Opis patentowy opublikowano: 15.07.1977 91015 MKP C07g 7/02 Int. Cl.2 C07G 7/02 Twórca wynalazku: Uprawniony z patentu: Bayer AG., Leverkusen (Republika Federalna Niemiec) Sposób wytwarzania rozpuszczalnej w wodzie penicylinazy kowa¬ lencyjnie zwiazanej z polimerycznym nosnikiem Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowej, rozpuszczalnej w wodzie penicylinazy (E.C.3.5.1.11), zwiazanej kowalencyjnie z polimerycznym nosni¬ kiem.Wiadomo, ze penicylinaze stosuje sie w proce¬ sach wielkoprzemyslowych do wytwarzania kwasu 6-aminopenieylanowego (6-APS), który stanowi pól¬ produkt przy produkcji cennych w terapii penicy¬ lin pclsyntetycznych.Sposobem wedlug opisu patentowego RFN nr 1111778 kwas 6-aminopenicylanowy wytwarza sie przez zadanie roztworu benzylopenicyliny za¬ wiesina bakterii, zawierajacych enzym penicylina¬ ze. Dzieki katalitycznemu dzialaniu enzymu zosta¬ je odszczepione boczne ugrupowanie karbonami- dowe penicyliny, bez otwarcia przy tym pierscie¬ nia |3-laktamowego.Sposób ten wykazuje jednak powazne wady.Kwas 6-aminopenicylanowy, wytworzony tym spo¬ sobem, zawiera wiele cial obcych, które pochodza miedzy innymi z pozywki, brzeczki fermentacyjnej i od bakterii. Oprócz tego aktywnosc enzymatycz¬ na zawiesiny bakterii po jednorazowym zastoso¬ waniu praktycznie zostaje zlikwidowana tak, ze jej ponowne zastosowanie staje sie niemozliwe.W celu unikniecia tych niedogodnosci stosowano w miejsce zawiesiny bakterii nierozpuszczalne w wodzie penicylinazy. Znane sa rózne metody wy¬ twarzania enzymów nierozpuszczalnych w wodzie 1) przez kowalencyjne wiazanie z rozpuszczalni- kiem nierozpuszczalnym w wodzie (G.J.H. Melrose, Rew. Pure and Appl. Chem. 21, 83{1971)], 2) przez zamkniecie ich w usieciowanym porowatym zelu [K. Mosbach, R. Mosbach, Acta, Chem. Scand. 1966, , 2807], przez 3) mikrokapsulkowanie [T.M.S.Chana, Nature 229, 117(1971)], 4) przez zamkniecie enzymów w strukturze wlóknistej (Fasergefiige) (ogloszeniowy opis patentowy DOS RFN nr 1 932 426).Takie nierozpuszczalne w wodzie enzymy mozna po kazdej reakcji oddzielic jako katalizatory he- terogenne i ponownie stosowac. Z drugiej strony wykazuja one jednak liczne wady. Sposoby otrzy¬ mywania kwasu 6-aminopenicylanowego przy uzy¬ ciu penicylinazy, zwiazanej kowalencyjnie z nos¬ nikiem, przedstawione w ogloszeniowych opisach patentowych DOS RFN nr nr 1 917 057 i 1 907 365 nie nadaja sie do stosowania w skali technicznej.Przyczyny tego tkwia z jednej strony w mecha¬ nicznych wlasciwosciach stosowanego nosnika, który w wysokim stopniu ulega scieraniu, a z dru¬ giej strony przy niskich wydajnosciach procesu uzyskuje sie tylko nieznaczna aktywnosc wlasciwa penicylinazy, zwiazanej z nosnikiem.Równiez nierozpuszczalny enzym, stosowany we¬ dlug ogloszeniowego opisu patentowego DOS RFN nr 2143062 wykazuje wady przy jego technicznym zastosowaniu. Stosuje sie wedlug niego penicylina¬ ze, która zwiazana jest za posrednictwem dwual- dehydu, rozpuszczalnego w wodzie, z substancjami 910153 91QI5 4 stalymi, rozpuszczalnymi w wodzie i o