PT100246B - Analogos de gnrh e seu processo de preparacao - Google Patents

Description

Este invento refere-se geralmente a péptidos que têm aminoácidos não naturais e à preparação de novos aminoácidos não naturais, os quais podem ser derivados de aminoácidos que têm uma cadeia lateral aromática amino-súbstituída, tal como o para-amino Phe . Mais particularmente, refere-se a análogos da GnRH que têm estes aminoácidos não naturais, os quais podem ser preparados quer nestes péptidos completamente montados quer para incorporação nestes péptidos como parte do habitual processo da síntese de alongamento da cadeia.

Num aspecto mais particular, o presente invento refere-se a péptidos que inibem a função das gónadas e a libertação das hormonas esteroides, progesterona e testosterona, bem como a processos para impedir a ovulação.

Antecedentes do Invento

A hormona estimuladora dos folículos (FSH) e a hormona luteinizante (LH), algumas vezes denominadas gonadotropinas ou hormonas gonadotrópicas, são libertadas pela hipófise. Estas hormonas em combinação, regulam o funcionamento das gónadas para produzir a testosterona nos testículos e progesterona e estrogénio nos ovários e regulam também a produção e a maturação dos gâmetas.

J

A libertação de uma hormona pelo lobo anterior da hipófise, exige habitualmente a prévia libertação de outra classe de hormonas produzida pelo hipotálamo. A hormona hipotalâmica GnRH dispara a libertação das hormonas gonadotrópicas especialmente da LH; esta hormona é também referida como LH-RH e como LRF. A GnRH dos mamíferos é um decapéptido bem conhecido descrito na patente E.U.A. N^a. 4 072 668.

Os péptidos são compostos que contêm dois ou mais aminoácidos nos quais o grupo carboxilo de um ácido está ligado ao grupo amino do outro ácido. Na representação convencional dos péptidos, o terminal amino aparece à esquerda e o terminal carboxilo à direita. As posições dos resíduos aminoácidos são

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identificadas numerando os resíduos aminoácidos da esquerda para a direita. Na GnRH, a porção hidroxilo do grupo carboxilo de glicina no C-terminal foi substituída por um grupo amino (NH₂), isto é, o C-terminal está amidado. As abreviaturas para os resíduos aminoácidos individuais anteriores são convencionais e baseiam-se no nome trivial do aminoácido, por exemplo, pGlu é ácido piroglutâmico, Glu é ácido glutâmico, His é histidina, Trp é triptofano, Ser é serina, Tyr é tirosina, Gly é glicina, Leu é leucina, Nle é norleucina, Orn é ornitina, Arg é arginina, Har é homoarginina, Pro é prolina, Sar é sarcosina, Phe é fenilalanina, Ala é alanina, Vai é valina, Nva é norvalina, Ile é isoleucina, Thr é treonina, Lys é lisina, Asp é ácido aspártico, Asn é asparagina, Gin é glutamina e Met é metionina. Com excepção da glicina, os aminoácidos dos péptidos do invento têm a configuração L a não ser que se indique de outro modo.

Existem razões para desejar impedir a ovulação nos mamíferos fêmeas e a administração de análogos da GnRH que são antagonistas da função normal da GnRH tem sido utilizada para suprimir ou retardar a ovulação. Por esta razão, os análogos da GnRH que são antagonistas da GnRH estão a ser investigados quanto à sua potencial utilização como contraceptivos ou para regular os períodos de concepção. Os antagonistas da GnRH também podem ser usadas para o tratamento da puberdade precoce e da endometriose. Também se verificou que estes antagonistas são úteis para regular a secreção das gonadotropinas nos mamíferos machos e podem ser empregados para impedir a espermatogenese, por exemplo como contraceptivos masculinos, no tratamento de agressores sexuais macho e no tratamento da hipertrofia prostática. Mais especificamente, os antagonistas da GnRH podem ser usados para tratar tumores dependentes de esteróides como os tumores da próstata e da mama e para o controlo do período de ovulação para a fertilização in vitro. Na fêmea, podem também ser usados para tratar o hirsutismo.

Num aspecto, deseja-se conseguir péptidos aperfeiçoados que são fortemente antagonistas da GnRH endógena e impedir a secreção de LH e FSH e a libertação de esteróides pelas gónadas de

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-4mamíferos e que tenham boa solubilidade a um pH fisiologicamente aceitável, como os pH entre cerca de 5 e cerca de 6,5. De particular interesse são os compostos que são mais eficazes in vivo quando administrados oralmente.

Sumário do Invento presente invento propociona aminoácidos não naturais que podem ser preparados de novo ou modificando um péptido previamente preparado ou um péptido-resina protegido, contendo uma sequência global desejada q-ue inclui um ou mais resíduos aminoácidos que têm um grupo amino a modificar. Os aminoácidos do invento preferidos têm uma cadeia lateral que contém um grupo guanidino modificado ou um equivalente ou derivado de guanidino que é obtido por maior elaboração de um grupo guanidino modificado como em seguida se descreve.

Noutro aspecto particular, o invento proporciona péptidos que inibem a libertação das gonadotropinas nos mamíferos, incluindo humanos e proporciona também processos para inibir a libertação de esteróides pelas gónadas de mamíferos macho e fêmea. Como acima se mencionou, estes antagonistas da GnRH podem ser utilizados para inibir a produção de gonadotropinas e de hormonas sexuais em diversas circunstâncias, incluindo a puberdade precoce, neoplasia dependente de hormonas, dismenorreia, endometriose e tumores dependentes de esteróides.

O invento proporciona aminoácidos não naturais que têm a fórmula U* seguinte:

onde j é 1, 2 ou 3; Y é N-CN, N-CONHR₉, O, S ou CH-NO₂ onde R₉ é H, Ac, alquilo (de preferência Cj a C₄), naftilo, piridilo, piri73 713

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*4 midilo, pirazinilo, indolilo, quinolinilo ou imidazolilo, grupos alquilo e cíclicos estes que são não substituídos ou substituídos (de preferência com cloro, fluoro, bromo, amino, nitro, alquilo (C_x a C₄) e alcoxi (C_x a C₄)); X é NH, 0, N₃, M₁-(CH_q)_p-M₂ ou M^ÍCHsJp/^fCHsJpii^, onde M_x é NR₁₀, N, 0 ou CHR₃ onde R₃ é metilo, etilo, propilo, fenilo, piridinilo, pirimidinilo ou purinilo, q é 1 ou 2; p, p⁷ e p são números inteiros entre 0 e 6; R10 é H, metilo, etilo, propilo, fenilo ou fenilo substituído (de preferência com Cl, F, N02 ou NH2); e M2 e M3 são Mx, COOH, CONH2, COOR3 ou CN (de preferência X é NH ou O); Rx é H, alquilo (de preferência Cx a Cg e, muito preferivelmente, Cx a C4), alquilo modificado (de preferência Cx a Cg, cujo carbono terminal está substituído com NH2, OH, Cl, Br ou F ou está substituído por CF3 ou CF2CF3), alcenilo (de preferência C2 a C4), como CH2CH=CHR3, alcinilo (de preferência C2 a C4 ) , como CH2C=CR3, arilo como benzilo, tolilo, p-aminobenzilo (anilinilo) e pCl-benzilo ou uma ligação directa a X; R2 é Rx, OH, NH2, NHRX, heterociclo (de preferência como ilustrado em seguida) ou desR2, sendo R2 desR2 quando X é N3. Opcionalmente R2 e X podem estar interligados ou Rx e R2 podem estar ligados entre eles através de uma ponte metilénica ramificada ou não ramificada do tipo (^CH2)_m“ ^ou -(CH2)m-M-(CH2)m/-. Nesta porção Rx-R2, m e m⁷ são números inteiros de 1 a 6 e de preferência de 1 a 3; e M é NH, 0, S ou CHR4, onde R₄ é alquilo inferior ou arilo e é, de preferência, metilo, etilo, propilo, fenilo ou pCl-fenilo, sendo M, de preferência, 0 ou S. Muito preferivelmente, quando R_x e R₂ estão interligados, formam um anel heterocíclico com 5-, 6- ou 7- membros com a parte ”N-C-X” da fórmula U*. Caso se queira formar um péptido cíclico, XR₂ pode conter uma parte de outro diaminoácido dentro do mesmo péptido.

A modificação da função amino primária especificada de um dado aminoácido ou péptido é realizada por tratamento do péptido devidamente protegido ou do aminoácido com um reagente ou reagentes apropriado(s). Os péptidos ou aminoácidos onde Y é NCN (aqui denominados cianoguanidinas) são preparados por reacção de um grupo amino com cianocarbonimidato de difenilo (I):

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-6N-CN

N-CN

II	II
Q-NH2 + PhO-C-OPh —	.—>	Q-NH-C-OPh
(I)		(II)

onde Q” é usado para representar, de uma maneira geral, a maior porção de um péptido ou de um aminoácido que tem um grupo aminoprimário (como o aminoácido que foi acima descrito) como parte da fórmula U*.

O péptido ou aminoácido que tem a porção N-substituída -N'-ciano-O-fenil-iso-ureia (II) pode depois ser isolado ou mais funcionalizado por reacção com um segundo nucleófilo HXR₂ para produzir péptidos ou aminoácidos contendo cianoguanidina que têm a fórmula (III):

N-CN		N-CN
11 Q-NH-C-OPh + HXR2	------>	II q-nh-c-xr2
(II)		(III)
Por exemplo,
N-CN	N-CN	(porção aminometil-
II	II	-cianoguanidino)

Q-NH-C-OPh + NH₂CH₃ -----> Q-NH-C-NHCH₃ (II) (III)

Por exemplo, quando HXR₂ = H₂N-CH₂-piridina, o resultado é:

(porção 3-aminometil-piridil-cianoguanidino)

Este grupo pode também ser denominado (nomenclatura (IUPAC) N-g-ciano-N-g^/-3-metilpiridilguanidino. Estes compostos podem ser

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hidrolisados sob condições ácidas para produzir compostos que também são biopotentes — por exemplo:

N-CN

II q-nh-c-nhch₃ tfa/h₂o

--------->

22°C

O

II n-c-nh₂ q-nh-c-nhch₃

As versões hidrolisadas, aqui referidas como incluindo o grupo N-g'-amido, também podem ser sintetizadas directamente fazendo reagir derivados de fosgénio com porções que tenham uma função guanidino.

Se HXR₂ é um grupo amino de outro péptido ou proteína, obter-se-á um dimero péptido-péptido ou um dímero péptido-proteína conjugado através da porção cianoguanidina. Se HXR₂ é o grupo amino primário do N-terminal ou o grupo amino da cadeia lateral de outro aminoácido no mesmo péptido, obter-se-á um péptido cíclico (IV) ligado através da porção cianoguanidina:

N-CN

II

J Q₁-NH-C (IV)

I

Q₂----NH onde e Q₂ representam os remanescentes de dois resíduos aminoácidos no mesmo péptido. A ciclização através do derivado cianoguanidina é efectuada preferivelmente enquanto parte do péptido resina, em oposição a ciclizar subsequentemente o péptido linear.

