Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych 4-hydroksy-3-nitrokumaryny stosowanych w kompozycjach farmaceutycznych, znajdujacych zastosowanie do zmniejszania efek¬ tów pewnych typów reakcji antygen-przeciwcialo co posiada znaczenie przy zapobieganiu i leczeniu chorób zwiazanych z reakcjami alergicznymi lub immunologicznymi, na przyklad pewnych rodzajów astmy i goraczki siennej, jak równiez przy lecze¬ niu niezytu nosa.Nowe zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku ilustruje wzór 2, w którym R1 oznacza atom wodoru, grupe metylowa, etylowa, n-propy- lowa, metoksylowa, etoksylowa lub n-propoksylo- wa, a R11 oznacza atom wodoru, grupe metylowa, etylowa, n-propylowa, metoksylowa, etoksylowa lub n-propoksylowa z tym zastrzezeniem, ze R1 i R11 nie moga jednoczesnie oznaczac atomów wodoru i gdy jeden z podstawników R1 i R11 oznacza atom wodoru, to drugi nie moze oznaczac grupy metok- sylowej.Szczególnie preferowane sa te zwiazki w których oba podstawniki R1 i R11 oznaczaja grupy metylo¬ we, etylowe, n-propylowe, metoksylowe, etoksylowe lub n-propoksylowe.Wedlug wynalazku, sposób wytwarzania zwiaz¬ ków o ogólnym wzorze 2, w którym R1 oznacza atom wodoru, grupe metylowa, etylowa, n-propy¬ lowa, metoksylowa, etoksylowa lub n-propoksylo¬ wa, a R11 oznacza atom wodoru, grupe metylowa, etylowa, n-propylowa, etoksylowa, metoksylowa lub n-propoksylowa z zastrzezeniem, ze R1 i R11 nie oznaczaja jednoczesnie atomów wodoru i jezeli jeden z podstawników R1 i R11, oznacza atom wo¬ doru to drugi nie moze oznaczac grupy metoksy- lowej lub ich dopuszczalnych farmakologicznie soli polega na nitrowaniu zwiazku o ogólnym wzorze 3, w którym R1 i R11 maja wyzej podane zna¬ czenie. Nitrowanie prowadzi sie przy uzyciu jed¬ nego z czynników nitrujacych takich jak dymy azotowe, wytwarzane przy uzyciu stezonego kwasu azotowego i tlenku arsenu, kwas octowy plus ste¬ zony kwas azotowy, dymiacy kwas azotowy w chloroformie lub stezony kwas azotowy.Przykladami odpowiednich soli zwiazków o ogól¬ nym wzorze 2 sa sole metali alkalicznych, a zwla¬ szcza potasu i sodu oraz sole metali ziem alkalicz¬ nych, takie jak sole glinu i magnezu, jak równiez sole organicznych zasad, takich jak aminy lub po¬ chodne amin. 4-hydroksy-3-nitrokumaryny o wzorze 1 moga wystepowac w wielu odmianach tautomerycznych przedstawionych na schemacie podanym na zala¬ czonym rysunku i jest zatem sprawa zrozumiala, ze okreslenie w niniejszym opisie 4-hydroksy-3-ni- trokumaryny odnosi sie równiez do tautomerycz¬ nych odmian tych zwiazków.Szczególnie korzystne cechy farmakologiczne po¬ siadaja nastepujace zwiazki o ogólnym wzorze 2 i ich dopuszczalne w farmacji sole: 6,7-dwumetylo- 96 04796047 3 -4-hydroksy-3-nitrokumaryna, 6,7-dwuetylo-4-hy- droksy-3-nitrokumaryna, 6,7-dwu-n-propylo-4-hy- droksy-3-nitrokumaryna, 6-metylo-7-etylo-4-hydro- ksy-3-nitrokumaryna, 6-etylo-7-metylo-4-hydroksy- -3-nitrokumaryna, 7-metoksy-4-hydroksy-3-nitroku- maryna, 