wlasciwos¬ ciach adsorbenta, jak np. z nylonem. W przypadku takim moze jednak wystapic oprócz wzajemnego usieciowania czasteczek enzymu równiez kowalen¬ cyjne usieciowanie z nosnikiem, o ile zawiera on grupy aktywne, zdolne do reakcji z dwualdehy- dem. Tak wytworzona nierozpuszczalna penicyli- naza moze odszczepic Rozpuszczalna proteinaze w wyniku hydrolizy. Wytworzona wiec w ten sposób nierozpuszczalna penicylinaza moze byc ponownie stosowana tylko w ograniczonym zakresie.W znanych sposobach wprowadzania enzymów do porowatych polimerów pracuje sie w takich warunkach, w których enzymy latwo ulegaja de- /naturacji: Przy wytwarzaniu tego rodzaju nieroz¬ puszczalnych enzymów trzeba wiec liczyc sie z du¬ zymi stratami wydajnosci. Niezaleznie od powyz- szegq yfjolny emzyrii moze dyfundowac poprzez pory do- srodowiska rekreacyjnego, przez co pogarsza sie stopniowo katalityczna aktywnosc nierozpusz¬ czalnego enzymu.Sposobem wedlug ogloszeniowego opisu patento¬ wego DOS RFN nr 1932426 enzymy wprowadza sie do latwo wytwarzanej struktury wlóknistej. Enzym zostaje zamkniety w pustych przestrzeniach, wza¬ jemnie od siebie oddzielonych, dzieki czemu prze¬ ciwdziala sie dyfuzji enzymu.Jako powazna wade tego sposobu nalezy jednak uwzglednic to, ze po wprowadzeniu enzymu do wlókien duza czesc jego pierwotnej aktywnosci ulega zniszczeniu. Poza tym trzeba dobrac tak mala wielkosc porów wlókien, azeby zaden z en¬ zymów nie wydyfundowal. Przy malych wielkos¬ ciach porów zostaje jednak silnie ograniczona dy¬ fuzja substratu przez strukture wlóknista do en¬ zymu, jak tez redyfuzja produktów reakcji do srodowiska reakcyjnego. Zamkniety enzym nie zostaje wiec optymalnie wykorzystany. Oprócz te¬ go zamkniety enzym wystepuje w postaci niezwia- zanej. Wiadomo juz jednak, ze wolne enzymy szyb¬ ciej ulegaja denaturacji, niz enzymy, kowalencyj¬ nie zwiazane z nosnikiem [H.D. Orth, W. Brummer, Angewandte Chemie, 84, S. 319—368 (1972)]. W zwiazku z tym enzymy, zamkniete w polimerach, sa uposledzone w porównaniu z enzymami, kowa¬ lencyjnie zwiazanymi z nosnikiem.Ponadto wiadomo juz, ze enzymy mozna wiazac z nosnikami rozpuszczalnymi w wodzie. Wedlug opisu patentowego St. Zjedn. Am. nr 3 625 827 enzymy sprzega sie z rozpuszczalnym w wodzie polimerem etylenu i bezwodnika maleinowego.Sposób ten nie nadaje sie jednak do wytwarzania wysokoczasteczkowych pochodnych enzymów, po¬ niewaz stosowane nosniki ze wzrastajacym cieza¬ rem czasteczkowym staja sie nierozpuszczalne.Oprócz tego enzym moze równiez wielokrotnie re¬ agowac z róznymi czasteczkami nosnika. Przez to wystepuja poprzeczne usieciowania, a to znowu powoduje, ze pochodna enzymu staje sie nieroz¬ puszczalna.Stwierdzono, ze nowe, rozpuszczalne w wodzie penicylinazy, kowalencyjnie zwiazane z polime- rycznym nosnikiem, nie wykazuja powyzszych wad i w zwiazku z tym nadaja sie doskonale do wy¬ twarzania kwasu 6-aminopenicylanowego (6-APS).Sposobem wedlug wynalazku rozpuszczalne . w wodzie penicylinazy otrzymuje sie przez kowalen¬ cyjne zwiazanie penicyjinazy z rozpuszczalnym w wódzie, polimerycznym nosnikiem i nastepnie skapsulkowanie powstalej pochodnej enzymu lub zamkniecie jej w polimerze. Wysokoczasteczkowa pochodna enzymu nie moze jufc^yiec wydyfundo- wac z porowatego nosnika. 