PL92081B1

PL92081B1 -

Info

Publication number: PL92081B1
Application number: PL16218573A
Authority: PL
Priority date: 1972-04-27
Filing date: 1973-04-27
Publication date: 1977-03-31
Also published as: YU41698B; YU54980A

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-lizyny na drodze fermentacji.

L-iizyna jest niezbedna w zywieniu ludzi i . zwierzat i ma szerokie zastosowanie jako skladnik, wzbogacaja¬ cy pokarmy i pasze. Znane jest wytwarzanie L-lizyny na drodze fermentacji weglowodanów za pomoca bakterii trzech typów. Pierwszym z nich jest znany z opisu patentowego St.Zj.Am. nr 2979439 szczep Micrococcus glutamicus, który dla wzrostu wymaga aminokwasów odpowiednich do biosyntezy L-lizyny, takich jak homoseryna. Drugi typ stanowia znane z francuskiego opisu patentowego nr 1533688 szczepy bakterii, wrazliwe na treonine albo metionine, szczepy, wrazliwe na treonine i szczepy, wymagajace treoniny. Ich wzrost, za wyjatkiem ostatniego z wymienionych, jest hamowany przez niskie stezenie treoniny i bez wyjatku przez niskie stezenie metioniny. Trzeci typ stanowi szczep znany z opisu patentowego St Zj. Amer. nr 3707441, odporny na S-!2-aminoetylo)-L-cysteine, bedacy siarkowa pochodna L-lizyny i nazywana dalej w skrócie AEC.

Stwierdzono, ze szczepy bakterii, odporne na zahamowanie odtwarzania lizyny i jej analogów, a równoczes¬ nie wykazujace zapotrzebowanie na co najmniej jeden z takich skladników odzywczych, jak seryna, prolina, alanina, amid kwasu nikotynowego, kwas pantotenowy, tiamina, guanina, hypoksantyna i witamina Bi2, hodowane w odpowiednim srodowisku, zawierajacym zródla przyswajalnego wegla i azotu oraz skladniki mineralne, wytwarzaja L-lizyne z wysoka wydajnoscia.

Zgodnie z wynalazkiem, do wytwarzania L-lizyny stosuje sie nowe szczepy o wyzej podanych cechach, otrzymywane znanymi sposobami ze znanych szczepów macierzystych nalezacych do gatunku Brevibacterium a mianowicie: szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 21798, wymagajacy seryny i odporny na AEC, szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799, wymagajacy kwasu pantotenowego i odporny na AEC,2 92 081 szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 21800, wymagajacy tiaminy i odporny na AEC, szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 21801, wymagajacy adeniny lub guaniny I odporny na AEC, szczep Brevibacterium lactofermentum FERM P-1711, wymagajacy alaniny I odporny na AEC, szczep Brevibacterium lactofermentum FERM P-1712, wymagajacy alanlnylub walinyi odporny na AEC, szczep Brevlbacterlum lactofermentum FERM P-1857, wymagajacy alaniny i leucyny. a odporny na AEC, szczep BreVlbiCterium lactofermentum FERM P-1570, wymagajacy prollny i odporny na AEC, szczep Brtyibacterium lactofermentum FERM P-1573, wymagajacy witaminy B42 i odporny na AEC, szczep Brevlbacterlum lactofermentum FERM P-1674, wymagajacy amidu kwasu nikotynowego i odporny na AEC, szczep Brevibacterium lactofermentum FERM P-1575, wymagajacy hypoksantyny i odporny na AEC- szczep BreVlbacterium lactofermentum FERM P—1571, wymagajacy amidu kwasu nikotynowego i leucyny, a odporny na AEC i szczep Brevib*cterium lactofermentum FERM P-1572, wymagajacy seryny i leucyny, a odporny na AEC.

Proces wytwarzania L-lizny zgodnie z wynalazkiem prowadzi sie w ten sposób, ze jeden z podanych wyzej nowych szczepów poddaje sie hodowli w warunkach aerobówych, przy wartosci pH = 5-9, w pozywce zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu uzytego mikroorganizmu i organiczne substancje, wzmagajace wzrost. Fermentacje prowadzi sie korzystnie w temperatu¬ rze 24-37°Cr wciagu 24-98 godzin, stosujac wytrzasanie lub napowietrzanie i mieszanie. Gdy wartosc pH pozywki jest mniejsze niz 5, podwyzsza sie ja przez dodawanie substancji zobojetniajacych, takich jak weglan wapia lub wodny roztwór amoniaku, a jezeli wartosc pH jest za wysoka, to stosuje sie dodatek kwasów, np. kwasu tolnego lub siarkowego.

Z brzeczki hodowlanej wyosabnla sie lizyne znanymi sposobami, np. przez odsaczanie lub odwirowywanie stalych czesci komórek i traktowanie przesaczu zywica kationowymlenna. Otrzymana L-lizyne identyfikuje sie na podstawie widma w podczerwieni, metoda chromatografii bibulowej, elektroforezy, prób z mikroorganizmami lub prób zdekarboksylaza. * Sklad pozywki fermentacyjne] oraz sposób hodowania jest znany, stosowany zazwyczaj przy fermentacji aminokwasów, jak równiez moga byc stosowane znane pozywki do wytwarzania lizyny na drodze fermentacji.

