PL85293B1 - Antibiotics a28695a and a28695b and a process for production thereof[us3839558a] - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych antybiotyków kwasowych i nieazo- towych lub ich soli z metalami alkalicznymi, me¬ talami ziem alkalicznych lub soli amonowych.Antybiotyki, wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku, oznaczono symbolami A20695A i A28695B.Wytwarza sde je wraz z inmymi niezidentyfiko¬ wanymi antybiotykami przez hodowanie w pozy¬ wce wodnej drobnoustroju Streptomyces altous NKRLi 3883 w warunkach wglebnej fermentacji aerobowej, przy czym ilosc wytworzonego anlty- biotyku A28695A przewyzsza ilosc antybiotyku A28695B. Ilosc innych wytworzonych antybiotyków jest jednak tak niewielka, ze ich odzyskiwanie jest nieoplacalne.Antybiotyk A28695A, wyosobniony z mieszaniny antybiotyków A28695 w postaci soli sodowopotaso- wej, tworzy krysztaly o barwie bialej i o tem¬ peraturze topnienia 161-165°C. Sól ta jest nie¬ rozpuszczalna w wodzie, slalbo rozpuszczalna w metanolu i rozpuszczalna w estrach takich, jak octan metylu, octan etylu itp., ketonach takich, jak aceton i keton metylowo-etylowy, weglowo- doralch chlorowcowanych talkach, jak chloroform i weglowodorach aromatycznych takich, jak ben¬ zen i toluen. Antybiotyk A28G95A jest zwiazkiem trwalym w roztworze o wartosci pH=4,0 w tem¬ peraturze do 27°C. Optyczna skrecalnosc wlasciwa \a]un mieszanej soli sodowo-potasowej antybiotyku A28695 wynosi +14,07° (c=l w metanolu).Na zalaczonych rysunkach fig. 1 przedstawia widimo absorpcyjne w podczerwieni antybiotyku A28605A w postaci mieszanej soli sodowo-potaso¬ wej w roztworze w chloroformie. Przy dlugosci fal 2,0—15,0 mikronów wyróznia sie nastepujace szczyty absorpcyjne: 3,1—3,3; 3,47; 6,24; 6,84; 7,00; 7,25; 7,37; 7,49; 7,68; 8,1; 8,47; 8,61; 8,95; 9,11; 9,20; 9,42; 9,5; 9,80; 9,98; 10,24; 10,54; 10,87; 11,09; 11,5 i 11,66 mikronów. Antybiotyk nie wykazuje zad¬ nych charakterystycznych cech absorpcji w nad¬ fiolecie.Rentgenowska analiza dyfrakcyjna krystalicz¬ nej mieszanej soli sodowo-potasowej antybiotyku A28695A, przeprowadzona z zastosowaniem ra¬ diacji wanadowo-chromowej przy dlugosci fali 2,2896 A do obliczenia odleglosci miedzypla- szczyznowych, daje nastepujace wartosci: I/Ii 18,23 14,75 13,26 12,05 9,53 9,01 8,27 8,02 7,61 7,36 1,00 1,00 0,40 0,60 0,40 0,50 0,30 0,30 0,30 0,50 85 29385 293 i/li 6,93 6,69 6,02 ,92 ,59 ,43 ,24 ,09 4,94 4,76 4,57 4,35 4,16 T3[* 0,02 0,60 0,40 0,30 0,10 0,40 0,10 0,20 0,40 0,05 0,10 0,05 0,02 0,10 0,05 tamipcgajfr\*PBg pierwiastkowa tego kwasu wykazuje obecnosc 63,31% wegla, 8,83% wodoru i 28,03% tlenu. Ana¬ liza widma masowego antybiotyku A28695A wyka¬ zuje przyblizony ciezar czasteczkowy 834. Miarecz¬ kowanie potencjometryczne soli sodowej antybioty¬ ku A28695A w 66% wodnym roztworze etanolu wy¬ kazuje obecnosc jednej miareczkowanej grupy o wartosci pKa 5,51. Ciezar czasteczkowy soli sodo¬ wej, wyznaczony metoda miareczkowania, wynosi okolo ®74i, co odpowiada ciezarowi czasteczkowe¬ mu wolnego kwasu w przyblizeniu 852. Wartosc ta jest wyzsza od wartosci, otrzymanej na podstawie analizy widma masowego, przy czym ta ostatnia jest prawdopodobnie dokladniejsza ze wzgledu na og¬ raniczone wyniki, osiagalne metoda miareczkowa¬ nia. Analiza widtma magnetycznego rezonansu ja¬ drowego wykazuje obecnosc w antybiotyku A28695A czterech grup metoksylowych.Mieszana sól sodowo-potasowa antybiotyku A28695 jest krystalicznym zwiazkiem o barwie bia¬ lej i o temperaturze topnienia 170—172°C. Rozpusz¬ czalnosc i 'trwalosc antybiotyku sa zblizone do roz¬ puszczalnosci d trwalosci mieszanej soli sodowo- -potasowej antybiotyku A28695A.Na fig. 2 przedstawiono widmo absorpcji w podczerwieni antybiotyku A286d5B w postaci mie¬ szanej soli sodowo^patiasowej w roztworze chlo¬ roformowym. Przy dlugosci fali 2,0—15,0 mikro¬ nów wyróznia sie nastepujace pasma: 3,0; 3,4 3,47; 6,24; 6,85; 7,01; 7,26; 7,68; 7,78; 8,1; 8,58; 8,82 8,95; 9,11; 9,19; 9,45; 9,59; 9,82; 10,04; 10,28; 10,55 11,10; 11,24; i 11,65 mikronów. Antybiotyk nie wy¬ kazuje zadinego charakterystycznego widma w nadfiolecie. Skrecalnosc optyczna [d^D mieszanej soli sodowo-potasowej antybiotyku A28695B wyno¬ si + 10,1° (ic=l w metanolu).Antybiotyk A28695B w postaci kwasu jest kry¬ staliczna substancja o barwie bialej i o tempera¬ turze topnienia 122—124°C. Mikroanalizia wykazuje nastepujacy sklad pierwiastkowy tego kwasu: 60,49%wegla, 9,15% wodoru i 31,32% tlenu. Ana¬ liza widma magnetycznego rezonansu jadrowego wykazuje, ze antybiotyk A28695B zawiera trzy grupy metoksytlowe. Analiza widma masowego an- ojtyk A28695A w postaci wolnego kwasu Iji&ija substancja o barwie bialej i o Joipnienia okolo 97—99°C. Analiza tybiotyku A28695B wykazuje przyblizony ciezar czasteczkowy 846. Miareczkowanie potencjometry¬ czne tego antybiotyku w postaci 66% roztworu soli sodowej w wodnym roztworze etanolu wy¬ kazuje obecnosc jednej miareczkowalnej grupy o wartosci pKa 5,9. Ciezar czasteczkowy soli sodo¬ wej antybiotyku A28695B, obliczony metoda mia¬ reczkowania, wynosi w przyblizeniu 877, co od¬ powiada ciezarowi czasteczkowemu tego antybio¬ tyku w postaci wolnego kwasu w przyblizeniu 855.Remitgenojwiska analiza dyffirafecytjna krystaliczne¬ go antybiotyku A28695B w postaci kwasu z za¬ stosowaniem radiacji wanadowo-chromowej przy dlugosci fali 2,2895 A do obliczenia odleglos¬ ci miedzyplaiszczyznowyah, wykazuje nastepujace wartosci: I/Ii 45 50 55 60 65 13,54 12,63 11,52 9,96 9,39 7,88 7,52 7,08 6,66 6,46 6,28 6,05 ,81 ,57 ,33 - 4,92 4,63 4,51 4,29 4,14 3,98 3,84 3,73 3,66 3,57 " 3,48 3,22 3,07 3,05 2,94 2,84 2,72 2,56 2,33 2,27 2,15 2,09 2,07 2,03 0,50 0,05 0,15 0,02 0,60 0,20 0,20 0,30 1,00 0,20 0,20 0,30 0,50 0,20 0,70 0,60 0,60 0,20 0,30 0,30 0,10 0,60 0,05 0,05 0,05 0,05 0,15 0,10 0,02 0,02 0.02 0,10 0,02 . 0,02 0,02 0,05 0,02 0,02 0,02 W tablicy 1 podano wartosci Rf, uzyskane droga chromatografii bibulowej, mieszanych soli sodo- wo-potasowych antybiotyków A28695A i A28695B, przy czym w analizie stosuje sie podane w tabli¬ cy rozpuszczalniki i przeprowaidza ja w kazdym przypadku za pomoca papierka Whatmana nr 1.5 85 293 6 Pozycje antybiotyków na chromatogramie wyzna¬ czono za pomoca bioautografu, stosujac Bacillus subtilis jako ustrój wykrywajacy.Tablica 1 Chromatografia bibulowa antybiotyków A28695A i A28605B Rozpuszczalnik Woda nasycona buta¬ nolem Woda nasycona buta¬ nolem z dodatkiem 2% kwasu p^toluenosulfo- nowego i 1% pipery- dyny Woda nasycona keto¬ nem metyloizobutylo- wym z dodatkiem 2% kwasu p-tioluenosulfo- nowego i 1% piperydy- ny Mieszanina wody z me¬ tanolem i acetonem (12:3:1)** Benzen nasycony woda Wartosc Rf* | A28695A 0,53 0,64 0,58 0,25 0,57 A28695B | i 0,83 0,76 0,74 0,54 0,48 * Wartosc Rf wyraza stosunek odleglosci prze¬ bytej przez antybiotyk od punktu wyjsciowego do odleglosci przebytej przez czolo rozpuszczal¬ nika od tego punkitu.