1, Niespodziewanie, rozpuszczalna' w,' jodzie peni- cylinaza, kowalencyjnie zwiazana i^ porowatym nosnikiem, moze byc otrzymywana sposobem we¬ dlug wynalazku z wydajnoscia prawie ilosciowa, co stwierdzono na podstawie aktywnosci enzyma¬ tycznej produktów wyjsciowych i koncowych.W porównaniu z niezwiazanym enzymem pro¬ dukty otrzymane sposobem wedlug wynalazku, wy¬ kazuja wielkie zalety odnosnie wiekszej stabilnosci równiez przy wyzszych stezeniach penicyliny.W zwiazku z tym stanowia one postepowe srodki przy wytwarzaniu kwasu 6-aminopenicylanowego.Jezeli jako nosniki polimeryczne rozpuszczalne w wodzie, stosuje sie polisacharydy, które uprzed¬ nio poddano reakcji z chlorowcocyjankiem (porów- m naj ogloszeniowy opis patentowy DOS RFN nr 1768572), wówczas przebieg reakcji mozna - przedstawic za pomoca schematu uwidocznionego na rysunku, na którym X oznacza grupe NH lub tlen. Polisacharydy stosowane w sposobie wedlug wynalazku sa znane i przykladowo wymienia sie takie, jak dekstran, skrobie, lewan, jak tez kar- boksymetyloceluloze.Jako rozcienczalnik wzglednie rozpuszczalnik stosuje sie wode.Jako chlorowcocyjan wchodza w rachube jodo-, chloro- i bromocyjan.Temperatura reakcji lezy w zakresie 0—50 °C, a reakcje mozna prowadzic przy cisnieniu normal¬ nym, jak tez przy zwiekszonym. 40 Podczas przeprowadzania sposobu wedlug wy¬ nalazku, pH srodowiska reakcji utrzymuje sie przez dodatek np. lugu sodowego w zakresie 8—13, korzystnie zas pH = 11,0. Reakcja chlorowcocyja- nu z polisacharydem jest zakonczona po 10—20 45 minutach. Roztwór nie moze zawierac wolnego chlorowcocyjanu, o ile w nastepnym stopniu po¬ chodna polimeru poddaje sie reakcji z penicyli¬ naza. Reakcja powinna nastapic tak szybko, jak tylko jest to mozliwe, poniewaz reaktywna po- 50 chodna polimeru zostaje latwo zinaktywowana z powodu hydrolizy. Przed reakcja z penicylinaza pH roztworu pochodnej polimeru nastawia sie na wartosc 8,5. Po dodaniu penicylinazy miesza sie w temperaturze 0—50°C, korzystnie 5—10°C. Zawar- 55 tosc nieprzereagowanego enzymu mozna ustalic, jezeli zastosowano dekstran o ciezarze czasteczko¬ wym 500.000. Wysokoczasteczkowa pochodna en¬ zymu mozna oddzielic od naturalnego enzymu np. przez ultrafiltracje za pomoca membran, które sa 60 nierozpuszczalne dla czasteczek o ciezarze czastecz¬ kowym wyzszym od 100.000.Stosunek polisacharydu, chlorowcocyjanu i pe¬ nicylinazy moze zmieniac sie w szerokim zakresie.Calkowite przereagowanie enzymu nastepuje z cala 65 pewnoscia wtedy, gdy na jednostke wagowa pro-91015 teiny enzymu stosuje sie co najmniej 5 czesci wa¬ gowych polisacharydu.Oprócz tego stwierdzono, ze na trwalosc pochod¬ nej enzymu wybitnie wplywa stosunek ilosciowy chlorowcocyjanu i polisacharydu. Tak wiec natu¬ ralna penicylinaza w roztworze wodnym przy pH = 7,8 i w temperaturze 45°C inaktywuje sie w 