Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ewentualnie acetylowanej hydroksy-L-proliny z hydroli¬ zatu zelatyny zwierzecej.Bardziej dokladnie przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania hydroksy-L-proliny lub N-acetylohy- droksy-L-proliny na drodze kwasnej lub zasadowej hydrolizy N-acetylo-O-benzoilohydroksy-L-proliny, otrzy¬ manej poprzez acetylowanie i nastepnie benzoilowanie hydrolizatu kazeiny zawierajacego wszystkie podstawowe aminokwasy.Wiadomym jest, ze pochodne hydroksy-L-proliny, w szczególnosci N-acetylohydroksy-L-proline stosuje sie jako srodek terapeutyczny w schorzeniach tkanki lacznej. Pochodne takie otrzymuje sie z hydroksy-L-proliny, stad otrzymywanie tego hydroksyaminokwasu ma szczególne znaczenie.Hydroksy-L-prolina jest skladnikiem wielu bialek pochodzenia zwierzecego, w najwiekszej jednak ilosci wystepuje w zelatynie, która tym samym jest surowcem wyjsciowym do produkcji w skali przemyslowej. Propo¬ nowane projekty chemicznej syntezy hydroksy-L-proliny nie maja praktycznego znaczenia, jesli wezmie sie pod uwage, iz otrzymuje sie wtedy wszystkie mozliwe izomery, z których trzeba izolowac izomer L.Wiele znanych metod wydzielania hydroksy-L-proliny z hydrolizatu zelatyny jest zbyt pracochlonnych i kosztownych. W japonskim opisie patentowym nr 3371/1955 zaleca sie izolowanie proliny lub hydroksyproliny z mieszaniny aminokwasów poprzez dzialanie azotynem sodowym i nastepny rozklad pochodnych nitrowych.Inne metody rozdzialu aminokwasów polegaja na wykorzystaniu róznicy rozpuszczalnosci badz samych aminokwasów otrzymanych z hydrolizatu zelatyny, badz tez ich soli addycyjnych z kwasami organicznymi lub nieorganicznymi.R.L.M. Synge opisuje w Bioch. J. 23, 1931/1939 metode usuwania argininy z hydrolizatu zelatyny na drodze stracania z kwasem flawianowym, stwierdzajac, iz bez usuniecia argininy nie jest mozliwa izolacja hydro¬ ksy-L-proliny. Taka sama metoda opisana jest w opisie patentowym NRD nr 39878 oraz opisie patentowym RFN nr 1119871.Stwierdzono, ze przez zastosowanie szczególnych warunków reakcji oraz nowej kombinacji etapów, usuwa¬ nie argininy z hydrolizatu zelatyny staje sie zbyteczne. Izolowana z hydrolizatu zelatyny sposobem wedlug wynalazku N-acetylo-O-benzoilohydroksy-L-prolina jest pólproduktem do wytwarzania N-acetylohydroksy-L-pro-2 89 100 liny i hydroksy-L-proliny. Otrzymuje sie, wbrew temu co podaje dotychczasowe pismiennictwo techniczne, dobra wydajnosc izolacji i dobra czystosc acetylo-benzoilohydroksy-L-proliny.Pozwala to na tansze wytwarzanie hydroksyaminokwasu lub jego pochodnej acetylowej. Sposób wedlug wynalazku wymaga mniejszej ilosci opera¬ cji, bez stosowania drogich reagentów i pozwala na uzyskiwanie wyzszej od dotychczas osiaganej wydajnosci.N-acetylohydroksy-L-proline otrzymuje sie metodami opisanymi w literaturze, na drodze acetylowania hydroksy-L-proliny lub alkalicznej hydrolizy N-acetylo-O-benzoilohydroksy-L-proliny. Zostalo to dokladnie opi¬ sane przez Synge'go w cytowanym wyzej odnosniku.Ewentualnie acetylowana hydroksy-L-proline sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie wychodzac z zelatyny zwierzecej w nastepujacych, kolejnych procesach: hydroliza, acetylowanie produktu hydrolizy, henzo- ilowanie roztworu po acetylowaniu oraz zasadowa, lub kwasna hydroliza N-acetylo- O-benzoilohydroksy-l^proliny. Hydrolize zelatyny prowadzi sie w sposób dobrze znany i szeroko stosowany Roztwór po hydrolizie odpowiadajacy 0,5-1 kg zelatyny w jednym litrze acetyluje sie stosujac bezwodnik octowy i mieszajac w temperaturze 0—5°C.Poniewaz reakcje acetylowania nalezy prowadzic w scisle obojetnym srodowisku, nalezy dodawac doklad¬ nie równoczesnie bezwodnik octowy i stezony roztwór wodorotlenku metalu alkalicznego. Dodawac je mozna w sposób ciagly lub w wielu porcjach. Drugi sposób dodawania pozwala na unikniecie wprowadzania nadmiaru bezwodnika, dokladne regulowanie wartosci pH roztworu i utrzymanie temperatury w zakresie 