Takwiec do hodowli szczepów, stosowanych w sposobie wedlug wynalazku, nadaja sie pozywki syntetyczne, jak i z naturalnych srodków odzywczych, pod warunkiem, ze zawieraja zasadnicze substancje odzywcze niezbedne dla wzrostu zastosowanego szczepu. Te srodki odzywcze sa dobrze znane, a mianowicie sa to zródla wegla, zródla azotu i,zwiazki nieorganiczne, które sa wykorzystywane przez zastosowany mikroorganizm w odpowied¬ nich Ilosciach. < Przykladami zródla wegla sa weglowodany, takie jak glikoza, fruktoza, maltoza, sacharoza, skrobia, produkt hydrolizy skrobi, melasa lub inne zródla wegla, takie jak kwasy organiczne, na przyklad kwas octowy, proplonowy, fumarowy itd. organiczne zwiazki chemiczne, na przyklad kwas benzoesowy lub alkohole, takje jak na przyklad metanol i etanol. Wymienione substancje moga byc stosowane oddzielnie lub w mieszaninie.

W zaleznosci ód zdolnosci przyswajania zastosowanego mikroorganizmu, jako zródlo wegla stosuje sie weglowodory w minimalnej lub maksymalnej ilosci.

Jako zródlo azotu stosuje sie rózne rodzaje nieorganicznych lub organicznych soli lub zwiazków, takich jak mocznik lub sole amonowe, np. chlorek amonu, siarczan amonu, azotan amonu, fosforan amonu, albo jeden iub wiecej aminokwasów, albo substancje naturalne, zawierajace azot, takie jak wyciag z kielków kukurydzy, wyciag Z drozdzy, wyciag z miesa, maczka rybna, pepton, bulion, produkty hydrolizy kazeiny, wyciag z otrebów ryzowych itd. Substancje te równiez mozna stosowac oddzielnie lub w mieszaninie.

Jako zwiazki nieorganiczne do pozywek hodowlanych dodaje sie siarczan magnezu fosforan sodu, dwuwodoroortofosforan potasowy, jednowodoroortofosforan potasowy, siarczan zelaza lub inne sole zelaza,, chlorek manganu, chlorek wapnia chlorek sodu itp.

Pozywka hodowlana powinna zawierac srodki odzywcze i inne substancje, konieczne do wzrostu szczepu.

Srodkami, pobudzajacymi wzrost oraz srodkami odzywczymi poprawiajacymi wydajnosc wytwrzania L-lizyny, sa aminokwasy, na przyklad sery na, prolina, alanina, leucyna, rózne witaminy, takie jak witamina B12, tiamina, kwas pantotenowy, amid kwasu nikotynowego lub kwas nikotynowy, zasady purynowe, takie jak guanina,92 081 3 adenina i hypoksantyna, produkt hydrolizy proteiny sojowej wyciag z drozdzy, wyciag z kielków kukurydzy, pepton, produkt hydrolizy kazeiny.

Wazna rzecza jest ograniczenie ilosci wymaganych aminokwasów i innych srodków odzywczych do ilosci mniejszej niz optimum stezenia dla wzrostu danego szczepu mikroorganizmu, co stosuje sie zazwyczaj przy fermentacjach aminokwasów.

Zaleta procesu, prowadzonego sposobem wedlug wynalazku, w porównaniu ze znanymi sposobami jest to, ze dzieki zastosowaniu nowych szczepów o podanej wyzej charakterystyce mozna wytwarzac L-lizyne z wyzsza wydajnoscia, przy czym dzieki odpornosci tych szczepów na analogi lizyny wydajnosc ta jest w nieznacznym tylko stopniu zalezna on wahan zawartosci treoniny i innych skladników odzywczych w pozywce. Szczepy, stosowane zgodnie z wynalazkiem, wytwarza sie znana metoda odsiewu lub metoda indukowania sztucznych mutantów. W nizej podanych doswiadczeniach opisano przyklady tych sposobów.

Doswiadczenie 1. Szczepy wykazujace zapotrzebowanie na rózne substancje odzywcze wyodrebnia sie metoda powtórzeniowa z kolonii na plytce agarowej, na której hodowano w temperaturze 31°C wciagu 4—10 dni komórki mikroorganizmów, otrzymane przez naswietlanie szczepu Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 promieniami Roentgena. Zapotrzebowanie otrzymanych mutantów na srodki odzywcze okreslano znanymi metodami. Otrzymano miedzy innymi 4 szczepy, a mianowicie mutanty, wykazujace zapotrzebowanie na seryne, kwas pantotenowy, tiamine i guanine (lub adenine).