7netoksy-4-hydroksy-3-nitrokumaryna, 7-n- -propoksy-4-hydroksy-3-nitrokumaryna, 6-metylo- -7-metoksy-4-hydroksy-3-nitrokumaryna, 6-etylo-7 - -metoksy-4-hydroksy-3-nitrokumaryna, 6-n-propy- lo-7-metoksy-4-hydroksy-3-nitrokumaryna, 6-mety- lo-7netoksy-4-hydfoksy-3-nitrokumaryna, 6-etylo-7- -etoksy-4-hydroksy-3-nitrokumaryna, 6-n-propylo- -7-etoksy-4-hydroksy-3-nitrokumaryna, 6-metylo-7- -n-propoksy-4-hydroksy-3-nitrokumaryna, 6-etylo-7 -7-n-propoksy-4-hydroksy-3-nitrokumaryna, 6-n- -propylo-7-n-propoksy-4-hydroksy-3-nitrokuma- ryna. k „ £ '¦< Wyjsciowe substancje o wzorze ogólnym 3 sa nowe i mozna otrzymac dowolnymi typowymi metodami opisanymi w literaturze dla wytwarzania -4-hydro- ksykumaryny. Mozna zatem stosowac reakcje od¬ powiedniego fenolu z kwasem malonowym przy uzyciu tlenochlorku fosforu i chlorku cynku jako czynnika kondensacyjnego.Przy uzyciu zgodnie z ta metoda fenoli podsta¬ wionych w pozycjach 2 lub 4 otrzymuje sie wy¬ lacznie pochodna kumaryny, natomiast przy uzyciu fenoli podstawionych w pozycji 3 mozna otrzymac mieszanine dwóch mozliwych izomerów. Izomery te mozna rozdzielac t typowymi metodami, takimi jak na przyklad frakcjonowana krystalizacja. Inna. me¬ toda jest kondensacja o-hydroksyaoetofenonu z we¬ glanem dwuetylu w obecnosci sodu lub wodorku sodowego.Kompozycje farmaceutyczne zawierajace jako substancje czynna zwiazek wytwarzany sposobem wedlug wynalazku mozna przygotowywac w po¬ staci mikro-rozdrobnionego proszku do wdmuchi¬ wania, na przyklad jako proszek do wachania lub w kapsulkach z twardej zelatyny. Moga one rów¬ niez wystepowac lacznie ze sterylnym, cieklym nosnikiem do zastrzyków. Zwiazki o ogólnym wzo¬ rze 2, które sa aktywne przy podawniu dozola/lko- kwym mozna przygotowywac w postaci syropów, tabletek, kapsulek, pigulek itp. Najkorzystniej mie¬ szanki te przygotowuje sie w formie dawki jedno¬ stkowej lub w postaci, która pacjent moze sam sto- . sowac w pojedynczej dawce. Jesli na przyklad mie¬ szanka wystepuje w postaci tabletek, pigulek lub kapsulki, odpowiednia dawka jednostkowa moze wynosic od 1 do 500 mg aktywnego skladnika. Jesli to pozadane, do kompozycji tych mozna wprowa¬ dzac niewielka ilosc srodka rozszerzajacego oskrze¬ la, takiego jak izoprenalina zarówno w celu zmniej¬ szenia' kaszlu przy wdmuchiwaniu kompozycji, jak równiez spowodawania bozposredniego wydzielenia w trakcie ataku astmatycznego. Skuteczna dawka zwiazku o ogólnym wzorze 2 zalezy od konkret¬ nego zwiazku lecz zazwyczaj wynosi od 0,1—100 mg/kg/dzien.Dokladne sprecyzowanie farmaceutycznego nos¬ nika stosowanego w omawianych kompozycjach nie jest tu istotne. Mozna stosowac standartowa tech¬ nika farmaceutyczna. 