebentadas e detritos. Na estirpe resistente SHY97-4320, a penicilina G (8 μρ/ιτΛ) , 53 isoladamente, não teve qualquer efeito visivel (Fig. 9B) , mas quando foi combinada com LF (1 mg/mL), as modificações de morfologia foram semelhantes às observadas para a estirpe susceptivel (Fig. 9A a 9D) . Este facto sugere que a LF pode restabelecer a susceptibilidade de estirpes resistentes à penicilina.

As células bacterianas da PC 1 (uma estirpe produtora de β-lactamase constitutivamente elevada) foram cultivadas durante a noite em MHB contendo penicilina G8 μρ/ιτΛ, LFC 16 μρ/ιτΛ, isoladamente ou em combinação, durante 4 h a 37 °C, sob agitação a 150 rpm. A morfologia das células bacterianas foi avaliada por microscopia electrónica de transmissão após fixação e o método de marcação com ferritina, como anteriormente descrito. A penicilina isolada não teve qualquer efeito sobre a morfologia. A exposição a LF ou LFC afectou a forma e o tamanho de S. aureus. Foi observada uma grande percentagem de bactérias lisadas com LFC, a qual foi intensificada na presença de

penicilina G (Fig. 10C e 10D, ver setas). Para além disso, a LFC induziu a formação de estruturas de mesossoma que originam dos septos e parede celular em S. aureus (Fig. 11) . Novamente, este facto sugere que a LF pode restabelecer a susceptibilidade de estirpes resistentes à penicilina.

Foi, igualmente, realizada microscopia electrónica de transmissão sobre uma secção fina de uma S. aureus SHY97-4320 produtora β-lactamase, de forma a investigar o mecanismo de acção da LF em combinação com a penicilina G sobre a divisão celular. As células bacterianas foram cultivadas em MHB contendo penicilina G 8 \iq/mLr LF 1 mg/mL isoladas ou em combinação durante 4 h a 37 °C sob agitação a 150 rpm. As bactérias foram 54 recolhidas e incubadas ou não durante 2 h em Tris 0,02 M (pH 7,4) contendo NaCl 0,15 M, 0,5 mg/mL e 50 μ]0 de aglutinina germe de trigo (WGA) ouro (Sigma Chemicals, St-Louis, Mo) durante 2 h. A morfologia das células bacterianas foi avaliada por microscopia electrónica de transmissão, como anteriormente descrito. Os efeitos dos tratamentos foram avaliados e comparados pelo teste "t". Foram observados grupos de células múltiplas não divididas, após o tratamento com LF, isoladamente ou em combinação com penicilina (Fig. 12A) . Estes resultados sugerem que a LF pode afectar a divisão celular estafilocócica. A WGA apresenta uma afinidade para residuos de N-acetil-β-ϋ-glucosamilo e oligómero N-acetil^-D-glucosamina. Após tratamento com LF, as células de S. aureus encontravam-se menos cobertas (P < 0,005) com WGA-ouro (Fig. 12 e Tabela 3). Estes resultados sugerem, igualmente, que a LF afecta a formação ou a acessibilidade da N-acetil-p-D-glucosamina, a qual é uma parte importante do peptidoglicano da parede celular.

EXEMPLO IV

Efeito de lactoferrina/lacoferricina bovina na Produção de β-lactamase

Foram avaliados os efeitos de sub-MICs de LF (1 mg/mL), LFC (32 e 64 μρ/ιτύΟ) , isoladamente ou em combinação com ampicilina (4 μg/mL) ou penicilina G (8 μρ/ιτΛ) sobre a actividade da β-lactamase das estirpes SHY97-4320 e PC 1 de S. aureus. Foi utilizada a cefalosporina cromogénica nitrocefina (Becton