95° w ciagu 24 godzin (patrz fig. 1, krzywa a).W tych samych warunkach rozpuszczalna w. wo¬ dzie penicylinaza, zwiazana z nosnikiem, np. sprze¬ zona z dekstranem o ciezarze czasteczkowym 500.000, stracila w ciagu 24 godzin tylko 47% ak¬ tywnosci w przypadku, gdy na gram dekstranu zastosowano 17 mg bromocyjanu (patrz fig. 1, krzywa b).Jezeli jednak na gram dekstranu stosuje sie 80 mg bromocyjanu, wówczas aktywnosc enzyma¬ tyczna zmniejsza sie w ciagu 24 godzin tylko o 5*/p (patrz fig. 1, krzywa c).Nieoczekiwane jest przy tym to, ze przy tej sa¬ mej wydajnosci sprzegania, przez zwiekszenie udzialu chlorowcocyjanu wybitnie wzrasta stabil¬ nosc rozpuszczalnej w wodzie penicylinazy, zwia¬ zanej z nosnikiem. Prawdopodobnie przez zwiek¬ szenie zawartosci chlorowcocyjanu powstaje wiecej kowalencyjnych wiazan miedzy czasteczkami nos¬ nika i enzymu. W zwiazku z tym trzeciorzedowa strukture enzymu mozna by lepiej stabilizowac w miare powstawania kowalencyjnych wiazan mie¬ dzy nosnikiem i enzymem. Ilosc wprowadzanego chlorowcocyjanu jest jednak ograniczona, poniewaz ze wzgledu na usieciowania poprzeczne moga po¬ wstawac pochodne enzymy trudno- lub nierozpusz¬ czalne. Z tego wzgledu nie zaleca sie, aby przy stosowaniu dekstranu o ciezarze czasteczkowym wynoszacym okolo 500.000 wprowadzac na 1 gram dekstranu wiecej niz 150 mg bromocyjanu.Jezeli jednak stosuje sie dekstran o mniejszym ciezarze czasteczkowym np. 20.000, wówczas bez trudnosci na gram dekstranu mozna doprowadzac do reakcji wiecej, niz 300 mg bromocyjanu. Jednak przy stosowaniu nosników o mniejszych ciezarach czasteczkowych zmniejsza sie stabilnosc enzymu.Na fig. 2 wskazana jest, w zaleznosci od czasu, resztkowa aktywnosc pochodnych penicylinazy i dekstranu, po wstepnej inkubacji w temperatu¬ rze 45°C i przy pH = 7,8.Krzywa a oznacza niezwiazana penicylinaze.Krzywa b oznacza penicylinaze, zwiazana kowa¬ lencyjnie z dekstranem o ciezarze czasteczkowym okolo 20.000 (80 mg bromocyjanu na 1 gram dekstranu).Krzywa c oznacza to samo, co krzywa b z tym, ze 160 mg bromocyjanu przypada na 1 gram dekstranu, a krzywa d oznacza penicylinaze, zwia¬ zana kowalencyjnie z dekstranem o ciezarze cza¬ steczkowym okolo 60.000 (80 mg bromocyjanu na 1 gram dekstranu).W doswiadczeniu b) i d) na 1 g dekstranu sto¬ sowano 80 mg bromocyjanu. Przez podwojenie ilosci bromocyjanu, jak w doswiadczeniu b) mozna bylo wyraznie polepszyc stabilnosc pochodnej en¬ zymu (krzywa c).Zastosowanie skrobi jako nosnika zezwala na wytworzenie nadzwyczaj stabilnych pochodnych penicylinazy. Stabilnosc pochodnej enzymu jest równiez zalezna od ilosci chlorowcocyjanu. Ko¬ rzystnie na 1 g skrobi wprowadza sie do reakcji co najmniej 150 mg bromocyjanu.Wyrazna stabilizacje penicylinazy zwiazanej, sposobem wedlug wynalazku, kowalencyjnie te skrobia wskazuje fig. 3. Na wykresach podane sa resztkowe aktywnosci po wstepnej inkubacji w temperaturze 45°C i przy pH = 7,8.Krzywa a oznacza niezwiazana penicylinaze, krzywa b — penicylinaze, zwiazana ze skrobia (80 mg bromocyjanu na 1 g skrobi) krzywa