40 45 50 55 60 65 Zgodnie z powszechna praktyka kompozycje ta¬ kie zaopatrzone sa w pisemne lub drukowane wskazówki co do sposobu uzycia a w tym przy¬ padku stosuje sie je jako srodek przeciwalergiczny do zapobiegania i leczenia na przyklad astmy, go¬ raczki siennej lub niezytu nosa.Przyklad I. 4-hydroksy-6-metylo-3-nitrokuma- ryna ml dymiacego kwasu azotowego dodaje sie w ciagu 1,5 godziny w temperaturze pokojowej do mieszanej zawiesiny 2,50 g 4-hydroksy-6-me- tylokumaryny (temperatura topnienia 261—264°C) w 250 ml chloroformu. Mieszanine pozostawia sie na okres 3 godzin i rozpuszczalnik usuwa sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze, pokojo¬ wej oraz do pozostalosci dodaje sie 200 ml wody.Po odsaczeniu otrzymuje sie produkt o tempera¬ turze topnienia 171—171,5°C (rozklad). Wartosci obliczone dla C10H7O5: C-54,31, H-3,19, N-6,33.Wartosci oznaczone: C-54,60, H-3,33, N-6,60. W wy¬ niku krystalizacji z etanolu temperatura topnienia wzrasta do 172—173°C (rozklad).Przyklad II. 6-etylo-4-hydroksy-3-nitrokuma- ryna 33 ml dymiacego kwasu azotowego dodaje sie w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej do mieszanej zawiesiny 5,52 g 6-etylo-4-hydroksyku- maryny (temperatura topnienia 216—218°C) w 500 ml chloroformu. Mieszanine pozostawia sie jeszcze na okres 1 godziny po czym rozpuszczalnik odpa¬ rowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem w tem¬ peraturze pokojowej i do pozostalosci dodaje sie 100 ml 6 n kwasu solnego. Po odsaczeniu otrzy¬ muje sie produkt o temperaturze topnienia 114— —115°C. Wartosci obliczone dla CnH9N05: C-56,17, H-3,86, N-5,96. Wartosci oznaczone: C-55,86, H-3,80, N-5,86. W wyniku krystalizacji z mieszaniny ben¬ zenu i eteru naftowego o temperaturze wrzenia 40—60°C temperatura topnienia produktu wzrasta do 117—119°C.Przyklad III. i) 6,7-dwumetylo-4-hydroksy-3- -nitrokumaryna 33 ml dymiacego kwasu azotowego dodaje sie w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej do mieszanej zawiesiny 5,52 g 6,7-dwumetylo-4-hydro- ksykumaryny (temperatura topnienia 252—253°C, rozklad) w 500 ml chloroformu. Mieszanine pozo¬ stawia sie jeszcze na okres 2 godzin, po czym roz¬ puszczalnik usuwa sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem w temperaturze pokojowej i do pozostalosci dodaje sie 100 ml 6 n kwasu solnego. Po odsa¬ czeniu otrzymuje sie produkt o temperaturze top¬ nienia 200—201°C (rozklad). Wartosci obliczone dla CnH9N05: C-56,18, H-3,86, N-5,96. Wartosci ozna¬ czone: C-56,33, H-4,07, N-5,95. W wyniku krystali¬ zacji z etanolu temperatura topnienia wzrasta do 203—204°C (rozklad). ii) Sól sodowa 6,7-dwumetylo-4-hydroksy-3-nitro- kumaryny Rozcienczony roztwór wodorotlenku sodowego dodaje sie do 4,32 g zawiesiny 6,7-dwumetylo-4- -hydroksy-3-nitrokumaryny w 60 ml wody do chwi¬ li az pH roztworu osiagnie wartosc 14. Po odsa¬ czeniu otrzymuje sie produkt o temperaturze top-96047 nienia powyzej 300°C. Wartosci oznaczone dla CnH8N05Na: C-51,37, H-3,14, N-5,45, Na-8,94. War¬ tosci oznaczone: C-51,69, H-3,26, N-5,33, Na-8,92.Wyniki te uzyskano po krótkim przemyciu woda i wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem.Przyklad IV. 6-etylo-4-hydroksy-7-metylo-3- -nitrokumaryna 16 ml dymiacego kwasu azotowego dodaje sie