DE69935799T2

DE69935799T2 - Therapeutische zusammenstellungen

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Publication number: DE69935799T2
Application number: DE69935799T
Authority: DE
Inventors: Richard L. Rockville VEECH
Original assignee: BTG International Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1998-09-15
Filing date: 1999-09-15
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2019-09-16
Also published as: RU2242227C2; KR100805490B1; AU767238B2; ZA200101260B; ES2283133T3; US20010014696A1; HK1035665A1; US7351736B2; EP1123094A4; WO2000015216A1; CN1316902A; DE69935799D1; EP1123094B1; US20040171671A1; CN1273129C; CA2339941A1; NZ509739A; AU5921299A; JP2002524506A; EP1123094A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft für die Verabreichung an Menschen und Tiere geeignete Zusammensetzungen bzw. Zusammenstellungen, welche die Eigenschaft der Erhöhung von Spiegeln von (R)-3-Hydroxybutyrat ((R)-3-Hydroxybuttersäure oder D-β-Hydroxybutyrat) aufweisen, wenn sie so verabreicht werden; insbesondere wenn sie oral, topisch, subkutan oder parenteral, am vorteilhaftesten jedoch oral, verabreicht werden.
Die Verabreichung von (R)-3-Hydroxybuttersäure besitzt eine Reihe von nützlichen Wirkungen auf den Körper von Mensch und Tier. Diese schließen unter anderem die Erhöhung der Herzeffizienz, z. B. bei Herzversagen, die Bereitstellung einer alternativen Energiequelle zu Glukose, z. B. bei Diabetes und Insulin-resistenten Zuständen, und die Behandlung von Krankheiten, die durch Schaden an neuronalen Zellen, z. B. ZNS-Zellen, verursacht werden, insbesondere durch Retardieren oder Verhindern von Hirnschaden, wie er bei Alzheimer und Parkinsonismus und ähnlichen Erkrankungen und Befunden vorgefunden wird, ein.
Natriumhydroxybutyrat erhöht gezeigtermaßen die Gehirndurchblutung und regionale vasomotorische Reflexe um bis zu 40 % (Biull. Eksp. Biol. Med., Band 88 11, S. 555–557). Das EP 0780123 A1 lehrt ferner die Verwendung von Acetoacetat, β-Hydroxybutyrat, einwertigen, zweiwertigen oder dreiwertigen Alkoholestern von diesen, oder linearen Oligomeren von 2 bis 10 Wiederholungseinheiten von β-Hydroxybutyrat zum Unterdrücken von Gehirnödem, Schützen von Gehirnfunktion, Berichtigen des Hirn-Energiestoffwechsels und Reduzieren des Ausmaßes von Gehirninfarkt.
Die intravenöse Infusion von Natriumsalzen von (R)-3-Hydroxybutyrat ist an normalen menschlichen Subjekten und Patienten mit einer Reihe von Krankheitszuständen, z. B. denjenigen, welche eine Behandlung hinsichtlich schwerer Sepsis in einer Intensivpflegestation durchlaufen, durchgeführt worden und wurde als nicht-toxisch und fähig zur Verringerung der Konzentration an Glukose, freier Fettsäure und Glycerol befunden, wenngleich als unwirksam zur Verringerung der Leucin-Oxidation.
Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat ferner festgestellt, dass Verbindungen und Zusammensetzungen, welche die Blutspiegel von (R)-3-Hydroxybuttersäure und/oder Acetoacetat erhöhen, ebenfalls Nützlichkeit bei der Reduzierung von freien Radikalen in vivo aufweisen und somit einen Platz bei der Behandlung von mit freien Radikalen assoziierten Erkrankungen finden. (R)-3-Hydroxybutyrat und Acetoacetat, welche üblicherweise als Ketonkörper bezeichnet werden, sehen eine normale physiologische Alternative zu den üblichen energieerzeugenden Substraten, Glukose und Fettsäuren, vor. Während längerer Fastendauern beim Menschen werden Fettsäuren durch die Leber zu (R)-3-Hydroxybuttersäure und Acetoacetat umgewandelt, welche durch die meisten Hauptgewebe des Körpers, mit Ausnahme der Leber, verwertet werden können. Unter diesen Bedingungen werden Gesamtblut-Ketonkörper auf etwa 7 mM erhöht. Wenn diese im Blut mäßig erhöht sind, verwerten extrahepatische Gewebe, wie Hirn, Herz und Skelettmuskulatur, diese Ketonkörper innerhalb der Mitochondrien, um Reduzierungs-Leistung bzw. -Kraft in der Form von NADH bereitzustellen, welche das primäre Substrat des Elektronentransportsystems sowie der Erzeuger der Energie, welche für die Synthese von ATP erforderlich ist, ist. Die Erzeugung von mitochondrialem NADH durch Ketone senkt ihrerseits das Verhältnis von freiem mitochondrialem [NAD⁺]/[NADH]-Verhältnis, und das cytosolische [NADP⁺]/[NADPH]-Verhältnis, an welches das mitochondriale [NAD⁺]/[NADH] gekoppelt ist. Während der Katabolismus von Ketonen das mitochondriale [NAD⁺]/[NADH] reduziert, oxidiert er das Verhältnis von mitochondrialem [Ubichinon]/[Ubichinol], [Q]/[QH₂]. Die Semichinon-Form von Ubichinol ist die Hauptquelle der Erzeugung von Superoxid O₂ ^- durch Mitochondrien. Durch Verringern der Menge der reduzierten Form QH₂, und seines Semichinons, kann man die Erzeugung von freien Radikalen durch Mitochondrien verringern, während gleichzeitig die Abfangmittel von an das NADP-System gekoppelten freien Radikalen, wie Glutathion, erhöht werden.
Der Erfinder hat somit bestimmt, dass ein Freiradikal-Schaden, resultierend aus überschüssigem reduzierten Q oder Inhibition von NADH-Dehydrogenase, wie er bei MPP-induzierter Toxizität auftritt, durch Verabreichen von Mitteln verringert werden kann, welche die Ketonkörperspiegel in vivo erhöhen.
Mehrere Krankheitsvorgänge beinhalten eine Schädigung durch freie Radikale, unter welchen die neurologischen Erkrankungen die folgenden sind: Parkinson-Krankheit, Amyotrophische Lateralsklerose, Alzheimer und Gehirnischämie. Darüber hinaus wurde von Schaden durch übermäßiges freies Radikal impliziert, eine Rolle bei koronärer Reperfusion, diabetischer Angiopathie, entzündlicher Darmkrankheit und Pankreatitis zu spielen.
Die gleichzeitig anhängige WO 98/41201 des Erfinders offenbart die Verabreichung von linearen Estern von (R)-3-Hydroxybuttersäure und/oder Acetoacetat in der Herstellung von erhöhten Spiegeln der freien Verbindungen in vivo. Die orale Verabreichung von 4 mM Lösungen des oligomeren Tetra-(R)-3-hydroxybutyrats oder von dessen Acetoacetylester erhöht gezeigtermaßen die Blutspiegel von Ketonkörpern, so dass von (R)-3-Hydroxybutyrat-Spiegeln ein Anstieg um 1 bis 2 mM während Zeitdauern über 2 Stunden gemessen werden konnte.
Der Erfinder hat nun festgestellt, dass unerwartete Vorteile bereitgestellt werden, wenn die (R)-3-Hydroxybuttersäure-Komponente einer derartigen Zusammensetzung als ein zyklisches Oligomer verabreicht wird. Diese Vorteile, können, unter anderem, beinhalten (a) erhöhte Effizienz bei der Erhöhung von Blut-(R)-3-Hydroxybuttersäure-Spiegeln, sodass Spiegel um mehr als 2 mM erhöht werden können, einschließlich Erreichung von Beinahe-Fasten-Spiegeln und darüber hinaus, (b) Aufrechterhaltung von erhöhten Spiegeln während Zeitdauern von mehreren Stunden, (c) Fähigkeit, ohne Gegenion, wie Natrium oder Methylglucamin, verabreicht zu werden, falls es wünschenswert ist, die Salzbelastung eines Patienten nicht zu erhöhen, oder falls eine signifikante Dosierung beabsichtigt wird, und (d) relative Leichtigkeit der Herstellung der reinen Verbindung aus polymeren Ausgangsmaterialien, welche durch Biokultur erhältlich sind.
Die vorliegende Anmeldung richtet sich insbesondere auf das Problem von neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere Krankheit, bei welcher Neuronen neurotoxischen Effekten von pathogenen Wirkstoffen, wie Proteinplaques, und oxidativem Schaden unterworfen sind, und sieht ferner Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung dieser und der zuvor erwähnten Erkrankungen vor.
In bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung die Erhöhung von Blutketonen bereit, notwendig zum Korrigieren der obenstehend beschriebenen Defekte, und kann durch parenterale oder enterale Verabreichung bewerkstelligt werden. Insbesondere erfordert sie nicht die Verabreichung von potenziell toxischen pharmakologischen Wirkstoffen. Die verbesserte Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung bei der Erhöhung von Spiegeln, insbesondere Blutspiegeln, von Ketonkörpern liefert therapeutische Effekte der klassischen ketogenen Diät, von welcher an sich nicht festgestellt wird, in Kindern toxisch zu sein, mit keinem der Nebeneffekte, welche sie für Erwachsene unbrauchbar macht. Darüber hinaus hat der Erfinder festgestellt, dass, mit der Korrektur der zuvor erwähnten metabolischen und toxischen Defekte, Cytokinantworten und die Erhöhung hinsichtlich apoptotischer Peptide in degenerierenden Zellen abnehmen werden aufgrund der Erhöhung des Energiestatus von neuronalen Zellen und der erhöhten trophischen Stimulation, welche aus der erhöhten Synthese von Neurotransmitter, z. B. Acetylcholin, resultiert.
Die Behandlung, welche der Anmelder der vorliegenden Erfindung bereitstellt, geht über Ketonkörper-Effekte auf den Kreislauf hinaus, zumal sie eine Behandlung für Zellen vorsieht, welche aufgrund von Neurodegeneration und/oder Stoffwechseldefekten, insbesondere im Stoffwechsel von Glukose, die z. B. durch neurotoxische Wirkstoffe, wie Peptide, Proteine, Freiradikal-Schaden und Auswirkungen von genetischer Abnormalität verursacht werden, nicht in der Lage sind, richtig zu funktionieren. Die Behandlung beinhaltet die Wirkung von Ketonkörpern auf die Zellen selbst und nicht auf den Blutstrom zu ihnen.
Somit wird, in einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung, die Verwendung eines zyklischen Esters von (R)-3-Hydroxybutyrat der Formel (1) vorgesehen
worin n eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist,
oder eines Komplexes dessen mit einem oder mehreren Kationen oder eines Salz dessen zur Verwendung in der Herstellung eines Medikamentes [Medikamentes] zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen oder Typ II-Diabetes,
wobei die Behandlung nicht in der Kontrolle von Anfällen besteht.
Für die orale Zuführung kann freies zyklisches Oligomer bevorzugt sein. Falls Kationen in einem Komplex vorhanden sind, sind bevorzugte Kationen Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium und werden durch ein physiologisch annehmbares Gegenanion unter Bereitstellung eines Salzkomplexes ausgeglichen.
Beispiele von typischen physiologisch annehmbaren Salzen werden aus Natrium, Kalium, Magnesium, L-Lysin oder L-Arginin oder z. B. komplexeren Salzen, wie denjenigen von Methylglucamin-Salzen, gewählt. Ester werden diejenigen sein, wie sie vorausgehend für andere Aspekte der Erfindung beschrieben wurden.
Vorzugsweise ist n eine ganze Zahl von 1 bis 200, weiter bevorzugt von 1 bis 20, am stärksten bevorzugt von 1 bis 10, und ist insbesondere 3, d. h. (R,R,R)-4,8,12-Trimethyl-1,5,9-trioxadodeca-2,6,10-trion.
Die Verwendung der zyklischen Ester der Erfindung erfolgt vorzugsweise für die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, die durch freie Radikale, toxische Wirkstoffe wie etwa Peptide und Proteine, genetische Defekte, Insulinresistenz oder andere Glukosestoffwechsel-Defekte oder Defekt-herbeiführende Zustände, Ischämie und Schädeltrauma vermittelt werden
Die Verwendung schließt eine derartige Verwendung für die Herstellung einer neuronalen Stimulanz ein, die z. B. in der Lage ist, axonales und/oder dendritisches Wachstum in Nervenzellen, z. B. in Hippocampus- oder Substantia nigra-Zellen, in vivo oder in vitro, insbesondere bei Befunden, worin Neurodegeneration ernste klinische Konsequenzen aufweist, durch seinen erhö henden Effekt auf Blut- und Plasma-(R)-3-Hydroxybutyrat- und Acetoacetat-Spiegel zu stimulieren.
Insbesondere ist die Zusammensetzung des Medikamentes geeignet zur parenteralen oder enteralen Verabreichung, insbesondere zur oralen Verabreichung. Wo die Zusammensetzung für parenterale Verwendung gedacht ist, ist sie steril und pyrogenfrei. Zur oralen Verwendung kann die Zusammensetzung eine Nahrungsmittel-Basis einschließen und kann in der Form einer Emulsion oder einer bloßen Mischung mit feststoffartiger Nahrung vorliegen.
Vorzugsweise machen die zyklischen Oligomer(e) eine wirksame Menge der Gesamtzusammensetzung des Medikamentes aus, z. B. mindestens % oder mehr, z. B. mindestens 5 % der Zusammensetzung, bezogen auf das Gewicht, weiter bevorzugt 20 % oder mehr, und am stärksten bevorzugt 50 % bis 100 %. Die Zusammensetzung kann zur oralen, parenteralen oder jedweden anderen herkömmlichen Form der Verabreichung angepasst sein.
In bevorzugten Formen aller Aspekte der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) zusammen mit einem physiologischen Verhältnis von Acetoacetat oder einem metabolischen Vorläufer von Acetoacetat verabreicht. Der Begriff "metabolischer Vorläufer davon" bezieht sich insbesondere auf Verbindungen, welche Acetoacetyl-Reste enthalten, wie Acetoacetyl-1,3-butandiol, Acetoacetyl-D-β-hydroxybutyrat und Acetoacetylglycerol. Ester von jeglichen derartigen Verbindungen mit einwertigen, zweiwertigen oder dreiwertigen oder höherwertigen, z. B. Glucosyl-, Alkoholen werden ebenfalls in Betracht gezogen.
In diabetischen Patienten gestattet diese Verwendung der zyklischen Oligomere die Aufrechterhaltung von niedrigen Blutzuckerspiegeln ohne Bedenken hinsichtlich hyperglykämischer Komplikationen. In normalen nicht-diabetischen Subjekten beläuft sich der Fasten-Blutzucker auf 80 bis 90 mg-% (4,4–5 mM), was nach einer Mahlzeit auf 130 mg-% (7,2 mM) ansteigt. Bei Diabetikern ist lange Zeit die "strikte Kontrolle" von Diabetes als ein Verfahren zur Verzögerung von Gefäßkomplikationen empfohlen worden, aber in der Praxis ist es von Ärzten aufgrund hypoglykämischer Episoden als schwierig befunden worden, den Blutzucker nach dem Essen strikt unter 150 mg-% (8,3 mM) reguliert zu halten. Ein hypoglykämisches Koma tritt regelmäßig in normalen Subjekten auf, deren Blutzucker auf 2 mM abfällt. Wie es früher erörtert wurde (62, 63), gibt es in Gegenwart von 5 mM Blut-Ketonen keine neurologischen Symptome, wenn der Blutzucker auf unterhalb von 1 mM abfällt.
Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat festgestellt, dass die ergänzende Versorgung von Typ II-Diabetikern mit zyklischen Oligomeren der Erfindung eine bessere Regulierung des Blutzuckers gestatten wird, wodurch die vaskulären Veränderungen in Auge und Niere verhindert werden, welche nun nach 20 Jahren Diabetes auftreten und welche die Hauptursache von Krankhaftigkeit und Sterblichkeit bei Diabetikern sind.
Besondere Krankheiten, welche mit diesen Medikamenten behandelbar sind, sind anwendbar auf alle Befunde, welche PDH-Blockierung beinhalten, einschließlich denjenigen Befunden, welche nach einem Schädeltrauma auftreten, oder welche Reduktion oder Eliminierung von Acetyl-CoA-Zufuhr an das Mitochondrium beinhalten, wie Insulin-Koma und Hypoglykämie, Defekte im Glukosetransporter im Gehirn oder andernorts (80) oder in glykolytischen Enzym-Schritten oder im Pyruvat-Transport.
Wo das Medikament oder Nutraceutical Acetoacetat umfasst, wird es vorzugsweise nicht während einer längeren Zeitdauer aufbewahrt oder an Temperaturen über 40 °C exponiert. Acetoacetat ist bei Erwärmen instabil und zerfällt heftig bei 100 °C zu Aceton und CO₂. Unter derartigen Umständen wird es bevorzugt, dass Acetoacetat durch die Zusammensetzung bei Kontakt mit metabolischen Prozessen des Körpers erzeugt wird. Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung einen Estervorläufer von Acetoacetat.