Dickinson Microbiology, Cockeysville, MD) num ensaio de espectrofotométrico quantitativo. As células bacterianas foram 55 inicialmente expostas a fármacos, durante 4 e 22 h, em meio liquido. 0 número de bactérias (cfu/mL) foi determinado e foram centrifugadas aliquotas das células em cada ponto temporal. Os sedimentos foram suspensos em tampão HEPES 10 mM (pH 7,4) numa OD 4i5 nm de 1 para a PC 1 e de 2 para a SHY97-4320. Foi adicionada nitrocefina (100 μΜ) a 100 μύ de células, num volume final de 1 mL. A hidrólise foi medida a 486 nm num espectrofotómetro. A actividade da β-lactamase foi expressa como ΔΟ.Ό.486 nm/min e corrigida para a OD bacteriana. Não foi observada qualquer actividade da β-lactamase na estirpe SHY97-4320, no controlo e nas culturas contendo LF (Fig. 13) . Na cultura contendo penicilina G 8 \\.q/mh, foi observado um grande aumento da actividade da β-lactamase. Quando foi utilizada LF em combinação com penicilina G, foi observada uma redução significativa de actividade da β-lactamase (P < 0,001). Na estirpe PC 1, a LF reduz moderadamente a actividade da β-lactamase (P < 0,05) . No entanto, nesta estirpe, a LFC demonstrou uma forte inibição (P < 0,001) da actividade da β-lactamase (Fig. 14) . Foram obtidos resultados semelhantes com ampicilina. Estes resultados indicam que a LF e a LFC reprimem a resistência a antibióticos de β-lactama, por inibição da actividade β-lactamase. 56

EXEMPLO V

Efeito da lactoferrina humana sobre a produção de β-lactamase A penicilina G foi adquirida de Novopharm Limited (Toronto, Ontário, Canadá) . A LF humana (Sigma) foi armazenada a -20 °C, numa concentração de 100 mg/mL em água. As soluções stock de antibiótico foram sempre preparadas de novo e diluídas à concentração pretendida em meio liquido de Mueller Hinton (MHB) (Difco Laboratories, Detroit, MI). A actividade da β-lactamase foi medida utilizando um ensaio espectrofotométrico quantitativo com a cefalosporina cromogénica nitrocefina. As células bacterianas foram inicialmente expostas a penicilina e/ou a LF durante 4 e 22 h em meio liquido. Em cada ponto temporal, foi determinado o número de cfu/mL e foram centrifugadas alíquotas das células.

Os sedimentos foram suspensos em tampão HEPES 10 mM (pH 7,4) numa OD 415 nm de 0,4 para a PC 1 e de 4 para a estirpe SHY97-4320. Foi adicionada nitrocefina (100 μΜ) a 20 μΕ de células num volume final de 200 μΕ. A hidrólise foi medida a 486 nm num equipamento Spectra Max 250 Microplate Spectrophotometer System de Molecular Device (Fisher Scientific, Otava, Canadá). A actividade da β-lactamase foi expressa como ΔΟ.Ό.486 nm/min e corrigida para a OD bacteriana.

Foi avaliado o efeito da LF humana e/ou da penicilina G sobre a actividade da β-lactamase das estirpes SHY97-4320 e PC 1 de S. aureus (Fig. 15) . Para a estirpe SHY97-4320, não foi observada qualquer actividade da β-lactamase, nas culturas 57 contendo controlo e LF (1 mg/mL). Na cultura contendo penicilina G 8 μg/mL, encontrava-se presente actividade β-lactamase. Quando foi adicionado LF 1 mg/mL simultaneamente com penicilina G, foi observada uma redução importante da actividade da β-lactamase (P < 0,001). Nas estirpes PC 1, uma estirpe produtora constitutiva de β-lactamase, a LF humana reduziu, igualmente, em 50% e 20% a actividade da β-lactamase, respectivamente, após incubação durante 4 e 22 h.

EXEMPLO VI

Efeito da lactoferrina bovina e antibiótico sobre o perfil de proteina e a transdução de sinal

As células de Staphylococcus aureus SHY97-4320 cultivadas em MHB contendo os compostos do teste foram suspensas em tampão de amostra de electroforese contendo dodecilsulfato de sódio a 2% (SDS) e 2-mercaptoetanol 5%, numa concentração final de 0,1 g por mL. As amostras foram aquecidas a 100 °C durante 5 minutos antes de serem depositadas para electroforese num gel descontinuo de poliacrilamida com SDS a 0,1% (SDS PAGE) com um gel de empacotamento de poliacrilamida a 6% e um gel de separação de poliacrilamida a 10 ou 12%. Os géis foram separados num equipamento Mini-protean® II (Bio Rad Laboratories, Richmond, CA) . Os perfis de proteína foram visualizados por coloração com azul brilhante de coomassie R-250 ou por coloração com prata.