Surge um caso especial quando -XR₂ contém um segundo sítio nucleófilo e X tem a fórmula geral:

Mi-(CH_q)p-M₂ ou M₁-(CH₂)_p,-M₂-(CH₂)_pn-M₃, onde M_x, M₂ e M₃ são individualmente NH, N, 0 ou CHR₃, p, p' e

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p são 0, 1, 2ou3eqélou2. Exemplos destes nucleófilos incluem H₂NNH₂, CH₃HNNH₂, CH3HNNHCH3, H₂NOH e h₂n-ch₂-ch₂oh. Neste caso a porção cianoguanidina que é formada pode ser convertida no heterociclo correspondente (V) que se forma a partir do intermediário inicial por reacção do grupo amino ómega com o grupo ciano tal como:

nh₂

------>

n-c=m₂--------II

Q-NH-C-M₁-(CH₂)_p -(V)

Por exemplo, quando -XR₂ = -HNNH₂,

Além disso, quando -XR₂ = -CH3NNHCH3

N-CN

II

Q-NH-C-CH3NNHCH3

NH

N---C

II I H⁺

ch₃ ch₃ que pode depois sofrer uma hidrólise como acima se indica.

Quando XR₂ contém um grupo ácido carboxílico ou equivalente, particularmente um éster carboxílico ou uma amida carboxiliça, é formada uma porção heterocíclica, como uma porção semelhante a pirimidina saturada (VI) por reacção de um grupo carbo73 713

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xílico com o grupo amino secundário (R-l) quando Mj é N e são formadas porções heterocíclicas semelhantes de 6 membros quando Mj é 0 ou S. Por exemplo, R₂ pode ser M-l~(CH₂ )p-M₂ com M₂ = COOH, C00CH₃ ou CONH₂ e p é um número inteiro de 1 a 4. Por exemplo, no caso de um grupo ácido carboxílico alifático estar presente e p = 2:

	N-CN
	II	3-péptido-2-
N-CN	c	-(ciano-imino)-4-
II	/ \	-oxo-hexa-hidro-
Q-NH-C-N-(CH2)p-COOH I	---> Q-N NH 1 I	(VI) pirimidino
1 H	1 1 C CH, y- \ / 2 0 \ / ch2

Se R₂ inclui um ácido carboxílico aromático orto-substituido, por exemplo ácido benzóico (q=l e p=6), forma-se a correspondente espécie semelhante à quinazolina (VII):

(VII)

Este ácido benzóico pode ainda ser substituído e tais substituições podem estar em qualquer das outras 4 posições do anel, conforme se mostra, criando a correspondente porção semelhante a quinazolina substituída que é considerada como sendo equivalente à não substituída. X' pode ser H, Cl, Br, F, NHCH₃ ou SCH₃, e Ry e Rg podem ser H, CH₃ ou CH₂CH₃.

As moléculas em que X é N₃ e R₂ é desR₂ (isto é deleccionado) são úteis para fotomarcação por causa da actividade do grupo

73 713	wi-' T- j_.iíífcí:'^í·· « J '
51142	. yfy_________ /7
-10-

-N₃ e são formadas por reacção da porção (II) com azida de sódio (NaN₃).

Os péptidos em que Y é 0 (aqui denominados ureias) ou S (denominados tio-ureias) são preparados pelo bem conhecido procedimento em que o grupo amino de cadeia lateral desejado é tratado com um isocianato ou tio-isocianato apropriado para obter estas ureias ou tio-ureias.

II

J	q-nh2 + o=c=nr2	—> q-nh-c-nhr2
		S
		II
	q-nh2 + s=c=nr2	—> q-nh-c-nhr2
	Os péptidos ou aminoâcidos	em que Y é CH-NO2 (aqui denomi-

nados diaminonitroetilenos) são preparados por conversão da ureia correspondente numa carbodiimida:

|| tosilo-Cl q-nh-c-nhr₂ -------------> q-n=c=nr₂ piridina seguida por tratamento com anião de nitrometano (preparado pela acção do hidreto de sódio sobre o nitrometano em DMF anidra) conforme descrito de uma forma geral em F. Meimas e outros em Svnthesis, 509-510 (1985):

	H NOo
Q-NH=C=NR2 + CH3NO2 + NaH -	—> II q-nh-c-nh-r2

Uma síntese alternativa que pode ser usada é a seguinte:

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		h-c-no2		h-c-no2
q-nh2	+	ch3s-c-sch3	---->	II qnh-c-sch3
h-c-no2 II	+	hnhr2	---->	h-c-no2
qnh-c-sch3				q-nh-c-nh-r2

Geralmente, de harmonia com o presente invento, são sintetizados péptidos que são antagonistas da GnRH, isto é, inibem fortemente a secreção das gonadotropinas pela hipófise dos mamíferos, incluindo humanos, e/ou inibem a libertação de esteróides pelas gónadas. Estes péptidos são análogos da GnRH que contêm um ou mais aminoácidos não naturais com a fórmula U* na posição 3-, na posição 5- e/ou na posição 6-. De preferência, estão presentes somente nas posições 5- e 6-. Todos os péptidos contêm pelo menos um isómero D- que pode ser o aminoácido não natural. Quando U* está na posição 3 e/ou 6, está sempre na forma de um isómero D; ao passo que quando U* está na posição 5, está sempre na forma de um isómero L. 0 antagonista deve ter uma substituição na posição 1, de preferência, )8-(1- ou 2-naftil)-Dalanina (aqui doravante /3-D-1NAL ou /3-D-2NAL) ou desidroPro, uma substituição na posição 2 na forma de um D-Phe modificado, de preferência, 4C1 ou 4F, e uma substituição na posição 3, de preferência D-Trp, D-3PAL, J3-D-NAL substituídos ou não substituídos ou o resíduo de um aminoácido u* isómero D, com maior preferência D-3PAL. A posição 5 pode ser ocupada por (a) Tyr, (b) um Phe ou Tyr halogenado ou metilado, (c) Arg, (d) Lys em que o grupo amino de cadeia lateral é acilado com

3- carboxipiridina (ácido nicotínico) ou com 2 ou

4- carboxipiridina, isto é, Lys(cpd), de preferência, Lys(3cpd) que também é denominada Lys(Nic), (e) His ou (f) o resíduo de um aminoácido U* isómero L, de preferência este último. Os antagonistas têm de preferência um U isómero D mas podem ter um D-Lys substituído ou acilado na posição 6. Se Leu não está na posição 7, é de preferência NML; contudo pode ser Nle, Phe, Nva, Met, Tyr, Trp ou Pal (dos quais o resíduo Phe ou Trp pode estar substituído). Os antagonistas podem ter também uma substituição

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opcional na posição 8 que é de preferência isopropil Lys, isto é, ILys ou Lys (Ipr) onde o grupo amino da cadeia lateral está substituído com isopropilo. Se é feita uma substituição na posição 10, é de preferência D-Ala. Pelo menos um resíduo de um aminoácido isómero D da fórmula U está presente, é o mais preferido, em cada péptido do invento.

D-Phe modificado na posição 2 proporciona uma actividade antagonista aumentada em consequência das modificações específicas presentes no anel benzénico. Substituições simples para hidrogénio no anel são feitas de preferência na posição para- ou na 4- mas podem ser feitas também nas posições 2 ou 3; as substituições são escolhidas de entre cloro, fluoro, bromo, metilo, metoxi e nitro, sendo a mais preferida a 4 cloro. As substituições com dicloro estão nas posições 2,4 ou 3,4 do anel. O átomo de carbono α também pode ser metilado, por exemplo, (C^aMe/4Cl)Phe. 0 substituinte da posição 1 é de preferência modificado de modo que o seu grupo α-amino contenha um grupo acilo tal como formilo For), acetilo (Ac), acrililo (Acr), vinilacetilo (Vac) ou benzoilo (Bz) sendo o acetilo e o acrililo os preferidos e sendo o acetilo o mais preferido. PAL e D-PAL representam os isómeros L e D da piridilalanina onde o carbono β de Ala está ligado à posição 2, 3 ou 4, de preferência à posição 3 no anel piridina. Quando /3-D-NAL está presente na posição 1 e R₅ não é Arg, um resíduo aminoácido D hidrofílico, tal como 4NH2~D-Phe, 4-guanidino-D-Phe, D-His, D-Lys, D-Orn, D-Arg, D-Har (Homo-arginina) ou D-PAL está de preferência presente na posição 6 se U* não está presente. Quando está presente desidroPro na posição 1, D-PAL ou um isómero D de um aminoácido lipofílico tal como D-Trp, D-Phe, For-D-Trp, NC^-D-Trp, D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Tyr, D-Val, D-Ala, dialquil Arg, dialquil Har, D-Ser(OtBu), /3-D-NAL ou (imBzl)D-His está de preferência na posição 6 se U* não está presente.

Estes análogos da GnRH são muito solúveis a um pH pouco inferior ao pH fisiológico, isto é, de cerca de 4,5 a cerca de 6, e assim podem ser formulados e administrados numa forma concentrada facilitando muito a administração a um pH de cerca de 5

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a 7,4, o qual é presentemente preferido. Estes antagonistas inibem a ovulação dos mamíferos fêmea quando administrados a níveis baixos durante o proestro e são também eficazes para provocar a ressorção de óvulos fertilizados quando administrados pouco depois da concepção. Estes antagonistas também são eficazes no tratamento contraceptivo de mamíferos macho e no tratamento de tumores dependentes de esteroides. Alguns destes antagonistas têm uma acção surpreendentemente prolongada na sua supressão dos níveis da LH após administração e têm efeito secundário particularmente baixo no que respeita à libertação da histamina.

I

Descrição Detalhada das Concretizações Preferidas

Como anteriormente se disse, os aminoácidos não naturais (que podem ser isómeros L ou D) são representados pela fórmula

NH₂ R, Rj onde W, X, Y, e R₂ são definidos como anteriormente e existe pelo menos um tal resíduo (de preferência um isómero D) em cada péptido do invento.