** Wartosc pH tego roztworu doprowadza sie do ,5 przez dodanie NH4OH, a nastepnie obniza sie te wartosc do 7,5 przez dodanie H3PO4.W celu zidentyfikowania i rozdzielenia anty¬ biotyków A28695A i A28695B stosuje sie równiez chromatografie cienkowarstwowa na plytkach zelu krzemionkowego z wanilina jako srodkiem wykry¬ wajacym. Otrzymane wyniki podano w tablicy 2.Tablica 2 Chromatografia 'Cienkowarstwowa antybiotyków A28695A i A28606B Rozpuszczalnik Mieszanina benzenu z octanem etylu (1:1) Mieszanina chlorofor¬ mu z octanem etylu (2:3) Mieszanina benzenu z acetonem (9:1) Wartosc Bi | A28695A | A28695B 1 0,71 0,69 0,29 0,61 0,61 0,20 Antybiotyki, wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku, dzialaja hamujaco na wzrost drobnoustro¬ jów, zarówno bakterii, jak i grzybów, szkodliwych dla zwierzat i roslin, dzieki czemu maja zastoso¬ wanie jako inhibitory wzrostu tych drobnoustro¬ jów. W tablicy 3 podano minimalne intubacyjne stezenia mieszanych soli sodowo-potasowych an¬ tybiotyków A28685A i A28695B, obliczone meto¬ da rozcienczenia agarowego.Tablica 3 Aktywnosc mikrobiologiczna antybiotyków A28695A i A28695B Drobnoustrój Staiphyloeooous aureus Streptoooocus faecalis Botrytis cinerca Minimalne stezenie inhibicyjne [i/ml | A28695A <1,56 <1,56 ,00 A28695B | 6,25 12,50 ,00 Analiza plytkowa antybiotyków A28695A i A28695B wykazuje strefy inhibicyjne wobec drobnoustrojów Bacillus subtilis, Mycobacterium aviuim i Sarcina lutea.Analiza antybiotyku A28695B w kulturze wiru¬ sowej wykazuje jego aktywnosc wobec naste¬ pujacych wirusów: Vaccinia virus, Foliovirus III, Semliki Forest virus:, Herpes vinus i Influenza vi- rus Japan 3i0i5.Antybiotyki, wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku, zapobiegaja rozwojowi pewnych chorób roslin. Roztwór mieszaniny antybiotyków A28695A i A28695B w postaci preparatu do rozpylania wy¬ kazuje aktywnosc wobec plesni u roslin stracz¬ kowych oraz wobec guzowatosci korzeniowej u pomidorów, a takze wobec wirusów roslin takich, jak mozaikowy wirus fasoli odmiany Southern i wirus, powodujacy karlowatosc kukurydzy.Boza wyzej omówionym 'dzialaniem, antybiotyki A28695 wykazuja równiez aktywnosc owadobój¬ cza. Na przyklad, roztwór antybiotyku A28605A lub A28695B o stezeniu 100 czesci/milion niszczy 88% much domowych, a przy stezeniu 250 czesci/ milion smiertelnosc tych owadów wynosi 99%.Inna wazna wlasciwoscia antybiotyków A28695 jest zdolnosc zapobiegania kokcydiozie u drobiu.W tablicy 4 podano rezultaty, uzyskane w wyniku dodawania antybiotyków do pokarmu kurczat za¬ kazonego Eimeria tenella, Bimeria necatrix, Edime- ria maxima i Eimeria acervulina.W tablicy 4, j.ak i w tablicy 5 przyrost wagi kurczat z grupy kontrolnej miezakazonej przyjeto za 100%, zas zmniejszenie zmian chorobowych podano w porównaniu z kurczetami z grupy kon¬ trolnej zakazonej.W tablicy 5 podano wyniki, uzyskane w przy¬ padku kurczat zakazonych Eimeria tenella.Osltra toksycznosc antybiotyku A28605A u my¬ szy, wyrazona w postaci LD5a, wynosi 41,1 mg/kg masy ciala przy podawaniu doustnym. Natomiast wartosc LD50 podawanego myszom doustnie anty¬ biotyku A28695B wynosi okolo 43,5 mg/kg masy ciala.85 293 Tablica 4 Aktywnosc antybiotyków wobec kokcydiozy u kurczat Badana grupa A28695A A28695B Grupa kon¬ trolna za¬ kazona Grupa kon¬ trolna nie- zafcaizona Zawartosc w pokarmie % wagowy 0,01 0,005 0,0025 0,02 smiertel¬ nosc % 0 0 0 0 0 Przyrost wagi % 76 100 80 90 36 100 Zmniejszenie zmian chorobowych % w jelitach | w zoladku 100 100 90 100 0 100 66 <40 96 0 Tablica 5 Skutecznosc dzialania antybiotyków A28695A i A28695B wobec Eimeria tenella u kurczat Badana grupa A28695A A28695B grupa kontrol¬ na zakazona Grupa kontrol¬ na niezakazó- na Zawasrtosc w pokarmie % wagowy 0,005 0,0025 0,00125 0,03 0,02 Smiertel¬ nosc 1 % 0 0 0 0 0 0 Przyrósl; wagi % 100 100 80 93 100 72 100 