Te 4 szczepy traktowano 200 jug/ml nitrozoguanidyny w temperaturze 30°C w ciagu 30 minut, a nastepnie szczepiono na plytkach agarowych, zawierajacych 2 g/dl glukozy, 0,3 g/dl mocznika, wymagana substancje, to jest 30 mg/dl seryny, 10 mg/litr pehtotenianu wapnia, 100 mg/litr adeniny oraz 0,5 g/dl treoniny, 0,1 g/dl KH2P04 0,04 g/dl MgS04 7H20, 2 ppm Fe*, 2 ppm Mn*, 50 jug/litr biotyny, 100 /Lig/litr tiaminy, 500 jug/ml AEC i 2 g/dl agaru o wartosci pH -» 7 i poddawano hodowli w temperaturze 31°C w ciagu 4-10 dni.

Przy badaniu zdolnosci wytwarzania L-lizyny przez szczepy izolowane z kolonii, wystepujacych w wyzej wymienionych hodowlanych na plytkach, stwierdzono, ze sa 4 nastepujace szczepy, wytwarzajace duze ilosci L-lizyny: Brevibacterium lactofermentum ATCC 21796 (AEC y + Ser~) Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799 (AEC 7 + kwas pantotenowy") Brevibacterium lactofermentum ATCC 21800 (AEC y + tiamina~) Brevibacterium lactofermentum ATCC 21801 (AEC y + adenina- lub guanina-' • Wzrost tych 4 szczepów w minimalnej pozywce i z minimalna pozywka, dodawana z wymaganymi srodka¬ mi odzywczymi, badano w sposób nastepujacy.

Wytwarza sie minimalna pozywke o wartosci pH - 7,2, zawierajaca 2 g/dl glukozy, 1 g/dl siarczanu amonowego, 0,3 g/dl mocznika, 0,1 g/dl KH2P04, 0,04 g/dl MgS04 7H20, 2 ppm jonów Fe i Mn, 50 /ig/Htr biotyny i 200 A-ig/litr chlorowodorku tiaminy. Do pozywki dodaje sie 30 mg/dl kazdego z wymienionych w tablicy 1 aminokwasów, 10 mg/litr pantotenianu wapnia lub 100 mg/litr adeniny i mieszajac hoduje sie mutanty szczepów w temperaturze 31 °C wciagu 24 godzin. Brzeczke hodowlana rozciencza sie 26-krotnie w stosunku do pierwotnej objetosci i oznacza wlasciwa gestosc optyczna przez pomiar absorbcji swiatla przy dlugosci fali 562milimikronów. < Wyniki podano w tablicy 1. ^v.',i:j: -, ; \; iOD) Gestosc optyczna (OD) przy hodowli minimalnej pozywki Szczep z dodatkiem bez dodatku srodka odzywczego BreYibacterium lactofermentum ATCC 13869 BreYibacterium lactofermentum ATCC 21798 BreYibacterium lactofermentum ATCC 21799 BreYibacterium lactofermentum ATCC 21800 BreYibacterium lactofermentum ATCC 21801 •Tiamina zostala wylaczona z minimalnej pozywki 0,400 0,065 seryna 0.410 0,059 pantotenian wapnia 0.405 0,380 0,075* 0,052 adenina 0.3754 92 081 Doswiadczenie II. Brevibecterium lactofermentum ATCC 13869 traktuje sie 250 jug/rnl nitrozoguanidyny w temperaturze 30°C wciagu 30 minut i zaszczepia na plytce agarowej, zawierajacej 2 g/dl glukozy, 0,3 g/dl mocznika, 1 g/dl (NH4)aS04, 0,6 g/dl treoniny, 0,1 g/dl KH2P04, 0,04 g/dl MgS04 • 7H20, 2 ppm jonów Fe i Mn, 60jUg/lltr biotyny, 200/ug/litr chlorowodorku tiaminy, 5 mg/ml AEC i 2 g/dl agaru i hoduje w temperaturze 31°C wciagu 4-10dni. przy wartosci pH « 7. Szczepy wyodrebnia sie z kazdej kolonii, wystepujacej w hodowli ni plytce. Sa to uczepy odporne na AEC i sposród nich wyodrebnia sie mutanty, zdolne do wytwarzania L-lizyny, przez badanie zdolnosci jej wytwarzania przez kazdy szczep.

Mutant odporny na AEC, lecz nie zawierajacy wymaganych srodków odzywczych, traktuje sie ponownie 250 Mfl/rnl nitrozoguanidyny w temperaturze 30° C wciagu 30 minut. Nastepnie wyodrebnia sie muntanty, zdolne do wytwarzania duzej Ilosci L-lizyny. Sa to mutanty odporne na AEC. Zapotrzebowanie na srodki odzywcze wyodrebnionych mutantów oznacza sie znanymi metodami. Otrzymano 6 nastepujacych szczepów: BriVfb*ct#rlum lactofermentum FERM P-1670 (AEC + Pro-) Brtvibect$rlum lactofermentum PERM P—1571 (AEC + nikotynoamid~-Leu~) BreWbacterlum iaotofermtntum FERM P-1572 (AEC + Ser" + Leu~) Brevib«ctarium lactofermentum FERM P-1573 (AEC + witamina B12"~) Brevibioterium lactofermentum FERM P-1674 (AEC + nikotynoamid") Breyfbacterlum lactofermentum FERM P-1676 (AEC + hypoksantyna-).

