PL95590B1 - Sposob wytwarzania alfa-lizyny - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia L-lizyny na drodze fermentacji.

L-lizyna jest niezbedna w zywieniu ludzi i zwie¬ rzat, i ma szerokie zastosowanie jako skladnik, wzbogacajacy pokarmy i pasze. Znane jest wytwa¬ rzanie L-lizyny na drodze fermentacji weglowo¬ danów za pomoca bakterii trzech typów. Pierw¬ szym z nich jest znany z opisu patentowego St. Zjedn. Amer. nr 2 979 439 szczep Micrococcus glutamicus, który do wzrostu wymaga aminokwa¬ sów, odpowiednich do biosyntezy L-lizyny, takich jak homoseryna. Drugi typ stanowia znane z fran¬ cuskiego opisu patentowego nr 1 533 688 szczepy bak¬ terii wrazliwe na treonine albo metionine, szczepy wrazliwe na treonine i szczepy wymagajace treoni- ny. Ich wzrost, za wyjatkiem ostatniego z wymie¬ nionych, jest hamowany przez niskie stezenie treo- niny i bez wyjatku przez niskie stezenie metioniny.

Trzeci typ stanowi szczep znany z opisu patento¬ wego St. Zjedn. Amer. nr 3 707 441, odporny na S-(2-aminoetylo)-L-cysteine, bedaca siarkowa po¬ chodna L-lizyny i nazywana dalej w skrócie AEC.

Stwierdzono, ze szczepy bakterii, odporne na za¬ hamowanie odtwarzania lizyny i jej analogów, a równoczesnie wykazujace zapotrzebowanie na co najmniej jeden z takich skladników odzywczych, jak seryna, prolina, alanina, amid kwasu nikoty¬ nowego, kwas pantotenowy, tiamina, guanidyna, hypoksantyna i witamina B12, hodowane w odpo¬ wiednim srodowisku, zawierajacym zródla przy- swajalnego wegla i azotu oraz skladniki mineral¬ ne, wytwarzaja duze ilosci L-lizyny.

Zgodnie z wynalazkiem, do wytwarzania L-lizy¬ ny stosuje sie nowe szczepy o wyzej podanych ce¬ chach, otrzymywane znanymi sposobami ze zna¬ nych szczepów macierzystych, nalezacych do ga¬ tunku Corynebacterium, a mianowicie szczep Co¬ rynebacterium glutamicum FERM P-1613, wyma¬ gajacy seryny, a odporny na AEC, wymagajacy proliny, a odporny na AEC szczep Corynebacte¬ rium glutamicum FERM P-1982, wymagajacy guaniny, a odporny na AEC szczep Corynebacte¬ rium glutamicum FERM P-1984 i wymagajacy wi¬ taminy B12 i leucyny, a odporny na AEC szczep Corynebacterium glutamicum FERM P-1985.

Proces wytwarzania L-lizyny zgodnie z wyna¬ lazkiem prowadzi sie w ten sposób, ze jeden z tych szczepów poddaje sie hodowli w warunkach aero- bowych, przy wartosci pH=5-9, w pozywce, zawie¬ rajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nie¬ organiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu danego mikroorganizmu i organiczne substancje wzmagajace wzrost. Fermentacje prowadzi sie ko¬ rzystnie w temperaturze 24—37°C, w ciagu 24—96 godzin, stosujac wytrzasanie lub napowietrzanie i mieszanie. Gdy wartosc pH pozywki jest mniejsza niz 5, podwyzsza sie ja za pomoca substancji zobo¬ jetniajacych, takich jak weglan wapnia lub wotiny roztwór amoniaku, a jezeli wartosc pH jest za wy- 95 59095 590 soka, to stosuje sie dodatek kwasów, np. kwasu solnego lub siarkowego.