Spadek zmian cho- iroibowych %| 90 33 0 100 100 0 — Poszczególne antybiotyki A28695 lub ich mie¬ szaniny zwiekszaja wykorzystanie weglowodanów przez przezuwacze, co zwieksza wydajnosc kar¬ mienia tych zwierzat. Jak wykazuja próby, prze¬ prowadzone in vitro z plynem zwaczowym, anty¬ biotyki te wplywaja na sklad lotnych wolnych kwasów tluszczowyoh w zwaczu, a w szczegól¬ nosci zwiekszaja ilosc proplionianu, bioracego udzial w przemianie 'materii u przezuwaczy, zas propionian jest wykorzystywany wydajniej niz octan, wystepujacy w wiekszych ilosciach u zwie¬ rzat, którym nie podano antybiotyku.Inna charakterystyczna wlasciwoscia antybioty¬ ków A28695 jesit ich zdolnosc tworzenia kompie- ksów z kationami jednowaiixsciowymi. W próbach z poszczególnymi jonami, antybiotyk A28695A wy¬ kazuje te zdolnosc wobec jonów potasowych i ru- bidowych, a antybiotyk A28695B wobec jonów sodowych i potasowych. W wielu analizach che¬ micznych wazne jest stosowanie odpowiednich dla danych jonów elektrod, a ze wzgledu na szczególne wlasciwosci, antybiotyki A23695A i B « 90 95 63 maja zastosowanie jako skladniki takich elektrod.Kompleksy antybiotyków A28695 z kationaimi jednowartosciowymi sa rozpuszczalne w lipidach, co ulatwia przenikanie jonów przez blony. Anty¬ biotyki o tych wlasciwosciach sa zwykle zwane jonoforami.Wplyw antybiotyków A28695 na przenikanie jo¬ nów bada sie za pomoca mitochondriów z watro¬ by szczurzej i walinomycyny. Zarówno antybio¬ tyk A28695A, jak i A28695B, powoduja cofniecie stymulujacego dzialania walinomycyny na hydro¬ lize trójfosforanu adenozyny w mitochondriach watroby szczurzej.Nowe antybiotyki wytwarza sie sposobem we¬ dlug wynalazku przez wglebne hodowanie nowo- odkrytego szczepu promieniowców w warunkach aerobowych w odpowiedniej pozywce, przy czym hodowle prowadzi sie do momentu wytworzenia sie w pozywce odpowiedniej aktywnosci antybio- tyczmej. Wytworzone antybiotyki oddziela sie od srodowiska fermentacyjnego i oczyszcza znanymi metodami.mm $ Stosowany w procesie wytwarzania antybioty¬ ków, sposobem wedilug wynalazku szczep promie¬ niowców jest szczepem -Streptomyces ailbus (Rossi -Doria, Waksraian i Heinnici). Ustró»j ten jest do¬ stepny bez ograniczen w zbiorze Northern Utili- zaition Research and Devedopmenit Division, Agri- culitunal Researdh Service w Mmisters;twie Rolni¬ ctwa USA w Peorii w stanie Illinois pod nume¬ rem NRRL 3883, przy czyim szczep wyosobniono z (próbki gleby, pobranej w Ouracao na Antylach Holenderskich. Poszczególne próbki gleby zmiesza- Tablica 6 Morfologia mikroskopowa, oechy hodowli i fizjologia 1* Morfologia mi¬ kroskopowa: Cechy hodowli: Pozywka ISP nr 2 Pozywka ISP rur 3 Pozywka ISP nr 4 Pozywka ISP nr 5 Maleinian wa¬ pniowy Pozywka Cza¬ pka Pasta pomido¬ rowa z macz¬ ka owsiana Fizjologia: Wymagana temperatura: MHeko odtlu¬ szczone: Zelatyna Redukcja azo¬ tanu Sporofory maja ksztalt spi¬ ralny. Sipory sa owalne, maja wielkosc 1,0—1,25 \i X X 0,5—1,0 \jl i wystepuja w| lancuchach 10—50.Wzrost obfity; odwrotny ja- snozóltawy brunat [11E5"|.Dobra grzybnia powietrzna i zarodinifcowanie, biel (W)a.Brak rozpuszczalnego pig¬ mentu.Wzrosit dobry; odwrotna biel. Niezla grzybnia powie trzna i zarodinikowanlie, biel (W) a, z rozrzuconymi ob¬ szarami jasnego zólcienia, (Y) 11/2 fb.Wzrosit olbfity; odwrotna blada zólcien [10F3"|. Obfita grzyibnia powieitirzna i za¬ rodnikowanie, biel (W) a.RozpuszczaiLny pigment ja- snobrunatny.Wzrost dobry do obfitego; odwrotna jasna zólcien T10I21. Dobra do obfitej grzybnia powietrzna i zaro¬ dnikowanie, jasna zólcien (Y) 2ba. Brak rozpuszczal¬ nego pigmentu. I Wzrost dobry; odwrotna ja-| sna zólcien flOF3l. Uimiar kowana grzybnia powietrz¬ na i zarodnikowanie, jasna zólcien (Y)lba, Wzrost dobry; odwrotna ja sna zólcien [9121. Dobra grzybnia powietrzna i zaro¬ dnikowanie,, blada zólcien (Y) 2ba. Brak rozpuszczal¬ nego pigmentu.Wzrost obfity; odwrotna blada zólcien [10B21. Dobra grzybnia powietrzna i zaro¬ dnikowanie, zóltawa szarzen (G) 2dc. Brak rozpuszczal¬ nego pigmentu.Dobry wzrost i zarodniko¬ wanie w temperaturze 26—\ 37°C, Brak wzrostu w tem¬ peraturze 43°C, 49°C i 55°C.Nie soina sie po uplywie 21 dni. Pierscien wzrostów na| powierzchni; osad.Calkowite rozpuszczenie po| uplywie 21 dni.Niewielka redukcja po uplywie 21 dni. bo 36 40 50 60 65 no z- wyjalowiona, odjonizowana woda i wtarto zawiesine w agar odzywczy na plytkach Petriegp.Po okresie inkubacji w tetmperatuTze 25—35°C przeniesiono kollonie ustrojów, wytwarzajacych antybiotyk A28695, na skosy agarowe za pomoca sterylnego uszka platynowego, po czym inkubo- wano skosy, otrzymujac odpowiednia szczepionke 'do wytwarzania A28695.W badaniach taksonomicznych szczepu NRRL 3883, wytwarzajacego antybiotyk A28695, zastoso¬ wano metody zalecane przez International Strop* tomyees Project [Shirling i Golttiieb, Intern. Buli.Systematic Bacteriol. 16 (1966), str. 313—340] oraz pewne próby dodatkowe. Rezultaty tych badan omówiono nizej w tablicy 6. Oznaczenia barw od¬ powiadaja wzorcom Inter-Socdety Color Council- Naitional Bureau of Sltamdainds (IiSlOC-NBS), (KeHy i Judd, ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Naimesi U.S. Dept. of Coimimerce Cire. 653, Wasihiinglton, DjC, 1955). Li¬ tery w nawiasach okraglych odnosza sie do blo¬ ków barw, a podkreslone litery i liczby do oz¬ naczen w serii barw Tresnera i Backusa [Appl.Microbiol. 11 (1963), str. 335—338]. Oznaczenia bloków barw wedlug Maerza i Paula [Dictionary of Color, McGraw-Hill Book Co., Inc., New York (1950)] podano w nawiasach kawdratowych. Cyfry ISP odnosza sie do pozywek opisanych w Inter- naltioaai Streptomyces Project przez Shlirliinga i Gottliiabtt, dostepnych w Difco Laboratories w Detroit w stanie Michigan, USA. Jezeli nie poda¬ no kiacaej, badania przeprowadizono po 14-dnió- wej inkubacji w temperaturze 30°C.W tablicy 7 podano wyniki prób na wykorzys¬ tanie wegla, przeprowadzonych na szczepie NRRL 3883, wytwarzajacym antybiotyk A28695. Stosowa¬ ne symbole oznaczaja: + = wykorzystanie pewne (+) = wykorzystanie mozliwe (—) = wykorzystanie watpliwe — = brak wykorzystania wegla.Tablica 7 Wykorzystanie wegla przez szczep NRRL 3683 : Podloze Inozyt Mannit Celuloza Celobioza Fruktoza Arialbinoza Raimnoza Rafinoza Ksyloza Dekstroza Reakcja (+) ' + (-) + + + + + + (+) Szczep NRRL 3883 jest bardzo podobny do szczepu Streptomyces ailbus ATTC 3004, opisane¬ go przez Lyonsa i Pridhana w J. Bacteriol. 83 (1962), str. 370—380. Róznice wystejpuija w wyko-11 85 293 12 rzystaniu czterech zródel wegla oraz we wzroscie w temperaturze powyzej 37°C. Szczep 3883 jest równiez podobny do szczepu NRRL 3384, z które¬ go wytwarza sie antybiotyk A204 [belgijski opis patentowy mr 728382]. Zauwazone róznice polega- 5 ja na tym, ze szczep NRRL 3384 wytwarza nieco dluzsze zarodniki, nie rozpuszcza zelatyny i roz¬ wija sie w nieco wyzszej temperaturze.Jako pozywke do wytwarzania antybiotyków A28695A i B przez hodowanie opisanego wyzej w mikroorganizmu stosuje sie rózne pozywki, po¬ niewaz, ijaik wykazuja powyzsze wyniki prób wy- korzystania wegla, ustrój ten moze korzystac z • róznych zródel energii. Ze wzgledów ekonomicz¬ nych, a takze w celu