w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej do mieszanej zawiesiny 3,17 g 6-etylo-4-hydroksy-7- -metylokumaryny {temperatura topnienia 234— —237°C) w 250 ml chloroformu. Mieszanine po¬ zostawia sie na okres 1 godziny i rozpuszczalnik usuwa sie pod zmniejszonym cisnieniem w tempe¬ raturze pokojowej oraz do pozostalosci dodaje sie 60 ml 6 n kwasu solnego. Po odsaczeniu otrzymuje sie produkt o temperaturze topnienia 170—172°C (rozklad). Wartosci obliczone dla C12H11NO5: C-57,83, H-4,45, N-5,62. Wartosci oznaczone: C-58,07, H-4,54, N-5,76.Przyklad V. i) 6,7-dwumetylo-4-hydroksy-3- -nitrokumaryna 17 ml dymiacego kwasu azotowego dodaje sie w ciagu 1,5 godziny w temperaturze pokojowej do mieszanej zawiesiny 3,46 g 6,7-dwuetylo-4-hydrok- sykumaryny (temperatura topnienia 213—216°C) w 300 ml chloroformu. Po uplywie 1 godziny rozpu¬ szczalnik usuwa sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze pokojowej i do pozostalosci doda¬ je sie 70 ml 6 n kwasu solnego. Po odsaczeniu otrzymuje sie produkt o temperaturze topnienia 115—117°C. Wartosci obliczone dla C13H13N05: C-59,31, H-4,98, N-5,32. Wartosci oznaczone: C-59,26, H-5,16, N-5,25. W wyniku krystalizacji z etanolu temperatura topnienia produktu wzrasta do 119— —120°C. ii) Sól sodowa 6,7-dwuetylo-4-hydroksy-3-nitro- kumaryny Rozcienczony roztwór wodorotlenku sodowego do¬ daje sie do zawiesiny 2,90 g 6,7-dwuetylo-4-hydro- ksy-3-nitrokumaryny w 20 ml wody do chwili az pH roztworu osiagnie wartosc 14. Po odsaczeniu otrzymuje sie produkt w postaci monohydratu o temperaturze topnienia 249—251°C (rozklad). War¬ tosci obliczone dla Ci3H12N05Na-H20: C-51,49, H-4,65, N-4,62, Na-7,58. Wartosci oznaczone: C-52,08, H-4,65, N-4,83, Na-7,81 po przemyciu woda i wy¬ suszeniu pod zmniejszonym cisnieniem.Przyklad VI. i) 4-hydroksy-6-metoksy-3-nitro- kumaryna ml dymiacego kwasu azotowego dodaje sie do mieszanej zawiesiny 4-hydroksy-6-metoksykumary- ny o temperaturze topnienia 271—272°C (rozklad).Wartosci obliczone dla Ci0H7NO5: C-50,64, H-2,97, N-5,91. Wartosci oznaczone: C-50,78, H^3,18, N-5,47. ii) Sól sodowa 4-hydroksy-6-metoksy-3-nitroku- maryny Rozcienczony roztwór wodorotlenku sodowego dodaje sie do zawiesiny 20 g 4-hydroksy-6-meto- ksy-3-nitrokumaryny w 40 ml wody do chwili az pH roztworu osiagnie wartosc 14. Po odsaczeniu otrzymuje sie produkt o temperaturze topnienia 277—278°C (rozklad). Wartosci obliczone dla C10H6NO6Na: C-46,35, H-2,33, N-5,41, Na-8,87. War¬ tosci oznaczone po krótkim przemywaniu woda i wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem: C-46,32, H-2,44, N-5,50, Na-8,34.Przyklad VII. 7-etoksy-4-hydroksy-3-nitroku- maryna ml dymiacego kwasu azotowego dodaje sie w ciagu 1,5 godziny w temperaturze pokojowej do mieszanej zawiesiny 5,0 g 7*-etoksy-4-hydroksyku- maryny (temperatura topnienia 267—268°C) w 500 ml chloroformu. Po uplywie 2 godzin rozpuszczal¬ nik usuwa sie pod zmniejszonym cisnieniem i do pozostalosci dodaje sie 100 ml 6 n kwasu solnego.Po odsaczeniu