O perfil de proteína de células bacterianas inteiras da S. aureus SHY97-4320 produtora de β-lactamase, obtido por SDS-PAGE 58 foi examinado. após electroforese, foi examinado. Foram expressas várias proteínas e foram observadas diferenças significativas nestas proteínas quando as condições de cultura foram comparadas. Podem ser visualizadas, de um modo muito claro, proteínas com, aproximadamente, 59, 42 e 27 kDa no controlo e na cultura contendo penicilina G, mas estas encontravam-se ausentes na cultura com LF isoladamente ou em combinação com penicilina G (Fig. 17) . A ausência das banda das proteínas com 27 a 59-kDa sugere que, provavelmente, a LF inibe a sintese e/ou a secreção destas proteínas. A ausência destas proteínas pode, igualmente, explicar o efeito sinergistico entre a LF e a penicilina e o restabelecimento da susceptibilidade em estirpes resistentes. Foram observadas modificações semelhantes nas estirpes PC 1, NCTC 9789 e ATCC 25923 de S. aureus.

EXEMPLO VII

Efeito da lactoferrina sobre a transdução de sinal

Uma vez que o sistema da β-lactamase é o sistema de transdução de sinal melhor conhecido em S. aureus. Foi testada a capacidade de LF inibir a transdução de sinal em S. aureus SHY97-4320, a qual é uma estirpe induzivel produtora de beta-lactamase. As células bacterianas foram inicialmente expostas a LF em meio liquido, durante 30 ou 60 min e adicionalmente tratadas com penicilina G 8 μρ/πΛ durante 4 h adicionais. As cfu/mL foram determinadas, as alíquotas de células foram centrifugadas e os sedimentos foram suspensos em tampão HEPES 10 mM (pH 7,4) como acima referido. A nitrocefina (100 μΜ) foi adicionada a 20 μΕ de células, num volume final de 200 μΕ. A 59 hidrólise foi medida a 486 nm num equipamento Espectra Max 250 Microplate Spectrophotometer System de Molecular Device (Fisher Scientific, Otava, Canadá). A actividade da β-lactamase foi expressa como Δθ.ϋ.486 nm/min e corrigida para a OD bacteriana.

Em S. aureus, a sintese de β-lactamase encontra-se organizada num operão constituído por um gene repressor (blal) e um anti-repressor (blaRl) que regulam o gene da β-lactamase (blaZ). A Proteólise de Blal por BlaRl demonstrou permitir a síntese de β-lactamase. A lactoferrina bloqueia completamente a indução da β-lactamase quando esta foi adicionada 30 ou 60 min antes da penicilina G (Fig. 16) . Estes resultados mostram que a LF ou a LFC afectam a indução e/ou a síntese da β-lactamase por interferirem, quer com BlaRl, quer com a totalidade da função do operão do bla e, consequentemente, bloqueando a indução da síntese e secreção da beta-lactamase induzida pela penicilina através da transdução de sinal.

EXEMPLO VIII

Efeito da lactoferrina sobre a expressão génica bacteriana Estirpes estafilocócicas e meios

Foi utilizada uma estirpe de um isolado clínico resistente à β-lactama (S. aureus SHY97-4320) para estudar o efeito da LF e/ou da penicilina G sobre a expressão génica. A estirpe foi mantida congelada a -80 °C em MHB contendo 7% de DMSO, até à utilização. Todos os meios de cultura foram obtidos de Difco (Detroit, MI, EUA). As bactérias do stock congelado foram 60 cultivadas em meios de Mueller Hinton durante 16 a 18 h e subcultivadas em meio liquido de Mueller Hinton (MHB). Foram adicionadas soluções aquosas dos produtos testados, por filtração através de uma montagem de filtração estéril (medida do poro 0,2 μιη, Fisher, Otava, Ontário) .