Mais especificamente, os antagonistas da GnRH do presente invento são representados pela fórmula seguinte (Fj):

G-AA^- (A) D—Phe—ΑΑβ—Ser—AA^—AÀg—ΑΑγ—AAg—Pro—AA^_q onde G é hidrogénio ou um grupo acilo tendo 7 ou menos átomos de carbono; ΑΑ_χ é desidroPro, D-pGlu, (A)D-Phe, (B)D-Trp, Pro ou 0-D-NAL; A é H, Cl, F, N0₂, CH₃, OCH₃, C^aMe/4Cl, Cl2 ou Br; B é H, NO2, NH2, OCH3, F, Cl, Br, CH3, NⁱⁿFor ou NⁱⁿAc; AA3 é U*, D-PAL, 0-D-NAL ou (B)D-Trp; AA₅ é U*, Tyr, (C)Arg, Lys(cpd), Orn(cpd), Dbu(cpd), Dpr(cpd), (A)Phe, (3I)Tyr ou His; ΑΑθ é U*, β-D-NAL, (B)d-Trp, (A')D-Phe, (D)D-Orn, (D)D-Lys, (D)D-Dbu, (D)D-Dpr, D-Har, D-Tyr, (E)D-His, D-PAL, (C)D-Arg ou um isómero

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D lipofílico apropriado; A^z é A, NH2, NHCH3 ou gua; C é H ou alquilo inferior; D é G, cpd ou um grupo arilo; E é H, imBzl ou dinitrofenol; AA·? é Nle, Leu, NML, (A)Phe, Met, Nva, Tyr (B)Trp ou PAL; AAg é (C')Arg, (C')Har ou ILys; C^z é H ou dialguilo inferior; AA10 é D-Ala-NH₂, Gly- -NH₂, AzaGly-NH₂ ou NH(R); R é alquilo inferior, de preferência CH₂CH₃; e U é o anteriormente definido. Quando AA-^ é β-D-NAL e AA₅ não é Arg, então AA₆ é de preferência U*, 4-NH₂-D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His,

4-gua-D-Phe, D-Pal ou D-Arg.

Por desidroPro entende-se 3,4 desidroprolina, C₅H₇, O₂N. Por 0-D-NAL entende-se o isómero D da alalina que está substituído com naftilo no átomo de carbono β, isto é, também 3-D-NAL. De preferência emprega-se o J3-D-2NAL quando a ligação ao naftaleno está na posição 2 da estrutura do anel; contudo, também pode ser usado o jS-D-lNAL. Os resíduos preferidos da posição 1 são /3-D-NAL, D-Phe substituído e D-Trp opcionalmente substituído. PAL representa alanina que está substituída com piridilo no átomo de carbono β; de preferência a ligação é na posição 3 do anel de piridina. Quando se emprega D-Trp, substituído, as substituições simples para o hidrogénio são feitas de preferência nas posições 5 ou 6, sendo escolhidas de entre cloro, fluoro, bromo, metilo, amino, metoxi e nitro, preferindo-se cloro, fluoro e nitro.

Em alternativa, o azoto do indolo pode ser acilado, por exemplo com formilo (NⁱⁿFor- ou lFor-) ou com acetilo. D-3PAL, NⁱⁿFor-D-T e 6NO2-D-Trp são os resíduos preferidos para a posição 3 embora o D-Trp seja usado muitas vezes. Quando U* não está na posição 5, é de preferência Tyr, Arg ou Lys(cpd). Por NML entende-se N^aCH3-L-Leu. Por Dbu entende-se o ácido alfa, gama-diaminobutírico e por Dpr entende-se o ácido α,β-diaminopropiónico. Por Aph entende-se 4NH₂Phe. Por Hap entende-se 4-amino-homofenilalanina (onde j é 2); por Hhp entende-se 4-amino-homo-homofenilalanina (onde j é 3). Quando desidroPro está presente na posição 1, Tyr ou U* está de preferência presente na posição 5 e um resíduo lipofílico está na posição 6. Por 4-gua-D-Phe entende-se um resíduo de D-Phe tendo guanidina

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substituída na posição para. Por AzaGly-NH₂ entende-se NHNHCONH₂. O grupo guanidino de um resíduo ARG pode ser substituído nas posições 5 ou 6 por alquilo inferior, isto é, com 1 a 4 átomos de carbono, por exemplo, propilo (Pr). Quando D-Lys, D-Dbu-D-Dpr ou D-Orn está presente na posição 6 o seu grupo amino da cadeia lateral pode ser acilado por um grupo acilo que pode ser alifático, heterocíclico ou aromático, por exemplo, ácido nicotínico ou pode ser substituído por um grupo arilo que não tenha mais do que 1 anel fenilo. Quando U não está presente na posição 6, ele é de preferência D-PAL ou D-Lys (cpd) e, muito preferivelmente, D-3PAL. O resíduo na posição 7 é de preferência Leu, NML, Nle ou Phe e, muito preferivelmente, Leu ou NML. 0 resíduo na posição 8 é de preferência Arg ou ILys.

Um subgénero preferido de antagonistas da GnRH tem a seguinte fórmula: Ac-AA₁-(A)D-Phe-AA₃-Ser-AA₅-AA₆-AA₇-AA₈-Pro-AA₁₀ onde AA-l é β-Ό-NAL, (A)D-Phe, (B)D-Trp ou desidroPro; A é H, 4C1, 4F, 4NO₂, 4CH₃, 4OCH₃, C^aMe/4Cl, 2,4C12 ou 4Br; B é H, 6NO2, 6NH2, 6OCH3, 6F, 6C1, 6Br, 6CH3, NⁱⁿFor ou NⁱⁿAc; AA3 é U*, D-PAL, /3-D-NAL ou (B)D-Trp; AA₅ é U*, Lys(cpd) OU Tyr; AA₆ é U*, J3-D-NAL, 4NH₂D-Phe, (B)D-Trp, D-Lys(cpd), D-PAL ou D-Arg; AA₇ é Nle, Leu, NML

ou Phe; AAg é ILys, ou Arg; AA10 ou NH(R); R é alquilo inferior e	é D-Ala-NH2, Gly-NH2, NHNHCONH2 T-rA* U e
(a)	0 II HO-C-CH-(CH2) · --		Y
	O	—N-C-X 1 1
	nh2		H Rj,

onde j él, 2 ou 3; X é NH ou 0; Yé N-CN ou N-CONHRg onde Rg é H ou alquilo inferior; R₂ é alquilo inferior, ciclo-hexilo, fenilo, piridilo, metilpiridilo ou histaminilo; ou o

II

HO-C-CH- (CH,) .

I nh₂

NHR..

/

C

II

N (b)

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onde j é 1 ou 2 e Rjj é H ou um radical acilo tendo 1 a 6 átomos de carbono; desde que, porém, pelo menos um de entre AA₃, AA₅ e AA₆ seja U*; de preferência AA₅ e AA_g são U*.

Outro subgénero preferido dos antagonistas da GnRH tem a seguinte fórmula: Ac-AA₁-(A)D-Phe-U*-Ser-AA₅-AA₆-AA₇-AA₈-Pro-AA₁₀ onde ΑΑ_χ é (A)D-Phe ou jS-D-NAL; A é 4C1, 4F ou 4NO₂; B é H, 6NO₂ ou NⁱⁿFor; AA₅ é Lys(cpd) ou Tyr; AA_g é p-D-NAL, 4NH₂D-Phe, (B)D-Trp, D-Lys(cpd), D-PAL ou D-Arg; AA₇ é Nle, Leu, NML ou Phe; AA₈ é ILys ou Arg; AA₁₀ é D-Ala-NH₂, Gly-NH₂, NHNHCONH₂ ou NH(R); R é alquilo inferior, e U é

nh₂ h r₂ onde j é 1, 2 ou 3 (de preferência 1); X é NH ou 0; Y é N-CN ou N-CONHR₉ onde R₉ é H ou alquilo inferior (Cj-Cg), de preferência H; R₂ é alquilo inferior (C-j^-Cg), ciclo-hexilo, fenilo, piridilo, metilpiridilo ou histaminilo; ou (b)

J o

II

HO-C-CH-(CH_?) _:

I nh₂

NHR., /

N - C

II II

N-C N

I \ /

Η N onde j é 1 ou 2 e R_i;l é H ou um radical acilo tendo 1 a 3 átomos de carbono, de preferência acetilo.

Ainda outro subgénero preferido de antagonista da GnRH tem a seguinte fórmula: Ac-/3-D-2NAL-(A)D-Phe-D-3PAL-Ser-AA₅-AA₆-AA₇-AAg-Pro-AA₁₀ onde A é 4C1 ou 4F; AA₅ é U*, Lys(cpd) ou Tyr; AA₆ é U*, 0-D-NAL, DLys(cpd), D-3PAL ou D-Arg; AA₇ é Leu ou NML; AAg é ILys ou Arg;

713

51142

onde j é 1, 2 ou 3 (de preferência 1); XéNHouO; Y é N-CN ou N-CONHR₉ onde R₉ é H ou alquilo inferior (C^-Cg), de preferência H; R₂ é alquilo inferior (Cj-Cg), ciclo-hexilo, fenilo, piridilo ou metilpiridilo; ou

onde j é 1 ou 2 e Rjj é H ou um radical acilo tendo 1 a 3 átomos de carbono; de preferência acetilo; desde que pelo menos um de entre AA₅ e AAg ou de preferência ambos sejam U*.

Os péptidos do presente invento podem ser sintetizados pela síntese clássica em solução mas, de preferência, são sintetizados pela técnica de fase sólida. Pode ser usada uma resina clorometilada ou uma resina hidroximetilada; contudo, uma resina de metilbenzidrilamina (MBHA), uma resina de benzidrilamina (BHA) ou algumas outras resinas apropriadas conhecidas na arte que deem directamente uma amida ou uma amida substituída C-terminal após clivagem é empregada de preferência quando é desejado um tal C-terminal. Por exemplo, os péptidos que têm uma amida substituída no C-terminal são sintetizados de preferência utilizando uma resina N-alquilaminometílica conforme ensina a patente Estados Unidos N^a. 4 569 967 concedida em 11 de Fevereiro de 1986. A síntese em fase sólida é realizada de modo a juntar passo a passo aminoácidos à cadeia da maneira exposta detalhadamente na patente E.U.A. 4 211 693. Os grupos protectores de cadeia lateral, são bem conhecidos na arte, são

713

51142

-18incluídos de preferência como parte

de qualquer aminoácido que tenha uma cadeia lateral particularmente reactiva e opcionalmente no caso de outros, como Trp, estes aminoácidos devem ser acoplados à cadeia em construção sobre a resina. Esta síntese dá o péptido resina intermediário completamente protegido.

Os intermediários químicos feitos geralmente de harmonia com o invento podem ser representados pela fórmula: X¹-AA1-AA2(X⁵)-U3-Ser(X³)-U5-U6-AA7(X² ou Χ⁷)-ΑΑθ(Χ⁵ ou X⁶)-Pro-X⁸ onde: U3 é U' ou AA₃(X²); U5 é U' ou AA5(X⁴ ou X⁵); U6 é U' ou AA₆(X⁴ ou X⁵ ou X⁶); U' é Aph(X^a), Hap(X^a) ou Hhp(X^a); X¹ é um grupo protector de α-amino do tipo que se sabe na arte ser útil na síntese passo a passo de polipéptidos e quando G, na desejada composição peptídica, é um grupo acilo particular, este grupo pode ser usado como grupo protector. Entre as classes de grupos protectores de α-amino abrangidas por X¹ contam-se (1) grupos protectores do tipo acilo tais como formilo (For), trifluoracetilo, ftalilo, p-toluenossulfonilo (Tos), benzoilo (bz), benzenossulfonilo, di-tiassuccinoilo (Dts), o-nitrofenilsulfenilo (Nps), tritilsulfenilo, o-nitrofenoxiacetilo, acrílilo (Acr), cloro-acetilo, acetilo (Ac) e Y-clorobutirilo; (2) grupos protectores aromáticos do tipo uretano, por exemplo, benziloxicarbonilo (Z), fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) e benziloxicarbonilo substituído como p-clorobenziloxicarbonilo (C1Z), p-nitrobenziloxicarbonilo, p-bromobenziloxicarbonilo e p-metoxibenziloxicarbonilo; (3) grupos protectores de uretano alifático como terc-butiloxicarbonilo (Boc), diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo e aliloxicarbonil; (4) grupos protectores do tipo cicloalquílico-uretano como ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo e ciclo-hexiloxicarbonilo; (5) grupos protectores do tipo tio-uretano como feniltiocarbonilo; (6) grupos protectores do tipo alquilo como alilo (Aly), trifenilmetilo (tritilo) e benzilo (Bzl); (7) grupos trialquilsilano como trimetilsilano. 0 grupo protector α-amino preferido é Boc quando X é hidrogénio.