Der Erfinder hat ferner festgestellt, dass Ketonkörper, die bereitgestellt werden durch Verabreichung der zyklischen Oligomere von (R)-3-Hydroxybuttersäure in ausreichenden Mengen, um die Blut-Ketonkörper-Gesamtkonzentration auf erhöhte Spiegel anzuheben, zu mehr als einer lediglichen Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit führen, sondern tatsächlich die Zellfunktion und das Wachstum über dasjenige bei normalen, d. h. Kontroll-Spiegeln hinaus in einer Weise verbessern, welche nicht mit dem Blutstrom oder der Ernährung zusammenhängt. In dieser Hinsicht sieht die Erfindung ferner die Verwendung der zyklischen Oligomere als Mittel vor, welche zur Hervorrufung einer neuronalen Stimulation, d. h. Nervenwachstumsfaktor-ähnliche Aktivität, Erhöhung der Stoffwechselgeschwindigkeit und Erhöhung des Ausmaßes von funktionellen Merkmalen, wie Axons und Dendriten, in der Lage sind. Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung bietet einen Mechanismus zur Verbesserung von neuronaler Funktion als auch zur bloßen Verzögerung von Degradation.
Die kürzliche Arbeit von Hoshi und Mitarbeitern (77, 78) legt in starkem Maße nahe, dass ein Teil des Amyloid-Proteins, dessen Akkumulierung das Kennzeichen von Morbus Alzheimer ist, Aβ_1-42, als eine mitochondriale Histidinproteinkinase wirkt, welche den Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplex phosphoryliert und inaktiviert. Der PDH-Komplex ist ein mitochondriales Enzym, das für die Erzeugung von Acetyl-CoA und NADH aus dem Pyruvat, welches durch Glycolyse innerhalb des Cytoplasmas hergestellt wird, verantwortlich ist. Das gebildete mitochondriale Acetyl-CoA kondensiert mit Oxalacetat, um den Krebs-TCA-Zyklus zu beginnen, welcher Pyruvat vollständig zu CO₂ verbrennt, während die Mitochondrien mit dem Reduktions- Vermögen versorgt werden, welche das Substrat für das Elektronentransportsystem wird, über welches die für mitochondriale ATP-Synthese erforderliche Energie erzeugt wird.
Ketonkörper-Verwertung im Gehirn ist durch den Transport limitiert, wobei eine geringere Verwertung im Basalganglion bei Blutspiegeln unter 1 mM stattfindet (76). Allerdings, bei Spiegeln von 7,5 mM, erzielt bei einem normalen Mann durch längeres Fasten, ist die Rate des Ketonkörper-Eintritts in das Gehirn ausreichend, um den Großteil der cerebralen Energieanforderungen zu übernehmen und hypoglykämische Symptome zu verhindern, selbst angesichts von Blutzuckerspiegeln, welche normalerweise Krämpfe oder Koma verursachen würden (63).
In der gleichzeitig anhängigen Anmeldung WO 98/41201, "Therapeutische Zusammenstellungen", ist es die Hypothese des Erfinders, dass bei Alzheimer, wo eine Blockierung bei PDH existiert, welche die normale Energieerzeugung aus Glukose verhindert, wenn man erhöhte, z. B. normale Fastenspiegel an Ketonen bereitstellen kann, man die in diesen Patienten vorhandene PDH-Blockade umgehen kann, wodurch der Zelltod wegen Energieauszehrung oder Mangel an cholinerger Stimulation verhindert und somit das Fortschreiten des Gedächtnisverlustes und der Demenz verlangsamt wird. Weiterhin, unter Nutzung der das Nervenwachstum stimulierenden Effekte der Ketonkörper, insbesondere (R)-3-Hydroxybutyrat oder eines physiologischen Verhältnisses davon mit Acetoacetat, können Zellen, die noch lebensfähig sind, dazu gebracht werden, sich über den Zustand hinaus, zu welchem sie degeneriert sind, zu verbessern, und folglich wird eine gewisse Verbesserung der Funktion bei Patienten zu beobachten sein.
In gefütterten Tieren und beim Menschen ist der Lebergehalt, welcher im Wesentlichen derjenige von Blut ist, von Acetoacetat sehr niedrig, z. B. 0,09 mM, und (R)-3-Hydroxybutyrat beträgt 0,123 mM, aber steigt nach 48 Stunden langem Fasten auf z. B. 0,65 mM Acetoacetat und 1,8 mM (R)-3-Hydroxybutyrat an (84). Die Ketonkörper steigen beim Hungern, weil der Abfall des Insulins die Umesterung von Fettsäuren zu Triglycerid in Fettgewebe verringert, was die Abgabe von freien Fettsäuren in den Blutstrom verursacht. Die abgegebenen freien Fettsäuren können dann aufgenommen und von Muskel, Herz, Niere und Leber im Vorgang der β-Oxidation als Energiequelle verwendet werden. Die Leber besitzt jedoch die Fähigkeit, die freien Fettsäuren zu einem metabolischen Brennstoff, Ketonen, zur Verwendung durch extrahepatische Organe, einschließlich des Gehirns, als Alternative zu Glukose während Fastenperioden, umzuwandeln. Die hepatische Synthese von Ketonkörpern erfolgt aus mitochondrialem Acetyl-CoA, welches während der β-Oxidation von Fettsäuren durch die Leber erzeugt wird.
Die Ketonkörper treten auf demselben Träger in extrahepatische Gewebe ein, auf welchem andere Monocarboxylate als kompetitive Inhibitoren wirken können. Unphysiologische Isomere, wie D-Lactat oder (S)-3-Hydroxybutyrat können ebenfalls als kompetitive Inhibitoren zum Ketonkörpertransport wirken. Da Ketonkörpertransport über die Bluthirnschranke hinweg ein limitie render Faktor für die Ketonkörperverwertung im Gehirn ist (76), sollte jede Anstrengung unternommen werden, um die Blutkonzentration dieser unphysiologischen Enantiomere während einer ketogenen Therapie bei niedrigen Spiegeln zu halten. Wenn Blut-Ketonkörperkonzentrationen auf Spiegel erhöht werden, welche beim Hungern gefunden werden, verwenden Herz, Muskulatur, Niere und Gehirn Ketonkörper als das bevorzugte Energiesubstrat:
Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat somit bestimmt, dass das mitochondriale Acetyl-CoA, welches aus Ketonkörpern abgeleitet ist, wie hergestellt unter Verwendung der zyklischen Oligomere, welche von der vorliegenden Erfindung gelehrt werden, somit den Acetyl-CoA-Mangel ersetzen kann, der während der Inhibition des PDH-Multienzymkomplexes in Geweben auftritt, die vom Glukosestoffwechsel für ihre Versorgung mit Stoffwechselenergie abhängig sind. Das zugeführte mitochondriale Citrat kann ebenfalls durch den Tri- oder Dicarbonsäure-Transporter zum Cytoplasma transportiert werden, wo es in cytoplasmatisches Acetyl-CoA umgewandelt werden kann, das für die Synthese von Acetylcholin erforderlich ist. Die Reaktionen des Krebszyklus sind in Schema 1 gezeigt, um bei der Veranschaulichung dieser Konzepte weiter zu helfen.
Ketonkörper können, im Gegensatz zu freien Fettsäuren, in der Leber kein Acetyl-CoA produzieren. Da Acetyl-CoA der wesentliche Vorläufer von Fettsäure ist, können sie nicht entweder zu erhöhter Fettsäure- oder Cholesterin-Synthese in der Leber führen, welche gewöhnlicherweise für über die Hälfte der Synthese dieser zwei potenziell pathogenen Materialien im Körper verantwortlich ist. Die Leber ist empfindlich gegenüber dem Verhältnis von Acetoacetat/(R)-3-Hydroxybutyrat, welches an sie präsentiert wird, und wird ihr mitochondriales freies [NAD⁺]/[NADH] aufgrund des Beinahe-Gleichgewichts, welches durch β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.30) etabliert wird, verändern (31).
Unter anderem weist das zuvor Gesagte ebenfalls darauf hin, dass man ein Verfahren zur Erhöhung der Effizienz der mitochondrialen Energieproduktion in einem Mensch oder Tier, welches nicht unter einer chronischen oder akuten Stoffwechselkrankheit leidet, bereitstellen kann, umfassend das Verabreichen einer ausreichenden Menge eines zyklischen Oligomers der Formel (I) an den Menschen oder das Tier, um die Blutspiegel von (R)-3-Hydroxybutyrat auf von 0,5 bis 20 mM zu erhöhen.
SCHEMA 1
Der einfachste Weg, um Blutketone zu erhöhen, ist das Hungern. Bei längerem Fasten erreichen Blutketone Spiegel von 7,5 mM (62, 63). Allerdings ist diese Option nicht auf einer langfristigen Basis verfügbar, da routinemäßig der Tod nach einer 60 Tage langen Fastendauer eintritt.