Zapotrzebowanie na srodki odzywcze tych szczepów potwierdzono przez badanie ich wzrostu w ten sposób, ze przygotowuje sie minimalna pozywke, zawierajaca 2% glukozy, 0,3% mocznika, 1% NH4/2S04,0,1% KHaP04, 0,04% Mg304 • 7HaO, 2 ppm Fe*\ 2 ppm Mn", 50 Mg/l biotyny i 200/ig/l chlorowodorku tiaminy, o wartosci pH m 7,2 i porcje po 3 ml otrzymanej pozywki, lacznie z kazdym wymienionym w tablicy 2 wymaganym srodkiem odzywczym, zaszczepia sie za pomoca kazdego szczepu, hodowanego uprzednio na skosie bulionowym i hoduje w temperaturze 31°C wciagu 24 godzin, stosujac napowietrzanie i mieszanie. Brzeczke hodowlana rozciencza sie 26-krotnie w stosunku do pierwotnej objetosci i oznacza wlaswica gestosc optyczna przez pomiar absorpcji swiatla przy 562 rnjU- Wyniki podno w tablicy 2.

Szczep ATCC 13869 FERM P-1670 FERM P-1571 FERM P-1 572 FERM P-1573 FERM P-1574 FERM P-1575 Tabl Ica 2 Wzrost (OD) Minimalna pozywka 0,40 0,058 0,057 0,052 0,058 0,055 0,059 Minimalna pozywka z dodatkiem srodka odzywczego 0,440 (40 mg/dl proliny) 0,420 (0,5 mg/dl nikotynoamidu + 40 mg/dl leucyny) 0,460 (50 mg/dl seryny + 40 mg/dl leucyny 0,390 (10Mg/dl witaminy Bl2) 0,430 (1 mg/dl nikotynoamidu) 0,420 (5 mg/dl hypoksantyny) Doswiadczenie III. Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 traktuje sie 250/ig/ml nitrozoguanidyny w temperaturze 30°C w ciagu 30 minut i zaszczepia sie na plytce agarowej, zawierajacej 2 g/dl glukozy, 0,3 g/dl mocznika, 1 g/dl (NH4/2S04, 0,4 g/dl treoniny, 0,1 g/dl KHaP04, 0,04 g/dl MgS04 • 7H20, 2 ppm jonów Fe i Mn, 50 Mg/litr biotyny, 100 /ig/litr chlorowodorku tiaminy, 4 mg/ml AEC i 2 g/dl agaru i przy wartosci pH = 7 hoduje w temperaturze 31°C wciagu 4-10 dni. Z kazdej kolonii, wystepujacej w hodowli na plytce jako szczep odporny na AEC, wyodrebnia sie szczep, którego mutanty sa zdolne do wytwarzania L-lizyny i bada zdolnosc jej wytwarzania w sposób wyzej opisany. Otrzymany szczep nr 872, wykazujacy odpornosc na AEC i nie wykazuja¬ cy zapotrzebowania na srodki odzywcze, traktuje sie ponownie 250 /ig/ml nitrozoguanidyny w temperaturze °C, wciagu 30 minut, a nastepnie wyodrebnia mutanty, zdolne do wytwarzania duzej ilosci L-lizyny Zapotrzebowanie na skladniki odzywcze wyodrebnionych mutantów oznacza sie znanymi metodami.

Jako mutanty dobrze wytwarzajace L-lizyne, wykazujace zapotrzebowanie na alanine, alanine, lub waline i odpornosc na AEC, otrzymano nastepujace mutanty szczepów:92 081 5 Brevsb3Cterium lactorermentum FERM P-1711 (AEC7 + Ala-) Brevibacterium lactof ermeritum FERM P—1712 (AEC7 + Ala~~lub Wal") Mutant szczepu FERM P—1711 traktuje sie ponownie nitrozoguanidyna w sposób wyzej opisany i otrzy¬ muje szczep FERM P—1857, wykazujacy odpornosc na AEC i zapotrzebowanie na alanine i leucyne, równiez dobrze wytwarzajacy L-lizyne.

Zapotrzebowanie na srodki odzywcze wymienionych trzech szczepów potwierdzaja nastepujace badania ich wzrostu. Przygotowuje sie minimalna pozywke, zawierajaca 2% glukozy, 0,3% mocznika, 1% (NH412SO4, 0,1 KH2P04, 0,04% MgS04 ¦ 7H20, 0,05% NaC!f 2 ppm Fe+\ 2 ppm Mn*\ 50 Mg/litr biotyny i 200 //g/litr chlorowodorku tiaminy, majaca wartosc pH = 7,0.

Przygotowuje sie zawiesiny 3 szczepów przez dodanie do 6 ml tej pozywki komórek mikrobowych kazdego szczepu, hodowanego uprzednio w skosie bulionowym w temperaturze 31°C wciagu 24 godzin. Stezenie komórek mikrobowych (OD) w kazdej zawiesinie wynosi 0,250 dla szczepu FERM P- 1711 10,295 dla FERM P-1712.