c — penicylinaze, zwiazana ze skrobia (160 mg bromo¬ cyjanu na 1 g skrobi).Tak wytworzone pochodne enzymu kapsulkuje sie. lub zamyka w polimerze. Szczególnie korzystne jest wprzasc je we wlókna (porównaj ogloszeniowy opis patentowy DOS R^N nr 1932426) lub wpo- limeryzowac. Tak np. penicylinaze, zwiazana z de- kstranem o ciezarze czasteczkowym 500.000, mozna . bylo wpolimeryzowac z wydajnoscia 60% pierwot¬ nej aktywnosci enzymatycznej, wedlug znanych z literatury sposobów [H. Nilsson, R. Mosbach, K. Mosbach, Biochim, Biophys. Acta 268(1972), 253—256]. W doswiadczeniu kontrolnym z natural¬ na penicylinaza, po polimeryzacji w tych samych warunkach doswiadczalnych uzyskano tylko 10% pierwotnej aktywnosci enzymatycznej. Wpólimery- zowany enzym, zwiazany z nosnikiem, okazal sie 80 bardzo stabilny równiez po powtórnych zastoso¬ waniach go do wytwarzania kwasu 6-APS. Spoli- meryzowana pochodna enzymu zezwala na szybkie i proste oddzielenie jej ze srodowiska reakcji, po¬ niewaz polimer wytwarza sie w postaci ziaren o srednicy powyzej 1 mm. Nowe substancje wyka¬ zuja silne dzialanie enzymatyczne dzieki czemu nadaja sie one w wysokim stopniu do wytwarza¬ nia 6-APS. Normalnie enzymatyczne rozszczepie¬ nie penicylin w celu wytworzenia 6-APS prowadzi 40 sie w roztworach rozcienczonych, aby nie nastapila inaktywacja enzymu. Przed oddzieleniem 6-Al?S trzeba odparowac okolo 80% wody. Poniewaz wy¬ tworzona sposobem wedlug wynalazku penicylina¬ za umozliwia rozszczepienie równiez przy wyzszych 45 stezeniach, odparowuje sie odpowiednio mniej wo¬ dy przy zwielokrotnionym wsadzie penicyliny.Wytwarzanie 6-APS za pomoca penicylinazy, otrzy¬ manej sposobem wedlug wynalazku, jest wiec z te¬ go wzgledu bardziej ekonomiczne, so Preparaty penicylinazy, otrzymanej wedlug wy¬ nalazku, po enzymatycznym rozszczepieniu mozna oddzielic bez trudnosci na drodze ultrafiltracji od produktów reakcji — penicyliny G, kwasu fenylo¬ octowego i 6-APS. Szczególnie odpowiednie do 55 tego celu sa znajdujace sie w handlu filtry mem¬ branowe, nieprzepuszczalne dla czasteczek o cie¬ zarze czasteczkowym powyzej 100.000. Odfiltrowa¬ na na tej drodze pochodna enzymu moze byc po¬ wtórnie zastosowana do enzymatycznego rozszcze- 60 pienia. Wytworzony podczas enzymatycznego roz¬ szczepiania kwas 6-aminopenicylanowy (6-APS) uzyskuje sie z roztworu poreakcyjnego znanymi sposobami (patrz np. opis patentowy RFN nr 111778) po uprzednim oddzieleniu pochodnej penicylinazy 65 i krystalizuje przy pH = 4,3'.91 015 7 g Podczas enzymatycznego rozszczepiania penicy¬ liny za pomoca otrzymanej sposobem wedlug wy¬ nalazku, rozpuszczalnej w wodzie i zwiazanej z nosnikiem penicylinazy uzyskuje sie znacznie wyz¬ sze wydajnosci kwasu 6-aminopenicylanowego, ani¬ zeli przy stosowaniu zawiesiny E. coli.Tak oddzielono 6-APS z wydajnoscia okolo 85—90*/o, niezaleznie od tego, czy rozpuszczalna w Wodzie pochodna penicylinazy byla zamknieta w polimerze, czy tez nie.Pochodna penicylinazy ze wzgledu na jej nad¬ zwyczaj wysoka stabilnosc, mozna wielokrotnie stosowac przez