Die ketogene Diät, die hauptsächlich aus Lipid besteht, ist seit 1921 für die Behandlung von Epilepsie bei Kindern verwendet worden, insbesondere myoklonischen und akinetischen Anfällen (109) und hat sich als wirkungsvoll in Fällen erwiesen, welche nicht auf übliche pharmakologische Mittel ansprechen (71). Entweder orale oder parenterale Verabreichung von freien Fettsäuren oder Triglyceriden kann Blutketone erhöhen, vorausgesetzt, dass Kohlenhydrat und Insulin niedrig sind, um eine Umesterung in Fettgewebe zu verhindern. Ratten, welche mit Nahrungen gefüttert wurden, welche aus 70 % Maisöl, 20 % Casein-Hydrolysat, 5 % Zellulose, 5 % McCollum'scher Salzmischung bestehen, entwickeln Blutketone von etwa 2 mM. Die Substitution von Schmalz für Maisöl erhöht die Blutketone auf nahezu 5 mM (Veech, unveröffentlicht).
Im Allgemeinen belaufen sich die bei derartigen Diäten erzielten Spiegel an Ketonkörpern auf etwa 2 mM (R)-3-Hydroxybutyrat und 1 mM Acetoacetat, während die Spiegel an freien Fettsäuren etwa 1 mM betragen. Andere Variationen der Zusammensetzung sind erprobt worden, einschließlich Triglyceriden mittlerer Kettenlänge. Im Allgemeinen ist das Einverständnis mit derartigen eingeschränkten Ernährungen aufgrund ihrer Nicht-Schmackhaftigkeit gering gewesen (56). Auch Hochlipid-Niedrigkohlenhydrat-Nahrungen sind als therapeutische Mittel bei Krebspatienten zur Verringerung der Glukoseverfügbarkeit für Tumore (88), als gewichtsverringernde Nahrung in Patienten mit und ohne Diabetes (74, 112) sowie zur Verbesserung von Anstrengungs-Toleranz (83) erprobt worden.
Die Beschränkung von Ernährungen, welche auf Lipid beruhen, um Blutketone auf neurologisch effektive Spiegel zu erhöhen, sind zahlreich. Zum Ersten neigen Spiegel von Ketonkörpern bei lipid-basierenden Ernährungen dazu, unter 3 mM zu betragen, signifikant geringer als der Spiegel von 7,5 mM, welcher bei übergewichtigen Menschen während längerem Fasten erzielt wird. Zum Zweiten erhöht ein unautorisierter Verzehr von Kohlenhydrat die Insulinsekretion und verursacht ein rasches Absinken der hepatischen Umwandlung von freien Fettsäuren zu Ketonen mit einem anschließenden Abfall hinsichtlich Blutketonen und der Umleitung von Lipid zur Veresterung zu Triglyceriden durch Fettgewebe. Viele anekdotenartige Berichte betreffen das Wiederauftreten von Anfällen bei Kindern, welche "ihre Diät mit einem Geburtstagskuchen unterbrochen haben". Zum Dritten verursachen ihre Nicht-Schmackhaftigkeit und die Notwendigkeit der Vermeidung von Kohlenhydrat, um hohe Ketonkörperspiegel aufrechtzuerhalten, Schwierigkeiten bei der Anwendung solcher Hochlipid-Diäten bei Erwachsenen in einer Tagespatienten-Situation, insbesondere in Gesellschaften, bei welchen traditionell eine hohe Aufnahme von raffinierten Zuckern, Brot, Nudelspeisen, Reis und Kartoffeln stattfindet. In der Praxis kann die tra ditionelle Hoch-Keton-Diät, anders als bei Kindern, bei Patienten jenseits des Alters, bei welchem sämtliche Nahrung zu Hause unter strikter Überwachung zubereitet wird, nicht erzwungen werden. Zum Vierten würde die Aufnahme von derartig großen Mengen an Lipid in der Erwachsenenpopulation zu einer signifikanten Hypertriglyceridämie und Hypercholesterinämie mit den pathologischen Folgeerscheinungen von erhöhter Gefäßerkrankung und sporadischer hepatischer und pankreatitischer Erkrankung führen, und könnte deshalb auf medizinischer Grundlage nicht verschrieben werden. Die Aufnahme von Hochlipid-Niedrigkohlenhydrat-Diäten war in den 1970er-Jahren zur Gewichtsreduktion populär angesichts einer hohen Kalorienaufnahme, mit der Maßgabe, dass die Kohlenhydrataufnahme niedrig war. Aufgrund des erhöhten Bewusstseins hinsichtlich der Beziehung von erhöhten Blutlipiden zu Atherosklerose fiel jedoch die Popularität dieser Diät abrupt ab.
Das Substituieren von Glukose in einer Flüssigdiät, wobei Glukose für 47 % des Kaloriengehalts verantwortlich ist, durch razemisches 1,3-Butandiol verursachte, dass die Blutketonkonzentration etwa 10-fach auf 0,98 mM (R)-3-Hydroxybutyrat und 0,33 mM Acetoacetat anstieg (107). Diese Werte sind geringfügig niedriger als diejenigen, welche normalerweise bei einem 48-stündigen Fasten erhalten werden, und bei weitem unterhalb der Spiegel von 7,5 mM, welche beim fastenden Mann bzw. Menschen erhalten werden. Razemisches 1,3-Butandiol wird von der Leber zu Acetoacetat und sowohl dem unnatürlichen L-β- als auch dem natürlichen D-β-Hydroxybutyrat ((S)-3-Hydroxybutanoat bzw. (R)-3-Hydroxybutyrat) umgewandelt. Obwohl razemisches 1,3-Butandiol als eine kostengünstige Kalorienquelle bei Tierfutter gründlich untersucht worden ist und sogar experimentell in menschlichen Diäten angewandt worden ist (81, 101), erzeugt die Herstellung des unnatürlichen L-Isomeren auf lange Dauer wahrscheinlich signifikante Toxizität, wie es für die Verwendung des unnatürlichen D-Lactats beim Menschen gezeigt wurde (64). Ein Nachteil der Verabreichung des unnatürlichen L-Isomers besteht darin, dass es mit dem natürlichen (R)-3-Hydroxybutyrat um den Transport konkurriert. Somit ist die Bereitstellung des (R)-1,3-Butandiols als Vorläufer für Ketonkörper eine Möglichkeit, welche die unnötige Verabreichung oder Produktion des unnatürlichen Isomeren vermeidet.
Die Mono- und Di-Acetoacetylester von razemischen 1,3-Butandiol sind als eine Kalorienquelle vorgeschlagen und in Schweinen getestet worden (67). Die orale Verabreichung, als die Ester, eines Bolus einer Diät mit 30 % Kalorien erzeugte einen kurzen Peak von Blutketonen auf 5 mM. Allerdings wird die Verwendung von razemischem 1,3-Butandiol, mit seiner Erzeugung des abnormalen (S)-3-Hydroxybutanoats, aus den oben angegebenen Gründen nicht empfehlenswert sein.
Während die Verwendung von razemischem 1,3-Butandiol in derartigen Formulierungen nicht empfohlen wird, können die Ester von (R)-1,3-Butandiol verwendet werden, entweder allein oder als der Acetoacetat-Ester. Untersuchungen in Ratten haben gezeigt, dass eine Fütterung mit razemischem 1,3-Butandiol verursachte, dass das cytosolische [NAD']/[NADH] der Leber von 1500 auf etwa 1000 abfiel (87). Im Vergleich dazu vermindert die Verabreichung von Ethanol das hepatische [NAD-]/[NADH] auf ungefähr 200 (106).
Wenn es frisch hergestellt wird, kann Acetoacetat in Infusionslösungen verwendet werden, wobei es in physiologisch normalen Verhältnissen mit (R)-3-Hydroxybutyrat für den optimalen Effekt verabreicht werden kann (95). Aufgrund von Herstellungsanforderungen, welche derzeitig eine lange Aufbewahrungs-Haltbarkeit und Hitze-sterilisierte Fluide erfordern, ist Acetoacetat häufig in der Form eines Esters gegeben worden. Dies erfolgte, um seine Aufbewahrungs-Haltbarkeit zu erhöhen und seine Stabilität gegenüber Hitze während einer Sterilisation zu erhöhen. Im Blutstrom beläuft sich Esterase-Aktivität nach Schätzungen auf etwa 0,1 mMol/min/ml und in der Leber auf etwa 15 mMol/min/g (68). Zusätzlich zu Estern, welche 1,3-Butandiol und Acetoacetat kombinieren, gab es des Weiteren eine gründliche Untersuchung von Glycerolestern von Acetoacetat in parenteraler (59) und enteraler Nahrung (82). Derartige Präparationen verringern berichtetermaßen Darmatrophie, aufgrund der hohen Aufnahme von Acetoacetat durch Darmzellen, und sind nützlich bei der Behandlung von Verbrennungen (85).