i krystalizacji z etanolu otrzymuje sie produkt o temperaturze topnienia 153—154°C (rozklad). Wartosci obliczone dla CnH9N06: C-52,59 H-3,61, N-5,58. Wartosci oznaczone: C-52,48, H-3,36, N-5,29. ' ¦ • " Przyklad VIII. i) 4-hydroksy-3-nitro-7-n-pro- poksykumaryna 15 ml dymiacego kwasu azotowego dodaje sie w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej do mieszanej zawiesiny 3,0 g 4-hydroksy-7-n-propok- sykumaryny (temperatura topnienia 216—218°C) w 300 ml chloroformu. Po uplywie 1 godziny rozpu- szczalnik usuwa sie pod zmniejszonym cisnieniem i do pozostalosci dodaje sie 60 ml 6 n kwasu' sol¬ nego. W wyniku odsaczenia i krystalizacji z eta¬ nolu otrzymuje sie produkt o temperaturze top¬ nienia 151—152°C, Wartosci obliczone dla C^Hn NOe: C-54,34, H-4,18, N-5,28. Wartosci oznaczone: C-54,38, H-4,28, N-5,24. ii) Sól sodowa 4-hydroksy-3-nitro-7-n-propoksy- kumaryny Rozcienczony roztwór wodorotlenku sodowego dodaje sie do zawiesiny 1,92 g 4-hydroksy-3-nitro- -7-n-propoksykumaryny w 20 ml wody do chwi¬ li az pH roztworu osiagnie wartosc 14. Po odsa¬ czeniu otrzymuje sie produkt o temperaturze* top¬ nienia 212—220°C, po przemyciu woda i wysu- 40 mzeniu pod zmniejszonym cisnieniem.Przyklad IX. Sól sodowa 6-benzyloksy-4-hy- droksy-3-nitrokumaryny 13 ml dymiacego kwasu azotowego dodaje sie w ciagu 1,5 godziny w temperaturze pokojowej do 45 mieszanej zawiesiny 3,13 g 6-benzyloksy-4-hydrok- sykumaryny (temperatura topnienia 226—228°C) w 200 ml chloroformu. Po uplywie 1,5 godziny roz¬ puszczalnik usuwa sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem w temperaturze pokojowej i do pozostalos- 50 ci dodaje sie 100 ml wody. Po odsaczeniu otrzy¬ muje sie oleisty osad, który rozpuszcza sie . w benzenie, odsacza sie przesacz odparowuje sie do sucha uzyskujac zólty osad, rozkladajacy sie w temperaturze 170°C. Osad zawiesza sie w 300 ml 55 wody i dodaje sie rozcienczonego roztworu sodo¬ wego do chwili az pH roztworu osiagnie wartosc 14. Po odsaczeniu otrzymuje sie produkt o tem¬ peraturze topnienia 262—264°C (rozklad). Wartosci obliczone dla Ci0H10NO6Na: C-57,32, H-3,01, N-4,18, 60 Na-6,86. Wartosci oznaczone: C-57,44, H-3,31, N-4,34. Wartosci oznaczone po przemyciu woda i wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem: C-57,44, H-3,31, N-4,34, Na-6,67.Przyklad X. 6-etylo-4-hydroksy-7-metoksy-3- M -nitrokumaryna/ 96047 ml dymiacego kwasu azotowego dodaje sie w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej do za¬ wiesiny 2,86 g 6-etylo-4-hydroksy-7-metoksykuma- ryny (temperatura topnienia 262—265°C, rozklad) w 250 ml chloroformu. Po uplywie 1 godziny roz¬ puszczalnik usuwa sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem w temperaturze pokojowej i do pozostalosci dodaje sie 60 ml 6 n kwasu solnego. Po odsacze¬ niu otrzymuje sie produkt o temperaturze topnie¬ nia 193—195°C i(rozklad). Wartosci obliczone dla C12HnN06: C-54,34, H-4,18, N-5,28. Wartosci ozna¬ czone: C-54,03, H-4,16, N-5,21.Przyklad