X² é hidrogénio ou um grupo protector para o azoto de indo73 713

51142

lo de Trp como Bz, Ac ou For. Em muitas sínteses não há necessidade de proteger Trp e esta protecção não é utilizada se está presente algures no péptido D-Trp acilado.

X³ é um grupo protector para a cadeia lateral hidroxilo de Ser ou Thr, por exemplo Ac, Bz, tritilo, DCB ou éter benzílico (Bzl) e é de preferência Bzl.

X⁴ é hidrogénio ou um grupo protector para o grupo hidro-

xilo fenólico de Tyr escolhido no grupo constituído por tetra-hidropiranilo, terc-butilo, tritilo, benzilo, Z, 2-bromobenziloxicarbonilo (2BrZ) e 2,6-diclorobenzilo (DCB). É preferido o 2Brz.

X⁵ é um grupo protector para um grupo guanidino da cadeia lateral como o de Arg ou Har ou para o grupo imidazol de His, como nitro, Tos, tritilo, adamantiloxicarbonilo, Z e 2,4-dinitrofenol (Dnp) ou X⁵ pode ser hidrogénio o que quer dizer que não há protecção para os átomos do grupo da cadeia lateral. 0 preferido é geralmente Tos.

X⁶ é um grupo protector para um grupo amino de cadeia lateral, amino primário ou secundário, como Z ou 2C1Z; X^a é uma subclasse de X⁶ que compreende os grupos protectores que podem ser removidos sem remover outros grupos protectores de cadeia lateral de modo a permitir que depois o grupo ómega-amino tome parte nas reacções para construir o resíduo aminoácido não natural. Utiliza-se, de preferência, um grupo lábil às bases como Fmoc, metilsulfoniletiloxicarbonilo (Msc) ou trifluoroacetilo (Tfa); contudo também pode ser possível utilizar um grupo lábil a hidrazina como ftaloílo

713

51142

ou um grupo lábil a tio como Nps ou Dts.

X⁷ é hidrogénio ou um grupo protector para Met como oxigénio; Met geralmente é deixado sem protecção.

X⁸ pode ser Gly-ΝΗ-[resina de suporte], D-Ala-NH-[resina de suporte] ou N(A)-[resina de suporte]; X⁸ também pode ser uma amida de Gly ou de D-Ala ou uma amida substituída ligada directamente a Pro ou NHNHCONH₂.

O critério de escolha dos grupos protectores de cadeia la| teral para X²-X⁷ é o de que o grupo protector dever ser estável perante o reagente nas condições de reacção escolhidas para remover o grupo protector de α-amino (de preferência Boc) em cada passo da síntese. Os grupos protectores geralmente não se devem separar sob as condições de acoplamento mas devem ser removíveis depois de completada a síntese da desejada sequência de aminoácidos sob condições de reacção que não alterem a cadeia peptídica.

Quando o grupo X⁸ é Gly-ΝΗ-[resina de suporte] ou D-Ala-NH- [resina de suporte], uma ligação amida liga Gly ou D-Ala a uma resina BHA ou a uma resina MBHA. Quando o grupo X⁸ é N(A)-[resina de suporte], uma ligação de amida substituída liga | Pro a uma resina de N-alquilaminometil (NAAM). Quando X⁸ é AzaGly-NH₂, o péptido é feito de preferência pela síntese em solução clássica como descreve a patente E.U.A. N^a. 4 234 571.

Quando G é acetilo, por exemplo na fórmula final, pode ser possível empregá-lo como o grupo protector X¹ para o grupo a-amino de 0-D-NAL ou para gualquer aminoácido que seja usado na posição 1 adicionando-o antes de acoplar este último aminoácido à cadeia peptídica. Contudo, a reacção é, de preferência, realizada com o péptido na resina (após desbloqueamento do grupo a-amino enquanto os grupos de cadeia lateral permanecem protegidos) por exemplo, por reacção com ácido acético na presença de diisopropil- ou diciclo-hexil-carbodiimida (DIC ou DCC) ou, de preferência, com anidrido acético ou por meio de outra reacção

713

51142 apropriada conhecida na arte.

Assim, o invento tem também por objecto um processo para fazer um péptido, péptido este tendo a fórmula G-AAj-AA₂-AA₃-Ser-AAg-AAg-AAy-AAg-Pro-AAjQ onde pelo menos um de entre AA₃, AA₅ e AAg é U* e os símbolos são descritos como anteriormente, processo este que compreende (a) a formação de um péptido intermediário tendo a fórmula: X¹-AAj-AA2(X⁵)-U3~Ser(X³)-Ug-Ug-AAy(X² ou X⁷)-AAg(X^ ou X^J-Pro-X⁸ onde: U3 é U^z ou AA3(X²); U5 é U^z ou AA5(X⁴ ou X⁵); U6 é U^z ou AAg(X⁴ ou X⁵ ou X⁶); U^z é Aph(X^a), Hap(X^a) ou Hhp(X^a); X³- é hidrogénio ou um grupo protec| tor de α-amino; X² é hidrogénio ou um grupo protector para um azoto de indolo; X³ é um grupo protector para um grupo hidroxilo de Ser ou Thr; X⁴ é hidrogénio ou um grupo protector para um grupo hidroxilo fenólico de Tyr; X⁵ é hidrogénio ou um grupo protector para uma cadeia lateral guanidino ou imidazolo; X⁶ é um grupo protector para uma cadeia lateral amino primário, do qual X^a é um subgrupo que pode ser removido sem remoção de outros grupos protectores; X⁷ é hidrogénio ou um grupo protector para Met; X⁸ é Gly-NH-[resina de suporte], D-Ala-NH-[resina de suporte], N(A)-(resina de suporte), uma amida de Gly ou de D-Ala ou uma amida substituída ligada directamente a Pro ou NHNHCONH2; desde que, porém, pelo menos um de entre U₃, U₅ e U₆ seja Aph(X^a), Hap(X^a) ou Hhp(X^a); (b) remoção de pelo menos um X^a ) para desproteger um grupo amino primário da cadeia lateral de pelo menos um resíduo aminoácido do referido péptido intermediário; (c) reacção do referido grupo amino primário da cadeia lateral desprotegido para construir o referido resíduo num que tenha a fórmula U*; e (d) separação de quaisquer grupos remanescentes X-*- a X⁷ e/ou clivagem de qualquer resina de suporte incluída em X⁸.

A purificação do péptido é efectuada por cromatografia de permuta iónica numa coluna de CMC, seguida por cromatografia de partição empregando o sistema de eluição: n-butanol; ácido acético O,1N (relação volumétrica 1:1) numa coluna carregada com Sephadex G-25, ou utilizando HPLC, como é conhecido na arte e está especificamente relatado em J. Rivier e outros em J. Chro73 713

51142

matoqraphy, 288 (1984) 303-328.

Os antagonistas do invento são eficazes a níveis inferiores a 100 microgramas por quilograma de peso corporal quando administrados subcutaneamente cerca do meio dia do dia do proestro, para impedir a ovulação nas ratazanas fêmeas. Para uma supressão prolongada da ovulação pode ser preciso usar níveis de dosagem na gama de cerca de 0,1 a cerca de 2,5 mg por quilograma de peso corporal. Estes análogos são particularmente solúveis aos pH fisiologicamente aceitáveis e portanto podem ser preparados para administração como soluções relativamente concentradas. Os antagonistas também são eficazes para suspender a espermatogénese quando administrados regularmente a mamíferos macho e podem portanto ser usados como contraceptivos. Como estes compostos vão reduzir os níveis de testosterona (uma consequência indesejável para o macho normal, sexualmente activo) pode ser razoável administrar dosagens de reposição de testosterona juntamente com o antagonista da GnRH. Estes antagonistas também podem ser utilizados para regular a produção de gonadotropinas e esteroides sexuais para outras finalidades como aqui anteriormente foi indicado.

Nas fórmulas seguintes, os resíduos U* são definidos em termos do resíduo aminoácido original que tem um grupo amino de cadeia lateral mais a modificação em questão que está indicada no parêntesis anexo. De preferência, o resíduo original Aph, Hap ou Hhp, ou as suas formas isómeras D está incorporado na cadeia peptídica principal e é modificado enquanto parte da cadeia peptídica que está ainda ligada à resina para formar o desejado resíduo do aminoácido U*. Contudo, como anteriormente aqui se indicou, o aminoácido não natural U* apropriadamente protegido pode ser adicionado como parte do processo habitual de alongamento da cadeia.

Em relação ao último grupo ómega-amino modificado da cadeia lateral são usadas as seguintes abreviaturas:

act = acetil-aminotriazol bcg = aminobutil-cianoguanidino

713

51142

bzcg = aminobenzil-cianoguanidino bur = N-g-amido, N-g'-butilguanidino chcg = aminociclo-hexil-cianoguanidino ecg = aminoetil-cianoguanidino icg = amino-isopropil-cianoguanidino hcg = amino-hexil-cianoguanidino hicg = histaminil-cianoguanidino (etilimidazol) mcg = aminometil-cianoguanidino ncg = aminoetil(l ou 2)naftil-cianoguanidino mncg = aminometilfl ou 2)naftil-cianoguanidino

Ocg = O-fenil-cianoguanidino pcg = aminopropil-cianoguanidino

Sbcg = tiobutil-cianoguanidino tcg = 3-amino-i,2,4-triazolo trcg = indoloetilamino-cianoguanidino(triptamino-cianoguanidino mpcg = aminometilpiridil-cianoguanidino (o número indica a posição do grupo aminometilo no anel piridilo).

EXEMPLO 1

Os péptidos indicados na TABELA I tendo a fórmula Ac-/3-D-2-NAL-( 4C1 )D-Phc-D-3PAL-Ser-AA₅-AA₆-Leu-AA₈-Pro-D-Ala-NH₂ são preparados pelo procedimento em fase sólida aqui descrito anteriormente de forma geral.