Für bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sollte, unter Optimumbedingungen, ein physiologisches Verhältnis von Ketonen durch Verabreichen von zyklischen Oligomeren und Acetoacetat hergestellt werden. Wenn dies nicht der Fall ist, wird die Leber im vollständigen Tier das Verhältnis von Ketonen gemäß ihres eigenen mitochondrialen freien [NAD⁺]/[NADH] einstellen. Wenn ein abnormales Verhältnis von Ketonen gegeben ist, wird die Leber das Verhältnis einstellen, mit begleitenden Änderungen im Leber-[NAD⁺]/[NADH]. Im arbeitenden Herzen induziert eine Perfusion mit Acetoacetat als einzigem Substrat rasch Herzversagen (99), im Gegensatz zu Rattenherzen, welche mit einer Mischung von Glukose, Acetoacetat und (R)-3-Hydroxybutyrat perfundiert werden, wobei die Herzeffizienz durch ein physiologisches Verhältnis von Ketonkörpern erhöht wurde (95).
Die zyklischen Oligomere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden zweckmäßigerweise aus den von Mikroorganismen erzeugten Polyestern synthetisiert. Natürliche Polyester von (R)-3-Hydroxybutyrat werden als Handelsartikel verkauft, z. B. als Polymere mit einem MG von 530 000, aus Alcaligenes eutrophus (Sigma Chemical Co., St. Louis) oder als Polymere mit einem MG von 250 000 für Zuckerrüben (Fluka, Schweiz). Die Bakterien produzieren das Polymer als eine Quelle von gespeichertem Nährstoff. Die Fermentation dieser Polymere durch Bakterien wurde in den 1970er-Jahren von ICI in Großbritannien und von Solvay et Cie in Belgien entwickelt, als ein potenziell biologisch abbaubarer Kunststoff für Tampon-Umhüllungen und andere Anwendungen. Das System, welches für die Synthese des Poly-(R)-3-Hydroxybutyrats verantwortlich ist, ist nun kloniert worden, und Variationen in der Zusammensetzung des produzierten Polymers basieren auf den Substraten, welche den Bakterien gegeben werden. Die für die Synthese von Polyalkanoaten verantwortlichen Gene sind kloniert und in einer Anzahl von Mikroorganismen exprimiert worden (93, 102, 113), was die Produktion dieses Materials in einer Vielzahl von Organismen unter extrem variablen Bedingungen gestattet.
Bevorzugte Formen von zyklischem oligomeren (R)-3-Hydroxybutyrat sind, wenigstens zum Teil, leicht verdaubar und/oder werden von Menschen oder Tieren metabolisiert. Sie sind vorzugsweise 2 bis 200 Wiederholungen lang, typischerweise 2 bis 20 und am zweckmäßigsten 3 bis 10 Wiederholungen, insbesondere 3 Wiederholungen, d. h. das Triolid. Es wird erkannt werden, dass Mischungen derartiger Oligomere mit dem Vorteil verwendet werden können, dass ein Bereich von Aufnahmecharakteristika erhalten werden könnte. In ähnlicher Weise können Mischungen mit dem Monomer oder linearen Oligomeren oder Polymeren bereitgestellt werden, um das produzierte Blutspiegelprofil zu modifizieren.
Zyklische Oligomere zur Verwendung in der Erfindung können, unter anderem, bereitgestellt werden durch Verfahren, welche beschrieben werden von Seebach et al., Helvetica Chimica Acta, Band 71 (1988), Seiten 155–167, und Seebach et al., Helvetica Chimica Acta, Band 77 (1994), Seiten 2007 bis 2033. Für manche Umstände können derartige zyklische Oligomere von 5 bis 7 oder mehr (R)-3-Hydroxybutyrat-Einheiten bevorzugt werden, da sie einfacher in vivo abgebaut werden können. Die Verfahren zur Synthese der Verbindungen, welche darin beschrieben werden, sind hierin durch den Bezug darauf einbezogen.
Sobald das Monomer im Blutstrom ist, und da die Leber nicht in der Lage ist, Ketonkörper zu metabolisieren, sondern nur das Verhältnis von (R)-3-Hydroxybutyrat/Acetoacetat verändern kann, werden die Ketonkörper zu extrahepatischen Geweben transportiert, wo sie verwertet werden können. Die erreichten Blutspiegel an Ketonen unterliegen keiner Variation, welche durch Verzehr von Kohlenhydrat wegen Nicht-Einverständnis verursacht wird, wie es bei der derzeitigen ketogenen Diät der Fall ist. Vielmehr werden sie lediglich ein Additiv zu der normalen Nahrung sein, das in ausreichenden Mengen gegeben wird, um einen anhaltenden Blutspiegel herzustellen, typischerweise von zwischen 0,3 und 20 mM, weiter bevorzugt 2 bis 7,5 mM, über eine Dauer von 24 Stunden hinweg, abhängig von dem behandelten Zustand. Im Fall von resistenter Kindheits-Epilepsie nimmt man derzeitig an, dass Blutspiegel von 2 mM ausreichend sind. Im Fall von Morbus Alzheimer könnten sogar Versuche unternommen werden, die Spiegel bei 7,5 mM oder mehr zu halten, wie sie in Untersuchungen am fastenden Mann erzielt werden, in einer Bestrebung, alternative Energie- und Acetyl-CoA-Versorgungen für das Gehirngewebe in Alzheimer-Patienten bereitzustellen, wo die PDH-Kapazität aufgrund von überschüssigen Mengen an Aβ_1-42-Amyloid-Peptid beeinträchtigt ist (77, 78).
Die Feststellung seitens des Erfinders, dass (R)-3-Hydroxybutyrat und seine Mischungen mit Acetoacetat als eine Nervenstimulanz, z. B. Nervenwachstum-Stimulanz und/oder Stimulanz von axonalem und dendritischem Wachstum, wirken, eröffnet die Option der Erhöhung von Ketonkörper-Spiegeln zu geringeren Ausmaßen, als nährstoffmäßig erforderlich, um Neurodegeneration zu behandeln.
Zusammensetzungen der Erfindung sind vorzugsweise steril und pyrogenfrei, insbesondere endotoxinfrei. Zum Zweiten werden sie vorzugsweise auf eine solche Weise formuliert, dass sie schmackhaft sein können, wenn sie als ein Additiv zu einer normalen Ernährung gegeben werden, um das Einverständnis der Patienten bei der Einnahme der Nahrungsergänzungen zu verbessern. Die zyklischen Oligomere sind im Allgemeinen geruchsfrei. Formulierungen der zyklischen Oligomere von (R)-3-Hydroxybutyrat und dessen Mischungen mit Acetoacetat können mit Maskierungsmitteln beschichtet werden oder können durch enterisches Beschichten derselben oder anderweitiges Verkapseln derselben zum Darm zielgelenkt werden, wie es auf dem Fachgebiet der Pharmazeutika oder Nutraceuticals allgemein verstanden wird.
Da Ketonkörper etwa 4 bis 6 Kalorien/g enthalten, gibt es vorzugsweise eine kompensatorische Verringerung in den Mengen der anderen eingenommenen Nährstoffe, um Fettleibigkeit zu vermeiden.
Besondere Vorteile der Verwendung von zyklischen Oligomeren, welche in der vorliegenden Erfindung gelehrt werden, sind:

1) Sie können mit einer normalen Nahrungsbeladung von Kohlenhydrat verzehrt werden, ohne Blutketonkörperspiegel zu verringern, wobei diese Verringerung die Effekte der Behandlung beeinträchtigen würde,
2) Sie werden Blut-VLDL und -Cholesterin nicht erhöhen, wie bei derzeitigen Sahne und Magarine enthaltenden Ernährungen, wodurch das Risiko einer beschleunigten Gefäßerkrankung, Fettleber und Pankreatitis eliminiert wird.
3) Sie werden einen weiteren Anwendungsbereich in einer größeren Vielfalt von Patienten aufweisen, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein: Typ II-Diabetes zum Verhindern von hypoglykämischen Anfällen und Koma, bei Alzheimer und anderen neurodegenerativen Erkrankungen zum Verhindern des Todes von Nervenzellen, z. B. Hippocampus-Zellen.

Die zyklischen Oligomere der Erfindung können in oraler und parenteraler Verwendung in Emulsionen angewandt werden, wohingegen Acetoacetat, im nicht-veresterten Zustand, weniger bevorzugt wird, da es einer spontanen Decarboxylierung zu Aceton mit einer Halbwertszeit bei Raumtemperatur von etwa 30 Tagen unterliegt. Wo die Zusammensetzungen der Erfindung Acetoacetat einschließen, kann dieses in der Form eines Vorläufers vorliegen. Acetoacetat kann zweckmäßigerweise als (R)-3-Hydroxybutyrat-Ester bereitgestellt werden, wie vorgesehen von der gleichzeitig anhängigen Anmeldung "Therapeutische Zusammenstellungen".