Porcje po 3 ml minimalnej pozywki z dodatkiem substancji odzywczych, wymienionych w tablicach 3 i 4, zaszczepia sie za pomoca 0,1 ml przygotowanych zawiesin i hoduje w temperaturze 31°C wciagu 24 godzin, stosujac napowietrzanie i mieszanie. Brzeczke hodowlana rozciencza sie 26-krotnie w stosunku do pierwotnej objetosci I oznacza wlasciwa gestosc optyczna przez pomiar absorpcji swiatla przy dlugosci fali 562 milimikro- ny. Wyniki podano w tablicach 3 i 4.

Dodany srodek odzywczy brak L-alanina D-alanina Walina Nikotynoamld Treonlne Metionina L*lenIna NlkotynoamW Dzianina NikotynoamkJ Walanina NfkotynoamkJ Stezanie mg/dl — 50 50 50 0,5 50 50 50 0,5 60 0,5 50 0,6 Tablica 3 FERM P- 0,027 0,185 0,155 0,058 0,045 0,022 0,425 0,510 - 1711 0,025* 0.152 0,162 0.080 0,037 0,020 0,460 0,480 - Wzrost (OD) FERMP- 0,068 0,170 0,236 0.160 0,066 0,072 0,238 0,348 0.312 -1712 0,070 0,176 0.250 0,210 0,071 0,076 0,251 0,341 0,323 Zamiast nlkotynoamidu mozna stosowac kwas nikotynowy.

Tablica 4 Dodane srodki odzywcze Dla szczepu AJ-3429 wzrost (OD) Brak Alanina Leucyna Alanina i Leucyna Alanina+leucyne+nikotynoamid Alanina+leucyna+nikotynoamid +treonina+metionina 0,030 0,031 0,032 0,180 0,460 0,435 0,036 0,033 0,033 0.176 0,480 0,4456 92 081 Stezenie dodanych srodków odzywczych wynosilo 50 mg/dl dla kazdego aminokwasu i 5 mg/dl dla nikotynoamldu. Ponizsze przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku.

Przyklad I. Przygotowuje sie pozywke hodowlana zawierajaca 10 g/dl glukozy, 5 g /dl (NH4 )2S04, 0r1 g/dl KH2P04, 0,04 g/dl MgS04 • 7H20, 2 ppm jonów zelaza i Mn, 50 jug/l chlorowodorku tianiny, 50/ig/l biotyny, 1,5 ml/dl produktu hydrolizy proteiny soi (o calkowitej zawartosci azotu 7%) i 5 g/dl weglanu wapnia, majaca wartosc pH * 7,2, 20 ml tej pozywki umieszcza sie we wstrzasanych butelkach o pojemnosci 500 ml i sterylizuje. Szczepy, wymienione w tablicy 6, zaszczepia sie na pozywce i hoduje w temperaturze 31°C w ciagu 72 godzin, wstrzasajac. Ilosci wytworzonej L-lizyny w postaci chlorowodorku podano w tablicy 5.

Tablica 5 Ilosc wytworzonej L-lizyny Szczep (g/dl) Brevlbacterlum lactofermentum (FERM P-1443) ATCC21798) 4,1 Brevlbacteri'jm lactofermentum (FERM P-1444) ATCC21799 2,5 Brevibacterium Lactofermentum (FERM P-1445) ATCC21800 3,0 Brevibacterlum lactofermentum (FERM P-1446) ATCC21801 2,8 Pozywki hodowlane dla drugiego i czwartego szczepu zawieraja OJ mg/ml metioniny, 5 mg/ml pantotenia- nu wapnia i 100 mg/litr adeniny I guanlny.

Komórki bakteryjne i stale sole wapniowe oddziela sie z brzeczki hodowlanej przez odwirowanie. Jeden litr cieczy sklarowanej nad osadem wprowadza sie na kolumne wypelniona silna kationowymienna zywica (Amberlite IR—120 typ jon wodorowy: Brand Name), L-lizyne, zaadsorbowana na zywicy, eluuje sie 3% wodnym roztworem amoniaku. Eluant zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem i do zatezonego roztworu dodaje sie kwasu solnego. Po ochlodzeniu roztworu lodem otrzymuje sie krysztaly surowego dwuwodnego chlorowodorku L-lizyny w ilosci 30,2 g.

Przyklad II. Brevibaoterium lactofermentum ATCC 21798, ATCC 21799; ATCC 21800 i ATCC 21801 zaszczepia sie na pozywce hodowlanej, zawierajacej 1,5 g/dl glukozy, 0,3 g/dl octanu amonu, 0,1 g/dl KH2P04, 0,04 g/dl Mg804 ' ^jOr 2 ppm jonów Fe i MN, 50 /ag/litr blotyny, 200 Mg/litr chlorowodorku tiaminy, 1,5 mi/dl produktu hydrolizy proteiny soi o calkowitej zawartosci azotu 7%) i 0,5 g/dl wyciagu z drozdzy, majacej wartosc pH - 8 i hoduje w temperaturze 31 °C wciagu 16 godzin, stosujac mieszanie i napowietrzanie.