TABELA 1

	aa5	aa6	aa8
103A	Aph(tcg)	D-Aph(tcg)	ILys
104A	Aph(bcg)	D-Aph(bcg)	ILys
105B	Hap(tcg)	D-Lys(Nic)	ILys
106C	Hhp(tcg)	D-Hhp(tcg)	ILys
107A	Aph(2ncg)	D-Aph(2ncg)	ILys
108A	Hhp(bcg)	D-Hhp(bcg)	ILys
109A	Hap(tcg)	D-Hap(tcg)	Arg
110A	Aph(icg)	D-Aph(icg)	ILys

Como exemplo de trabalho, é descrita a seguir uma síntese em fase sólida do anterior péptido η². 103A que é referido como

713

51142

[AC-/3-D-2NAL^{1 11}, (4C1)D-Phe², D-3PAL·³, Aph(tcg)⁵, D-Aph(tcg)⁶, ILys^, D-Ala^-θ ]-GnRH. Este péptido tem a fórmula seguinte: [Ac-/3-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-Aph(3-amino 1,2,4 triazolo)-D-Aph-(3-amino 1,2,4 triazolo)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Alanh₂.

É utilizada uma resina MBHA e D-Ala protegida com Boc é acoplada à resina durante um período de 2 horas em CH₂C1₂ usando um excesso de 3 vezes de derivado de Boc e DCC como reagente de activação. 0 resíduo D-Ala liga-se à resina MBHA por uma ligação amida.

Depois do acoplamento de cada resíduo aminoácido, é executada a lavagem, desbloqueamento e acoplamento do resíduo aminoácido seguinte de acordo com o seguinte esquema empregando uma máquina automática e começando com cerca de 5 gramas de resina:

PASSO REAGENTES E OPERAÇÕES

TEMPOS DE MISTURA MIN

Lavagem com CH₂C1₂-8O ml (2 vezes)

Lavagem com metanol (MeOH)-30 ml (2 vezes)

Lavagem com CH2CI2-8O ml (3 vezes)

50% de TFA mais 5% de 1,2-etanoditiol em CH₂C1₂-7O ml (2 vezes)

Lavagem com álcool isopropílico + 1% de etanoditiol-80 ml (2 vezes)

TEA a 12,5% em CH₂C1₂-7O ml (2 vezes)

Lavagem com MeOH-40 ml (2 vezes)

Lavagem com CH₂C1₂-8O ml (3 vezes)

Boc-aminoácido (10 mmoles) em 30 ml de dimetilformamida (DMF) ou CH₂C1₂ conforme a solubilidade do aminoácido protegido em questão (1 vez) mais DIC ou DCC (10 mmoles) em CH₂C1₂

Lavagem com MeOH-40 ml (2 vezes)

Trietilamina (TEA) 12,5% em CH₂C1₂-7O ml (1 vez)

30-300

Depois do passo 3, pode ser tirada uma alíquota para um ensaio com ninidrina bem conhecido na arte: se o ensaio é

713

51142

-25negativo, segue-se para o passo 4 para remoção do grupo Boc antes do acoplamento do aminoácido seguinte; se o ensaio é positivo ou ligeiramente positivo repetem-se os passos 9 a 11.

anterior esquema é utilizado para acoplar cada um dos aminoácidos do péptido do invento depois do primeiro aminoácido ter sido ligado. A protecção com N^aBoc é utilizada para cada um dos restantes aminoácidos ao longo da síntese. 0 N^aBoc-/3-D-2NAL é preparado por um processo conhecido na arte, por exemplo, como descrito em detalhe na patente E.U.A. N². 4 234 571 concedida em 18 de Novembro de 1980 ou pode ser obtido comercialmente na SyntheTech, Oregon, E.U.A.. Os grupos amino primário da cadeia lateral de Aph na posição 5 e de D-Aph na posição 6 são protegidos por Fmoc. O Bzl (éter benzilico) é utilizado como grupo protector da cadeia lateral para o grupo hidroxilo de Ser. A Boc-Lys(Ipr,Z) é utilizada para a posição 8. Após o desbloqueamento do grupo α-amino no N-terminal utilizando ácido trifluoracético (TFA), a acetilação é conseguida usando um grande excesso de anidrido acético em diclorometano.

Depois de completada a montagem do péptido e a acetilação do N-terminal, está presente o seguinte intermediário: AC-/3-D-2NAL- (4C1) D-Phe-D-3PAL-Ser (Bzl) -Aph(Fmoc) —D—Aph( Fmoc) -Leu-Lys(Ipr,Z)-Pro-D-Ala-D-Ala-NH-[resina de suporte MBHA]. Os aminoácidos não naturais nas posições 5 e 6 são formados realizando simultaneamente as seguintes reacções com as cadeias laterais dos resíduos Aph desprotegidas . 0 grupo protector Fmoc é removido de ambos por tratamento do péptido-resina com 20% de piperidina em DMF durante 5 minutos, lavando depois com DMF e tratando então com mais piperidina/DMF durante 20 minutos. Após lavagem da resina com DMF, CH₃OH, CH₂C12 e# finalmente, DMF, o grupo amino recém-libertado é tratado com um grande excesso (>10 vezes) de cianocarbonimidato de difenilo (PCI) em DMF. A seguir o péptido é submetido a lavagem normal e depois é tratado com hidrazina e dissolvido em DMF durante 24 horas a cerca de 22 °C para completar a formação da porção cianoguanidino; de preferência repete-se este passo. As porções cianoguanidino que se formam espontaneamente convertem-se no heterociclo correspondente,

713 s 51142 isto é, 3-amino, 1,2,4 triazol.

A clivagem do péptido da resina e a desprotecção das cadeias laterais Ser e Lys realizam-se muito facilmente a 0”C com HF. Junta-se anisol como depurador antes do tratamento com HF. Depois da remoção do HF sob vácuo, a resina é extractada com ácido acético a 50% e as lavagens são liofilizadas para dar um péptido bruto em pó.

Executa-se depois a purificação do péptido por cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC) como se sabe na arte e é especificamente descrita em J. Rivier e outros J. Chromatogra^f Dhv, 288 (1984) 303-328.

O péptido é avaliado quanto à homogeneidade por meio de electroforese de zona capilar (CZE) bem como utilizando cromatografia líguida de alta pressão em fase inversa e uma solução aquosa de fosfato de trietilamónio mais acetonitrilo. A análise de aminoácidos do péptido purificado resultante é consistente com a fórmula para a estrutura preparada, mostrando essencialmente valores inteiros para cada aminoácido da cadeia; a análise espectral de massa é também consistente. A rotação óptica é medida num polarimetro fotoeléctrico, dando:

[a]²⁰ _D = -33 ± 1,0 (c=l, ácido acético a 50%)

I

Os outros péptidos da Tabela 1 são analogamente sintetizados e purificados. Os péptidos foram ensaiados in vivo o que determina a sua eficácia para impedir a ovulação nas ratazanas fêmea. Neste ensaio, um número determinado de ratazanas Sprague-Dawley fêmea maduras, por exemplo 5 a 10 tendo cada uma um peso corporal de 225 a 250 gramas, são injectadas com uma dosagem específica em microgramas de péptido em solução salina, água bacteriostática, polietilenoglicol, óleo de milho ou suas misturas com etanol cerca do meio dia do dia do proestro. 0 proestro é a tarde da ovulação. Foi utilizado um grupo separado de ratazanas fêmea como controlo a que não se administrou péptido. Em todas as ratazanas fêmea de controlo ocorreu a ovulação na noite do proestro; das ratazanas tratadas

713

51142

registou-se o número daquelas em que tinha ocorrido a ovulação. O ensaio in vivo do péptido 103A mostrou que, com uma dosagem de

2,5 microgramas, em nenhuma de 8 ratazanas ocorreu a ovulação e que, com uma dosagem de 1 micrograma, em nenhuma de 7 ratazanas ocorreu a ovulação. 0 péptido mostra alguma actividade mesmo com uma dosagem de 1/2 micrograma, caso em que, de 18 ratazanas, a ovulação só ocorreu em 8. 0 péptido 104A foi ensaiado a 5 microgramas e mostrou que, de 11 ratazanas, somente em 6 ocorreu a ovulação.

Em adição à síntese de trabalho acima descrita, o péptido 103A foi também sintetizado com glicinamida no C-terminal em vez de D-Ala-NH₂; o ensaio biológico in vivo mostrou que esta versão era apenas ligeiramente menos potente biologicamente que o péptido 103A.

péptido 103A também foi sintetizado com N-etilamida no C-terminal em vez de D-Ala-NH₂; o ensaio biológico in vivo mostrou que esta versão apresentava uma potência biológica apenas ligeiramente menor do que a do péptido 103A. Em adição, o péptido 104A também foi sintetizado com a glicinamida no Cterminal em vez de D-Ala-NH₂; o ensaio biológico in vivo mostrou que esta versão tinha uma potência biológica algo menor do que a do péptido 104A.

Todos os péptidos arrolados na tabela 1 são considerados eficazes para bloquear a secreção da LH induzida pela GnRH in vitro com concentrações razoáveis. Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação, de mamíferos fêmea, a dosagens baixas.

Em adição ao supramencionado ensaio in vivo para determinar a eficácia na prevenção da ovulação em ratazanas fêmea, grupos de cerca de 6 ratazanas macho, Sprague-Dawley, adultas, castradas, tendo cada uma peso corporal de 225 a 250 g, foram injectadas I.V. com uma dosagem de 50 microgramas de péptido 103A ou de um antagonista padrão designado por antagonista Nal-Glu (ver J. Clin. Edno. Metab., 71. 4, 881-888 (1990)) em

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51142

óleo de milho ou em tampão de fosfato na presença de BSA (albumina do soro bovino). Um grupo separado de ratazanas foi usado como controlo administrando-lhes somente o portador. Cada ratazana do controlo e cada ratazana em tratamento foi monitorizada quanto aos níveis de LH na corrente sanguínea passadas cerca de 3 horas, 24 horas, 36 horas e 48 horas depois da injecção deste único bolus. O péptido N^a. 103A é surpreendentemente eficaz para suprimir o nível da LH que circula na corrente sanguínea das ratazanas macho, a níveis muito substancialmente abaixo dos do controlo e, passadas 12 horas, abaixo dos das ratazanas tratadas com o antagonista NAL-Glu. Esta duração de acção muito longa do efeito biológico é verdadeiramente surpreendente.

EXEMPLO 2

Os péptidos indicados na Tabela 2 tendo a fórmula Ac-j0-D—2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-AA₅-AA₆-AAy-ILys-Pro-AA₁₀ são preparados pelo procedimento em fase sólida anteriormente referido.