0—5°C. Miesza¬ nine po reakcji mozna stosowac bez oczyszczania do procesu benzoilowania.Reakcja benzoilowania chlorkiem benzoilu moze byc prowadzona z dodatkiem, lub bez mieszajacego sie z woda rozpuszczalnika. Korzystnym jest stosowanie acetonu, ale mozna równiez stosowac inne mieszajace sie z woda rozpuszczalniki np. czterowodorofuran, dioksan, dwumetyloformamid i podobne. Jesli reakcje prowad/i sie bez dodawania rozpuszczalnika chlorek benzoilu dodaje sie podczas mieszania. Dla uzyskania dobrej wydaj¬ nosci reakcji i produktu o wysokiej czystosci, reakcje nalezy prowadzic w zakresie temperatur 0-5°C, w srodo¬ wisku mozliwie dokladnie obojetnym. Chlorek benzoilu dodaje sie jednoczesnie z roztworem wodorotlenku, w sposób ciagly lub malymi porcjami, tak by nie wprowadzac nadmiaru chlorku benzoilu do mieszaniny reak¬ cyjnej. Postepujac w ten sposób mozna zapewnic utrzymanie wlasciwej wartosci pH roztworu.Dla uzyskania dobrych wyników benzoilowania wazne jest dobre mieszanie, skuteczne chlodzenie i kontro¬ la pH, którego wartosc musi sie utrzymywac dokladnie w poblizu 7.Po zakonczeniu reakcji benzoilowania mieszanine reakcyjna zakwasza sie i ekstrahuje chloroformem. R< twór chloroformowy przemywa sie woda i zateza pod zmniejszonym cisnieniem. Do pozostalosci dodaje k\ podczas mieszania, eteru etylowego, pozostawia w ciagu jednej godziny i saczy. Tak otrzymana N-acetylo-0-K'i- zoilohydroksy-L-proline mozna stosowac do dalszego przerobu.Hydroksy-L-proline otrzymuje sie na drodze hydrolizy kwasnej pochodnej acetyloben/oilowej Koi/s tnym jest stosowanie do tego celu kwasu solnego ale mozna stosowac takze inny mocny kwas lub kation*^ zywice jonowymienna. Hydrolize mozna prowadzic w zakresie temperatur od pokojowej do temperatury wrztii;? roztworu, w czasie od 18 godzin do dwu dni. Nadmiar chlorowodoru usuwa sie z mieszaniny reakcyjm-j-i dod.ur sie anionowej zywicy jonowymiennej, np. Amberlitu 1RA 68 w postaci wolnej zasady. Po przesaczeniu ioz-wóf zateza sie i dodaje metanolu otrzymujac hydroksy-L-proline o wysokim stopniu czystosci.N-acetylohydroksy-L-proline mozna otrzymywac poddajac acetylobenzoilohydroksyproline bvdr.-liyje srodowisku alkalicznym. Korzystnym jest stosowanie wodorotlenku sodowego, lecz mozna równiez. si<,sowu«; inna mocna zasade, np. wodorotlenek potasowy, barowy lub wapniowy. Proces prowadzi sie w le pokojowej, w ciagu 3-8 godzin. Mieszanine reakcyjna traktuje sie kationowa zywica jonowymienna i saczy Przesacz podaje sie na kolumne z kationitem, np. Amberlitem IR 120 w formie wodorowej, liluat pr/einvwa le chloroformem, odbarwia przy pomocy wegla zwierzecego, saczy i suszy. Pozostalosc krystali/uje s*e z a etonu.Przyklad I. Hydroliza zelatyny.Mieszanine zawierajaca 34 kg technicznej zelatyny o lepkosci 3/4° Englera, 20,5 litra wody ora/ 4 li; -i handlowego 34% kwasu solnego ogrzewa sie pod chlodnica zwrotna w ciagu 6 godzin, w reaktorze typu V* u w .?;• o objetosci 1001. Mieszanine po ochlodzeniu do temperatury 20°C odbarwia sie przy pomocy I .j »^ wy^ » aktywnego. Po odsaczeniu wegla roztwór odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista [«». stalosc dodaje sie do 15 litrów wody i znów zateza do sucha a pozostalosc rozpuszcza powhirnie w wod/io do objetosci 46 litra. Wydajnosc hydroksy-L-proliny wynosi 80% w odniesieniu do jej /.jwailosci v. ;sc uw<-¦ zelatynie.Acetylowanie hydroksy-L-proliny. 11 litrów otrzymanego hydrolizatu zobojetnia sie przy pomocy 4,9 litra 45% wodnej. i.»/iv < ,?