PT1123094E - Armário eléctrico de perfis de armação. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES TERAPÊUTICAS (II)" A presente invenção refere-se a composições adequadas para administração a humanos e animais que têm a propriedades de aumentar os níveis de (R)-3-hidroxibutirato (ácido (R)-3-hidroxibutírico ou D^-hidroxibutirato) quando administradas, particularmente quando administradas oralmente, topicamente, subcutaneamente ou parentericamente, mas de forma muito vantajosa oralmente. A administração de ácido (R)-3-hidroxibutírico exerce algumas acções benéficas no corpo humano e animal. Estas incluem, inter alia, aumento da eficiência cardíaca, por exemplo, em falha cardíaca, fornecimento de uma fonte de energia alternativa à glucose, por exemplo, em diabetes e estados resistentes à insulina, e tratamento de perturbações causadas por danos em células neuronais, por exemplo, células do SNC, particularmente por retardamento ou prevenção de danos cerebrais, como em doença de Alzheimer e Parkinsonismo e doenças e estados semelhantes.

Foi mostrado que o hidroxibutirato de sódio aumenta a circulação cerebral e reflexos vasomotores regionais até 40% (Biull. Eksp. Biol. Med. Volume 88 11, páginas 555-557). A patente EP 0780 123 A 1 também ensina a utilização de acetoacetato, β-hidroxibutirato, ésteres de álcoois mono-hídricos, di-hídricos ou tri-hídricos destes ou oligómeros lineares com 2 até 10 repetições de β-hidroxibutirato para suprimir edema cerebral, proteger a função 3 cerebral, rectificar o metabolismo da energia cerebral e reduzir a extensão de enfarte cerebral.

Efectuou-se infusão intravenosa de sais de sódio de (R)-3-hidroxibutirato em sujeitos humanos normais e pacientes para tratar alguns estados, por exemplo, os submetidos a tratamento de sepsia grave numa unidade de cuidados intensivos, tendo-se verificado que não é tóxica e que é capaz de diminuir a concentração de ácidos gordos sem glucose e de glicerol, mas é ineficaz para reduzir a oxidação de leucina. 0 presente inventor também determinou que compostos e composições que aumentem os níveis sanguíneos de ácido (R)-2-hidroxibutírico e/ou acetoacetato também são úteis na redução de radicais livres in vivo e, assim, podem ser utilizados no tratamento de doenças associadas a radicais livres. 0 (R)-3-hidroxibutirato e acetoacetato, habitualmente referidos como corpos cetona, proporcionam uma alternativa fisiológica normal aos substratos habituais de produção de energia, glucose e ácidos gordos. Durante jejum prolongado do homem, os ácidos gordos são convertidos pelo fígado em ácido (R)-3-hidroxibutírico e acetoacetato, que podem ser utilizados pela maior parte dos tecidos principais do corpo excepto o fígado. Nestas condições, o total no sangue de corpos cetona está aumentado para cerca de 7 mM. Quando estes compostos estão modestamente aumentados no sangue, tecidos extra-hepáticos, como cérebro, coração e músculo-esquelético, utilizam estes corpos cetona nas mitocôndrias para conferir poder redutor na forma de NADH, que é o substrato principal do sistema de transporte de electrões e 4 gerador da energia necessária para a sintese de ATP. Por sua vez, a geração de NADH mitocondrial por cetonas diminui a razão de [NAD+] / [NADH] mitocondrial livre e a razão de [nadp+]/[nadph] citosólico à qual está ligada a [NAD+] / [NADH] mitocondrial. Se bem que o catabolismo de cetonas reduza a [NAD+] /[NADH] mitocondrial, oxida a razão de [ubiquinona]/[ubiquinol] mitocondrial, [Q]/[QH2]. A forma de semiquinona do ubiquinol é a principal fonte da geração por mitocôndrias de superóxido, 02”. Ao diminuir a quantidade da forma reduzida QH2 e da sua semiquinona é possível diminuir a geração de radicais livres por mitocôndrias aumentando simultaneamente os agentes de remoção de radicais livres ligados ao sistema NADP, como glutationa.

Assim, 0 inventor determinou que os danos provocados por radicais livres resultantes do excesso de Q reduzida ou de inibição da NADH desidrogenase, como ocorre em toxicidade induzida por MPP, podem ser reduzidos por administração de agentes que aumentem os níveis de corpos cetona in vivo.

Alguns processos de doença envolvem danos ocasionados por radicais livres, entre os quais se contam as doenças neurológicas: doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer e isquemia cerebral. Adicionalmente, foi relatado que danos excessivos ocasionados por radicais livres desempenham um papel em reperfusão coronária, angiopatia diabética, doença inflamatória do intestino e pancreatite. A patente co-pendente do inventor WO 98/41201 revela a administração de ésteres lineares de ácido (R)-3- 5 hidroxibutírico e/ou acetoacetato na produção de níveis aumentados dos compostos livres in vivo. Foi mostrado que a administração oral de soluções 4 mM do oligómero tetra-(R)-3-hidroxibutirato ou do seu éster acetoacetilo aumenta os níveis no sangue de corpos cetona, tendo-se medido os níveis de (R)-3-hidroxibutirato, que aumentaram em 1 ou 2 mM durante períodos superiores a 2 horas. 0 inventor determinou agora que se obtêm vantagens inesperadas quando o componente ácido (R)-3-hidroxibutírico dessa composição é administrado na forma de oligómero cíclico. Estas vantagens podem incluir, inter alia, (a) eficiência acrescida no aumento dos níveis no sangue de ácido (R)-3-hidroxibutírico, de modo que os níveis podem aumentar em mais de 2 mM, incluindo chegar a níveis próximos dos que se obtêm em jejum e superiores, (b) manutenção de níveis elevados durante períodos de várias horas, (c) aptidão para serem administrados sem contra-ião, como sódio ou metilglucamina, quando não for desejável aumentar a carga de sal num paciente ou quando se pretender dosagem significativa, e (d) facilidade relativa de preparação do composto puro a partir de materiais de partida poliméricos disponibilizados por biocultura. A presente candidatura aborda particularmente o problema de doenças neurodegenerativas, particularmente doenças em que os neurónios estão sujeitos a efeitos neurotóxicos de agentes patogénicos, como placas de proteínas e danos oxidativos, e também proporciona composições para utilização no tratamento destas e das perturbações acima mencionadas. 6

Em especificações preferidas, a presente invenção proporciona o aumento de cetonas no sangue necessário para corrigir os defeitos descritos acima, que pode ser obtido por administração parentérica ou entérica. Particularmente, não requer a administração de agentes farmacológicos potencialmente tóxicos. A eficácia acrescida da presente invenção no aumento dos níveis, particularmente dos níveis no sangue, de corpos cetona proporciona efeitos terapêuticos da dieta cetogénica clássica, que se verificou não ser tóxica em crianças, com nenhuns dos efeitos secundários que a tornam inapropriada para utilização em adultos. Suplementarmente, o inventor determinou que, com a correcção dos defeitos metabólicos e tóxicos acima mencionados, as respostas de citoquinas e o aumento de péptidos apoptóticos em células em degeneração diminuirão devido ao aumento do estado de energia de células neuronais e à estimulação trófica acrescida resultante da síntese aumentada de neurotransmissores, por exemplo, acetilcolina. 0 tratamento que o presente inventor proporciona vai além dos efeitos de corpos cetona na circulação, pois proporciona o tratamento de células incapazes de funcionar devido a neurodegeneração e/ou defeitos metabólicos, particularmente no metabolismo da glucose, por exemplo, causados por agentes neurotóxicos como péptidos, proteínas, danos ocasionados por radicais livres e efeitos de anormalidade genética. 0 tratamento envolve a acção de corpos cetona nas próprias células e não do fluxo de sangue para elas.