TABELA 2

	aa5	aa6	AA7	AAio
111A	Aph(tcg)	D-Aph(tcg)	NML	D-Ala-NH2
112A	(bcg)	(bcg)	11	II
113B	(bcg)	” (bcg)	Leu	Gly-NH2
114B	(tcg)	” (tcg)	II	nhch2ch3
115A	(tcg)	(tcg)	NML	II
116A	(tcg)	(tcg)	Leu	Gly-NH2
117B	” (2mpcg)	(2mpcg)	NML	D-Ala-NH2
118A	·' (4mpcg)	(4mpcg)	II	II
119A	(icg)	” (icg)	II	II
120B	(©cg)	” (ecg)	II	II
121A	” (3mpcg)	/3-D-2NAL	II	II
122B	(tcg)	II	Leu	II.
123A	Lys(Nic)	D-Aph(tcg)	II	II
124A	Hap(bcg)	/3-D-2NAL	II	II
125C	Hhp(bcg)	D-3PAL	II	II
126A	Tyr	D-Aph(tcg)	II	II
Todos os péptidos	arrolados na Tabela	2 são	considerados
eficazes	para bloquear	in vitro a secrecão	da LH	induzida pela

713

51142

GnRH, a uma concentração razoável. Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação dos mamíferos fêmea, a dosagens baixas.

EXEMPLO 3

Os péptidos indicados na Tabela 3 tendo a fórmula Ασ-β-D-2NAL-(4C1)D-Phe-AA₃-Ser-AA₅-AA₆-Leu-AA₈-Pro-D-Ala-NH₂ são preparados pelo procedimento em fase sólida anteriormente referido.

TABELA 3

	aa3	aa5	aa6	AA8
127A	D-Aph(tcg)	Tyr	D-3PAL	ILys
128A	(icg)	11	VI 11
129A	·' (bcg)	II	II	II
130A	(tcg)	II	Arg
131A	” (bcg)	Arg	/J-D-2NAL	II
13 2A	(2mpcg)	11	II	II
133A	(tcg)	II	II	II
134A	(bcg)	Tyr	D-Arg	ILys
135A	(tcg)	II	II	II
136A	D-Hap(tcg)	II	D-3PAL	Arg
137A	(bcg)	II	P-D-2NAL	ILys
138A	D-Hhp(bcg)	II	D-3PAL	II
139A	(2mpcg)	11	II	1!
140A	D-Aph(2mpcg)	Arg	jB-D-2NAL	Arg
141A	D-Hhp(bcg)	Tyr	D-Arg	II
14 2A	D-Hap(bcg)	Hap(bcg)	D-Hap(bcg)	ILys
143A	D-Aph(bcg)	Tyr	D-Aph(bcg)	II
144A	D-3PAL	Aph(bur)	/3-D-2NAL	Arg
145A	D-Aph(bur)	II II	II	II
146A	(2mpcg)	Tyr	II	ILys
147A	(tcg)	Tyr	D-Aph(tcg)	II
148A	(tcg)	Aph(tcg)	D-3PAL	II

Todos os péptidos arrolados na Tabela 3 são considerados eficazes para bloquear in vitro a secreção da LH induzida pela

GnRH, a uma concentração razoável. Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação de mamíferos fêmea, a dosagens baixas.

-3073 713

51142

EXEMPLO 4

Os péptidos indicados na TABELA 4 tendo a fórmula: Ac-desidroPro-(A)D-Phe-AA₃-Ser-AA₅-D-Aph(tcg)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂ são preparados pelo procedimento em fase sólida acima referido.

TABELA 4

A	aa3	aa5
149	4C1	/3-D-2NAL	Tyr
150	1!	II	11
151	4F	(lFor)D-Trp	(2F)Phe
152	n	1!	Tyr
153	II	11	(2NO2)Phe
154	11	(lAc)D-Trp	(2CH3)Phe
155	4Br	II	Tyr
156	11	11	(2Br)Phe
157	H	D-Trp	(2Cl)Phe
158	4NO2	(5CH3)D-Trp	(3CH3)Phe
159	II	(5F)D-Trp	His
160	2,4C12	(5C1)D-Trp	(3F)Phe
161	II	(6NO2)D-Trp	(3Br)Phe
162	CaMe/4Cl	(50CH3)D-Trp	(31)Tyr
163	3,4C12	(5NH2)D-Trp	(3Cl)Phe

Todos os péptidos arrolados na Tabela 4 são considerados eficazes para bloquear in vitro a secreção da LH induzida pela GnRH, a uma concentração razoável. Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação de mamíferos fêmea, a dosagens baixas.

EXEMPLO 5

Os péptidos indicados na TABELA 5 tendo a fórmula: G-β-Ό-2NAL-(4C1)D-Phe-D-3PAL-Ser-Aph(tcg)-AAg-Leu-ILys-Pro-AA₁₀ são

713

51142

preparados pelo procedimento em fase sólida anteriormente referido.

TABELA 5

	G	aa6	AA10
164	Acr	D-Arg	D-Ala-NH2
165	Ac	D-Arg	11
166	Acr	D-Aph(tcg)	II
167	For	D-Tyr	Gly-NH2
168	Bz	(Et)D-Arg	11
169	Ac	D-Lys	II
170	Vac	D-Har	II
171	Acr	(4gua)D-Phe	AzaGly-NH2
172	Ac	D-Orn	D-Ala-NH2
173	Acr	D-His	II
174	Ac	(Bu)D-Arg	II
175	II	(Bz)D-Orn	II
176	Vac	(4NH2)D-Phe	Π
177	Bz	(Ac)D-Lys	AzaGly-NH2

Todos os péptidos arrolados na Tabela 5 são considerados eficazes para bloquear in vitro a secreção da LH induzida pela GnRH a uma concentração razoável. Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação de mamíferos fêmea, a dosagens baixas.

EXEMPLO 6

Os péptidos indicados na TABELA 6 tendo a fórmula: Ac-AA-^-(4Cl)D-Phe-AA₃-Ser-AA₅-AAg-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂ são preparados pelo procedimento em fase sólida anteriormente referido.

Ί3 713

51142

TABELA 6

	aa-l	aa3	aa5	aa6
178	J3-D-2NAL	D-3PAL	Aph(bcg)	J3-D-2NAL
179	II	(6NO2)D-Trp	II 1!	(Dnp)D-His
180	II	D-Trp	(ecg)	(4gua)D-Phe
181	desidroPro	/3-D-2NAL	Hap	(6NO2)D-Trp
182	II	/3-D-1NAL	” (mcg)	D-Val
183	/3-D-2NAL	(lFor)D-Trp	(tcg)	(Pr)D-Arg
184	II	1!	Aph(bcg)	(5NH2)D-Trp
185	desidroPro	D-Trp	(2mpcg)	D-Tyr
186	II	D-2PAL	(4mpcg)	D-Nle
187	II	(lAc)D-Trp	” (hcg)	(4F)D-Phe
188	Pro	D-3PAL	Hhp(pcg)	/3-D-1NAL
189	(lFor)D-Trp	II	(chcg)	(4NHCH3)D-Phe
190	0-D-2NAL	II	Aph(hcg)	(Ac)D-Orn
191	11	«	(Ocg)	(4NH2)D-Phe
192	0-D-1NAL	(6Br)D-Trp	(tcg)	(lFor)D-Trp
193	(6CH3)D-Trp	D-4PAL	(bzcg)	D-4PAL

Os péptidos arrolados na Tabela 6 são considerados eficazes para bloquear in vitro a secreção da LH induzida pela GnRH, a uma concentração razoável. Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação de mamíferos fêmea, a dosagens baixas.

EXEMPLO 7

Os péptidos indicados na TABELA 7 tendo a fórmula: Ac-j3-D-2NAL- (4C1) D-Phe-D-3PAL-Ser-AA₅-AA₆-Leu-AA₈-Pro-D-Ala-NH₂ são preparados pelo procedimento em fase sólida anteriormente referido.

73 713
51142		-33-
		TABELA 7
	aa5	aa6

αα₈

194	Arg	D-Aph(bcg)	Arg
195	II	” (Ocg)	II
196	Aph(bcg)	(4gua)D-Phe	(Et2)Arg
197	(2ncg)	D-Aph(2ncg)	ILys
198	(bzcg)	” (bzcg)	Har
199	(act)	(act)	ILys
200	Hap(hicg)	(hicg)	II
201	(trcg)	D-Hap(trcg)	II
202	Hhp(bcg)	(bcg)	II
203	II II	D-3PAL	(EtPr)Har
204	II II	D-Lys(Nic)	(Me2)Arg
205	Aph(tcg)	D-Aph(tcg)	(MeBu)Arg
206	(Sbcg)	(Sbcg)	ILys

Os péptidos arrolados na Tabela 7 são considerados eficazes para bloquear in vitro a secreção da LH induzida pela GnRH, a uma concentração razoável. Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação de mamíferos fêmea a dosagens baixas.

)

Os resultados do ensaio in vivo de alguns destes antagonistas seleccionados estão representados na seguinte Tabela A sendo as dosagens dadas em microgramas por ratazana:

713

51142

-34Libertação de histamina in vitro

Dosagem

Péptido n^E.

TABELA A

Ratazanas em ovulação

ED₅₀ ± SEM (Mg/ml)

103A.	2,5	0/8
	1,0	1/17
	0,5	8/18
104A.	5,0	6/11
	2,5	2/3
111A.	1,0	0/8
	0,5	6/10
114B.	2,5	0/8
	1,0	8/9
115A.	10	0/5
116A.	1,0	9/16
117B.	5,0	0/6
127A.	15	1/5
128A.	15	0/9
	5	2/4
129A.	15	4/6

A anterior Tabela

A ± 6,7 ± 2,1 também relata ensaio de vários destes o

antagonistas da GnRH num ensaio de libertação de histamina in vitro. Todos estes análogos são considerados como sendo substancialmente menos potentes na libertação de histamina que a [Ac-D-2NAL·¹, (4F)D-Phe², D-Trp³, D-Arg⁶]-GnRH para a qual o ED₅₀ era de 0,17 ± 0,01 gg/ml - uma vantagem muito substancial para estes antagonistas.

EXEMPLO 207

Um intermediário peptídico tendo a fórmula Ac-)8-D-2NAL- (4C1) D-Phe-D-3PAL-Ser (Bzl) -Tyr (2BrZ) -D-Aph(Fmoc) -Leu-Lys (Tpr) -Pro-D-Ala-NH-[resina de suporte] foi preparado pelo procedimento em fase sólida anteriormente referido. Depois da remoção da protecção Fmoc, o intermediário peptídico reagiu, como se

713

51142

-35«Λ. · _s-_a ^*· descreveu genericamente no Exemplo 1, usando o isocianato de naftilo em vez de PCI para formar a porção naftilureia com o grupo amino da cadeia lateral do resíduo D-Aph na posição 6. Depois de clivagem e purificação por HPLC como anteriormente se descreveu, o antagonista da GnRH foi ensaiado. O péptido é considerado eficaz para impedir a ovulação nos mamíferos fêmea a dosagens baixas.