Die Behandlung kann die Bereitstellung eines signifikanten Anteils der Kalorienaufnahme von Patienten mit dem zyklischen (R)-3-Hydroxybutyrat-Oligomer oder Oligomeren umfassen, die so zum Ergeben einer verzögerten Freisetzung formuliert sind, dass Blutketone über eine Dauer von 24 Stunden im erhöhten Bereich, z. B. 0,5 bis 20 mM, vorzugsweise einem Bereich von 2–7,5 mM, gehalten werden. Die Freigabe der Ketonkörper in das Blut kann durch Anwenden einer Vielzahl von Techniken eingeschränkt werden, wie Mikroverkapselung, Adsorption und dergleichen, was derzeitig bei der oralen Verabreichung einer Reihe von pharmazeutischen Mitteln praktiziert wird. Enterisch beschichtete Formen, welche auf eine Zuführung nach dem Magen abzielen, können insbesondere verwendet werden, falls das Material keine Hydrolyse in saurer Umgebung erfordert, oder nicht anfällig dafür ist. Falls eine gewisse derartige Hydrolyse gewünscht wird, können unbeschichtete Formen verwendet werden. Manche Formen können Enzyme einschließen, die zur Spaltung der Ester unter Freisetzung der Ketonkörper in der Lage sind, wie diejenigen, auf welche in Doi, Microbial Polyesters, Bezug genommen wird.
Bevorzugte zyklische Oligomere, z. B. das Triolid, können lediglich als solches zu Nahrungsmitteln zugegeben werden und/oder können in einem Behandlungs-Plan durch andere Ketonkörper-Generatoren mit unterschiedlichem Freisetzungsprofil, wie etwa dem monomeren (R)-3-Hydroxybutyrat, supplementiert werden. Das Letztgenannte kann als eine wässrige Lösung, z. B. als ein Salz, z. B. Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalz, vorgesehen werden.
Für eine 1500-Kalorien-Diät könnte der menschliche erwachsene Patient 198 g zyklische Ester der vorliegenden Erfindung am Tag konsumieren. Für eine 2000-Kalorien-Diät der gleichen Proportionen, könnte man 264 g Ketone am Tag konsumieren. Bei der ketogenen Lipid-Diät werden Blutketone auf etwa 2 mM erhöht, was sich zu einem gewissen Ausmaß wenigstens in über 60 % der behandelten Kinder als effektiv erweist. Bei der Keton-Diät sollten Ketonspiegel höher sein, weil Ketone bei dem kalorischen Äquivalent von Fett, d. h. 1,5 g Keton/g Fett, substituiert worden sind. Folglich sollten sich die Blutketone auf ungefähr 3 mM belaufen, ein wirksamer Spiegel in Kindern, aber noch unterhalb des beim fastenden Mann erzielten Spiegels von 7,5 mM.
Die Vorteile der Verwendung von Verbindungen, welche Ketonkörperspiegel direkt erhöhen, einschließlich der vorliegenden zyklischen Oligomere, welche die Blutspiegel von Ketonkörpern selbst erhöhen, sind zahlreich. Zum ersten erfordert die Bereitstellung von Ketonkörpern selbst nicht die Limitierung von Kohlenhydrat, wodurch die Schmackhaftigkeit der Nahrungsformulierungen erhöht wird, insbesondere in Kulturen, bei welchen Ernährungen von hohem Kohlenhydrat üblich sind. Zum Zweiten können Ketonkörper durch Muskulatur, Herz und Gehirngewebe, aber nicht von der Leber, verstoffwechselt werden. Somit wird die Fettleber, welche ein unangenehmer Nebeneffekt der ketogenen Diät sein kann, vermieden. Drittens erhöht die Fähigkeit zum Einschließen von Kohlenhydrat in den Nahrungsformulierungen die Wahrscheinlichkeit des Ein verständnisses und eröffnet praktische therapeutische Vorgehensweisen zu Typ II-Diabetes, bei welchem eine hoher Gehalt an Insulin vorliegt, was die bekannte ketogene Diät nichtfunktionierend sein lässt.
Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat festgestellt, dass, während jede Erhöhung von Ketonkörpern wünschenswert sein kann, eine bevorzugte zu verabreichende Menge an zyklischen Ester ausreichend sein wird, mit jedweder Acetoacetyl-Komponente, um Blut-Ketonkörper-Spiegel auf den Spiegel von 0,5 bis 20 mM, vorzugsweise den Spiegel von 2 mM bis 7,5 mM und höher, zu erhöhen, insbesondere wenn versucht wird, den Tod von Hirnzellen bei Erkrankungen, wie Alzheimer und Parkinsonismus, aufzuhalten. Obgleich tote Zellen nicht wiederhergestellt werden können, lässt sich das Aufhalten einer weiteren Verschlechterung und wenigstens eine gewisse Wiederherstellung der Funktion voraussehen.
Die Gesamtmenge an in der Behandlung von Neurodegeneration, wie Alzheimer und Parkinsonismus, verwendeten Ketonkörpern wird vorzugsweise Blutspiegel von Ketonkörpern um 0,5 mM bis 20 mM erhöhen. Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung schätzt, dass 200 bis 300 g (0,5 Pfund) Ketonkörper-Äquivalent je Patient pro Tag erforderlich sein könnten, um dies zu erzielen. Falls die Behandlung durch Aufrechterhaltung von Zellen gegen die Effekte von Neurotoxin erfolgt, kann dies bei einem hinreichenden Spiegel erfolgen, um als eine signifikante Kalorienquelle zu wirken, z. B. 2 bis 7,5 mM in Blut. Falls sie auf dem so hervorgerufenen "Nerven-Stimulatorischen-Faktor"-Effekt des (R)-3-Hydroxybutyrats beruht, kann die verabreichte Menge niedriger sein, z. B. um eine Erhöhung von 0,2 bis 4 mM vorzusehen, aber kann selbstverständlich für diese oder eine andere Erkrankung höher sein.
Es wird erkannt werden, dass eine Behandlung für neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer oder Parkinsonismus, am effektivsten bald nach der Identifizierung von Patienten mit einer Prädisposition zur Entwicklung der Krankheit gegeben werden wird. Somit folgt eine Behandlung für Alzheimer am wirksamsten einem positiven Testergebnis für einen oder mehrere Zustände, ausgewählt aus der Gruppe von (i) Mutationen in dem Amyloidvorläufer-Protein-Gen auf Chromosom 21, (ii) Mutationen in dem Presenilin-Gen auf Chromosom 14, (iii) Vorhandensein von Isoformen von Apolipoprotein E. Andere Tests, welche gezeigtermaßen für Alzheimer aussagefähig sind, werden selbstverständlich anwendbar sein.
Im Anschluß an ein derartiges positives Testergebnis, wird es angemessen sein, die Entwicklung von Gedächtnisverlust und/oder sonstiger neurologischer Dysfunktion zu verhindern, indem man die Gesamtsumme der Konzentrationen der Ketonkörper (R)-3-Hydroxybutyrat und/oder Acetoacetat im Blut oder Plasma des Patienten auf etwa zwischen 1,5 und 10 mM, weiter bevorzugt 2 bis 8 mM, durch eine von mehreren Methoden erhöht. Vorzugsweise erhält der Patient eine Nah rung von ausreichenden Mengen an Verbindung von Formel (I), gegebenenfalls parenteral, aber vorzugsweise und vorteilhaft enteral.
Es wird erkannt werden, dass hypoglykämische Gehirn-Dysfunktion ebenfalls unter Verwendung der Behandlungen und Zusammensetzungen und Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelbar sein wird. Eine weitere mit der vorliegenden Behandlung assoziierte Eigenschaft wird eine allgemeine Verbesserung in der Muskelleistung sein.
Die Bereitstellung von auf zyklischem Oligomer basierenden Medikamenten der Erfindung wird durch die einfache Verfügbarkeit einer Anzahl von relativ kostengünstigen, oder potenziell kostengünstigen, Ausgangsmaterialien erleichtert, aus denen zyklische (R)-3-Hydroxybuttersäure abgeleitet werden kann (siehe Microbial Polyesters, Yoshiharu Doi. ISBN 0-89573-746-9, Kapitel 1.1, 3.2 und 8). Die Verfügbarkeit von Genen, welche zur Insertion in nahrungserzeugende Organismen in der Lage sind, stellt eine Methode zur Erzeugung von Produkten, wie etwa Joghurts und Käse, bereit, welche hinsichtlich zyklischer Oligomer-(R)-3-Hydroxybuttersäure oder, nach Abbau mit Enzymen, die zum Spalten derartiger Polymere in der Lage sind, mit der monomeren Substanz selbst angereichert sind (siehe Doi. Kapitel 8).
Verfahren zur Herstellung von Poly-(R)-3-Hydroxybutyrat werden nicht spezifisch beansprucht, da diese im Fachgebiet bekannt sind; zum Beispiel Shang et al. (1994) Appli. Environ. Microbiol. 60:1198–1205. Dieses Polymer ist im Handel von Fluka Chemical Co. P1082, Kat.-Nr. 81329, 1993–94, 980. Second. St. Ronkonkoma NY 11779 - 7238, 800 358 5287, erhältlich.