Assim, num primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionada a utilização de um éster cíclico de (R)-3-hidroxibutirato de fórmula (1): 7

em que n é um inteiro de 1 ou mais, ou de um complexo deste com um ou mais catiões ou respectivo sal, para utilização no fabrico de um medicamento destinado ao tratamento de estados de doenças neurodegenerativas ou de diabetes do tipo II, em que o tratamento não consiste no controlo de crises de epilepsia.

Para distribuição oral, o oligómero cíclico livre pode ser preferido. Quando estiverem presentes catiões num complexo, catiões preferidos são sódio, potássio, magnésio e cálcio e estão equilibrados por um contra-ião fisiologicamente aceitável, proporcionando um complexo de sal.

Exemplos de sais típicos fisiologicamente aceitáveis serão seleccionados de entre sódio, potássio, magnésio, L-Lisina e L-arginina ou, por exemplo, sais mais complexos, como os sais de metilglucamina. Os ésteres serão os descritos previamente para outros aspectos da invenção.

Preferivelmente, n é um inteiro desde 1 até 200, mais preferivelmente desde 1 até 20, muito preferivelmente desde 1 até 10 e particularmente é 3, isto é, (R,R,R)-4,8,12-trimetil-1,5,9-trioxa-2,6,10-dodecatriona. 8 A utilização dos ésteres ciclicos da invenção destina-se preferivelmente à preparação de medicamentos para o tratamento de estados de doenças neurodegenerativas mediadas por radicais livres, agentes tóxicos, como péptidos e proteínas, defeitos genéticos, resistência à insulina ou outros defeitos ou estados indutores de defeitos do metabolismo da glucose, isquemia e traumatismo craniano. A utilização inclui para o fabrico de um estimulador neuronal, por exemplo, capaz de estimular o crescimento de axónios e/ou dendrites em nervos, por exemplo, células do hipocampo ou da substantia nigra, in vivo ou in vitro, particularmente em estados em que a neurodegeneração tem consequências clinicas graves, através do seu efeito promotor dos níveis no sangue e plasma de (R)-3-hidroxi-butirato e acetoacetato.

Particularmente, a composição do medicamento é adequada para administração parentérica ou entérica, particularmente para administração oral. Quando a composição se destinar a utilização parentérica, será esterilizada e não terá pirogénios. Para utilização oral, a composição pode incluir uma base alimentícia e pode tomar a forma de uma emulsão ou simples mistura com alimentos sólidos.

Particularmente, o(s) oligómero(s) cíclico(s) constitui (constituem) uma quantidade eficaz da composição total do medicamento, por exemplo, pelo menos % ou mais, por exemplo, pelo menos 5% da composição por peso, mais preferivelmente 20% ou mais e muito preferivelmente 50% até 100%. A composição pode ser adaptada para administração 9 oral, parentérica ou qualquer outra forma de administração convencional.

Em formas preferidas de todos os aspectos da invenção, o composto de fórmula (I) é administrado juntamente com uma razão fisiológica de acetoacetato ou de um precursor metabólico de acetoacetato. 0 termo respectivo precursor metabólico refere-se particularmente a compostos que incorporam fracções acetoacetilo, como acetoacetil-1,3-butanodiol, acetoacetil-D-p-hidroxibutirato e acetoacetil-glicerol. Também são contemplados ésteres de quaisquer desses compostos com álcoois mono-hídricos, di-hídricos ou tri-hídricos ou superiores, por exemplo, glucosílico.

Esta utilização dos oligómeros cíclicos em pacientes diabéticos permite manter níveis baixos de açúcar no sangue sem recear complicações hipoglicémicas. Em sujeitos normais não diabéticos, o nível de açúcar no sangue em jejum é 80 até 90 mg % (4,4-5 mM), subindo até 130 mg % (7,2 mM) após uma refeição. Em diabéticos, o "controlo estrito" da diabetes tem sido recomendado desde há muito como método de retardamento de complicações vasculares, mas, na prática, é difícil para os médicos controlarem estritamente os açúcares no sangue abaixo de 150 mg % (8,3 mM) após uma refeição devido a episódios hipoglicémicos. O coma hipoglicémico ocorre regularmente em sujeitos normais cujo açúcar no sangue diminua para 2 mM. Como discutido anteriormente (62, 63), na presença de 5 mM de cetonas no sangue não há sintomas neurológicos quando os açúcares no sangue diminuem para menos de 1 mM. O presente inventor determinou que a suplementação de diabéticos de tipo II com oligómeros cíclicos da invenção 10 permite controlar melhor o açúcar no sangue, prevenindo assim as alterações vasculares que ocorrem agora no olho e no rim após 20 anos de diabetes e que são a principal causa de morbidez e mortalidade em diabéticos.

Perturbações particulares que podem ser tratadas com estes medicamentos são aplicáveis a todos os estados que envolvam bloqueio da PDH, incluindo os estados que ocorrem após traumatismo craniano ou que envolvem redução ou eliminação do fornecimento de acetil-CoA para a mitocôndria, como coma de insulina ou hipoglicemia, defeitos no transportador de glucose no cérebro ou noutras partes do corpo (80) ou em passos de enzimas glicoliticas ou no transporte de piruvato.

Quando o medicamento ou nutracêutico compreender acetoacetato, preferivelmente não é armazenado durante um período de tempo prolongado nem é exposto a temperaturas superiores a 40°C. O acetoacetato é instável por aquecimento e decompõe-se violentamente a 100°C em acetona e CO2. Nessas circunstâncias, é preferido que o acetoacetato seja gerado pela composição por contacto com os processos metabólicos dos corpos. Preferivelmente, a composição compreende um precursor éster do acetoacetato. O inventor também determinou que corpos cetona, fornecidos pela administração dos oligómeros cíclicos do ácido (R)-3-hidroxibutirico em quantidades suficientes para aumentar a concentração total no sangue de corpos cetona para níveis elevados, proporcionam uma manutenção mais simples da viabilidade celular; na prática, melhoram a função e crescimento celulares para além dos níveis normais, isto é, de controlo, de um modo que não está 11 relacionado com o fluxo de sangue ou com a nutrição. Neste aspecto, a invenção também proporciona a utilização dos oligómeros cíclicos como agentes capazes de produzir estimulação neuronal, isto é, actividade do tipo factor de crescimento dos nervos, aumento da taxa metabólica e aumento da extensão de características funcionais, como axónios e dendrites. Este aspecto da presente invenção oferece um mecanismo de melhoria da função neuronal, bem como simples retardamento da degradação. 0 trabalho recente de Hoshi e colaboradores (77,78) sugere fortemente que uma parte da proteína amilóide, cuja acumulação é a característica distintiva da doença de Alzheimer, Αβΐ-42 j actua como uma proteína quinase de histidina mitocondrial que fosforila e inactiva o complexo multienzimático piruvato desidrogenase. O complexo PDH é uma enzima mitocondrial responsável pela geração de acetil-CoA e NADH a partir do piruvato produzido por glicólise no citoplasma. A acetil-CoA mitocondrial formada condensa com oxaloacetato, fazendo com que o ciclo TCA de Krebs proceda à combustão completa de piruvato em C02 enquanto confere às mitocôndrias poder redutor que se torna no substrato do sistema de transporte de electrões através do qual é gerada a energia necessária para a síntese de ATP mitocondrial. A utilização de corpos cetona no cérebro é limitada pelo transporte, ocorrendo menor utilização nos gânglios basais para níveis no sangue inferiores a 1 mM (76). No entanto, aos níveis de 7,5 mM atingidos no homem normal por jejum prolongado, a taxa de entrada de corpos cetona no cérebro é suficiente para satisfazer a maior parte das necessidades de energia cerebral e para prevenir sintomas 12 hipoglicémicos, mesmo para níveis de açúcar no sangue que normalmente causariam convulsões ou coma (63).