Antibióticos e reagentes A penicilina G foi adquirida de Novopharm Limited (Toronto, Ontário, Canadá). A LF bovina (Besnier, San Juan Capistrano, Califórnia EUA) foi armazenada a -20 °C numa concentração de 100 mg/mL em água. As soluções stock de antibiótico foram sempre preparadas de novo e diluidas na concentração pretendida em meio MHB (Difco Laboratories, Detroit, MI) . Foi utilizado pó padrão de nitrocefina para avaliar a actividade da β-lactamase. As endonucleases de restrição foram adquiridas de Amersham

Pharmacia Biotech.

Condições de crescimento bacteriano MHB renovado, contendo ou não penicilina G 8 μρ/ιτΛ e/ou LF bovina 1 mg/mL (desenho factorial de 2x2), foi ajustado para uma densidade óptica de 0,04 a 540 nm com uma cultura durante a noite de S. aureus e, seguidamente, incubado a 37 °C, sob agitação (150 rpm). Após 4 e 22 h de incubação, foram retiradas aliquotas para determinar o crescimento bacteriano pela contagem de viáveis (unidades formadoras de colónia por mL, cfu/mL), medindo a turbidez da cultura (OD54o nm) com um espectrofotómetro Philips PU e para medir a actividade da β-lactamase nas células 61 bacterianas. Após cultura sob as mesmas condições, as células bacterianas foram recolhidas para extracção do ARN.

Quantificação da actividade da β-lactamase

Os sedimentos foram suspensos em tampão HEPES 10 mM (pH 7,4) numa OD4i5 nm de 4. Foi adicionada nitrocefina (100 μΜ) a 100 μ]0 de células num volume final de 1 mL. A hidrólise foi medida a 486 nm num equipamento Espectra Max 250 Microplate Spectrophotometer System de Molecular Device (Fisher Scientific, Otava, Canadá). A actividade da β-lactamase foi expressa como Δθ.ϋ.486 nm/min e corrigida para a OD bacteriana.

Iniciadores

Os iniciadores oligonucleotidicos para RT-PCR em Tempo-Real foram sintetizados por PE Applied Biosystem (Foster City, CA EUA) . O ADN alvo para amplificação para PCR em Tempo-Real foi proveniente da sequência publicada do gene BlaZ.

Extracção do ARN total O ARN bacteriano total foi preparado utilizando o minikit RNeasy (Qiagen, Mississauga, ON, Canadá). As bactérias lavadas foram inicialmente tratadas com lisostafina 50 μυ/ηΛ (GramCracker, Ambion, Austin, TX) , durante 10 min a 37 °C e o ARN foi purificado de acordo com o protocolo do fabricante. O ADN contaminante foi removido do ARN total pela utilização de 1 62

U de ADNase isenta de ARNase I (Gibco Life Technologies, Grand Island, NY) numa mistura de reacção de 10 μΕ contendo, aproximadamente, 50 ng de ARN total por μΕ e Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), MgC12 2 mM e KC1 50 mM. A mistura de reacção foi incubada durante 15 min à temperatura ambiente e a ADNase foi inactivada adicionando 1 μL de EDTA 25 mM à mistura e incubando durante 10 min a 65 °C, antes de avaliar quantidade e pureza. A quantidade de ARN celular foi, seguidamente, determinada por medição da OD 2 60 nm S da OD 280 nm ·