Z brzeczki hodowlanej wyosobnia sie lizyne zna¬ nymi sposobami, np. przez odsaczanie lub odwiro¬ wanie stalych czesci komórek, po czym z przesa¬ czu otrzymuje sie L-lizyne, stosujac zywice katio- nowymienne. Otrzymana L-lizyne identyfikuje sie na podstawie widma w podczerwieni, metoda chro¬ matografii bibulowej, elektroforezy, prób z mikro¬ organizmami lub prób z dekarboksylaza.

Sklad pozywki fermentacyjnej oraz sposób hodo¬ wania jest znany, stosowany zazwyczaj przy fer¬ mentacji aminokwasów, jak równiez moga byc sto¬ sowane znane pozywki do wytwarzania lizyny na duodue4eillllliljS^jMslkk wiec do hodowli szczepów, sposbbie wedlug wynalazku, na¬ daja sie pozywki syntetyczne, jak i z naturalnych sr&dków odzywczych', fcod warunkiem, ze zawieraja zasadnicze substancje odzywcze, niezbedne dla wzrostu zastosowanego szczepu. Te srodki odzyw¬ cze sa dobrze znane, a mianowicie sa to zródla wegla, zródla azotu i zwiazki nieorganiczne, które sa wykorzystywane przez zastosowany mikroorga¬ nizm w odpowiednich ilosciach.

Przykladami zródla wegla sa weglowodany, takie jak glikoza, fruktoza, sacharoza, skrobia, produkt hydrolizy skrobi, melasa lub inne zródla wegla, takie jak kwasy organiczne, na przyklad kwas octowy, propionowy, fumarowy, organiczne zwiazki chemiczne, na przyklad kwas benzoesowy lub alko¬ hole, takie jak np. metanol i etanol. Wymienione substancje moga byc stosowane oddzielnie lub w mieszaninie.

W zaleznosci od zdolnosci przyswajania zastoso¬ wanego mikroorganizmu, jako zródlo wegla stosuje sie weglowodany w minimalnej lub maksymalnej ilosci.

Jako zródlo azotu stosuje sie rózne rodzaje nie¬ organicznych soli lub organicznych soli lub zwiaz¬ ków, takich jak mocznik lub sole amonowe, np. chlorek amonu, siarczan amonu, azotan amonu, fosforan amonu, albo jeden lub wiecej aminokwa¬ sów, albo substancje naturalne, zawierajace azot, takie jak wyciag z kielków kukurydzy, wyciag z drozdzyj wyciag z miesa, maczka rybna, pepton, bulion, produkty hydrolizy kazeiny, wyciag otre¬ bów ryzowych itd. Substancje te równiez mozna stosowac oddzielnie lub w mieszaninie.

Jako zwiazki nieorganiczne do pozywek hodowla¬ nych dodaje sie siarczan magnezu, fosforan sodu, dwuwodoroortofosforan potasowy, jednowodoro- ortofosforan potasowy, siarczan zelaza lub inne sole zelaza, chlorek manganu, chlorek wapnia, chlorek sodu itp.

Pozywka hodowlana powinna zawierac srodki odzywcze i inne substancje, konieczne do wzrostu szczepu. Srodkami, pobudzajacymi wzrost oraz srodkami odzywczymi, poprawiajacymi wydajnosc wytwarzania L-lizyny, sa aminokwasy, na przy¬ klad seryna, prolina, alanina, leucyna, rózne wita¬ miny, takie jak witamina B12, tiamina, kwas pan¬ totenowy, amid kwasu nikotynowego lub kwas ni¬ kotynowy, zasady purynowe, takie jak guanina, adenina i hypoksantyna, produkt hydrolizy pro¬ teiny sojowej, wyciag z drozdzy, wyciag z kielków kukurydzy, pepton, produkt hydrolizy kazeiny.

Wazna rzecza jest ograniczenie ilosci wymaga-, nych aminokwasów i innych srodków odzywczych do ilosci mniejszej niz optimum stezenia dla wzro¬ stu danego szczepu mikroorganizmu, jak to stosuje sie zazwyczaj przy fermentacjach aminokwasów.