Po 16 ml kazdej t tych hodowli dodaje sie do 300 ml glównej pozywki hodowlanej o wartosci pH - 7,5, zawierajacej 3 g/dl glukozy, 0,6 g/dl octanu amonu, 0,2 g/dl mocznika, OJ g/dl KH2P04, 0f04 ^g/dl MgS04 • 7H30, 2 ppm jonów Fe i Mn, 50 /ig/l biotyny, 50 Mfl/1 chlorowodorku tiaminy, 3 ml/di produktu hydrolizy proteiny soi oraz srodki odzywcze, wymienione w tablicy 6, i hoduje w temperaturze 31,5°C, stosujac mieszanie 1600 obrotów/minute oraz wprowadzajac równa objetosciowo ilosc powietrza na minute. Wartosc pH W Czasie hodowania utrzymuje sie na poziomie 7,2—6 przez automatyczne dodawanie mieszaniny kwasu octowego i octanu amonu, zawierajacej 0,25 mola octanu amonu na 1 mol kwasu octowego i w której stezenie kwasu octowego wynosi 60%.

Po 48 godzinach hodowania w brzeczce hodowlanej kazdego szczepu otrzymuje sie 4,8-6,4 g/dl Chlorowodorku L-Nzyny, co przedstawiono w tablicy 6.92 031 7 Tablica 6 Szczep ATCC21798 ATCC 21799 ATCC 21800 ATCC 21801 Dodany srodek odzywczy (mg/l) _ pentotenian wapnia : 5 ~ adenina: 100 i guanina: 100 I losc wytworzonej L-lizyny (g/dl) 6,4 4,8 ,7 6,0 Przyklad Ml. Szczepy Brevibacterium lactofermentum ATCC 21798 ATCC 21799, ATCC 21800 i ATCC 21801 hoduje sie w temperaturze ,31,5°C wciagu 16 godzin, stosuje wstrzasanie, na pozywce hodowlanej, zawierajacej 1,5 g/di glukozy, 0,3 g/dl mocznika, 0,1 g/dl KH2P04, 0,04 g/dl MgS04 • 7H20,2ppm jonów Fe i Mn, 50jug/litr biotyny, 200/ig/litr chlorowodorku tiaminy, 1,5 ml/dl produktu hydrolizy proteiny soi i 0,5 g/dl wyciagu z drozdzy.

Wartosc pH pozywki wynosi 8,0. Po 15 ml kazdej z tych hodowli dodaje sie do 300 ml glównej pozywki hodowlanej, zawierajacej: glikoza 1 g/dl etanol 1,5 g/dl • (NH4/2S04 0,5 g/dl mocznik 0,2 g/dl KH2P04 0,1 g/dl MgS04 -7H20 0,04 g/dl Fe*4 2ppm Mn** 2 ppm blotyna 50jUfl/' witamina Bi • HCI 50jtig/l produkt hydrolizy bialka soi (calkowita zawartosc azotu: 7%) 3 ml/dl srodki odzywcze wedlug tablicy 7 Wartosc pH tej pozywki wynosi 7,5. Hodowle prowadzi sie w temperaturze 31,5°C, stosujac mieszanie z szybkoscia 1600 obrotów na minute i wprowadzajac równo objetosciowa w stosunku do objetosci pozywki Ilosc powietrza.

W czasie fermentacji utrzymuje sie wartosc pH pozywki 7—7,5 przez wprowadzanie gazowego amoniaku.

Mosc pozostalego etanolu okresla sie za pomoca gazowej chromatografii i gdy ilosc ta maleje do okolo 0,3 g/dl, do pozywki dodaje sie etanolu. Po 48 godzinach w brzeczce hodowlanej kazdego szczepu znajduje sie chlorowodorek L-lizyny w ilosciach, podanych w tablicy 7.

Szczep ATCC 21798 ATCC 21799 ATCC 21800 ATCC 21801 Tabl ica 7 Dodany srodek odzywczy (mg/litr) __ pantotenian wapnia: 5 - adenina: 100 i guanina : 100 Ilosc wytworzonej L-lizyny (g/dl) ,5 4,4 ,5 ,78 92 081 Pr zy klad IV. Szczepy Brevibacterium lactofermentum FERM P-1570, FERM P-1571, FERM P-1572, FERM P-1673, FERM P-1574 i FERM P-1576 hoduje sie w sposób, opisany w przykladzie I, z ta róznica, ie dodaje sie produkt hydrolizy proteiny soi w ilosciach, podanych w tablicy 8 i 5 rng/dl hypoksantyny dodaje sie do pozywki dla szczepu FERM P-1575.

Po 72 godzinach hodowania w brzeczce hodowlanej kazdego szczepu otrzymuje sie chlorowodorek L-llzyny w ilosciach, podanych w tablicy 8.