dluzszy okres czasu, po czym jej aktywnosc enzymatyczna utrzymuje sie praktycz¬ nie jeszcze w calosci. Przy stosowaniu rozpusz¬ czalnej w wodzie penicylinazy, zwiazanej z nosni¬ kiem, powazne znaczenie ma jej stabilnosc po wie¬ lokrotnym stosowaniu enzymu.Przytoczone w ponizszych przykladach aktyw¬ nosci enzymatyczne (E) okreslaja aktywnosc, przy której w ciagu minuty i w temperaturze 37°C nastepuje hydroliza 1 ^mola penicyliny G do 6-APS i kwasu fenylooctowego.Zastosowana penicylinaza zostala wytworzona wedlug Le A 13991 (DOS nr 2151236).Przyklad I. a)5g dekstranu 500 o ciezarze czasteczkowym okolo 500.000 rozpuszcza sie w 165 ml wody i za pomoca 2N lugu sodowego do¬ prowadza do pH = 11,0. W temperaturze 20°C dodaje sie w trakcie mieszania 85 mg bromocyjanu i utrzymuje pH roztworu przy wartosci 11,0 za pomoca roztworu 2N NaOH. 10 minut po dodaniu bromocyjanu roztwór doprowadza sie do pH = 8,5 za pomoca 2N kwasu solnego i miesza ze 170 ml wodnego roztworu 550 g penicylinazy (aktywnosc enzymatyczna 7,3 E/mg).Roztwór miesza sie przez 16 godzin w chlodni w temperaturze 4°C. Po ultrafiltracji w przesaczu nie stwierdzono aktywnosci enzymatycznej. Sprze¬ ganie z nosnikiem przebiega wiec calkowicie. Wy¬ dajnosc aktywnosci enzymatycznej wynosi 98°/o w odniesieniu do aktywnosci wyjsciowej. Po liofili¬ zacji aktywnosc enzymatyczna zostaje w pelni za¬ chowana.W celu zbadania stabilnosci skladowano roztwór dekstranu 500, zwiazanego z penicylinaza, w tem¬ peraturze 45°C i przy pH = 7,8. Okreslone w róz¬ nych czasach aktywnosci resztkowe podane sa na fig. 1, krzywa b. Krzywa a otrzymano analogicz¬ nie przy uzyciu naturalnej penicylinazy. b) 5 g dekstranu 500 o ciezarze czasteczkowym okolo 500.000 rozpuszcza sie w 165 ml wody i do¬ prowadza za pomoca 2N lugu sodowego do pH = 1. W temperaturze 20°C dodaje sie, mieszajac, 400 mg bromocyjanu i utrzymuje pH roztworu za pomoca 2N lugu sodowego przy wartosci 11,0. minut po dodaniu bromocyjanu roztwór dopro¬ wadza sie za pomoca 2N kwasu solnego do pH = 8,5 i miesza ze 170 ml wodnego roztworu 550 mg pe¬ nicylinazy (aktywnosc enzymatyczna 7,3 E/mg).Roztwór miesza sie przez 16 godzin w chlodni w temperaturze 4°C. W tych warunkach enzym zo¬ staje calkowicie zwiazany z nosnikiem. Wydajnosc aktywnosci enzymatycznej wynosi 96*/o w odniesie¬ niu do aktywnosci wyjsciowej. Trwalosc pochodnej enzymu — okreslona odpowiednio, jak w przykla¬ dzie la, jest przedstawiona graficznie na fig. I,' krzywa c.Przyklad II. a) 5 g dekstranu 20 o ciezarze czasteczkowym okolo 20.000 poddaje §ie reakcji, jak w przykladzie Ib, z 400 mg bromocyjanu, a na¬ stepnie z 556 mg penicylinazy. Wydajnosc aktyw¬ nosci enzymatycznej po reakcji wynosi 96*/o w odniesieniu do aktywnosci wyjsciowej. Trwalosc tej pochodnej enzymu, okreslona, jak w przykla¬ dzie la, przedstawiona jest graficznie na fig. 2, krzywa b. b) 5 g dekstranu 20 poddaje sie reakcji, jak w przykladzie Ib, z 800 mg bromocyjanu, a nastepnie z 550 mg penicylinazy. Wydajnosc aktywnosci en¬ zymatycznej wynosi po reakcji 87f/« w odniesieniu