Zaleta procesu prowadzonego sposobem wedlug wynalazku w porównaniu ze znanymi sposobami jest to, ze dzieki zastosowaniu nowych szczepów mozna uzyskiwac L-lizyny z wieksza wydajnoscia, przy czym wydajnosc ta, dzieki odpornosci tych szczepów na analogi lizyny, jest w nieznacznym tyl¬ ko stopniu zalezna od wahan zawartosci treoniny i innych skladników odzywczych w pozywce. Szcze¬ py, stosowane zgodnie z wynalazkiem, wytwarza sie znana metoda odsiewu lub metoda indukowania sztucznych mutantów. W nizej podanych doswiad¬ czeniach opisano przyklady tych sposobów.

Doswiadczenie 1. Micrococcus glutamicus ATCC 13032 (taksonomiczna nazwa tego szczepu zostala zmieniona na Corynebacterium glutamicum) trak¬ tuje sie 250 \ig/ml nitroguanidyny w temperaturze 30°C w ciagu 30 minut i zaszczepia na agarowej plytce, zawierajacej 2 g/dl glikozy, 0,3 g/dl mocz¬ nika, 1 g/dl (NH4)2S04, 0,4 g/dl treoniny, 0,1 g/dl KH2P04 0,04 g/dl MgS04-7H20, 2 ppm jonów Fe i Mn, 50 ^i/litr biotyny, 100 ^ig/litr chlorowodorku tiaminy, 4 mg/ml AEC i 2 g/dl agaru i przy war¬ tosci pH = 7,0 poddaje hodowli w temperaturze 31°C w ciagu 4-10 dni. Z kazdej kolonii, wystepu¬ jacej w hodowli na plytce jako szczep odporny na AEC, wyosabnia sie szczep, którego mutanty sa zdolne do wytwarzania L-lizyny, przy czym dla kazdego mutanta okresla sie te zdolnosc. Wyosob¬ niany szczep Corynebacterium FERM P-1987, wy¬ kazujacy odpornosc na AEC, lecz nie wykazujacy zapotrzebowania na srodki odzywcze, traktuje sie 40 ponownie 250 \kg/ml nitrozoguanidyny w tempera¬ turze 30°C w ciagu 30 minut, a nastepnie wyosobnia mutanty, zdolne do wytwarzania duzej ilosci L- -lizyny, a mianowicie 3 mutanty, wykazujace od¬ pornosc na AEC i zapotrzebowanie na niektóre 45 srodki odzywcze, a mianowicie Corynebacterium glutamicum FERM P-1982 (AEC y +Pro") Corynebacterium glutamicum FERM P-1984 (AEC y + Guanina") 50 Corynebacterium glutamicum FERM P-1985 (AEC y + witamina B12~ + Leu~) Zapotrzebowanie na srodki odzywcze tych szcze¬ pów potwierdzily badania wzrostu prowadzone w znany sposób, przy uzyciu pozywki w nastepuja- 55 cym skladzie: Glikoza — 2°/o (NH4)2S04 — 1% KH2P04 — 0,l°/o MgS04 + 7H20 —0,04% 66 NaCl — 0,05% Biotyna — 50 [ig/1 Tiamina • HC1 — 200 ^g/1 Fe++ — 2 ppm Mn++ — 2 ppm 65 CaCO, — 2%95 590 6 Wartosc pH pozywki wynosila 5,0. Wyniki badan podano w tablicy I. dowli otrzymuje sie chlorowodorek L-lizyny w ilos¬ ciach, podanych w tablicy II.

Tablica I Tablica II Szczep FERM P-1982 FERM P-1984 FERM ! P-1985 FtiRM P-1987 Stezenie (OD) zawiesi¬ ny 0,455 0,430 0,400 0,451 Srodek od¬ zywczy L-Proli¬ na Guanina witami¬ na B12 ,+ L-Leu¬ cyna — Ilosc srodka odzyw¬ czego (mg/dl) 40 0 0 0,01 + 50 0+0 — Wzrost (OD) 0,475 0,030 0,320 0,090 | 0,300 0,75 0,512 Doswiadczenie 2. Mutanty szczepu Corynebacte- rium glutamicum FERM P-1613 otrzymuje sie rów¬ niez w sposób opisany w Doswiadczeniu 1, stosu¬ jac jako szczep macierzysty Micrococcus glutami- cus ATCC 13032, którego cechy taksonomiczne po¬ dano w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 3087863.