Szczep FERM P-1670 FERM-P-1571 FERM P-1572 FERM P-1573 FERM P-1574 FERM P-1575 Tablica 8 I loic produktu hydrolizy bialka soi (%) • 3 1.5 1,5 3 2 3 I losc wytworzonej L-lizyny (g/dl) 2,9 ,0 ,6 3,5 3,1 3,0 Przyklad V. Szczepy Brevibacterium lactofermentum FERM P-1570, FERM P-1571, FERM P-1572, FERM-1573, FERM P-1574 i FERM P-1575 hoduje sie w sposób, opisanyw przykladzie II, stosujac jako glówne zródlo wegla kwas octowy i z ta. róznica, ze do pozywki dla szczepu FERM P-1575 dodaje sie 5 mg/ml hypoksantyny.

Po 48 godzinach hodowania w brzeczce hodowlanej kazdego szczepu otrzymuje sie chlorowodorek L-lizyny w ilosciach, podanych w tablicy 9.

Po 48 godzinach hodowania szczepu FERM P-1571 w sposób wyzej podany, zostaje zuzyte 30% objetosciowych kwasu octowego w stosunku do pierwotne] objetosci pozywki. Brzeczka hodowlana zawiera 7,1 g/dl chlorowodorku L-lizyny. Z jednego litra bulionu w sposób opisany w przykladzie I, otrzymano 56,3 g dwuwodnego chlorowodorku L-lizyny.

Tablica 9 Szczep FERM P-1570 FERM P-1571 FERM P-1572 FERM P-1573 FERM P-1574 FERM.P-1575 Dodatek hypoksantyny (mg/dl) * - - - - I losc wytworzonej L-lizyny (g/dl) SA 7,1 7,0 6,5 ,8 6,1 Przyklad VI. Szczepy Brevibacterium Lactofermentum podane w przykladzie V, hoduje sie, stosujac etanol jako glówne zródlo wegla w sposób opisany w przykladzie III, z ta róznica, ze do pozywki dla szczepu FERM P—1575 dodaje sie 5 mg/ml hypoksantyny.

Po 48 godzinach hodowli otrzymuje sie chlorowodorek L-lizyny w ilosciach, podanych w tablicy 10. Jak widac z tablicy 10, po 48 godzinach hodowli otrzymuje sie 6,3 g chlorowodorku L-lizyny (27,7% wydajnosci w stosunku do etanolu), a z 1 litra bulionu hodowlanego przy prowadzeniu procesu w sposób opisany w przykla¬ dzie I, otrzymuje sie 50,4 g dwuwodnego chlorowodorku L-lizyny.92 081 Tablica 10 Szczep FERM P-1570 FERMP-1571 FERM P-1572 FERM P-1573 FERM P-1574 FERM P-1575 Dodatek hypoksantyny (mg/dl) _ - - - " - ¦ 5 Ilosc wytworzonej L-lizyny — -A- (g/dl) ,2 6,3 6,5 6,1 ,0 ,5 Przyklad VII. Szczepy Brevlbacterium lactofermentum FERM P—1711 r FERM P-1712, I nr 872 (kontrolny) hoduje sie W sposób, opisany w przykladzie I, z ta róznica, ze do pozywki dodaje sie 200 /ig/Iitr chlorowodorku tiaminy i dla szczepu FERM P—1712 dodaje sie 3% produktu hydrolizy proteiny soi.

Po 72 godzinach hodowli otrzymuje sie chlorowodorek L-lizyny w ilosciach, podanych w tablicy 11.

Szczep FERM P-1711 f^RM P-1712 Nr 872 Tabl Ica 11 I losc wytworzonej L- (g/dl) 4,4 3,2 1,8 lizyny Wydajnosc • w stosunku do glikozy (%) 44 32 18 Przyklad VIII. Szczepy Brevibacterium lactofermentum FERM P—1711, FERM P—1712 i nr 872 (kontrolny), zaszczepia sie na pozywce o skladzie nizej podanym i nastepnie hoduje w temperaturze 31°C w ciagu 18 godzin przy mieszaniu i napowietrzaniu.

Pozywka hodowlana: glikoza 1,5% octanamonu 0,3% mocznik 0,1% KH2P04 * 0,1% MgS04 • 7HaO 0,04% Fe 2 ppm Mn+* 2 ppm biotyna 50 J*g/litr chlorowodorek tiaminy 200 Mg/litr produkt hydrolizy bialka soi (calkowita zawartosc azotu 7%) 2% ""' ~~ Wartosc pH pozywki wynosi 7,5.

W fermentorach o pojemnosci 1 litra umieszcza sie po 300 ml glównej pozywki hodowlanej o nastepuja¬ cym sklad/Je: glikoza 2% octanamonu 0,5% mocznik 0,2% KH2P04 0,1% MgS04 • 7H20 0,04% Fe*+ 2ppm Mn*+ 2 ppm10 92 081 biotyna 50/ig/litr chlorowodorektiaminy 50 fA/Utr produkt hydrolizy bialka soi (calkowita zawartosc azotu 7%) ' 2,5% Wartosc pH pozywki wynosi 7,5.