do aktywnosci wyjsciowej. Trwalosc tej pochodnej enzymu, okreslona, jak w przykladzie la, jest przedstawiona graficznie na fig. 2, krzywa c. c) 5 g dekstranu 60 o ciezarze czasteczkowym okolo 60.000 poddaje sie reakcji, jak w przykla¬ dzie Ib, z 400 mg bromocyjanu, a nastepnie z 550 mg penicylinazy.Wydajnosc aktywnosci enzymatycznej wynosi po reakcji 99*/o w odniesieniu do aktywnosci wyjscio¬ wej. Trwalosc tej pochodnej enzymu, okreslona, jak w przykladzie la, jest przedstawiona graficz¬ nie na fig. 2, krzywa d.Przyklad III. a) 5 g rozpuszczalnej skrobi wedlug Zulktfwsky'ego rozpuszcza sie w 165 ml wody i doprowadza za pomoca 2N lugu sodowego do pH = 11,0. W temperaturze 20°C dodaje sie, mieszajac, 400 mg bromocyjanu i utrzymuje roz¬ twór za pomoca 2N NaOH przy wartosci pH = 11,0. 5:0 minut po dodaniu bromocyjanu roztwór do¬ prowadza sie za pomoca 2N kwasu solnego do pH = 8,5 i miesza ze 170 ml wodnego roztworu 550 mg penicylinazy (aktywnosc enzymatyczna 7,3 E/mg). *o Roztwór miesza sie przez 16 godzin w chlodni w temperaturze 4°C. Po przereagowaniu wydaj¬ nosc aktywnosci enzymatycznej wynosi 98Vo w odniesieniu do wydajnosci wyjsciowej. Penicylina- ze, kowalencyjnie zwiazana ze skrobia, mozna lio- 45 filizowac bez strat aktywnosci.Wydajnosc 6,2 g o aktywnosci enzymatycznej 0,65 E/mg. Stabilnosc penicylinazy, zwiazanej ze skrobia, badano jak podano w przykladzie la, w wodnym roztworze, w temperaturze 45°C i przy so PH = 7,9 (patrz wykres graficzny, fig. 3, krzywa b). b) 5 g rozpuszczalnej skrobi wedlug Zulkowsky'- ego zadaje sie, jak w przykladzie Ilia, 800 mg bromocyjanu i nastepnie 550 mg penicylinazy. Wy¬ dajnosc aktywnosci enzymatycznej wynosi po re- 55 akcji 98°/o w odniesieniu do aktywnosci wyjsciowej.Stabilnosc penicylinazy, zwiazanej ze skrobia; ba¬ dano w roztworze wodnym, w temperaturze 45°C i przy pH = 7,8 (patrz wykres graficzny fig. 3, krzywa c). Wydajnosc po liofilizacji 6,1 g^ o ak- 66 tywnosci enzymatycznej 0,65 E/mg.W przykladach IV—VI przedstawiono zastoso¬ wanie penicylinazy wytwarzanej sposobem wedlug wynalazku, do wytwarzania kwasu 6-APS.Przyklad IV. 210 ml roztworu rozpuszczalnej 85 w wodzie penicylinazy, zwiazanej z dekstranem91015 9 10 500, o aktywnosci 9,6 E/mg, wytworzonej wedlug przykladu Ib, wprowadza sie do roztworu 63 g penicyliny G-potasowej w 800 ml wody i miesza w temperaturze 38°C. Wartosc pH wsadu reakcyj¬ nego utrzymuje sie na stalym poziomie = 7,8 przez ciagle dodawanie trójetyloaminy. Po 6 godzinach trójetyloamina nie zostaje juz wiecej pobierana.Roztwcr filtruje sie przez ultrafiltr, az do obje¬ tosci resztkowej 100 ml, po czym do pozostalego roztworu dodaje sie 200 ml wody i filtruje po¬ nownie do objetosci 100. ml. Przesacz wraz z woda przemywajaca zageszcza sie w prózni do 150 ml.Przez dodatek pólstezonego kwasu solnego wytraca sie 6-APS w punkcie izoelektrycznym przy pH = 4,3, w obecnosci 100 ml metyloizobutyloketonu. Po godzinie 6-APS odfiltrowuje sie i przemywa 100 ml wody i 100 ml acetonu. Suszy sie w prózni w temperaturze 40°C; temperatura