Numer FERM P- jest numerem, pod którym kul¬ ture danego szczepu zdeponowano w Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science of Technology, the Ministry of the industrial Trade and Industry, Japonia, gdzie szczepy te sa do¬ stepne.

Przyklad I. Przygotowuje sie pozywke o na¬ stepujacym skladzie: Glikoza - 10% (NH4)2S04 — 4,5% KH2P04 — 0,1% MgS04 •7H20 — 0,04% Fe++ — 2 ppm Mn++ — 2 ppm Biotyna — 50 ^g/1 Chlorowodorek tiaminy — 200 |Ag/l Produkt hydrolizy proteiny soji (calkowita zawartosc azotu 7%) — 1% CaC03 — 5% ml tej pozywki o wartosci pH = 7,0 umiesz¬ cza w butlach o pojemnosci po 500 ml. umieszczo¬ nych w wstrzasarce i wyjalawia, w temperaturze 110°C w ciagu 5 minut. W pozywce tej holduje sie wytrzasajac w temperaturze 31°C w ciagu 72 go¬ dzin szczepy Corynebacterium glutamicum FERM P-1613, FERM P-1982, FERM P-1984 i FERM P-1985, przy czym dla szczepu FERM P-1984 doda¬ je sie do pozywki 0,5% wyciagu z drozdzy. Szczep Corynebacterium glutamicum FERM P-1987, od¬ porny na AEC, lecz nie wykazujacy zapotrzebowa¬ nia na srodki odzywcze, równiez przygotowuje sie w sposób, opisany w doswiadczeniu 1, ze szczepu Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 i sto¬ suje go jako szczep kontrolny. Po 72 godzinach ho- 40 50 55 Szczep FERM P-1613 FERM P-1982 FERM P-1985 FERM P-1984 FERM P-1987 Ilosc wytwo¬ rzonej L-lizyny (g/dl) 3,0 3,0 r r. 3,1 2,0 Wydajnosc w stosuuku do glukozy (%) 41 31 Przyklad II. Przygotowuje sie pozywke o na¬ stepujacym skladzie: Glikoza Octan amonu KH2P04 MgS04 • 7H20 Fe++ i Mn+ + — 1,5 g/dl — 0,3 g/dl — 0,1 g/dl — 0,04 g/dl — po 2 czesci na milion — 50 ^ig/litr — 200 pig/litr — 1,5 ml/dl — 0,5 g/dl pH = 8, mieszajac temperaturze 31°C w ciagu 16 godzin szczepy Corynebacterium gluta¬ micum FERM P-1613, FERM P-1982, FERM P-1984, FERM P-1985.

Nastepnie po 15 ml kazdej wli dodaje sie do glównej o wartosci pH = 7,0, majacej Glikoza Biotyna Chlorowodorek tiaminy Produkt hydrolizy proteiny sojowej, zawierajacej 7% azotu Wyciag z drozdzy W pozywce tej, o wartosci i napowietrzajac hoduje sie w Octan amonu Mocznik KH2P04 MgS04 • 7H,0 Fe++ i Mn+ + Biotyna Chlorowodorek tiaminy Wyciag z drozdzy Produkt hydrolizy proteiny sojowej z otrzymanych hodo- pozywki hodowlanej nastepujacy sklad: — 3 g/dl — 0,5 g/dl — 0,2 g/dl — 0,1 g/dl — 0,04 g/dl — po 2 czesci na milion — 50 ^g/litr — 50 |ig/litr — 0,5% — 3 ml/dl Hodowle prowadzi sie w temperaturze 31,5°C, stosujac mieszanie z predkoscia 1500 obrotów na minute i doprowadzajac w ciagu 1 minuty powie¬ trze o objetosci równej objetosci hodowli. W cza¬ sie procesu utrzymuje sie wartosc pH = 7,2-8 przez dodawanie mieszaniny kwasu octowego z octanem amonu, zawierajacej 0,25 mola octanu amonu na 1 mol kwasu octowego i w której stezenie kwasu octowego, bedacego glównym zródlem wegla, wy¬ nosi 60% wagowych. Po uplywie 55 godzin otrzy¬ muje sie chlorowodorek L-lizyny w ilosciach, po¬ danych w tablicy III.