Transcrição in vitro de ARNm do gene BlaZ de S. aureus

Foi purificado um fragmento de PCR do gene BlaZ de S. aureus PC 1 com 600 bp, utilizando o QIAQUICK PCR Purification Kit e foi clonado num vector pGEM-T easy (Promega, Madison, WI) com um Rapid DNA Ligation Kit (Roche, Lavai, QC, Canadá), após amplificação por RT-PCR. Resumidamente, a RT-PCR foi realizada com as esferas de RT-PCR "ready to go" (Amersham Pharmacia Biotech), ressuspensa em 45 μΐ; de água isenta de ARNase (Qiagen) , com 1 μΕ do iniciador inverso (10 μΜ 5'-TAGTCTTTTGGAACACCGTC-3' , SEQ ID NO:1) e 2 μΕ de ARN total (25 ng/μΕ). A transcrição reversa foi realizada durante 30 min a 42 °C. Subsequentemente, foi adicionado 1 μL do iniciador directo (10 μΜ, 5'-ACAGTTCACATGCCAAAGAG-3', SEQ ID NO: 2) e 1 μΕ do iniciador inverso (10 μΜ) . O PCR foi realizado a 94 °C. durante 2 min, seguido de 30 ciclos a 94 °C durante 30 s, 60 °C. durante 30 s e 72 °C durante 45 s. O amplicão foi quantificado por espectrofotometria e num gel de agarose de 1,5%. 63

Ligação A ligação do amplicão BLAZ com o sistema pGem-T vector easy foi realizada como se segue: foram misturados 2 μΐ, de tampão 2 (5x) com 1,5 μ]1 de pGem-T easy vector (8 ng/μΐ.) e 2,5 μ]1 do amplicão BlaZ (10 ng/μΒ) . O volume de reacção foi completado para 10 μ]1 com água isenta de ARNase (Qiagen) previamente à adição de 10 μΐϋ de tampão 1 (2x) e 1 μι de ligase de T4 (5 U/mL) . A mistura foi incubada 20 min à temperatura ambiente. Foi, seguidamente, utilizada uma aliquota de 2 μ]1 para transformar células HB101 de E. coli competentes (Gibco Life Technologies). Após rastreio por PCR, o ADN plasmídico foi extraido de colónias positivas, quantificado por espectrofotometria e num gel de agarose a 0,8% e utilizado na transcrição in vitro. A porção do amplicão BLAZ dos novos clones foi, igualmente, sequenciada para confirmar a inserção BLAZ.

Transcrição in vitro O clone pGemT easy-BLAZ foi inicialmente linearizado com Sal I, a montante do promotor T7, previamente à transcrição de ARNm in vitro. Resumidamente, foram misturados 600 ng de ADN linear com 1 μL de cada um dos DNTP (10 mM) e 2 μΒ de polimerase de ARN de T7 (15 υ/μΒ), numa reacção de 20 μΒ. A mistura foi incubada a 37 °C durante 1 h previamente ao tratamento com ADNase I. O ARNm foi purificado com uma coluna RNAeasy (Qiagen) e quantificado por espectrof otometria. O ARNm de BLAZ foi, seguidamente, utilizado numa curva padrão na análise de RT-PCR em Tempo-Real. 64

Detecção do gene BLAZ de S. aureus por RT-PCR quantitativo em Tempo-Real

Foi utilizado o PCR em Tempo-Real à base de fluorescência com nuclease 5', o qual é um método amplamente aceite na medição de niveis de expressão génica para quantificar por RT-PCR o ARN do BlaZ da β-lactamase com o equipamento detector de sequências ABI Prism™ 7700 (TaqMan®) (PE Applied Biosystems, Foster Sity, CA) . O iniciador directo, o iniciador inverso e a sonda TaqMan para amplificação em Tempo-Real por RT-PCR foram concebidos com o prgrama informático PrimerExpress (PE Applied Biosystems), de forma a amplificar especif icamente o gene BLAZ de S. aureus. Resumidamente, foi adicionado ARN (50 ng) a uma mistura de reacção de 50 μΕ contendo 25 μ]0 de One-Step Universal Master Mix para RT-PCR 2x, 1,25 μΕ de MultiScribe 40x e RNase Inhibitor Mix, 4,5 μΕ do iniciador directo (10 μΜ, 5'-AATTAAATTACTATTCGCCAAAGAGCA-3', SEQ ID NO:3), 4,5 μΐ, do iniciador inverso (10 μΜ, 5'-TGCTTAATTTTCCATTTGCGATAA-3', SEQ ID NO: 4) e 1,2 5 μΕ da sonda TaqMan (10 μΜ, 6FAM- ACGCCTGCTGCTTTCGGCAAGA-TAMRA, SEQ ID NO:5). A transcrição reversa com a Transcritase Reversa do virus recombinante da Leucemia Murina de Moloney (M-MuLV) (0,25 U/μΕ) foi realizada a 48 °C durante 30 min. Após activação inicial da polimerase de ADN AmpliTaq Gold (1,25 U/μΕ) a 95 °C, durante 10 min, foram realizados 40 ciclos de PCR a 95 °C, durante 15 s e a 60 °C. durante 1 min. Foi determinado o valor limiar do ciclo (CT) , indicador da quantidade de gene alvo para a qual a fluorescência excede um limiar pré-estabelecido, o qual foi comparado com o CT de uma curva padrão contendo quantidades conhecidas de ARNm (1,1 65 x IO2 a 1,1 χ ΙΟ9) do gene BLAZ de S. aureus obtido por transcrição in vitro. A análise estatistica foi realizada sobre o LOGIO do número de cópias.