osiagniecia maksymalnej 15 wydajnosci w prodJutotfjli antybiotyku i zapewnie¬ nia najlatwiejszego wyosobniania go z pozywki, korzystnie stosuje sie jednak stosunkowo proste zródla przysiwajailnegjo wegla takie, jak glikoza, mannit, fruktoza, rozpoiszczalna skrobia, dekstry- ^ na, melasa, culkier nieraifinowany itp. Najkorzyst¬ niejszymi zródlami wegla sa glikoza i dekstryna.Pozo tyim mozna stosowac zródla przyswajalnego azotu takiie, jak maczka owsiana, ekstrakt wolo¬ wy, hydir.olizowana kazeina, wyciag namokowy ffi kukurydzy, ekstrakt drozdzowy, maczka sojowa, peptony (miesne luib sojowe) itp, przy czym ko¬ rzystnie stosuje sie maczke sojowa lub hydroli- zowana kwasowo kazeine. Korzystne wyniki daje wmieszanie dlo pozywki soli mineralnych beda- *? cyoh zródlami jonów wapniowych, magnezowych, sodowych^ potasowych, kobaltowych, chlorkowych, siarczanowych i weglanowych, a takze przyspie¬ szacza wzrostu takiego, jak drozdze lub ekstrakt drozdzowy. Jak w przypadku wielu innych dro- & bnoustrojów, wydaje sie korzystne wlaczenie do pozywki pierwiastków sladowych, które zwykle wystepuja w postaci domieszek do innych sklad¬ ników pozywki.Preces wytwarzania antybiotyków sposobem we- *° dftug wynalazku prowadzi sie w dowolnej, odpo¬ wiedniej riCa drobnoustroju temperaturze, np. w temperaturze okolo 26—40°C, a korzystnie w tem¬ peraturze 26—30°C, zwykle w ciagu 2—5 dni Wyjsciowa wartosc pH pozywki moze sie wa- ^ hac w szerokim zakresie, lecz korzystnie wynosi 6,5—7,2. Jak zaobserwowano podczas hodowli in¬ nych promieniowców, wartosc pH pozywki stop¬ niowo wzrasta w miare rozwoju hodowli i osiaga paziom okolo 7,0—8,0 lub wyzszy, przy czym kon- so cowa wartosc pH zailezy co najmniej czesciowo od wartosci wyjsciowej, wystepujacych w pozyw¬ ce substancji buforowych oraz czasu hodowli.Niewiielkit ilosci antybiotyku mozna wytwarzac dogodnie w powierzchniowych hodowlach w bu- 56 telkach. W celu wytworzenia wiekszych ilosci an¬ tybiotyku A28695, korzystnie prowadzi sie jednak hodowle wglebna w duzych zbiornikach, w wa¬ runkach aerobowych.W oedu przyspieszania procesu wytwarzania an- GJ) tylbiotyku korzystnie jest stosowac do zaszczepie¬ nia pozywki wegetatywna, a nie zarodnikowa postac idirolbnousltroju. W tym celu przez zaszcze¬ pienie stosunkowo niewielkiej ilosci pozywki za¬ rodnikowa postacia drobnoustroju wytwarza sie ^ najpierw szczepionke wegetatywna, a nastepnie wytworzona szczepionke wegetatywna przenosi sie antyseptycznie do duzych zbiorników, przezna¬ czonych do wytwarzania antybiotyku. Do wytwa¬ rzania szczepionki wegetatywnej stosuje sie taka sama pozywke co do wytwarzania antybiotyku lub inna.Jak zwykle w procesie, prowadzonym w wa¬ runkach aerobowych i wglebnych, przez pozywke przepuszcza sie strumien wyjalowionego powie¬ trza, przy czym wydajny wzrost ustroju i wydaj¬ na produkcje antybiotyków A28695A i B osiaga sie, stosujac korzystnie co najmniej 0,1 objetosci pcrwieit ne warunki zapewnia stosowanie co najmniej 0,3 dbjejtesci pcwietrza/1 imimuite/1 objetosc pozywki.Zawartosc antybiotyku w pozywce okresla sie podczas fermentacji przez badanie próbek pozyw¬ ki pod wzgledem ich dzialania hamujacego wzrost ustroju, o którym wiadomo, ze dzialanie antybioty- kówA28695A i A28695B hamuje jgo wzrost, np. ta¬ kiego, jak Bacillus subtilis. Badanie próbek pro¬ wadzi sie znana metoda mierzenia stopnia zmetnie¬ nia lub metoda plytkowa.W celu wyosobniania i oczyszczania antybioty¬ ków A28G95A i A28695B stosuje sie rózne znane metody, np. ekstrahowanie z rozpuszczalnika, ad- sorbowanie lub chromatografie kolumnowa, przy czym