Na candidatura co-pendente WO 98/41201, "Therapeutic compositions", o inventor põe a hipótese de, em doença de Alzheimer, quando ocorre um bloqueio da PDH que evita a produção normal de energia a partir da glucose, se for possível fornecer níveis em jejum aumentados, isto é, normais de cetonas, então é possível contornar o bloqueio de PDH presente nestes pacientes, desse modo prevenindo a morte celular devido a depleção de energia ou ausência de estimulação colinérgica, e, assim, abrandar a progressão da perda de memória e demência. Suplementarmente, ao utilizar os efeitos de crescimento/estimulador dos nervos dos corpos cetona, particularmente (R)-3-hidroxibutirato ou uma razão fisiológica deste com acetoacetato, as células que ainda são viáveis podem melhorar para além do estado até ao qual foram degeneradas e, em conformidade, observar-se-ão algumas melhorias da função nos pacientes.

Em animais nutridos e no homem, o teor de acetoacetato no fígado, que é essencialmente o do sangue, é muito baixo, por exemplo, 0,09 mM, e o do (R) -3-hidroxibutirato é 0,123 mM, mas, após um jejum de 48 horas, aumentam para, por exemplo, 0,65 mM de acetoacetato e 1,8 mM de (R)-3-hidroxibutirato (84) . Os corpos cetona aumentam em jejum prolongado porque o decréscimo de insulina diminui a re-esterificação de ácidos gordos em triglicéridos em tecido adiposo, provocando a libertação de ácidos gordos livres para a corrente sanguínea. Em seguida, os ácidos gordos livres libertados podem ser absorvidos e utilizados como fonte de energia pelo músculo, coração, rim e fígado no processo de β-oxidação. Todavia, o fígado tem a capacidade 13 de converter os ácidos gordos livres num combustível metabólico, cetonas, a ser utilizado por órgãos extra-hepáticos, incluindo o cérebro, como alternativa à glucose durante períodos de jejum. A síntese hepática de corpos cetona ocorre a partir de acetil-CoA mitocondrial gerada durante a β-oxidação de ácidos gordos pelo fígado.

Os corpos cetona entram em tecidos extra-hepáticos no mesmo transportador, onde outros monocarboxilatos podem actuar como inibidores competitivos. Isómeros não fisiológicos, como (D)-lactato ou (S)-3-hidroxibutirato, também podem actuar como inibidores competitivos do transporte de corpos cetona. Uma vez que o transporte de corpos cetona através da barreira hematoencefálica é um factor limitador da utilização de corpos cetona no cérebro (76), devem envidar-se todos os esforços para manter a concentração no sangue destes enantiómeros não fisiológicos em níveis baixos durante a terapia cetogénica. Quando as concentrações no sangue de corpos cetona são aumentadas para níveis típicos de jejum prolongado, o coração, músculo, rim e cérebro utilizam corpos cetona como substrato energético preferido.

Assim, o presente inventor determinou que a acetil-CoA mitocondrial derivada de corpos cetona produzidos utilizando os oligómeros cíclicos ensinados pela presente invenção podem substituir a deficiência de acetil-CoA que ocorre durante a inibição do complexo multienzimático PDH em tecidos dependentes do metabolismo da glucose para o seu fornecimento de energia metabólica. 0 citrado mitocondrial fornecido também pode ser transportado para o citoplasma pelo transportador de ácidos tri- ou dicarboxílicos, onde pode ser convertido em acetil-CoA citoplasmática necessária 14 para a síntese de acetilcolina. As reacções do ciclo de Krebs estão apresentadas no Esquema 1 para ajudar a ilustrar melhor estes conceitos.

Os corpos cetona, em contraste com ácidos gordos livres, não conseguem produzir acetil-CoA no fígado. Uma vez que a acetil-CoA é o precursor essencial de ácidos gordos, não conseguem aumentar a síntese de ácidos gordos ou de colesterol no fígado, que habitualmente é responsável por mais de metade da síntese no corpo destes dois materiais potencialmente patogénicos. 0 fígado é sensível à razão de acetoacetato/(R)-3-hidroxibutirato que lhe é apresentada e irá alterar a sua razão [NAD+] / [NADH] livre mitocondrial devido ao quasi-equilíbrio estabelecido pela β-hidroxibutirato desidrogenase (EC 1.1.1.30) (31).

Inter alia, o que foi mencionado acima também indica ser possível proporcionar um método para aumentar a eficiência da produção de energia mitocondrial num humano ou animal que não sofra de uma doença metabólica crónica ou aguda, que compreende administrar ao humano ou animal uma quantidade de um oligómero cíclico de fórmula (I) suficiente para aumentar os níveis no sangue de (R)-3-hidroxibutirato de 0,5 para 20 mM. 15 Lactato ESQUEMA 1 NAD+c

LDH NADHc+lTc Piruvato

16 0 modo mais fácil de aumentar as cetonas no sangue consiste em jejum prolongado. Em jejum prolongado, as cetonas no sangue atingem níveis de 7,5 mM (62,63). No entanto, esta opção não está disponível a longo prazo, pois normalmente ocorre morte após um jejum de 60 dias. A dieta cetogénica, compreendida maioritariamente por lipidos, tem sido utilizada desde 1921 para o tratamento de epilepsia em crianças, particularmente de crises mioclónicas e acinéticas (109), e demonstrou ser eficaz em casos que não respondem aos meios farmacológicos habituais (71). A administração oral ou parentérica de ácidos gordos livres ou triglicéridos pode aumentar as cetonas no sangue, desde que os hidratos de carbono e a insulina tenham niveis baixos para prevenir a re-esterificação em tecido adiposo. Ratos nutridos com dietas compreendidas por 70% de óleo de milho, 20% de hidrolisado de caseína, 5% de celulose, 5% de mistura de sal de McCollum, desenvolvem cetonas no sangue de cerca de 2 mM. A substituição do óleo de milho por banha de porco aumenta as cetonas no sangue para quase 5 mM (Veech, não publicado).