Efeito da lactoferrina sobre a actividade da β-lactamase

Os efeitos da LF bovina e da penicilina G sobre a actividade sa β-lactamase foram idênticos aos observados anteriormente (ver o exemplo 4).

Efeito da lactoferrina sobre a transcrição do BlaZ A lactoferrina reduziu (P < 0,001) em 35% os niveis de ARNm em bactérias (Tabela 4) . A Adição de penicilina G ao meio de

crescimento induziu um aumento de 28 vezes (P < 0,01) do número de cópias de ARNm do BlaZ por mL de cultura. Este aumento foi completamente evitado pela adição simultânea de LF 1 mg/mL (Tabela 4) . Estes resultados indicam que a LF reduz a actividade da β-lactamase, inibindo a expressão do gene BlaZ. Os dados respeitantes ao perfil de proteina das bactérias (ver o exemplo 6) mostram que o nivel de várias proteínas (especialmente de proteínas secretadas) foi reduzido pela LF. É aqui, demonstrado que a LF resulta, não apenas numa grande redução do ARNm do BlaZ mas, igualmente, numa redução geral do nível de ARN, indicando uma inibição geral da expressão génica. Consequentemente, a LF pode contrariar todos os mecanismos de resistência a antibióticos que envolvem a expressão de genes. 66 TABELA 1

Concentrações mínimas inibitórias (MICs) da penicilina G, isoladamente ou em combinação com lactoferrina bovina (LF) 0,5 mg/mL ou 1 mg/mL, como determinado pelo método da macrodiluíção contra 13 estirpes de S. aureus S. aureus Tipo de β- MICs da penicilina G ^g/mL) lactamase

Isoladamente + LF 0,5 + LF 1

mg/mL mg/mL ATCC - 0,031 0,031 0,015 25923 SHY97- - 0,015 0,007 0,007 3923 SHY97- + 0,5 0,5 0,25 3906 não caracterizada SHY97- + 64 32 32 4320 não caracterizada PC-1 + A > 128 128 128 constitutiva NCTC + A > 128 128 128 2076 + A 0,5 0,25 0,25 22260 + B 32 16 16 ST79/41 + B 32 16 16 3804 + C 128 64 64 RN 9 + C 128 64 64 FAR 8 + D 16 8 8 FAR 10 + D 2 1 1 67 TABELA 2 MICs e Índice FIC da penicilina em combinação com lactoferrina bovina (LF) de MICs como determinados pelo método da macrodiluíção de tabuleiro de damas contra algumas estirpes de S. aureus

Estirpe MIC ^g/mL) índice FIC LF Diminuição Penicilina Diminuição S. aureus 780 32 0,0156 2 0,53 (S) ATCC 25923 S. aureus 1560 16 0,125 4 0,31 (S) SHY97-3906 S. aureus 390 64 16 4 0,26 (S) SHY97-4320 S. aureus 390 64 128 > 2 < 0,51 (S) PC 1 0 índice FIC foi calculado como descrito no texto e a sua interpretação entre parênteses foi: S, sinergia (< 1). 68 TABELA 3 Números de partículas WGA-ouro por μιη de parede celular bacteriana. S. aureus SHY97-4320 foi tratada com penicilina G 8 μg/mL (PG), lactoferrina 1 mg/mL (LF), isoladamente ou em combinação