XI. Ogólnym sposobem opisanym w \ przykladach III i V dodajac dymiacego kwasu azo¬ towego w ciagu 2 godzin w temperaturze pokojo¬ wej do mieszanej zawiesiny 6,7-dwu-n-propylo-4- -hydroksykumaryny w chloroformie otrzymuje sie 6,7-dwu-n-propylo-4-hydroksy-3-nitrokumaryne w postaci wolnego kwasu i soli sodowej.Sposobem opisanym w przykladzie V lecz przy uzyciu 6-metylo-7-etylo-hydroksykumaryny jako substancji wyjsciowej otrzymuje sie 6-metylo-7-ety- lo-4-hydroksy-3-nitrokumaryne.Ogólnym sposobem opisanym w przykladzie XI lecz przy uzyciu 6-metylo-7-metoksy-4-hydroksyku- maryny jako substancji 'wyjsciowej otrzymuje sie 6-metylo-7-metoksy-4-hydroksy-3-nitrokumaryne.Ogólnym sposobem opisanym w przykladzie XI lecz przy uzyciu 6-n-propylo-7-metoksy-4-hydro- ksykumaryny jako substancji wyjsciowej otrzymu¬ je sie 6-n-propylo-7-metoksy-4-hydroksy-3-nitroku- maryne.Ogólnym sposobem opisanym w przykladzie XI lecz przy uzyciu nastepujacych substancji wyjscio¬ wych: 6-metylo-7-etoksy-4-hydroksykumaryny, 6- -etylo-7-etoksy-4-hydroksykumaryny, 6-n-propylo- -7-etoksy-4-hydroksykumaryny, 6-metylo-7-n-pro- poksy-4-hydroksykumaryny,1 6-etylo-7-n-propoksy- -4-hydroksykumaryny i 6-n-propylo-7-n-propoksy- -4 hydroksykumaryny, otrzymuje sie nastepujace zwiazki: 6-metylo-7-etoksy-4-hydroksy-3-nitroku- maryne, 6-etylo-7-etoksy-4-hydroksy-3-nitrokuma- ryne, 6-n-propylo-7-etoksy-4-hydroksy-3-nitrokii- maryne, 6-metylo-7-n-propoksy-4-hydroksy-3-nitro- kumaryne, 6-etylo-7-n-propoksy-4-hydroksy-3-ni- trokumaryne i 6-n-propylo-7-n-propoksy-4-hydrok- sy-3-nitrokumaryne.Przyklad XII. Niektóre 4-hydroksykumaryny otrzymane zgodnie z poprzednimi przykladami ba¬ da sie wedlug opisanego ponizej pasywnego testu skórnego na nadczulosc (test PCA). Zwiazki te podaje sie w postaci ich soli sodowych albo w bu¬ forze fosforanowych o pH 7,2 (dla soli rozpusz¬ czalnych) lub jako zawiesine w 1%-owej metylo- celulozie (dla soli nierozpuszczalnych). i) Sposobem podobnym do opisanego przez No¬ ta^ (I. Mota Immunology 7 (1964) zwieksza sie po¬ ziom surowicy zawierajacej termicznie nietrwale przeciwciala homocytotropowe u szczurów.Samcom szczurów (Wistar) o wadze 250—300 g wstrzykuje sie dootrzewnowo 0,5 ml szczepionki Bordatella pertussis zawierajacej 4X1010 niezywych organizmów na mililitr i podskórnie 0,5 ml emul¬ sji 100 mg emulsji 100 mg ewalbuminy w 2 ml soli fizjologicznej i 3 ml niecalkowitego dodatku 40 45 50 55 Wyniki badan biologicznych Przyklad I wzór 4 Przyklad II wzór 5 Przyklad III wzór 6 Przyklad IV wzór 7 Przyklad V wzór 8 Przyklad VI wzór 9 Przyklad VII wzór 10 Przyklad VIII wzór 11 Przyklad IX wzór 12 Przyklad X wzór 13 dawka mg/kg 100 100 100 100 100 J00 100 100 100 100 100 100 100 1 ioo 100 50 czas (minuty) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 60 0 0 60 60 0 0 0 0 60 60 0 0 % zahamo¬ wania re¬ akcji PCA 12 48 18 37 61 93 90 < 100 45 59. 88 63 19 17 73 74 38 34 45 11 40 81 41 1 82 3© —1 8 19 22 47 76 ^ 38 ' 31. 