topnienia 208°C; wydajnosc 31,9 g 6-APS, co odpowiada 87,2% teorii.Oddzielona na drodze ultrafiltracji rozpuszczalna w wodzie i zwiazana z nosnikiem penicylinaza moze byc stosowana do dalszych procesów roz¬ szczepiania. Po pieciokrotnym powtórzeniu roz¬ szczepiania aktywnosc enzymatyczna nie spada tak, ze czasu reakcji nie trzeba przedluzac.Przyklad V. 2,9 g penicylinazy, kowalencyj¬ nie zwiazanej ze skrobia, o aktywnosci 650 E/mg, wytworzonej wedlug przykladu Illb, rozpuszcza sie w 600 ml 0,05 ml buforu trójetanoloamina-kwas solny o.pH = 7,0. Do roztworu dodaje sie 85,5 g akryloamidu, 4,5 g N, N'-metylenobisakryloamidu i 5 ml wodnego roztworu 2,5 g nadtlenodwusiar- czanu amonowego (roztwór A).Do kolby trójszyjnej z mieszadlem wprowadza sie 2900 ml toluenu, 1100 ml chloroformu, 5 ml N,N,N',N'-czterometyloetylenodwuaminy i 10 ml emulgatora 1736 (Bayer AG), ochladza do 4°C i miesza przy 250 obrotach na minute. Pod oslona azotu jako gazu ochronnego, wkrapla sie do na¬ czynia reakcyjnego przez wkraplacz roztwór A, miesza przez 30 minut i odsysa (odsacza) polimer.Nastepnie przemywa dwukrotnie po 1 1 toluenu i 2 1 0,5 ml roztworu chlorku sodowego. W poli¬ merze utrzymuje sie 63% pierwotnej aktywnosci penicylinazy.Spolimeryzowana pochodna penicylinazy wpro¬ wadza sie do roztworu 31,5 g penicyliny G-potaso¬ wej w 500 ml wody i miesza w temperaturze 38°C. pH wsadu reakcyjnego utrzymuje sie na stalym poziomie, odpowiadajacym wartosci 7,8 przez do* datek trójetyloaminy. Po 6 godzinach trójetylo¬ amina nie zostaje juz wiecej pobierana. Spolime¬ ryzowana pochodna penicylinazy odsacza sie i przemywa mala iloscia wody. Przesacz lacznie z woda z przemywania zageszcza sie pod próznia do 80 ml. Przez dodanie pólstezonego kwasu sol¬ nego wytraca sie 6-APS w punkcie izoelektrycz¬ nym przy pH = 4,3 w obecnosci metyloizobutylo¬ ketonu. Po godzinie odsacza sie 6-APS i przemywa 75 ml wody i 75 ml acetonu. Suszy sie go w próz¬ ni w temperaturze 40°C. Temperatura topnienia 208°C; wydajnosc 16,7 g (91% teorii).Spolimeryzowana pochodna penicylinazy moze byc stosowana bez straty aktywnosci enzymatycz¬ nej co najmniej kolejno 20 razy.Przyklad VI. 210 ml roztworu rozpuszczalnej w wodzie penicylinazy, zwiazanej z dekstranem 500, o aktywnosci 9,6 E/ml, wytworzonej wedlug przykladu Ib, dodaje sie do 63 g penicyliny G-po¬ tasowej i 290 ml wody i miesza w temperaturze 38°C. Wartosc pH wsadu reakcyjnego utrzymuje sie na stalym poziomie przez ciagle dodawanie trójetyloaminy. Po 12 godzinach trójetyloamina, nie zostaje juz wiecej pobierana.. Dalsza przeróbke mieszaniny reakcyjnej prowadzi sie wedlug przy¬ kladu IV. Roztwór enzymu oddzielony przez ultra- filtracje wykazuje aktywnosc resztkowa 92%. Wy¬ dajnosc 6-APS wynosi 30,8 g (84% teorii).W równoleglym doswiadczeniu z taka sama iloscia naturalnej, niezwiazanej penicylinazy i przy analogicznych warunkach reakcji, po 12 godzinach prowadzenia rozszczepienia obecna byla jeszcze nieprzereagowana penicylina. Jeszcze zachowana aktywnosc resztkowa penicylinazy wynosila 67% teorii. PL