Em geral, os níveis de corpos cetona atingidos com essas dietas são cerca de 2 mM de (R)-3-hidroxibutirato e 1 mM de acetoacetato, ao passo que os níveis de ácidos gordos são cerca de 1 mM. Tentaram-se outras variações da composição, incluindo triglicéridos de cadeia média. Em geral, a concordância com essas dietas restritas tem sido baixa devido ao seu sabor desagradável (56). Também foram tentadas dietas com elevado teor de lipidos e baixo teor de hidratos de carbono como agentes terapêuticos em pacientes com cancro, para reduzir a disponibilidade de glucose aos tumores (88), como dietas de emagrecimento em pacientes com 17 e sem diabetes (74,112) e para melhorar a tolerância ao exercício (83). São muitas as limitações de dietas que se baseiam em lipidos para aumentar as cetonas no sangue para niveis neurologicamente eficazes. Em primeiro lugar, os niveis de corpos cetona em dietas à base de lipidos tendem a ser inferiores a 3 mM, valor que é significativamente inferior ao nivel de 7,5 mM atingido em humanos obesos durante jejum prolongado. Em segundo lugar, a ingestão não autorizada de hidratos de carbono aumenta a secreção de insulina e provoca um decréscimo rápido da conversão hepática de ácidos gordos livres em cetonas, com queda consequente das cetonas no sangue e desvio de lipidos a serem esterifiçados em triglicéridos por tecido adiposo. Muitos relatos anedóticos referem o reinicio de crises em crianças que "quebraram a sua dieta com o bolo de aniversário". Em terceiro lugar, o seu sabor desagradável e a necessidade de evitar hidratos de carbono para manter niveis elevados de corpos cetona dificultam a utilização dessas dietas ricas em lipidos em adultos e num cenário de paciente externo, particularmente em sociedades que tradicionalmente ingerem teores elevados de açúcares refinados, pão, massa, arroz e batatas. Na prática, a dieta tradicional com elevado teor de cetonas não pode ser imposta a pacientes que não sejam crianças nas idades em que toda a alimentação é preparada em casa com supervisão estrita. Em quarto lugar, a ingestão dessas grandes quantidades de lipidos na população adulta conduziria a hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia significativas com sequelas patológicas de doença vascular acrescida e doença hepática e pancreática esporádica e, em consequência, não seria prescrita numa base médica. A ingestão de dietas com elevado teor de lipidos e baixo teor 18 de hidratos de carbono era popular na década de 1970 para emagrecer tendo em vista o elevado teor calórico, desde que a ingestão de hidratos de carbono fosse baixa. No entanto, devido à consciência crescente da relação entre lípidos no sangue elevados e aterosclerose, a popularidade desta dieta diminuiu abruptamente. A substituição de glucose numa dieta líquida, em que a glucose é responsável por 47% do teor calórico, por 1,3-butanodiol racémico aumentou a concentração de cetonas no sangue em cerca de 10 vezes, para 0,98 mM de (R)-3-hidroxibutirato e 0,33 mM de acetoacetato (107). Estes valores são ligeiramente inferiores aos normalmente obtidos num jejum de 48 horas e muito inferiores aos níveis de 7,5 mM obtidos no homem em jejum. O 1,3-butanodiol racémico é convertido pelo figado em acetoacetato e no L-p-hidroxi-butirato não natural e no Ό-β-hidroxibutirato natural (respectivamente (S)-3-hidroxibutanoato e (R)-3-hidroxi-butirato). Não obstante o 1,3-butanodiol racémico ter sido extensamente estudado como fonte calórica barata em rações para animais e de ter mesmo sido utilizado experimentalmente em dietas humanas (81,101), é provável, a longo prazo, que a produção do L-isómero não natural produza toxicidade significativa, como foi mostrado para a utilização humana do D-lactato não natural (64). Uma desvantagem da administração do L-isómero não natural é o facto de competir, quanto ao transporte, com o (R)—3— hidroxibutirato natural. Assim, fornecer (R)-1,3-butanodiol como precursor de corpos cetona é uma possibilidade que evita a administração ou produção desnecessária do isómero não natural. 19

Os ésteres mono- e di-acetoacetilo do 1,3-butanodiol racémico foram sugeridos como fonte de calorias e foram testados em porcos (67) . A administração oral de um bolus de uma dieta que continha 30% de calorias na forma dos ésteres produziu um máximo breve de corpos cetona para 5 mM. No entanto, a utilização do 1,3-butanodiol racémico, com a sua produção do (S)-3-hidroxibutanoato anormal, não deve ser recomendada pelos motivos apresentados acima.

Se bem que a utilização do 1,3-butanodiol racémico nessas formulações não seja recomendada, os ésteres de (R)-1,3-butanodiol podem ser utilizados, isoladamente ou na forma do éster acetoacetato. Estudos em ratos mostraram que a nutrição com 1,3-butanodiol racémico diminuiu a [NAD']/[NADH] citosólica no fígado de 1500 para cerca de 1000 (87). Comparativamente, a administração de etanol reduz a [NAD-]/[NADH] hepática para cerca de 200 (106). O acetoacetato, quando preparado de fresco, pode ser utilizado em soluções de infusão, onde pode ser administrado em razões fisiologicamente normais com (R)—3 — hidroxibutirato para obter um efeito óptimo (95). Devido aos requisitos de fabrico que presentemente requerem longo tempo de vida por armazenamento e fluidos esterilizados a quente, o acetoacetato tem sido frequentemente administrado na forma de um éster. Isto tem sido feito para aumentar o seu tempo de vida por armazenamento e para aumentar a sua estabilidade ao aquecimento durante a esterilização. Estimou-se que a actividade de esterases na corrente sanguínea é cerca de 0,1 mmol/minuto/ml e no fígado é cerca de 15 mmol/minuto/g (68). Para além dos ésteres que combinam 1,3-butanodiol e acetoacetato, também têm sido extensamente estudados ésteres de glicerol de acetoacetato 20 em nutrição parentérica (59) e entérica (82). Foi relatado que essas preparações diminuem a atrofia dos intestinos, devido à elevada absorção de acetoacetato por células dos intestinos, e são úteis no tratamento de queimaduras (85).

Para especificações preferidas da presente invenção, em condições óptimas, deve produzir-se uma razão fisiológica de cetonas por administração de oligómeros cíclicos e acetoacetato. Não sendo este o caso, no animal, o fígado ajustará a razão de cetonas de acordo com a sua própria razão [NAD']/[NADH] livre mitocondrial. Se for apresentada uma razão anormal de cetonas, o fígado ajustará a razão, com alterações coincidentes da razão [NAD']/[NADH] no fígado. No coração a bater, a perfusão com acetoacetato como único substrato induz rapidamente falha cardíaca (99), em contraste com corações de rato submetidos a perfusão com uma mistura de glucose, acetoacetato e (R)-3-hidroxi-butirato, em que a eficiência cardíaca aumentou devido a uma razão fisiológica de corpos cetona (95).

Os oligómeros cíclicos para utilização na presente invenção são convenientemente sintetizados a partir de poliésteres produzidos por microrganismos. Poliésteres naturais de (R)-3-hidroxibutirato são vendidos como mercadorias, por exemplo, na forma de polímeros de PM 530 000 de Alcaligenes eutrophus (Sigma Chemical Co., St. Louis) ou na forma de polímeros de PM 250 000 para beterraba de açúcar (Fluka, Suiça). As bactérias produzem o polímero como fonte de nutrientes armazenados. A fermentação destes polímeros por bactérias foi desenvolvida na década de 1970, pela ICI no Reino Unido e pela Solvay et Cie. na Bélgica, como plástico potencialmente biodegradável para revestimentos de tampões e outras utilizações. O 21 sistema responsável pela síntese do poli-(R)-3-hidroxi-butirato foi agora clonado, tendo sido produzidas variações da composição do polímero com base nos substratos dados às bactérias. Os genes responsáveis pela síntese de polialcanoatos foram clonados e expressos nalguns microrganismos (93,102,113), permitindo produzir este material numa variedade de organismos em condições extremamente variáveis.