Die vorliegende Erfindung wird nun lediglich zur Veranschaulichung durch Bezugnahme auf die folgenden Figuren und experimentellen Beispiele weiter beschrieben werden. Weitere Ausführungsformen, welche innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen, werden dem Fachmann auf dem Gebiet in Hinsicht auf selbige offensichtlich sein.
FIGUR
Die 1 ist eine Grafik, welche den Blut-(R)-3-Hydroxybutyrat-Spiegel zeigt, welcher im Verlauf der Zeit nach Fütterung von Ratten mit dem Triolid von (R)-3-Hydroxybutyrat, einem in Beispiel 1 hergestellten zyklischen Oligomer, in Joghurt und bei Kontrollen, welche mit Joghurt allein gefüttert wurden, erzeugt wurde.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung von (R,R,R)-4,8,12-Trimethyl-1,5,9-trioxadodeca-2,6,10-trion: Triolid von (R)-3-Hydroxybuttersäure
Die Synthese war beschaffen, wie es in Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1992), 31, 434, beschrieben ist. Eine Mischung von Poly[(R)-3-Hydroxybuttersäure] (50 g) und Toluol-4-Sulfonsäuremonohydrat (21,5 g, 0,113 Mol) in Toluol (840 ml) und 1,2-Dichlorethan (210 ml) wurde gerührt und 20 Stunden lang bis zum Reflux erwärmt. Das Wasser wurde mittels einer Dean-Stark-Falle 15 Stunden lang entfernt, wonach die braune Lösung auf Raumtemperatur gekühlt und zuerst mit einer halbgesättigten Lösung von Natriumcarbonat und dann mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft wurde. Der braune halbfeste Rückstand wurde unter Anwendung einer Kugelrohr-Vorrichtung destilliert, wodurch man einen weißen Feststoff (18,1 g) bei 120–130 °C/0,15 mmHg erhielt. Über 130 °C begann ein wachsartiger Feststoff zu destillieren – die Destillation wurde an diesem Punkt gestoppt. Das destillierte Material wies einen Schmp. von 100–102 °C auf (Literatur Schmp.: 110–110,5 °C). Eine Umkristallisierung aus Hexan ergab farblose Kristalle in einer Ausbeute von 15,3 g. Schmp. = 107–108 °C; [α]_D-35,1 (c = 1,005, CHCl₃), (Lit. = –33,9). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 1,30 (d, 9H, CH₃); 2,4–2,6 (m, 6H; CH₂); 5,31–5,39 (M, 3H; HC-O). ¹³C-NMR (CDCl₃) δ = 20,86 (CH₃), 42,21 (CH₂), 68,92 (CH), 170,12 (CO). Elementanalyse: Berechnet für C₁₂H₁₈O₆: C, 55,81; H 7,02; gefunden: C, 55,67; H, 7,15.
Vergleichsbeispiel 1: Herstellung von Oligomeren von (R)-3-Hydroxybuttersäure (R)-3-Hydroxybutyrat).
(R)-3-Hydroxybuttersäure (Fluka – 5,0 g: 0,048 Mol), p-Toluolsulfonsäure (0,025 g) und Benzol (100 ml) wurden unter Rückfluss innerhalb einer Dean-Stark-Fallen-Anordnung 24 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, und das Benzol im Vakuum (0,5 mm Hg) verdampft. 4,4 g farbloses Öl wurden erhalten, wovon man eine 20 mg-Probe zur Analyse der Anzahl an Monomer-Wiederholungen unter Verwendung von NMR in den Methylester umwandelte. Diese Untersuchungen zeigen, dass das Produkt eine Mischung von Oligomeren von D-β-Hydroxybutyrat mit einer durchschnittlichen Anzahl an Wiederholungen von 3,75 ist, welche hauptsächlich eine Mischung von Trimeren, Tetrameren und Pentameren ist, wobei das einzige häufigste Material das Tetramer ist. Die Produktmischung war in 1 Äquivalent Natriumhydroxid löslich.
Vergleichsbeispiel 2: Herstellung von Acetoacetylester von oligomerer (R)-3-Hydroxybuttersäure.
Ein weiterer Ansatz des farblosen Ölprodukts aus Beispiel 1 (4,5 g) wurde 1 Stunde lang bei 60 °C mit Diketen (3,8 g) und Natriumacetat (0,045 g) unter Stickstoff erwärmt. Weiteres Diketen (3,8 g) wurde zugesetzt, und die Reaktion wurde eine weitere Stunde lang erwärmt, abgekühlt und mit Ether verdünnt, mit Wasser gewaschen und dann mit gesättigtem Natriumbicarbonat (5 × 100 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde mit Ether gewaschen und dann mit konzentrierter HCl (tropfenweise zugegeben) angesäuert. An eine Ethylacetat-Extraktion (3 × 50 ml) schlossen sich eine Trocknung über Magnesiumsulfat und das Eindampfen in Vakuum an. Eine gelbe Feststoff/Öl-Mischung wurde erhalten (7,6 g), welche auf einer Siliciumdioxid bzw. Silicasäule unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98:2) chromatographiert wurde, um ein hell-bernsteinfarbenes Ölprodukt zu ergeben. Sich schneller bewegende Verunreinigungen wurden isoliert (1,6 g), und nach erneutem Auftragen von Kohlenstofftetrachlorid/Methanol (99:1) auf die Säule wurden 0,8 g Öl gewonnen, von welchem durch NMR und Massenspektrometrie gezeigt wurde, die gewünschte Mischung von acetoacetylierten Oligomeren von (R)-3-Hydroxybutyrat zu sein. Die Produktmischung wies ein Rf von 0,44 in Dichlormethan/Methanol (90:1) auf und war in 1 Äquivalent Natriumhydroxid löslich.
Beide Produkte, aus den Vergleichsbeispielen 1 und 2, sind einer Trennung von individuellen Komponenten durch präparative HPLC zugänglich.
Beispiel 2.
Orale Verabreichung von Triolid von (R)-3-Hydroxybutyrat von Beispiel 1 an Ratten.
Die Fähigkeit von oral verabreichtem Triolid, Blutketon-Spiegel zu erhöhen, wurde wie folgend untersucht. Am Tag bevor das Experiment begann, wurden 12 Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 316 ± 10 g in getrennte Käfige eingebracht. Sie hatten 15 Stunden lang vor der Darreichung von Triolid enthaltenden Zusammensetzungen keinen Zugang zu Futter, aber Wasser wurde frei zugänglich bereitgestellt.
Am Morgen des Experiments wurden für 9 der Ratten 0,64 g Triolid mit 5 g Schwarzkirsch-Joghurt der Marke "Co-op" in getrennten Futterschalen gemischt. Die übrigen 3 Ratten erhielten 5 g des Joghurts ohne das Triolid, als Kontrollen. Die Joghurt enthaltenden Schalen wurden in die Käfige gebracht und für die Ratten wurde die Zeit gemessen, während sie aßen. Zwei der drei Kontrollratten verzehrten das gesamte Joghurt und vier der sechs Triolid-Joghurt-Ratten verzehrten ungefähr die Hälfte der bereitgestellten Menge. Die restlichen sechs Ratten schliefen.
Kontrollratten (n = 2) wurden 60 und 180 Minuten nach dem Verzehr von Joghurt getötet, wohingegen mit Triolid gefütterte Ratten nach 80, 140, 150 und 155 Minuten getötet wurden. Blutproben wurden für den Assay von (R)-3-Hydroxybutyrat entnommen. Gehirne wurden in einem Trichter eingefroren und später in Perchlorsäure extrahiert, und die Extrakte wurden neutralisiert und geassayt. Blutspiegel von (R)-3-Hydroxybutyrat wurden unter Anwendung eines NAD^-/EDTA-Assays von Anal. Biochem. (1983) 131, S. 478–482, gemessen. 1,0 ml einer Lösung, welche hergestellt wurde aus 2-Amino-2-methyl-1-propanol (100 mM, pH 9,9, 0,094 g/10 ml) NAD⁺ (30 mM, 0,199 g/10 ml) und EDTA (4 mM, 0,015 g/10 ml), wurde zu jeder einer Anzahl von Küvetten, und 4 μl Probe oder (R)-3-Hydroxybutyrat-Kontrolle, zugegeben.
Die zwei Kontrollratten verzehrten 5,2 ± 0,1 g Joghurt, und ihre Plasma-(R)-3-Hydroxybutyrat-Konzentrationen beliefen sich auf etwa 0,45 mM bei 60 Minuten und 180 Minuten. Die vier mit Triolid gefütterten Ratten verzehrten 0,39 ± 0,03 g des Triolids und 2,6 ± 0,2 g Joghurt. Ihre Plasma-(R)-3-Hydroxybutyrat-Konzentrationen beliefen sich auf 0,8 mM nach 80 Minuten und 1,1 mM für die Gruppe, welche bei ungefähr 150 Minuten getötet wurde. Sämtliche Ratten zeigten keine Krankheits-Auswirkungen durch den Verzehr von Triolid. Somit wurde festgestellt, dass das Serum-(R)-3-Hydroxybutyrat mittels Verfüttern von lediglich 0,4 g Triolid um 0,65 mM erhöht war. Es ist anzumerken, dass, wenn die Ratten fasten gelassen worden waren, die anfänglichen Spiegel von (R)-3-Hydroxybutyrat von 0,1 mM beim gefütterten Zustand auf etwa 0,45 mM erhöht waren.