EXEMPLO 208

Um intermediário peptídico tendo a fórmula Ac-/?-D-2NAL-(4C1)D-Phe-D-3PAL-Ser(Bzl)-Tyr(2BrZ)-D-Aph(Fmoc)-Leu-Lys(Ipr)-Pro-D-Ala-NH-[resina de suporte] foi preparado pelo procedimento em fase sólida anteriormente referido. Depois da remoção da protecção Fmoc, o intermediário peptídico reagiu, como se descreveu genericamente no Exemplo 1, usando isotiocianato de naftilo em vez de PCI para formar a porção naftiltio-ureia com o grupo amino da cadeia lateral do resíduo na posição 6. Depois de clivagem e purificação por HPLC como anteriormente se descreveu, o antagonista da GnRH foi ensaiado. 0 péptido é considerado eficaz para impedir a ovulação nos mamíferos fêmea, a dosagens baixas.

EXEMPLO 209

Um intermediário peptídico tendo a fórmula AC-/3-D-2NAL-(4C1)D-Phe-D-3PAL-Ser(Bzl)-Tyr(2Brz)-D-Aph(Fmoc)-Leu-Lys(Ipr)-Pro-D-Ala-NH[resina de suporte] foi preparado pelo procedimento em fase sólida anteriormente referido. Depois da remoção da protecção Fmoc, o intermediário peptídico reagiu primeiramente com éter de 2-bromo-etilo,2'(Boc-amino)etilo dissolvido em DMF durante 1 hora ou até que o ensaio de ninidrina seja negativo para ligar o átomo de carbono ao grupo amino da cadeia lateral por meio da remoção do halogéneo para formar Q-NH-(CH2)₂-°“ (CH₂)₂- -NH(Boc). Este composto reagiu depois, como se descreveu genericamente no Exemplo 1, usando PCI para formar a porção cianoguanidino com o grupo amino secundário da cadeia lateral do resíduo na posição 6. A seguir o grupo protector Boc foi

713

51142

removido e o grupo amino primário reagiu com o grupo -OPh para dar o composto:

N-CN

Q-N-C-NH --------I (CH₂)₂-O-(CH₂)₂ —I

Depois de clivagem e purificação por HPLC como anteriormente se descreveu, o antagonista da GnRH foi ensaiado. 0 péptido é considerado eficaz para impedir a ovulação nos mamíferos fêmea, a dosagens baixas.

Depois da purificação dos péptidos vários deles foram ainda caracterizados dissolvendo-os em TFA a 0,1% (10 /ig/10 /il) e submetendo-os a cromatografia líquida de alto rendimento em sílica ^c18 (Vydao 0,45 x 25 cm) empregando um caudal de 2,0 ml/min sob condições isocráticas e usando uma solução de TFA a 0,1% em água mais o volume % (v/v) de acetonitrilo indicado. A seguinte Tabela B mostra quando os péptidos específicos eluem da sílica C₁₈ que tem um tamanho de partícula de cerca de 5 μ e um tamanho de poro de 300 Â quando submetidos ao fluxo isocrático acima descrito sendo o tempo dado em minutos. As medições de rotação óptica são feitas a c=l, em ácido acético a 50%, à temperatura ambiente.

TABELA B

Péptido N2.	% ch3cn	Tempo de Eluição	[“Id
103A	30,6	4,48	-33°
104A	43,2	4,02	-23°
111A	38,4	3,75
113B	42,0	6,02
114B	38,4	4,00
115A	37,7	4,44
116A	31,2	4,01
117B	31,8	4,76
127A	33,6	4,63	-30°
128A	39,6	4,19	-30,3
129A	40,2	4,20	-42,0

713

51142

Os péptidos segundo o invento são muitas vezes administra dos na forma de sais não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis (como os sais de adição de ácido) ou de complexos metálicos, por exemplo, com zinco, bário, cálcio, magnésio, alumínio ou análogos (que são considerados como sais de adição para as finalidades deste pedido) ou de combinações dos dois. Exemplos destes sais de adição de ácido são hidrocloreto, hidrobrometo, sulfato, fosfato, nitrato, oxalato, fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, alginato, maleato, ascorbato, tartarato e análogos. É preferido o sal acetato. Por exemplo, uma solução aquosa do péptido pode ser tratada repetidamente com ácido acético IN e depois liofilizada para dar o seu sal de ácido acético. Se o ingrediente activo vai ser administrado na forma de comprimidos, o comprimido pode conter um diluente farmaceuticamente aceitável que inclui um ligante como tragacanto, amido de milho ou gelatina; um agente desintegrante como o ácido algínico e um lubrificante como estearato de magnésio. Se for desejada a administração na forma líquida, pode utilizar-se um edulcorante e/ou aroma como parte do diluente farmaceuticamente aceitável, e pode ser realizada a administração intravenosa em em soro salino isotónico, soluções tamponadas com fosfato ou análogos.

As composições farmacêuticas conterão habitualmente o péptido em conjunto com um portador convencional farmaceuticamente aceitável. Habitualmente, a dosagem vai de cerca de 10 Mg a cerca de 2,5 mg de péptido por quilograma de peso corporal do hospedeiro quando administrado por via intravenosa; embora as dosagens orais sejam mais elevadas, prevê-se que a natureza destes compostos permitirá uma administração oral eficaz. Além do mais, o tratamento de indivíduos com estes péptidos é realizado geralmente da mesma maneira que o tratamento clínico que utiliza outros antagonistas da GnRH usando um portador apropriado onde o péptido é solúvel. Por causa da solubilidade favorável é possível a administração em solução salina.

Pode ser também desejável dar o análogo de GnRH para períodos de tempo prolongados, por exemplo, para períodos desde uma

73 713
51142	Pc; *
	—38—
semana até um ano	com uma única administração e formas de	dosa-

gem de libertação lenta, depósito ou implantação podem ser utilizadas.

Estes péptidos podem ser administrados aos mamíferos intravenosa, subcutânea, intramuscular, oral, percutaneamente, por exemplo, intranasal ou intravaginalmente para conseguir a inibição e/ou controlo da fertilidade e também em aplicações que pedem a supressão reversível da actividade das gónadas, como para controlo da puberdade precoce ou durante radio ou quimioterapia. São também úteis no tratamento de tumores que dependem dos esteroides. As dosagens eficazes variarão conforme a forma de administração e a espécie particular de mamíferos a ser tratada. Um exemplo de uma forma típica de dosagem é uma solução de água bacteriostática contendo o péptido, solução que é administrada parentericamente para dar uma dose na gama de cerca de 0,1 a

2,5 mg/kg de peso corporal por dia. A administração oral do péptido pode ser feita na forma sólida ou na forma líquida.

Embora o invento tenha sido descrito relativamente às suas concretizações preferidas, deve ser compreendido que alterações e modificações que serão óbvias para quem tenha conhecimentos vulgares desta arte, podem ser feitas sem exorbitar o âmbito do invento que é o definido nas reivindicações anexas. Por exemplo, podem ser empregadas nestes péptidos do invento outras substituições conhecidas na arte que não diminuem significativamente a eficácia dos péptidos. D-2PAL e D-4PAL são considerados equivalentes a D-3PAL. Podem ser usados outros grupos de acilação equivalentes no N-terminal em vez de acetilo. Phe substituído, como o (4F)Phe, pode ser usado na posição 7 em vez de Phe. Tanto butil Lys como dietil Lys são consideradas equivalentes à ILys; prefere-se porém a ILys. Har é considerado equivalente de Arg na posição 8. Outros resíduos aminoácidos hidrofobos podem também ser empregados na posição 1, de preferência na forma isómera D e são considerados equivalentes aos que foram especificados.

Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES

   51142

   1 - Péptido antagonista do GnRH ou um seu sal não tóxico, caracterizado por o referido péptido ter a fórmula: Ac-AA₁-(A)D-Phe-AA₃-Ser-AA₅-AA₆-AA₇-AA₈-Pro-AA₁₀ onde AAj é β-Ό-NAL, (A)D-Phe ou (B)D-Trp; A é 4C1, 4F, 4NO₂, 4CH₃, 4OCH C^aME/4Cl, 2,4 Cl2, 4Br ou Η; B é Η, 6NO2, 6NH2, 6OCH3, 6F, 6Br, 6CH3, NⁱⁿFor ou NⁱⁿAc; AA3 é D-PAL, U Trp; AA₅ é U*, Lys (cpd) ou Tyr; AAg é U*, (B)D-Trp, D-Lys(cpd), D-PAL ou D-Arg; AA·? é Leu Phe; AA_: NH(R);

   (^a)

   4F, 4NO₂, 4tun₃, 4tuvxi₃, 6NH₂, 6OCH₃, 6F, 6C1, *, B-D-NAL ou (B)Dj8-D-NAL, 4NH₂D-Phe, NML, Nle ou

   NHNHCONH₂ ou

   Λ

   ILys ou Arg; AA₁₀ é D-Ala-NH₂, Gly-NH₂, alquilo inferior; e U* é onde j átomos ou 2 e R^j é H ou um de carbono;

   radical

   NHR^ acilo que tem de 1 a 6 ou (b) onde j él, 2 ou 3; X é NH ou 0; Y é N-CN ou N-CONHRg onde R_g é H ou alquilo inferior; R₂ é alquilo inferior, ciclo-hexilo, fenilo, piridilo, metilpiridilo ou histaminilo;

   desde que, porém, pelo menos um entre AA₃, AA₅ e AAg seja U , sendo AA₃ e AAg sempre um isómero D.
2. 2 - Péptido antagonista do GnRH de acordo com a reivindica73 713

   51142 ção 1, caracterizado por j ser 1, X ser NH, Y ser N-CN ou N-CONH₂ e Rjj ser H ou acetilo.
3. 3 - Péptido antagonista do GnRH de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ter a fórmula

   Ac-/3-D-2NAL-(4Cl )D-Phe-D-3PAL-Ser-Aph(3-amino-l,2,4-triazolo)-D-Aph(3-amino-l,2,4-triazolo)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH₂-
4. 4 - Péptido ou um seu sal não tóxico, caracterizado por o referido péptido ter a fórmula:

   G-AA^-(AJD-Phe-AAg-Ser-AAg-AAg-AAy-AAg-Pro-AA-LQ onde G é hidrogénio ou um grupo acilo que tem 7 ou menos átomos de carbono; AA^ é desidroPro, D-pGlu, (A)D-Phe, (B)D-Trp, Pro ou 0-D-Nal; A é H, Cl, F, NO₂, CH₃, OCH₃, C^aMe/4Cl, Cl2, ou Br; B é H, N02, NH2, OCH3, F, Cl, Br, CH3, NⁱⁿFor ou NⁱⁿAc; AA3 é U* D-PAL, β-Ό-NAL ou (B)D-Trp; AA₅ é U*, Lys(cpd), Orn(cpd), Dbu(cpd), Dpr(cpd), Tyr, (C)Arg, APhe, (3I)Tyr ou His; C é H ou alquilo inferior; AAg é U*, /3-D-NAL, (B)D-Trp, (A')D-Phe, (D)D-Orn (D)D-Lys, (D)Dbu, (D)D-Dpr, D-Har, D-Tyr, (E)D-His, D-PAL, (C)D-Arg, D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ala ou D-Ser(OtBu); A^z é A, NH2, NHCH3 ou gua; D é G, cpd ou um grupo arilo; E é H, imBzl ou dinitrofenol; AA7 é Nle, Leu, NML, (A)Phe, Met, Nva, Tyr, (B)Trp ou PAL; AAg é ILys, (C^z)Arg ou (C^z)Har; C^z é H ou di-alquilo inferior; AA10 é D-Ala-NH₂, Gly-NH₂, NHNHCONH₂ ou NH(R); R é alquilo inferior; e XJ* é onde j él, 2 ou 3; Yé N-CN, N-CONHR₉, O, S ou CH-NO₂ onde Rg é H, Ac, alquilo, naftilo, piridilo, pirimidilo, pirazinilo, indolilo, quinolinilo ou imidazolilo, cujos grupos alquilo e cíclicos estão não substituídos ou substituídos; X é NH, 0, N₃, Mi(CHq)pM₂ ou M₁-(CH₂)p,-M₂-(CH₂)pii-M₃; onde Mj é NR₁₀, N, 0 ou CHR₃ onde R₃ é metilo, etilo, propilo, fenilo, piridinilo,

   73 713

   51142 pirimidinilo ou purinilo; q é 1 ou 2; p, p' e p” são números inteiros entre 0 e 6; R^q é H, metilo, etilo, propilo, fenilo ou fenilo substituído; e M₂ e M₃ são M_lf COOH, CONH₂, COOR₃ ou CN;

   Rj é H, alquilo, (CH2)_n/X, alcenilo, alcinilo, arilo, ou uma ligação directa a X; n^z é 1, 2, 3 ou 4; X é CH₂NH₂, CH₂OH, CH₂C1, CH₂Br, CH₂F, CF₃ ou CF₂CF₃; R₂ é R_lz OH, NH₂, ΝΗΡ_χ, heterociclo ou desR₂, sendo R₂ desR₂ quando X é N₃; desde que, porém, R^ e R₂ estejam, opcionalmente, interligados através de uma ponte ramificada ou não ramificada de modo que Rj-R₂ seja -(CH₂)_ni- ou -(CH₂)_m-M-(CH₂)_m/-, onde m e m' são números inteiros de 1 a 6 e M é NH, 0, S ou CHR₄, sendo R₄ alquilo inferior ou ) arilo; desde que também Y e R₂ estejam opcionalmente interligados; e também ainda desde que pelo menos um entre AA₃, AAg e AAg seja U , sendo U um isómero D sempre que presente como AA₃ ou AAg.
5. 5 - Péptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por AAg ser U*.
6. 6 - Péptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado “ii por AAg ser U .
7. 7 - Péptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por AAg e AAg serem ambos U*.

   I
8. 8 - Péptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por AA₃ ser U*.
9. 9 - Péptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por AA-l ser 0-D-2NAL, (A) ser 4C1 ou 4F e AA₃ ser D-3PAL.
10. 10 - Péptido de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por AAg ser D-Trp, D-PAL, β-D-NAL, (imBzl)D-His ou (6NO₂)D-Trp e AA₅ ser U*.
11. 11 - Péptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por U* ser Aph(tcg).

    73 713

    51142
12. 12 - Péptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por U* ser Aph(bcg).
13. 13 - Péptido de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 12, caracterizado por AA₈ ser Arg, g ser AC e (D) e (E) serem ambos H.
14. 14 - Péptido de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 10, caracterizado por U conter uma porção cianoguanidina e j ser 1.
15. 15 - Péptido de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 12, caracterizado por AA_g ser ILys.
16. 16 - Péptido de acordo com as reivindicações 4 ou 9, caracterizado por AAg ser Aph(tcg), AAg ser D-Aph(tcg) e AA_g ser ILys.
17. 17 - Péptido de acordo com as reivindicações 4 ou 9, caracterizado por AAg ser Lys(Nic), AAg ser U e AA_g ser ILys.
18. 18 - Péptido intermediário para fazer um péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ter a fórmula: Ac-AA-l- (4C1) D-Phe-AA₃ -Ser (X³) -Aph (X^a) -D-Aph (X^a) -Leu-Lys (Ipr, X⁶) Pro-D-Ala-NH-(suporte de resina), onde ΑΑχ é /3-D-NAL, (A)D-Phe OU (B)D-Trp; B é H, 6NO2 OU NⁱⁿFor; AA3 é D-PAL, 0-D-Nal OU (B)D-Trp, X³ é um grupo protector de um grupo hidroxilo de Ser ou Thr; X^a é um grupo protector de um grupo amino primário que é lábil às bases, lábil a hidrazina ou lábil a tio; e X⁶ é Z ou 2C1Z.
19. 19 - Péptido intermediário de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por ter a fórmula: Ac-/?-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3 PAL-Ser (X³) -Aph (X^a) -D-Aph (X^a) -Leu-Lys (Ipr, Z) -Pro-D-Ala-NH- (suporte de resina).
20. 20 - Aminoácido, isómero L ou D, não natural, caracterizado por ter a fórmula:

    73 713

    51142 onde j él, 2 ou 3; Y é N-CN, N-CONHRg, O, S ou CH-NO₂ onde R_g é H, Ac, alquilo, naftilo, piridilo, pirimidilo, pirazinilo, indolilo, quinolinilo ou imidazolilo, cujos grupos alquilo e cíclicos estão não substituídos ou substituídos; X é NH, O, Ng, ^Ml(^CHq)p^M2 ^{ou onde M}1 ^é ^10' ^N' ^{0 ou} CHR3 onde R3 é metilo, etilo, propilo, fenilo, piridinilo, pirimidinilo ou purinilo; q é 1 ou 2; p, p^z e p são números inteiros entre 0 e 6; R10 é H, metilo, etilo, propilo, fenilo ou fenilo substituído com Cl, F, N0₂ ou NH₂; e M₂ e M₃ são Mj, COOH, CONH₂, COOR₃ ou CN; R_x = H, alquilo (C_T a C₆), (CH₂)_n,X, alcenilo (C₂ a C₄), alcinilo (C₂ a C₄), arilo ou uma ligação directa a X; n' é 1, 2, 3 ou 4; X é CH₂NH₂, CH₂0H, CH₂C1, CH₂Br, CH₂F, CF₃ ou CF₂CF₃; R₂ é R_lz OH, NH₂, NHRj, heterociclo ou desR₂, sendo R₂ desR₂ quando X é N₃; desde que, porém, R₁ e R₂ estejam, opcionalmente, interligados por meio de uma ponte ramificada ou não ramificada de modo que R-_L~R₂ seja “(^CH2^m“ ^ou -(CH2)m-M-(CH2)m^/, onde m e m' são números inteiros de 1 a 6 e M é NH, O, S ou CHR4, sendo R₄ alquilo inferior ou arilo; desde que, também, Y e R₂ estejam opcionalmente interligados.
21. 21 - Processo para fazer um péptido que inclui um resíduo U* de um aminoácido não natural de acordo com a reivindicação 20, péptido que tem a fórmula: G-AA^-fA)D-Phe-AA₃-Ser-AA₅-AA₆~ AA₇-AA₈-Pro-AA₁₀ onde G é hidrogénio ou um grupo acilo que tem 7 ou menos átomos de carbono; AA-^ é desidroPro, D-pGlu, (A)D-Phe, (B)D-Trp, Pro ou β-D-Nal; A é H, Cl, F, NO₂, CH₃, OCH₃, C^aMe/4Cl, Cl2, ou Br; B é H, N02, NH2, OCH3, F, Cl, Br, CH3, N^ÍnFor e NⁱⁿAc; AAg é U*, D-PAL, /3-D-NAL OU (B)D-Trp; AA5 é U*, Lys(cpd), Orn(cpd), Dbu(cpd), Dpr(cpd), Tyr, (C)Arg, APhe, (31)Tyr ou His; C é H ou alquilo inferior; AA₆ é U*, β-D-NAL, (B)D-Trp, (A')D-Phe, (D)D-Orn (D)D-Lys, (D)Dbu, (D)D-Dpr, D-Har,

    73 713

    51142

    ... Ζ '

    D-Tyr, (E)D-His, D-PAL, (C)D-Arg, D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ala ou D-Ser(OtBu); A' é A, NH₂, NHCH₃ ou gua; D é G, cpd ou um grupo arilo; E é H, imBzl ou dinitrofenol; AA₇ é Nle, Leu, NML, (A)Phe, Met, Nva, Tyr, (B)Trp ou PAL; AAg é ILys, (C^z)Arg (C')Har; C' é H ou di-alquilo inferior; AA₁₀ é D-Ala-NH₂, Gly-NH₂, NHNHCONH₂ ou NH(R); R é alquilo inferior, desde que, porém, pelo menos um entre AA₃, AA₅ e AA_g seja U*, processo caracterizado por compreender (a) a formação de um péptido intermediário que tem a fórmula:

    X¹-AA1(A)D-Phe-U3-Ser(X³)-U5-U₆-AA₇(X² ou X⁷)-AAg(X⁵ ou X⁶)-Pro-X⁸ onde: U³ é U' ou AA'(X²); U5 é U' ou AA5(X⁴ ou X⁵); Ug é U' ou AA_g(X⁴, X⁵ ou X⁶); a U' é Lys(X^a), Orn(X^a), Dbu(X^a) ou Dpr(X^a); X-L é hidrogénio ou um grupo protector α-amino; X² é hidrogénio ou um grupo protector para um azoto do indolo; X³ é um grupo protector de um grupo hidroxilo de Ser ou Thr; X⁴ é hidrogénio ou um grupo protector de um grupo hidroxilo fenólico de Tyr; X⁵ é hidrogénio ou um grupo protector de um grupo guanidino ou imidazolo; X^ é um grupo protector de um grupo amino primário; X^a é um grupo protector de um grupo amino primário que é lábil às bases, lábil a hidrazina ou lábil a tio; X⁷ é hidrogénio ou um grupo protector de Met; X⁸ é Gly-NH-[resina de suporte], D-Ala-NH-[resina de suporte], N(A)-[resina de suporte] , uma amida de Gly ou de D-Ala ou uma amida substituída ligada directamente a Pro; desde que, porém, pelo menos um entre U3, U5 e Ug seja Aph(X^a), Hap(X^a) ou Hhp(X^a), sendo U3 e U_g sempre um isómero D; (b) a remoção de pelo menos um X^a para desproteger um grupo amino primário de cadeia lateral de pelo menos um resíduo de aminoácido do referido péptido intermediário; (c) a reacção do referido grupo amino primário de cadeia lateral desprotegido para construir o referido resíduo num que tem a fórmula U*; e (d) separação de qualquer dos grupos remanescentes X-*- a X⁷ e/ou clivagem de qualquer resina de suporte incluída em X⁸.
22. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 21 caracterizado por U₅ ser U' ou U_g ser U' ou serem ambos U'.