Formas preferidas de (R)-3-hidroxibutirato oligomérico cíclico são, pelo menos em parte, facilmente digeríveis e/ou metabolizadas por humanos ou animais. Estas têm, preferivelmente, 2 até 200 repetições, tipicamente 2 até 20 e muito convenientemente desde 3 até 10 repetições de comprimento, particularmente 3 repetições, isto é, a triolida. Entender-se-á que podem empregar-se vantajosamente misturas desses oligómeros, podendo obter-se toda uma gama de características de absorção. De modo semelhante , podem ser proporcionadas misturas com o monómero ou oligómeros lineares ou polímeros com a finalidade de modificar o perfil do nível no sangue produzido.

Oligómeros cíclicos para utilização na invenção podem ser obtidos, ínter alia, por métodos descritos por Seebach et al., Helvetia Chimica Acta, Volume 71 (1988), páginas 155-167, e Seebach et al., Helvetia Chimica Acta, Volume 77 (1994) páginas 2007 até 2033. Nalgumas circunstâncias poderão ser preferidos oligómeros cíclicos com 5 até 7 ou mais unidades (R)-3-hidroxibutirato, pois as suas ligações poderão ser mais facilmente quebradas in vivo. Os métodos de síntese dos compostos aí descritos são aqui incorporados por referência. 22

Depois do monómero estar na corrente sanguínea, e uma vez que o fígado é incapaz de metabolizar corpos cetona, podendo apenas alterar a razão (R)-3-hidroxibutirato/ acetoacetato, os corpos cetona são transportados para tecidos extra-hepáticos, onde podem ser utilizados. Os níveis de cetonas atingidos no sangue não estão sujeitos a variações causadas por ingestão não concordante de hidratos de carbono, como acontece com a presente dieta cetogénica. Ao invés, serão simplesmente um aditivo à dieta normal, administrados em quantidades suficientes para produzir um nível prolongado no sangue, tipicamente entre 0,3 e 20 mM, mais preferivelmente 2 até 7,5 mM, durante um período de 24 horas, dependendo do estado a ser tratado. No caso de epilepsia infantil resistente, presentemente pensa-se que níveis no sangue de 2 mM sejam suficientes. No caso de doença de Alzheimer, podem mesmo fazer-se tentativas para manter os níveis em 7,5 mM ou superior, como atingido em estudos no homem em jejum, num esforço para proporcionar fornecimentos alternativos de energia e acetil-CoA a tecido do cérebro em pacientes de Alzheimer nos quais a capacidade de PDH está enfraquecida devido a quantidades excessivas do péptido amilóide Αβι_42 (77, 78). A determinação pelo inventor de que o (R)-3-hidroxi-butirato e suas misturas com acetoacetato actuam como estimulador dos nervos, por exemplo, estimulador do crescimento dos nervos e/ou estimulador do crescimento de axónios e dendrites, oferece a opção de aumentar os níveis de corpos cetona em graus inferiores aos necessários nutricionalmente para tratar neurodegeneração.

As composições da invenção são preferivelmente esterilizadas e não têm pirogénios, particularmente não têm 23 endotoxinas. Em segundo lugar, são preferivelmente formuladas de modo a terem sabor agradável quando administradas como aditivo a uma dieta normal, com a finalidade de melhorar a concordância dos pacientes para tomarem os suplementos. Os oligómeros cíclicos são geralmente inodoros. Formulações dos oligómeros cíclicos de (R)-3-hidroxibutirato e suas misturas com acetoacetato podem ser revestidas com agentes de mascaramento ou podem ser dirigidas para o intestino revestindo-as entericamente ou encapsulando-as, como é bem conhecido na área farmacêutica ou de nutracêuticos.

Uma vez que os corpos cetona têm desde cerca de 4 até 6 calorias/g, preferivelmente haverá um decréscimo compensatório das quantidades ingeridas dos outros nutrientes, para evitar obesidade.

Vantagens particulares da utilização dos oligómeros cíclicos ensinados na presente invenção são: 1) podem ser ingeridos com um teor dietético normal de hidratos de carbono sem diminuir os níveis no sangue de corpos cetona, cujo decréscimo enfraqueceria os efeitos do tratamento, 2) não aumentarão as VLDL e colesterol no sangue, como acontece com dietas correntes com natas e margarina, desse modo eliminando o risco de doença vascular acelerada, fígado gordo e pancreatite, 3) terão uma gama de utilização mais ampla numa variedade maior de pacientes, incluindo mas não se limitando a estes: diabetes de tipo II, para prevenir crises de hipoglicemia e coma, em doença de Alzheimer e outros estados 24 neurodegenerativos, para prevenir a morte de nervos, por exemplo, células do hipocampo.

Os oligómeros ciclicos da invenção podem ser utilizados em aplicações orais e parentéricas em emulsões, ao passo que o acetato, no estado não esterifiçado, é menos preferido, pois é propenso a descarboxilação espontânea em acetona com um tempo de semi-vida, à temperatura ambiente, de cerca de 30 dias. Quando as composições da invenção incluírem acetoacetato, este pode estar presente na forma de um precursor. O acetoacetato pode ser convenientemente fornecido como ésteres de (R)-3-hidroxibutirato, como proporcionado pela candidatura co-pendente "Therapeutic compositions". O tratamento pode compreender administrar uma porção significativa da ingestão calórica dos pacientes na forma do oligómero ou oligómeros de (R)-3-hidroxibutirato ciclico(s) formulado(s) para proporcionar libertação retardada, de modo a manter as cetonas no sangue na gama elevada, por exemplo, 0,5 até 20 mM, preferivelmente na gama de 2-7,5 mM, durante um período de 24 horas. A libertação dos corpos cetona no sangue pode ser restringida por uma variedade de técnicas, como microencapsulação, adsorção e afins, que são presentemente implementadas na administração oral de alguns agentes farmacêuticos. Formas revestidas entericamente destinadas a distribuição pós-estômago podem ser particularmente utilizadas quando o material não requerer, ou não for susceptível a hidrólise em ambiente ácido. Quando for desejada alguma hidrólise podem utilizar-se formas não revestidas. Algumas formas podem incluir enzimas capazes de clivar os ésteres para 25 libertar os corpos cetona, como as referidas em "Doi. Microbial Polyesters".

Oligómeros cíclicos preferidos, por exemplo, a triolida, podem ser meramente adicionados como tal a géneros alimentícios e/ou podem ser suplementados, num regime de tratamento, com outros geradores de corpos cetona com perfis de libertação diferentes, como o (R)—3— hidroxibutirato monomérico. Este último pode ser fornecido na forma de uma solução aquosa, por exemplo, na forma de um sal, por exemplo, sal de sódio, potássio, magnésio ou cálcio.