Die Testratten zeigten daher eine Erhöhung im Plasma-(R)-3-Hydroxybutyrat über mindestens 3 Stunden mit keinerlei Krankheits-Auswirkungen. Es sollte angemerkt werden, dass zwei andere Ratten, welchen ungefähr 1,5 g Triolid jeweils in "Hob-Nob"-Biscuit verfüttert wurde, keine Krankheitseffekte nach zwei Wochen aufzeigten.
Es sollte bemerkt werden, dass die erhöhten Spiegel an (R)-3-Hydroxybutyrat ebenfalls in Acetoacetat-Spiegeln reflektiert werden, welche hier nicht gemessen wurden, da eine rasche Einrichtung eines Gleichgewichts zwischen den beiden in vivo besteht, sodass die Acetoacetatspiegel zwischen 40 und 100 % der (R)-3-Hydroxybutyrat-Spiegel betragen werden.
Vergleichsbeispiel 3: Orale Verabreichung von (R)-3-Hydroxybutyrat, Oligomeren und Acetoacetyl-(R)-3-Hydroxybut-Oligomeren an Ratten.
Die Fähigkeit von oral verabreichtem (R)-3-Hydroxybutyrat und der linearen Oligomere der Vergleichsbeispiele 1 und 2 zur Erhöhung von Blut-Ketonkörperspiegeln wurde wie folgend untersucht. Ratten wurden über Nacht fasten gelassen und erhielten dann 100 μl/100 g Körpergewicht an 4 M (R)-3-Hydroxybutyrat, welches unter Verwendung von Methylglucamin auf pH 7,4 gebracht worden war. Es wurde gemessen, dass die Plasmaspiegel von (R)-3-Hydroxybutyrat sich nach 30 Minuten auf 0,62 mM beliefen, im Vergleich zu 3 mM, wenn 9 M (R)-3-Hydroxybutyrat verwendet wurde.
Diese Verfahrensweise wurde mit 2 M Lösungen der Mischungen von (R)-3-Hydroxybutyrat-Oligomeren und ihren Acetoacetyl-Estern, welche in den Vergleichsbeispielen 1 und 2 beschrieben sind, wiederholt. Das (R)-3-Hydroxybutyrat-Oligomer (19/1) und der Acetoacetylester (20/4) wurden beide mit Methylglucamin auf pH 7,6 gebracht, und der Blut-(R)-3-Hydroxybutyrat-Spiegel wurde unter Anwendung des zuvor genannten Assay-Vorgehens überwacht. Erhöhungen im Serum-(R)-3-Hydroxybutyrat beliefen sich gezeigtermaßen auf 0,2 mM bis 0,5 mM 60 und 120 Minuten nach der Verabreichung.
Beispiel 5
Tabelle 2. Ketogene 1500-Kalorien-Probediät unter Anwendung von zyklischem Oligomer (I) der Erfindung. Es wird angenommen, dass das zyklische Oligomer 6 kcal/g Fette, 9 kcal/g Kohlenhydrat und 4 kcal/g Protein enthält. Oligomere sind substituiert worden, um äquivalente Kalorien zu ergeben.
Beispiel 6: Effekt von (R)-3-Hydroxybutyrat auf Hippocampus-Zellen.
Methoden
Kulturmedium und Chemikalien
Das von Tag 0 bis Tag 4 verwendete serumfreie Medium enthielt Neurobasal-Medium mit B27-Ergänzung, in 50-facher Verdünnung (Life Technology, Gaithersburg, MD), wozu folgendes zugesetzt wurde: 0,5 mM L-Glutamin, 25 μM Na-L-Glutamat, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Nach Tag 4 wurde DMEM/F12-Medium, das 5 μM Insulin, 30 nM L-Thyroxin, 20 nM Progesteron, 30 nM Na-Selenit, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthielt, verwendet.
Hippocampale Mikroinselkulturen
Die primären hippocampalen Kulturen wurden aus Wistar-Embryonen an Tag 18 entnommen und durch vorsichtiges Bewegen in einer Pipette dispergiert. Die Suspension wurde bei 1500 × g während 10 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in neuem Medium zu einer End-Zellzählung von 0,4–0,5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Zehn μl dieser Suspension wurden in die Mitte von mit Poly-D-Lysin beschichteten Kulturvertiefungen pipettiert, und die Platten wurden bei 38 °C während 4 Stunden inkubiert, und danach wurden 400 μl frisches Neurobasal-Medium zugegeben. Nach 2 Tagen Inkubation wurde die Hälfte des Mediums durch frisches Medium ersetzt, und die Inkubation wurde 2 weitere Tage lang fortgesetzt. Nach Tag 4 wurde das Medium durch DMEM/F12-Medium, welches 5 μM Insulin, 30 nM l-Thyroxin, 20 nM Progesteron, 30 nM Na-Selenit, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthielt, ausgetauscht. Die Vertiefungen wurden in 4 Gruppen eingeteilt: Die Hälfte der Vertiefungen erhielt (R)-3-Hydroxybutyrat zu einer Endkonzentration von 8 mM, während [die andere] Hälfte der Vertiefungen 5 nM Amyloid β_1-42 (Sigma) erhielt. Diese Medien wurden 2 Tage später (Tag 8) ausgewechselt, und die Zellen wurden am Tag 10 fixiert und mit Anti-MAP2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, In) zur Sichtbarmachung von Neuronen und Vimentin sowie mit GFAP (Boehringer) zur Sichtbarmachung von Gliazellen gefärbt.
Ergebnisse
Zellzählungen
Die Zugabe von (R)-3-Hydroxybutyrat zu der Inkubation führte zu einer Erhöhung in der Neuronenzellanzahl je Mikroinsel von einem Mittelwert von 30 zu einem Mittelwert von 70 Zellen je Mikroinseln. Die Zugabe von 5 nM Amyloid β_1-42 zu den Kulturen reduzierte die Zellzahlen von 70 auf 30 Zellen je Mikroinsel, was die früheren Beobachtungen von Hoshi et al. bestätigte, dass Amyloid β_1-42 für hippocampale Neuronen toxisch ist. Die Zugabe von (R)-3-Hydroxybutyrat zu Kulturen, welche Amyloid β_1-42 enthielten, erhöhte die Zellzahl von einem Mittelwert von 30 auf 70 Zellen je Mikroinsel. Aus diesen Daten folgern wir, dass die Zugabe von Substrat-Spiegel-Mengen an (R)-3-Hydroxybutyrat zu Medien, deren Hauptnährstoffe Glukose, Pyruvat und L-Glutamin sind, die Geschwindigkeit des Zelltods in Kultur verlangsamt. Es wird ferner gefolgert, dass (R)-3-Hydroxybutyrat die erhöhte Geschwindigkeit von hippocampalem Zelltod, welcher durch die Zugabe von Amyloid β_1-42 in Kultur verursacht wird, verringern kann.
Sowohl die Zahl dendritischer Auswüchse als auch die Länge von Axonen waren nach Beobachtungen bei Vorhandensein von (R)-3-Hydroxybutyrat erhöht, ungeachtet dessen, ob β_1-42 vorhanden war oder nicht. Dies weist auf ein Nervenwachstumfaktor-ähnliches Verhalten hin.
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Claims

Verwendung eines zyklischen Esters von (R)-3-Hydroxybutyrat der Formel (I)
wobei n eine ganze Zahl von 1 oder mehr ist oder ein Komplex dessen mit einem oder mehreren Kationen oder ein Salz dessen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen oder Typ II-Diabetes wobei die Behandlung nicht in der Kontrolle von Anfällen besteht.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung durch freie Radikale oder toxische Wirkstoffe wie etwa Peptide und Proteine, Insulinresistenz, Ischämie, Schädeltrauma, Mangel an oder Blockierung von Pyruvatdehydrogenase oder die Unfähigkeit zur Durchführung der Glykolyse in einem oder mehreren Zelltypen vermittelt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung Alzheimer, Parkinsonismus, Amyotrophische Lateralsklerose oder Typ II-Diabetes ist.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das zyklische Oligomer der Formel (I) als eine neuronale Stimulanz wirkt, die in der Lage ist, axonales und/oder dendritisches Wachstum in Nervenzellen in vivo oder in vitro zu stimulieren.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Nervenzellen Hippocampus- oder Substantia nigra-Zellen sind.