Tratamento Número médio de partículas de WG-ouro V SME Controlo 43,22 V 4,14 PG 26, 50 V 5,29 LF 24,41 V 3,20 PG-LF 26, 09 V 1,59 SME, erro padrão das médias. TABELA 4

Efeitos da lactoferrina (1 mg/mL) e/ou da penicilina G sobre a expressão génica da β-lactamase (BlaZ) na estirpe SHY97-4320 de S. aureus

Parâmetro Tratamento Controlo Penicilina Lactoferrina PG-LF G (PG) (LF) RNA1 (:g/mL) 2,90 ± 0,26 3,22 ± 0,49 1,88 ± 0,68 1,89 ± 0, 61 BlaZ1 1, 1 x 104 22,9 x 104 1,4 x 104 0, 6 x 104 BlaZ total2 6,1 x 102 174,9 x 102 5,6 x 10b 2,2 x 102 1 Ajustado para uma OD54o nm de 1,0. 2 Número de cópias do ARNm do gene BlaZ/50 ng de ARNm. 69 3 Número total de cópias do ARNm do gene BlaZ/mL de cultura.

Embora a invenção tenha sido descrita em ligação às suas formas de realização especificas, será entendido que esta se encontra apta para novas modificações e que este pedido se destina a abranger quaisquer variações, utilizações ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo todas as variações da presente divulgação, como resulta da prática conhecida ou normal dentro da técnica à qual a invenção pertence e de como pode ser aplicada às características essenciais anteriormente estabelecidas e, como se segue, no âmbito das reivindicações em anexo. 70

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Sa Majesté La Reine du Chef du Canada -Agriculture et Agroalimentaire Canada DIARRA, Moussa S. LAÇASSE, Pierre PETITCLERC, Denis

<120> MÉTODO E COMPOSIÇÃO PARA TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO de INFECÇÕES POR MICRORGANISMO RESISTENTE A ANTIBIÓTICO <130> 14 654-lpct <150> US 60/172.577 <151> 1999-12-20 <160> 5 <170> FastSEQ para Windows Versão 3.0 <210> 1 <211> 20

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador inverso para o gene BlaZ de S. Aureus <4 0 0> 1 tagtcttttg gaacaccgtc 20 71 <210> 2

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador directo para ο gene BlaZ de S. Aureus <400> 2 acagttcaca tgccaaagag 20

<210> 3 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador directo para quantificar ARN de BlaZ da beta-lactamase <400> 3 aattaaatta ctattcgcca aagagca 27

<210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador inverso para quantificar ARN de BlaZ da beta-lactamase 72 <4Ο0> 4 24 tgcttaattt tccatttgcg ataa <210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sonda TAQMan <4 0 0> 5 acgcctgctg ctttcggcaa ga 22