Po sterylizacji kazda porcje pozywki zaszczepia sie 15 ml poprzednio przygotowanej hodowli i hoduje w temperaturze 31—33°C, mieszajac z szybkoscia 1500 obrotów/minute i wprowadzajac równa objetosc tlenu na minute. Wartosc pH pozywki utrzymuje sie w granicach 7,2—8,0 przez automatyczne dodawanie mieszaniny kwasu octowego i octanu amonu, zawierajacego 0,25 mola octanu amonu na 1 mol kwasu octowego i w której stezenie kwasu octowego wynosi 60%.

Po 55 godzinach hodowli otrzymuje sie chlorowodorek L-lizyny w ilosciach, podanych w tablicy 12.

Tablica 12 Szczep FERMP-1711 FERMP-1712 Nr 872 Ilosc wytworzonej L-lizyny (g/dl) 7,2 6,1 4,0 Zuzycie ;' } y\ :u i kwasu octowego (%) 22 24 32 Przyklad IX. Szczepy Brevlbacterium lactofermentum FERM P—1711 i FERM P—1712 oraz szczep nr 872 (kontrolny) zaszczepia sie na pozywce hodowlanej o skladzie, podanym w przykladzie VIII, z ta róznica, ze zamiast octanu amonu dodaje sie 0,5% etanolu i,dodaje sie 0,3% mocznika, po czym mieszajac hoduje W temperaturze 31°C w ciagu 18 godzin z mieszaniem i napowietrzaniem.

Fermentacje prowadzi sie dalej z glówna pozywka hodowlana, jak opisano w przykladzie VIII, z tym, ze do glównej pozywki hodowlanej zamiast octanu amonu dodaje sie 1% glukozy, 1% etanolu i 0,5% siarczanu amonu. Wartosc pH utrzymuje sie w granicach 7,2—8,2 za pomoca gazowego amoniaku. Ilosc pozostalego etanolu okresla sie za pomoca gazowej chromatografii i dodaje go w przypadku, gdy ilosc ta spada do okolo 0,3%.

Po 48 godzinach otrzymuje sie chlorowodorek L-lizyny w ilosciach, podanych w tablicy 13.

Tablica 13 Szczep FERMP-1711 FERMP-1712 Nr 872 Ilosc wytworzonej L-lizyny (g/dl) 6,6 ,6 3,6 Wydajnosc w stosunku do etanolu r.:-.¦•"-.(%) 26 17

Claims

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep Breyibacterium lactofermentum ATCC 21798 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH - 5—0, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/lub kwas octowy i/albo etanol.

3. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH » 5—9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.92081 11

4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol.

5. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep Brevibacterium iactoferrnenturn ATCC 21800 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH ° 5-9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla, i azotu, nieorganiczne sole, substan¬ cja niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

6. Sposób wedlug zastrz. 6, z n a m i e n n y t y m, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/lub kwas octowy i/albo etanol.

7. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep Brevibacterium Iactofermentum ATCC 21801 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH =* 5-9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

8. Sposób wedlug zastrz, 7 •, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/lub kwas octowy i/albo etanol.

9. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep Brevibacterium Iactofermentum FERM P—1711 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH = 5—9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i oraganiczne substancje wzmagajace wzrost.

10. Sposób wedlug zastrz. 9f znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol.

11. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep 8revibacterium lactofrmentum FERM P-1712 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH * 5—9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

12. Sposób wedlug zastrz. 11, z n a m i,e n n y tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/lub kwas octowy i/albo etanol.

13. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep Brevibacterium Iactofermentum FERM P—1857 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH m 5—9 w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

14. Sposób wedlug zastrz. 13, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol.

15. Sposób wytwarzania L-lizyny, z n a m i,e n n,y tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep Brevibacterium Iactofermentum FERM P-1570 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH » 5—9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne soie, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

16. Sposób wedlug zastrz. 15, z na mienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol.

17. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatuku Brevibacterium nowy szczep

18. Brevibacterium Iactofermentum FERM P—1571 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH ¦ 5-9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje nlezbed- _ na dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost 16. Sposób wedlug zastrz. 17, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol.

19. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep Brevibacterium iactofermentum FERM P-1572 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH * 5-9 w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

20. Sposób wedlug zastrz. 19, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol.

21. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep Brevibacterium Iactofermentum FERM P—1573 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH = 5-9 w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego weglai azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

22. Sposób wedlug zastrz. 21, z n a m i e n n y tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol.12 92 081

23. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep Brevibacterium lactofermentum FERM P—1674 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH = 5-9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

24. Sposób wedlug zastrz. 23, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol.

25. Sposób wytwarzania L-lizyny, znam i e n n y tym, ze nalezacy do gatunku Brevibacterium nowy szczep Brevibacterium lactofermentum FERM P-1575 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH = 5—9, w pozywce zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

26. Sposób wedlug zastrz. 25, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/lub etanol. Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 10 zl