Para uma dieta de 1500 calorias, o paciente adulto humano pode consumir 198 g de ésteres cíclicos da presente invenção por dia. Para uma dieta de 2000 calorias com as mesmas proporções, é possível consumir 264 g de cetonas por dia. Na dieta lipídica cetogénica, as cetonas no sangue estão aumentadas para cerca de 2 mM, o que é eficaz nalguma extensão, pelo menos em mais de 60% de crianças tratadas. Na dieta de cetonas, os níveis de cetonas devem ser mais elevados porque as cetonas substituíram o equivalente calórico da gordura, isto é, 1,5 g de cetonas/g de gordura. Em conformidade, as cetonas no sangue devem ser aproximadamente 3 mM, um nível eficaz em crianças mas ainda inferior ao nível atingido no homem em jejum de 7,5 mM. São várias as vantagens que decorrem da utilização de compostos que aumentaram directamente os níveis de cetonas no corpo, incluindo os presentes oligómeros cíclicos que, eles próprios, aumentam os níveis no sangue de corpos cetona. Em primeiro lugar, administrar os próprios corpos cetona não requer a limitação de hidratos de carbono, 26 aumentando assim o sabor agradável das formulações dietéticas, particularmente em culturas em que são comuns dietas ricas em hidratos de carbono. Em segundo lugar, os corpos cetona podem ser metabolizados por tecido de músculo, coração e cérebro, mas não pelo figado. Assim evita-se o figado gordo, que pode ser um efeito secundário indesejado da dieta cetogénica. Em terceiro lugar, a capacidade de incluir hidratos de carbono nas formulações dietéticas aumenta as hipóteses de concordância e permite seguir abordagens terapêuticas práticas aos diabéticos de tipo II que têm um nivel elevado de insulina, o que não permite aplicar a dieta cetogénica conhecida. 0 presente inventor determinou que, se bem que possa ser desejável qualquer aumento do nivel de corpos cetona, uma quantidade preferida de éster ciclico a ser administrada será suficiente, com qualquer componente acetoacetilo, para aumentar os níveis no corpo de cetonas no sangue para o nível de 0,5 até 20 mM, preferivelmente para o nível de 2 mM até 7,5 mM e superior, particularmente quando se tentar travar a morte de células cerebrais em doenças tais como doença de Alzheimer e Parkinsonismo. Não obstante não ser possível recuperar as células mortas, antecipa-se travagem de deterioração suplementar e pelo menos algum restabelecimento da função. A quantidade total de corpos cetona utilizada no tratamento de neurodegeneração, como doença de Alzheimer e Parkinsonismo, irá preferivelmente aumentar os níveis no sangue de corpos cetona desde 0,5 mM até 20 mM. O presente inventor estima que, para atingir esta finalidade, poderão ser necessários 200 até 300 g (0,5 libras) de equivalentes de corpos cetona por paciente por dia. Quando o tratamento 27 for feito através de manutenção de células contra os efeitos de neurotoxinas, este nível poderá ser suficiente para actuar como importante fonte calórica, por exemplo, 2 até 7,5 mM no sangue. Quando se basear no efeito do factor estimulador dos nervos do (R)-3-hidroxibutirato produzido, a quantidade administrada poderá ser inferior, por exemplo, para proporcionar um aumento de 0,2 até 4 mM, mas obviamente poderá ser necessário mais para esta ou outra doença.

Entender-se-á que o tratamento de doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer ou Parkinsonismo, será muito eficazmente administrado logo após a identificação de pacientes com predisposição para desenvolver a doença. Assim, o tratamento de doença de Alzheimer será muito eficazmente administrado após um resultado de teste positivo para uma ou mais condições seleccionadas do grupo que consiste em (i) mutações no gene da proteína precursora amilóide no cromossoma 21, (ii) mutações no gene da presenilina no cromossoma 14, (iii) presença de isoformas da apolipoproteína E. Serão obviamente aplicáveis outros testes que se verificar serem indicadores de doença de Alzheimer.

Após esse resultado de teste positivo, será apropriado prevenir o desenvolvimento de perda de memória e/ou de outras disfunções neurológicas aumentando a soma total das concentrações dos corpos cetona (R)-3-hidroxibutirato e/ou acetoacetato no sangue ou plasma do paciente para, digamos, entre 1,5 e 10 mM, mais preferivelmente 2 até 8 mM, por um de vários meios, preferivelmente, o paciente recebe uma dieta de quantidades suficientes de composto de fórmula 28 (I), opcionalmente parentericamente mas preferível e vantajosamente de forma entérica.

Entender-se-á que a disfunção cerebral hipoglicémica também pode ser tratada utilizando os tratamentos, composições e compostos da presente invenção. Outra propriedade associada ao presente tratamento será a melhoria geral do desempenho muscular. 0 fornecimento de medicamentos à base de oligómero(s) cíclico(s) da invenção é facilitado pela disponibilidade imediata de alguns materiais de partida relativamente baratos, ou potencialmente baratos, dos quais se pode derivar 0 ácido (R)-3-hidroxibutírico cíclico (ver "Microbial Polyesters" Yoshiharu Doi. ISBN 0-89573-746-9, Capítulos 1.1, 3.2 e 8). A disponibilidade de genes aptos a serem inseridos em organismos que geram alimentos proporciona um meio para criar produtos, como iogurtes e queijo, que estão enriquecidos no oligómero cíclico ácido (R)-3-hidroxibutírico ou, após degradação com enzimas capazes de clivar esses polímeros, com a própria substância oligomérica (ver Doi., Capítulo 8). Métodos de preparação de poli-(R)-3-hidroxibutirato não são especificamente reivindicados, pois são conhecidos na área. Por exemplo, Shang et al. (1994) Appli. Environ. Microbiol. 6_0: 1198-1205. Este polímero é disponibilizado comercialmente pela Fluka Chemical Co., P1082, car#81329, 1993-94, 980, Second St. Ronkonkoma NI 11719-7238, 800 358 5287. A presente invenção será agora suplementarmente descrita, apenas a título ilustrativo, com referência às 29 seguintes Figuras e exemplos experimentais. À luz destes, outras especificações no âmbito da invenção ocorrerão aos experimentados na área.

FIGURA A Figura 1 é um gráfico que mostra o nível no sangue de (R)-3-hidroxibutirato produzido ao longo do tempo após a nutrição de ratos com a triolida do (R)-3-hidroxibutirato, um oligómero cíclico produzido no Exemplo 1 em iogurte, e controlos alimentados só com iogurte.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de (R,R,R)-4,8,12-trimetil-l,5,9-trioxa-2, 6,10-dodecatriona: triolida do ácido (R)-3-hidroxibutírico

O procedimento de síntese foi como descrito em Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1992) 3_1, 434. Uma mistura de poli[ácido (R)-3-hidroxibutírico] (50 g) e mono-hidrato do ácido tolueno-4-sulfónico (21,5 g, 0,113 mol) em tolueno (840 ml) e 1,2-dicloroetano (210 ml) foi agitada e aquecida até ao refluxo durante 20 horas. Removeu-se a água com uma armadilha de Dean-Stark durante 15 horas; em seguida, a solução castanha foi arrefecida para a temperatura ambiente, foi lavada primeiramente com uma solução meio saturada de carbonato de sódio e depois com cloreto de 30 sódio saturado, foi seca em sulfato de magnésio e evacuada in vacuo. Destilou-se o resíduo semi-sólido castanho utilizando um aparato Kugelrohr, dando origem a um sólido branco (18,1 g) a 120-130°C/0,15 mm Hg. Acima de 130°C, um sólido ceroso começou a destilar, tendo-se terminado a destilação nesta altura. O material destilado tinha p.f. 100-102°C (literatura p.f. 110-110,5°C). A recristalização a partir de hexano deu origem a cristais incolores com um rendimento de 15,3 g. P.f. = 107-108°C; [a]o - 35.1 (c = 1, 005, CHC13) (lit. = -33,9). XH NMR (300 MHz, CDCI3) : δ = 1,30 (d, 9H, CH3) ; 2,4-2,6 (m, β H, CH2) ; 5,31-5,39 (m, 3H, HC-O) . 13C NMR (CDCI3) δ = 20, 86 (CH3), 42,21 (CH2), 68,92 (CH), 170,12 (CO). Análise elementar: calculada para Ci2Hi806: C, 55,81; H, 7,02; Experimental: C, 55, 67; H, 7,15.