Przyklad III. Corynebacterium glutamicum FERM P-1613 zaszczepia sie na pozywce o nizej podanym skladzie i hoduje w temperaturze 31°C w ciagu 18 godzin, mieszajac i napowietrzajac.95 590 8 Sklad pozywki: Glukoza — 1,5% Mocznik — 0,3°/o KH2P04 — 0,1% MgS04 •7H.O . — 0,04% Fe++ — 2 ppm Mn++ — 2 ppm Biotyna — 50 jig/1 Chlorowodorek tiaminy — 200 Lig/l Produkt hydrolizy proteiny soi (calkowita zawartosc azotu 7%) — 1,5% Wartosc pH pozywki wynosi 7,5.

T Szczep FERM P-1613 FERM P-1982 FERM P-1984 FERM P-1985 a b 1 i c a III Ilosc wytwo¬ rzonej L-lizyny (g/dl) ,0 ,2 4,7 6,4 Zuzycie kwasu octowego (%) 22 23,5 23 W butlach fermentacyjnych o pojemnosci 1 litra umieszcza sie próbki po 300 ml glównej pozywki hodowlanej o nizej podanym skladzie i wartosci pH = 7,5.

Sklad pozywki glównej: Glikoza Etanol (NH4)2S04 Mocznik KH,P04 MgS04 • 7H20 Fe++ Mn++ Biotyna Chlorowodorek tiaminy Produkt hydrolizy proteiny soi (calkowita zawartosc azotu 7%) Po sterylizacji kazda próbke zaszczepia sie 15 ml poprzednio przygotowanej kultury i hoduje w tem¬ peraturze 31—33°C, mieszajac i wprowadzajac rów¬ na objetosc powietrza na minute. Wartosc pH utrzymuje sie w granicach 7,2—7,8 przez wprowa¬ dzenie gazowego amoniaku. Ilosc pozostalego eta¬ nolu okresla sie za pomoca gazowej chromatografii Tablica IV — 1% — 1% — 0,5% — 0,2% — 0,1% — 0,04% — 2 ppm — 2 ppm — 50 ng/1 — 50 tig/1 — 1,5% Szczep FERM P-1613 Ilosc wytwa¬ rzanej L-lizyny (gdl) 4,8 Wydajnosc w stosunku do etanolu 23 45 i dodaje go w przypadku, gdy ilosc ta maleje do okolo 0,3%.

Po 48 godzinach hodowli otrzymuje sie chlorowo¬ dorek L-lizyny w ilosciach, podanych w tablicy IV:

Claims (8)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Corynebacterium nowy szczep Corynebacterium glutamicum FERM P-1613 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH = 5-9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organicz¬ ne substancje wzmagajace wzrost.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle, prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol.

3. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Corynebacterium nowy szczep Corynebacterium glutamicum FERM P-1982 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH = 5-9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol.

5. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Corynebacterium nowy szczep Corynebacterium glutamicum FERM P-1984 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH = 5-9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorgani¬ czne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i orga¬ niczne substancje wzmagajace wzrost.

6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol.

7. Sposób wytwarzania L-lizyny, znamienny tym, ze nalezacy do gatunku Corynebacterium nowy szczep Corynebacterium glutamicum FERM P-1985 poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych, przy wartosci pH = 5-9, w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje niezbedna dla wzrostu i organiczne substancje wzmagajace wzrost.

8. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej jako zródlo przyswajalnego wegla weglowodan i/albo kwas octowy i/albo etanol. OZGraf. Zam. 2579 (naklad 105+17 egz.) Cena 45 zl