65 Freunds'm. Szczurom pobiera sie krew przez na¬ klucie sercowe w 18-tym dniu i krew zbiera sie, rozdziela oraz surowice przechowuje sie w tempe¬ raturze —20°C i odmraza sie tylko raz' przed uzy¬ ciem.96047 9 10 ii) Test PCA jest podobny do opisanego przez Ovary'ego i Bier'a (A. Ovary i O.E. Bier, Prod.Soc. Exp. Biol. Med. 81, 584 (1952) i Goose'a i Bla¬ ira (J. Goose i A.M.J.H. Blair, Immunology 16 769 1969).Samcom szczurów (Wistar) o ciezarze 250—350 g wstrzykuje sie podskórnie w oddzielnych miej¬ scach na ogolonej powierzchni grzbietowej 0,1 ml kazdego z szesciu dwukrotnie rozcienczanych roz¬ tworów w surowicy w 0,9%-owej soli fizjologicz¬ nej. Po uplywie 72 godzin zwierzeta bada sie przez wstrzykniecie 0,3 ml 1%-owej owalbuminy zmie¬ szanej z 0,1 ml 5%-owego roztworu pontaminy (blekitno-niebieski barwnik) w izotonicznym roz¬ tworze soli fizjologicznej buforowanym do pH 7,2 przy uzyciu buforu Sorenson'a (PBS).Szczury usmierca sie po 20 minutach i mierzy sie srednica niebieskich prag w miejscach wstrzy¬ kniecia przeciwciala. Wyjsciowy roztwór surowicy tak sie dobiera aby nie bylo reakcji po próbie w miejscu wstrzykniecia roztworu o najmniejszym stezeniu oraz aby maksymalna reakcje uzyskiwac przy dwóch lub trzech najmniejszych rozciencze- niach. Zazwyczaj stosuje sie szesc dwukrotnych rozcienczen surowicy 1/4 do 1/128.Zwiazki bada sie ha ich zdolnosc zmniejszania srednicy preg w miejscach wstrzykniecia rozcien¬ czonych roztworów przeciwciala, które we wszy¬ stkich próbach kontrolnych daja reakcje mniejsza od maksymalnej.,Zwiazki te wstrzykuje sie szczu¬ rom podskórnie w obszarze karkowym w postaci roztworu w PBS lub jako zawiesine w 12-owej metylocelulozie dana ilosc wstrzykuje sie kazdej badanej grupie 6 zwierzat w okreslonym czasie przed wprowadzeniem owalbuminy. Srednice nie¬ bieskich preg, które rozwijaja sie na zwierzetach porównuje sie z pregami na zwierzetach kontrol¬ nych (6 szczurów w kazdej grupie) potraktowanych tak samo jak zwierzeta testowe, lecz wstrzykuje im sie podskórnie równowazna ilosc cieklego nos¬ nika w takiej samej objetosci lecz niezawieraja- cego badanego zwiazku. % zahamowania PCA = 100 (1— £) a — srednica sumy srednic preg uzyskiwanych w grupie zwierzat testowych w tym miejscach wstrzykniecia przeciwciala, w których wszystkie zwierzeta grupy kontrolnej wykazuja reakcje mniejsza nizmaksymalna. \/ b — srednica sum srednic preg uzyskiwanych w grupie zwierzat kontrolnych w tych miejscach wstrzykniecia przeciwciala, w których wszystkie zwierzeta tej grupy wykazuja reakcje mniejsza niz maksymalna. .Zalecana postacia zwiazków do podawania jest roztwór w buforze o pH = 7,2 i zobojetniony kwa¬ snym weglanem sodowym. W przypadku zwiazków dajacych nierozpuszczalne sole sodowe, sole te wydziela sie na drodze reakcji wolnego zwiazku nitrowego z 2,5 n roztworem wodorotlenku sodo¬ wego i z odsaczonej soli sodowej lug wymywa sie woda. Wysuszone sole podaje sie w postaci zawie¬ siny w 1%-owej metylocelulozie. PL