Lisboa, 8 de Junho de 2006 73

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição para inibir β-lactamase num microrganismo, compreendendo ampicilina, em que a referida ampicilina se encontra numa concentração de 4 μρ/ιη]1 e uma proteína seleccionada do grupo consistindo numa lactoferrina, uma lactoferricina ou um seu fragmento, em associação com um veículo aceitável.
2. Composição para inibir β-lactamase num microrganismo, compreendendo cefazolina, em que a referida cefazolina se encontra na concentração de cerca de 0,5 μg/mL e uma proteína seleccionada do grupo consistindo numa lactoferrina, uma lactoferricina ou um seu fragmento, em associação com um veículo aceitável.
3. Composição para inibir β-lactamase num microrganismo, compreendendo neomicina, em que a referida neomicina se encontra na concentração entre 0,125 μρ/ιηΐ; e 1 μρ/ιτΛ, e uma proteína seleccionada do grupo consistindo numa lactoferrina, uma lactoferricina ou um seu fragmento, em associação com um veículo aceitável.
4 . num microrganismo e uma proteína lactoferrina, uma associação com um Composição para inibir β-lactamase compreendendo novobiocina, penicilina seleccionada do grupo consistindo numa lactoferricina ou um seu fragmento, em veículo aceitável. 1
5. Método in vitro para desinfectar e/ou prevenir a infecção de uma superfície por microrganismo produtor de β-lactamase, compreendendo o referido método, o tratamento da referida superfície com uma quantidade eficiente de lactoferrina ou lactoferricina.
6. Método de acordo com a reivindicação 5 que compreende adicionalmente o tratamento com, pelo menos, um antibiótico.
7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o referido microrganismo é seleccionado do grupo consistindo em Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Enterococcus, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, histeria, Erysipelothrix, Propionibacterium, Eubacterium, Corynobacterium, Mycoplasma, Ureaplasma, Streptomyces, Haemophilus, Nesseria, Eikenella, Moraxellus, Actinobacillus, Pasteurella, Bacteroides, Fusomicroorganism, Prevotella, Porphyromonas, Veillonella, Treponema, Mitsuokella, Capnocytophaga, Campylobacter, Klebsiella, Shigella, Proteus e Vibriae.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o referido antibiótico é seleccionado do grupo consistindo em aminoglicósidos, vancomicina, rifampina, lincomicina, cloranfenicol e o fluoroquinol, penicilina, beta-lactamas, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, mezlocilina, nafcilina, oxacilina, piperacilina, ticarcilina, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefuroxima, cefalexina, cefalotina, imipenem, aztreonam, gentamicina, netilmicina, tobramicina, tetraciclinas, sulfonamidas, macrólidos, eritromicina, claritromicina, 2 azitromicina, polimixina B, ceftiofur, cefazolina, cefapirina e clindamicina.
9. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a referida superfície é seleccionada do grupo consistindo numa parede, um chão, um tecto, um dispositivo médico, um elemento de mobiliário médico, um dispositivo cirúrgico, uma prótese, uma órtese, um contentor de distribuição fluido biológico, (e.g., saco de sangue, frasco de gotas oftálmicas), um dispositivo de processamento de alimentos, um dispositivo colector de alimentos e um tubo.
10. Utilização de lactoferrina e/ou lactoferricina na produção de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de infecções causadas por microrganismo produtor de β-lactamase.
11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a referida lactoferrina e/ou lactoferricina se encontra em associação com, pelo menos, um antibiótico.
12. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o referido microrganismo é seleccionado do grupo consistindo em Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Enterococcus, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Listeria, Erysipelothrix, Propionibacterium, Eubacterium, Corynobacterium, Mycoplasma, Ureaplasma, Streptomyces, Haemophilus, Nesseria, Eikenella, Moraxellus, Actinobacillus, Pasteurella, Bacteroides, Fusomicroorganism, Prevotella, Porphyromonas, Veillonella, Treponema, Mitsuokella, Capnocytophaga, Campylobacter, Klebsiella, Shigella, Proteus e Vibriae. 3
13. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o referido antibiótico é seleccionado do grupo consistindo em aminoglicósidos, vancomicina, rifampina, lincomicina, cloranfenicol e o fluoroquinol, penicilina, beta-lactamas, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, mezlocilina, nafcilina, oxacilina, piperacilina, ticarcilina, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefuroxima, cefalexina, cefalotina, imipenem, aztreonam, gentamicina, netilmicina, tobramicina, tetraciclinas, sulfonamidas, macrólidos, eritromicina, claritromicina, azitromicina, polimixina B, ceftiofur, cefazolina, cefapirina e clindamicina.
14. Utilização de acordo com a reivindicação 10 para desinfectar uma superfície seleccionada do grupo consistindo numa parede, um chão, um tecto, um dispositivo médico, um elemento de mobiliário médico, um dispositivo cirúrgico, uma prótese, uma órtese, um contentor de distribuição de fluido biológico, (e.g. saco de sangue, frasco de gotas oftálmicas), um dispositivo de processamento de alimentos, um dispositivo colector de alimentos e um tubo. Lisboa, 8 de Junho de 2006 4