Exemplo Comparativo 1: Preparação de oliqómeros de ácido (R)-3-hidroxibutírico-(R)-3-hidroxibutirato Ácido (R)-3-hidroxibutírico (Fluka - 5,0 g, 0,048 mol), ácido p-toluenossulfónico (0,025 g) e benzeno (100 ml) foram agitados sob refluxo numa montagem com um aparato de Dean-Stark durante 24 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional e evaporou-se o benzeno in vacuo (0,5 mm Hg). Obtiveram-se 4,4 g de óleo incolor; uma amostra de 20 mg foi convertida no éster de metilo para análise do número de repetições monoméricas utilizando NMR. Estes estudos mostram que o produto é uma mistura de oligómeros de D-β-hidroxibutirato com número médio de repetições 3,75, sendo maioritariamente uma mistura de trímeros, tetrâmeros e pentâmeros, em que o material mais abundante é o tetrâmero. A mistura de produto era solúvel em 1 equivalente de hidróxido de sódio. 31

Exemplo Comparativo 2: Preparação do éster de acetoacetilo de ácido (R)-3-hidroxibutírico oliqomérico

Outro lote do produto de óleo incolor do Exemplo 1 (4,5 g) foi aquecido durante 1 hora a 60°C com diceteno (3,8 g) e acetato de sódio (0,045 g) sob azoto. Adicionou-se mais diceteno (3,8 g) e aqueceu-se a reacção durante mais uma hora, tendo sido arrefecida e diluída com éter, lavada com água e depois extraída com bicarbonato de sódio saturado (5 x 100 ml) . O extracto combinado foi lavado com éter e depois foi acidificado com HC1 concentrado (adicionado gota-a-gota). À extracção com acetato de etilo (3 x 50 ml) seguiu-se secagem em sulfato de magnésio e evaporação in vacuo. Obteve-se uma mistura amarela de sódio/óleo (7,6 g), que foi submetida a cromatografia numa coluna de sílica utilizando diclorometano/metanol (98:2), dando origem a um produto oleoso âmbar claro. Isolaram-se impurezas com movimento mais rápido (1,6 g) e, após nova operação em coluna com tetracloreto de carbono/metanol (99:1), recuperaram-se 0,8 g de óleo, que se verificou, por NMR e Espectrometria de massa, ser a mistura desejada de oligómeros acetoacetilados de (R)-3-hidroxibutirato. A mistura de produto tinha um Rf de 0,44 em diclorometano/metanol (90:1) e era solúvel em 1 equivalente de hidróxido de sódio. Ambos os produtos dos Exemplos Comparativos 1 e 2 são propensos a separação dos componentes individuais por HPLC preparativa.

Exemplo 2

Administração oral a ratos da triolida de (R)-3-hidroxibutirato do Exemplo 1

Investigou-se do modo seguinte a capacidade da triolida administrada oralmente para aumentar os níveis no sangue de cetonas. No dia antes da experiência começar, 12 ratos 32

Wistar com peso 316 ± 10 g foram colocados em gaiolas separadas. Não tiveram acesso a alimentos durante 15 horas antes da apresentação das composições que continham triolida, mas forneceu-se água a d libitum.

Na manhã da experiência, misturaram-se 0,64 g de triolida com 5 g de iogurte Co-op da marca Black Cherry em taças separadas para 9 dos ratos. Os restantes 3 ratos receberam 5 g do iogurte sem a triolida, como controlos. As taças com iogurte foram colocadas nas gaiolas e os ratos foram cronometrados enquanto comiam. Dois dos três ratos de controlo comeram todo o iogurte e quatro dos seis ratos com iogurte com triolida comeram aproximadamente metade da quantidade fornecida. Os restantes seis ratos dormiram.

Os ratos de controlo (n = 2) foram mortos aos 60 e 180 minutos após a ingestão do iogurte, ao passo que os ratos alimentados com triolida foram mortos aos 80, 140, 150 e 155 minutos. Recolheram-se amostras de sangue para testar quanto ao (R)-3-hidroxibutirato. Os cérebros foram congelados com um funil e azoto liquido, posteriormente foram extraídos em ácido perclórico e os extractos foram neutralizados e avaliados. Mediram-se os níveis no sangue de (R)-3-hidroxibutirato utilizando um ensaio de NAD+/EDTA de Anal. Biochem. (1983) 131, páginas 478-482. Adicionou-se a cada uma de algumas cuvetes 1,0 ml de uma solução de 2-amino-2-metil-l-propanol (100 mM pH 9, 9, 0, 094 g/10 ml), NAD+ (30 mM, 0,199 g/10 ml) e EDTA (4 mM, 0,015 g/10 ml) e 4 μΐ de amostra ou controlo de (R)-3-hidroxibutirato.

Os dois ratos de controlo comeram 5,2 + 0,1 g de iogurte e as suas concentrações no plasma de (R)-3-hidroxibutirato foram cerca de 0,45 mM aos 60 minutos e 180 33 minutos. Os quatro ratos alimentados com triolida comeram 0,39 ± 0,03 g de triolida e 2,6 ± 0,2 g de iogurte. As suas concentrações no plasma de (R)-3-hidroxibutirato foram 0,8 mM após 80 minutos e 1,1 mM para o grupo sacrificado aos cerca de 150 minutos. Nenhum dos ratos exibiu efeitos de doença por ingestão da triolida. Assim, verificou-se que o (R)-3-hidroxibutirato no soro estava aumentado em 0,65 mM por administração de apenas 0,4 g de triolida. De notar que, uma vez que os ratos tinham estado em jejum, os níveis iniciais de (R)-3-hidroxibutirato estavam aumentados de 0,1 mM do estado nutrido para cerca de 0,45 mM.

Em consequência, os ratos de teste exibiram um aumento do (R)-3-hidroxibutirato no plasma durante pelo menos 3 horas sem efeitos de doença. Deve notar-se que outros dois ratos nutridos aproximadamente com 1,5 g de triolida cada numa bolacha 'Hob-Nob' não exibiram efeitos de doença após duas semanas.

Deve notar-se que os níveis acrescidos de (R)—3— hidroxibutirato também serão acompanhados paralelamente de níveis de acetoacetato, não medidos aqui, pois estabelece-se rapidamente o equilíbrio entre os dois in vivo, de modo que os níveis de acetoacetato situar-se-ão entre 40 e 100% dos níveis de (R)-3-hidroxibutirato.