w sikali (przemyslowej korzystnie stosuje sie ekstrakcje rozpuszczalnikowa ze wzgledu na krót¬ szy czas, mniejsze koszty i wieksza wydajnosc przy stosowaniu tej metody.Antybiotyk wytwarza sie zarówno w grzybni, jak i w roztworze fermentacyjnym. Grzybnie oddziela sie od tego roztworu przez filtrowanie po czym grzybnie i przesacz ekstrahuje sie odpo¬ wiednim rozpuszczalnikiem organicznym, wyosa- bniajac w ten sposób wytworzony antybiotyk, przy czym mozna równiez ekstrahowac odpowcednim rozpuszczalnikiem roztwór nieprzefiltrowany. Od¬ powiednimi do ekstrahowania antybiotyku rozpu¬ szczalnikami sa np. octan etylu, octan amylu, bu¬ tanol, pentanol, etanol, metanol lub chloroform.Otrzymane ekstrakty odparowuje sie pod obnizo¬ nym cisnieniem, otrzymujac nieoczyszozona ole¬ ista mieszanine antybiotyków A28695, które wy¬ stepuja w postaci soli sodowo-potasowych. Mie¬ szanine te mozna nastepnie oczyscic droga chro¬ matografii na od^powiednitm adsorbencie takim, jak wegiel aktywowany lub zel krzemionkowy, przy czym korzystnym adsorbentem jest wegiel akty¬ wowany, na przeklad Pittsburgh Carbon.Kazdy z antybiotyków wyosabnia sie z miesza¬ niny przez dalsze prowadzenie chroimotogracfii. Na przyklad, po rozpuszczeniu mieszaniny soli sodo- wo-potasowych antybiotyków A28695A i B w mie¬ szaninie benzenu z octanem etylu w stosunku 9:1, roztwór cluromloltiograifiuje sie na kolumnie zelu krzemionkowego, po czym eluuje sie kolumne tym samym rozpuszczalnikiem i zbiera poszczególne frakcje. Przebieg frakcjonowania kontroluje sie, badajac pqszczególne frakcje na chromatografach cienkowarstwowych lub bibulowych. Frakcje, za¬ wierajace dany antybiotyk, miesza sie po czym od¬ parowuje rozpuszczalnik, otrzymujac praktycznie89 293 13 biorac oczyszczone i rozdzielone antybiotyki w po¬ staci mieszanych soli sodowo-potasowych.Antybiotyki A28695A i A28695B maja typowa dla kwasów organicznych wlasciwosc tworzenia soli z takimi zasadami nieorganicznymi, jak wodo¬ rotlenki metali alkalicznych, np. wodorotlenek lito¬ wy, sodowy lufo potasowy, weglany lufo wodoro¬ weglany metali alkalicznych, np. weglan litowy lufo wodoroweglan sodowy, wodorotlenki lub we¬ glany metali ziem alkalicznych, np. wodorotlenek waipniowy lufo weglan magnezowy i inne.Przykladami zasaid organicznych, tworzacych z antybiotykami fizjologicznie dopuszczalne sole sa pierwszo- dnuigo- i trzeciorzedowe nizsze alkilo- lub hydiroksyalkHoanTiny o 1—4 atomach wegla takie, jak etyloamina, izopropyloamina, dwuetylo- amina, metylo-n-butyloamina, etanoloamina i dwu- etanoloamina.Sole amonowe A28695A i A28695B wytwarza sie z zasftosowandeim amoniaku kub wodorotlenku amonowego.Sode antybiotyków wytwarza sie znanymi spo¬ sobami, stosowanymi do wyttwarzania soli ka¬ tionowych. Na .przeklad, antybiotyk w postaci -wodnego kwasu rozpuszcza sie w odpowiednim rozpuszczalniku i do roztworu dodaje wodny lub organiczny rcizitwór odpowiedniej zasady. Wytwo¬ rzone sole odifiltrowuje sie lufo wyosobnia przez odlparowanie rozpuszczalnika, a nastepnie oczy¬ szcza przez przekrystarizowanie.Przyklad I. Wytwarzanie antybiotyku A28G95 droga fenmenitaeji we wstozajsarpe.Wytwarza sie Ihodowle mikroorganizmu, wytwa¬ rzajacego antybiotyk A28695, na skosach agaro¬ wych o nastepujacym Skladzie: 14 dekstryna 700* N-'2 amina A** ekstrakt wolowy eksforakt dtaozdzowy agar woda odjonkowiana ,0 g 2,0 g 1,0 g 1,0 g ,0 g 1 litr. glikoza maczka sojowa substancje stale z Wyciagu kukurydzy CaCOa NaCl woda wodociagowa ,0 g ,0 g ,0 g 2,0 g " 5,0 g 1 litr. 110 * dekstryna ziemniaczana importowana w Ho¬ landii. « ** Sheffield Chemical Co., Division of National Dairy Produclts Corp., Niorwich, N. Y.Po zaszczepieniu skosu hodowla NRRL 3883 poddaje sie go inkubacji w temperaturze 30°C w ciagu 4^-6 dni. W celu otrzymania wodnej zawie- 50 siny zarodników pokrywa sie skos niewielka ilo¬ scia wyjalowionej i odjonizowanej wody i delika¬ tnie oskrobuje. 