¦. v .dwu¬ tlenku sodowego, w temperaturze 5-10°C. Po ochlodzeniu do temperatury 0°C dodaje siy jw.di/as : les/aina V89 100 3 litrów bezwodnika octowego oraz 29,9 litra 8N roztworu wodorotlenku sodowego, utrzymujac temperature w granicach 0 IV. Calosc bezwodnika i wodorotlenku dodaje sie w 10 porcjach co 20 minut, utrzymujac w czasie reakcji wartosc pH równa 7. Wydajnosc acetylowania, oznaczana metoda ninhydrynowa, wynosi 98-100%.Benzoilowanie N-acetylohydroksy-L-proliny.A. 8 litrów acetylowanego roztworu produktu rozciencza sie w 16 litrach wody i ochladza do temperatury 0°(\ Do tego ro/tworu dodaje sie podczas mieszania w ciagu 30 minut 1,05 litra chlorku benzoilu oraz 8 litrów 2N roztworu wodorotlenku sodowego, utrzymujac temperature w granicach 0-3°C i pH obojetjie. Mieszanine reakcyjna zakwasza sie do wartosci pH równej 1 przy pomocy 5 litrów 34% kwasu solnego, podczas mieszania w temperaturze 0°C.Mieszanine ekstrahuje sie chloroformem i po rozdzielaniu warstwe organiczna przemywa sie woda i zateza jhkI zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc miesza sie w ciagu 30 minut z 4—5 litrami eteru etylowego, pozosta¬ wia w temperaturze 4°C w ciagu 40 minut i saczy. Po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem otrzymuje sie 100 gramów N-acetylo-O-benzoilohydroksy-L-proliny o temperaturze topnienia 175°C i skrecalnosci wlasciwej l^lii* = ~~40,4°. Próbka rekrystalizowana z chloroformu i eteru etylowego ma temperature topnie¬ nia 183 -184°C.B. 2,8 litra roztworu acetylowanego produktu rozpuszczonego w 280 ml acetonu dodaje sie podczas mie¬ szania do 8 ml chlorku benzoilu i 80 ml 2N wodorotlenku sodowego tak by temperatura nie przekraczala 0°C.Calosc miesza sie w ciagu 30 minut, utrzymujac pH obojetne przy pomocy 2N roztworu wodorotlenku sodo¬ wego lub kwasu octowego. Nastepne porcje chlorku benzoilu dodaje sie w taki sam sposób az do osiagniecia 80 ml chlorku benzoilu i 800 ml 2N roztworu wodorotlenku sodowego. Calosc miesza sie w ciagu 90 minut, w temperaturze 0°C a nastepnie usuwa sie aceton odparowujac go pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc tozciencza sie 250 ml wody i zakwasza 600 ml stezonego kwasu solnego a nastepnie ekstrahuje chloroformem, faze organiczna przemywa woda i zateza pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc krystalizuje sie z 1 litra eteru etylowego. Otrzymuje sie 12 g N-acetylo-O-benzoilohydroksy-L-proliny o temperaturze topnienia 170 176°C, nie odbiegajacej od temperatury topnienia próbki otrzymanej inna metoda i skrecalnosci wlasciwej |«|tf= 35°.N acetylohydroksy-L-prolina. 150 gramów N-acetylo-O-benzoilohydroksy-L-proliny i 600 ml 2N roztworu wodorotlenku sodowego miecza sie w ciagu 5 godzin w temperaturze pokojowej a nastepnie dodaje 750 ml wymieniacza jonowego Ainhcilii iK 120 w formie wodorowej i miesza w ciagu dalszych 30 minut. Wypada obfity osad kwasu benzoeso¬ wego. Mieszanine saczy sie, pozostalosc zas przemywa woda do lacznej objetosci przesaczu 4 litry. Przesacz pi/opttsA/a sie przez kolumne wypelniona wymieniaczem jonowym Amberlit IR 120 w formie wodorowej* I hut / iir/a sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 450 ml, w temperaturze 40°C i ekstrahuje 200 ml chlor*, .-kumu. Roztwór wodny odbarwia sie przy pomocy 6 g wegla zwierzecego, saczy i zageszcza. Pozostalosc mics/j h$ z 270 ml acetonu, pozostawia w ciagu 30 minut do krystalizacji, po czym osad odsacza i suszy pod /rmis j, ..ilMii cisnieniem. Otrzymuje sie 84,5 g monohydratu N-acetylohydroksy-L-proliny o temperaturze top¬ nieniu JA lu'C. Produkt ten po przetrzymywaniu pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 55°C, w ciagu ^:t»i.l/in, naci wode krystalizacyjna i otrzymuje sie 76 g bezwodnej N-acetylohydroksy-L-proliny.Z lugów po kj Mih ..^ ji otrzymuje sie dodatkowo 6,5 g bezwodnego produktu. Lacznie otrzymuje sie wiec 82,5 g produktu 0 ren.]-..» anize topnienia 126-128°C i skrecalnosci wlasciwej [a]j)8 = 119,5° (woda, c = 3,75).V r z y k 1 a d II. Hydroksy-L-prolina.Mieszanine 50 g N-acetylo-O-benzoilohydroksy-L-proliny, otrzymanej sposobem opisanym w przykladzie I, 300 l/r kwasu solnego i 200 ml wody ogrzewa sie pod chlodnica zwrotna w ciagu 18 godzin. Mieszanine odiLfl/j sie nastepnie do temperatury pokojowej i ekstrahuje dwukrotnie porcjami po 100 ml chloroformu. 1 a/e winhia zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem, dodaje sie wody, zageszcza powtórnie. Operacje te l