Exemplo Comparativo 3: Administração oral a ratos de (R)-3-hidroxibutirato, oligómeros e oligómeros de acetoacetilo-(R)-3-hidroxibutirato

Investigou-se do modo seguinte a capacidade de (R)-3-hidroxibutirato e dos oligómeros lineares dos Exemplos comparativos 1 e 2 administrados oralmente para aumentar os níveis no corpo de cetonas no sangue. Os ratos jejuaram 34 durante a noite e depois foram submetidos a gavagem com 100 μ1/100 g de peso do corpo de (R) -3-hidroxibutirato 4 M ajustado para pH 7,4 utilizando metilglucamina. Mediram-se os niveis no plasma de (R)-3-hidroxibutirato, 0,62 mM, após 30 minutos, em comparação com 3 mM quando se utiliza (R)—3— hidroxibutirato 9 M.

Repetiu-se este procedimento com soluções 2 M das misturas de oligómeros de (R)-3-hidroxibutirato e seus ésteres de acetoacetilo descritos nos Exemplos Comparativos 1 e 2. Tanto o oligómero de (R)-3-hidroxibutirato (19/1) como o éster de acetoacetilo (20/4) foram ajustados para pH 7,6 com metilglucamina e monitorizou-se o nível de (R)-3-hidroxibutirato no sangue utilizando o procedimento de ensaio acima mencionado. Verificou-se que os aumentos de (R)-3-hidroxibutirato no soro foram de 0,2 mM até 0,5 mM aos 60 e 120 minutos após a gavagem.

Exemplo 5

Tabela 2. Amostra de dieta cetogénica de 1500 calorias utilizando o oligómero cíclico (I) da invenção. Presume-se que o oligómero cíclico contém 6 kcal/g de gorduras, 9 kcal/g de hidratos de carbono e 4 kcal/g de proteínas. Os oligómeros foram substituídos para se obterem calorias equivalentes. 35

Quantidade Gorduras Proteínas CHO (I) (g) (g) (g) (g) Cíclico (g) Pequeno-almoço 4 4 Ovo 32 sumo de maçã 70 7 cetonas 66 66 leite desnatado 92 0 2 3 Total do Pequeno-Almoço 4 6 10 66

Almoço carne de vaca magra 12 1,75 3,5 cenouras cozinhadas 45 0,6 3 peras em lata 40 4 cetonas 69,75 69,75 leite desnatado 92 2 3 Total do Almoço 1,75 6,1 10 69,75

Jantar "Frankfurter" 22,5 6 3 bróculos cozinhados 50 1 2 melancia 75 5 cetonas 62,25 62,25 leite desnatado 92 2 3 Total do Jantar 6 6 10 62,25 Total Diário 11,75 18,1 30 198

Exemplo 6: Efeito do (R)-3-hidroxibutirato em células do hipocampo Métodos

Meio de Cultura e Compostos Químicos 0 meio sem soro utilizado desde o dia 0 até ao dia 4 continha meio Neurobasal com suplemento B27 diluído 50 vezes (Life Technology, Gaithersburg, MD) ao qual se adicionou: L-glutamina 0,5 mM, L-glutamato de Na 25 μΜ, 100 U/ml de penicilina e 100 μρ/ιηΐ de estreptomicina. Após o dia 4, utilizou-se meio DMEM/F12 que continha insulina 5 μΜ, 1-tiroxina 30 nM, progesterona 20 nM, selenito de Na 30 nM, 100 U/ml de penicilina e 100 μρ/ιηΐ de estreptomicina. 36

Culturas de Micro-Ilhas do Hipocampo

As culturas primárias do hipocampo foram removidas de embriões Wistar no dia 18 e foram dispersas numa pipeta por agitação suave. Centrifugou-se a suspensão a 1 500 x g durante 10 minutos e deitou-se fora o sobrenadante. O grânulo foi novamente suspenso em meio novo para uma contagem final de células de 0,4-0,5 x 106 células/ml. Pipetaram-se 10 μΐ desta suspensão para o centro de cavidades de cultura revestidas com poli-D-lisina, incubaram-se as placas a 38°C durante 4 horas e depois adicionaram-se 400 μΐ de meio Neurobasal fresco. Após 2 dias de incubação, metade do meio foi substituído por meio fresco e continuou-se a incubação durante mais 2 dias. Após o dia 4, o meio foi substituído por meio DMEM/F12 que continha insulina 5 μΜ, 1-tiroxina 30 nM, progesterona 20 nM, selenito de Na 30 nM, 100 U/ml de penicilina e 100 μρ/ιηΐ de estreptomicina. Dividiram-se as cavidades em 4 grupos: metade das cavidades recebeu (R)-3-hidroxibutirato para uma concentração final de 8 mM e metade das cavidades recebeu βι_42 amilóide 5 nM (Sigma) . Estes meios foram substituídos 2 dias depois (dia 8), as células foram fixadas no dia 10, foram coradas com anti MAP2 (Boehringer Manheim, Indianapolis IN) para visualizar neurónios e com vimentina e GFAP (Boehringer) para visualizar células gliais.

Resultados

Contagens de Células A adição de (R) -3-hidroxibutirato à incubação aumentou o número de células neuronais por micro-ilha, de uma média de 30 para uma média de 70 células por micro-ilha. A adição 37 às culturas de βι_42 amilóide 5 nM reduziu os números de células de 70 para 30 células por micro-ilha, confirmando as observações anteriores de Hoshi et al. segundo as quais a βi_42 amilóide é tóxica para neurónios do hipocampo. A adição de (R)-3-hidroxibutirato a culturas que continham βi_42 amilóide aumentou o número de células de uma média de 30 para 70 células por micro-ilha. A partir destes dados concluímos que a adição de quantidades de nível de substrato de (R)-3-hidroxibutirato a meio cujos principais nutrientes são glucose, piruvato e L-glutamina abranda a taxa de morte celular em cultura. Também se conclui que o (R)-3-hidroxibutirato consegue diminuir a taxa acrescida de morte de células do hipocampo causada pela adição de βι 42 amilóide em cultura.

Observou-se que o número de protuberâncias dendríticas e o comprimento de axónios aumentaram com a presença de (R)-3-hidroxibutirato, quer a βι_42 estivesse ou não presente. Isto é indicador de comportamento do tipo factor de crescimento dos nervos.

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Lisboa, 19 de Junho de 2007

Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um éster cíclico de (R)-3-hidroxibutirato de fórmula (I):

D em que n é um inteiro de 1 ou superior, ou respectivo complexo com um ou mais catiões ou respectivo sal, para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento de estados de doenças neurodegenerativas ou de diabetes do tipo II, em que o tratamento não consiste no controlo de crises de epilepsia.

2. Utilização como reivindicada na Reivindicação 1, caracterizada por a doença ser mediada por radicais livres ou agentes tóxicos como péptidos e proteínas, resistência à insulina, isquemia, traumatismo craniano, deficiência ou bloqueio de piruvato desidrogenase ou incapacidade para efectuar glicólise em um ou mais tipos de células.

3. Utilização como reivindicada na Reivindicação 1, caracterizada por a doença ser doença de Alzheimer, Parkinsonismo, Esclerose lateral amiotrófica ou Diabetes de tipo II.

4. Utilização como reivindicada na Reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizada por o oligómero cíclico de fórmula (I) 2 actuar como estimulador neuronal capaz de estimular o crescimento de axónios e/ou dendrites em nervos in vivo ou in vitro.

5. Utilização como reivindicada na Reivindicação 4, em que os nervos são células do hipocampo ou da substantia nigra. Lisboa, 19 de Junho de 2007