1 ml wytworzonej zawiesiny za¬ szczepia sie 100 ml wyjalowionej pozywki wege¬ tatywnej, zawierajacej nastepujace skladniki: 55 —48 godzin w temperaturze 30°C we wstrzasarce o ruchu posuwisto-zwrotnym, o skoku 5 cm, pra¬ cujacej z predkoscia 106 wstezasów/minute. Za pomoca 5 ml wyitworzonej hodowli zaszczepila sie nastepnie w kolbie Erlenmeyiera 100 ml wyjalo¬ wionej pozywki o nastepujacym sklakizie: maczka sojowa kazeina NaiNOa syrop glikozowy woda wodociagowa ,0 g M g 3,0 g ,0 g 1 litr.Zaszczepiona (pozywke poddaje sie 42—712 godzin¬ nej fennenltacffi w temperaturze 25—30°C we wstraasarce obrotowej, pracujacej z predkoscia 250 obrotów/minute. Koncowa wartosc pH roztworu fermentacyjnego wynosi okolo 7,0.Przyklad II. Wyitwarzanie A28695 w kadzi fermentacyjnej.Hodowle mikroorganizmu, wyltwarzajacego anty¬ biotyk A28695, przygotowuje sie na skosie aga¬ rowym o nasitejpujacyim skladzie: dekstryna ekstrakt drozdzowy kazeina izhytdirolizowaaa enzymami ekstrakt wolowy CoCfl2 • 6HjO agar woda odjonizowana ,0 g 1,0 g 2,0 g 1,0 g 0,01 ,0 g 1 litr.Wartosc pH pozywki ustala sie na 7,0 przez do¬ danie roztworu wodorotlenku sodowego. Po 30-mi- nutowej sterylizacji parowej w autoklawie pod cisnieniem 1,0—1,4 kG/om* wartosc pH wynosi 6,9.Nastepnie zaszczepia sie skos hodowla NRRL 3683 i inkubuje w ciajgu 10 dnd w temperaturze 30°C.Po .pokryciu skosu niewielka iloscia wyjalowionej i odjoniizowaneji wody oskrobuje sie go delakaitmde, otrzymujac wodna zawiesine zarodników. Kazdym ze skosów zaszczepia sie 6 kolb o pojemnosci po 250 mil, zawierajacych jpo 50 ml wyjalowionej po¬ zywki wegetatywnej o nastepujacym skladzie: glikoza srut sojowy roztwór naimokowy kukurydzy NaCl CaCOs Woda wodociagowa ,0 g ,0 g ,0 g ,0 2,0 1,1 litra.Zaszczepiona pozywke inkulbuje sie w ciagu 24 & Przez dodanie rozftworu wodorotlenku sodowego ustala sie wartosc pH pozywki na 6,5, przy czym wartosc ta nie ulega zmianie po 30-minutowej sterylizacji w aultoklawie pod* cisnieniem 1,0—1,4 kG/am2.Zaszczepiona pozywke poddaje sie 72-godzinnej fermentacji w tempera/turze 30°C we wstrzasarce obrotowej, pracujacej z predkoscia 250 obrotów/ minuite. Za pomoca 10 ml wytworzonej hodowli zaszczepia sie 200 ml sterylizowanej pozywki o tym samym skladzie, jak podany wyzej, umie-15 85 293 16 szczanej w kolbie o pojemnosci 1 litra. Zaszcze¬ piona pozywke ..poddaje sie 30^godzinmej fermen¬ tacji iw temlperajtiuirze 30°C we wstrzasarce obro¬ towej:, pracujacej z predkoscia 250 obrotów/minu¬ te. 200 ml wytworzonej hodowli zaszczepia sie w 5 kaidizd fermentacyjnej 25 litrów pozywki o naste¬ pujacym skladzie: glikoza srut sojowy kazeina zhydrolizowaaia kwasem melasa OaiCOa woda wodociagowa 2,5% 1,5% 0,1% 0,3% 0,25% 95,35% octanem etylu w stosunku 9:1, po czym prze¬ puszcza roztwór przez kolumne zelu krzernionko- wego (Graice, nr 62, Davison Chemical, Baltimore, Maryland 21226) o wymdiairach 5,5X115 cm, przy czym adsorbent uprzednio wyplukano mieszanina benzenu z octanem etylu (9:1). Kolumne plucze sie 6 litrami mieszaniny benzeniu z octanem etylu (9:1), po czym odrzuca sie odciek i popluczyny, a kolumne eluuje sie mieszanina benzenu z oc¬ tanem etylu (4:1). Efoiait zbiera sie w wielu frak¬ cjach, przy czym antybiotyk A28695A wystepuje w pierwszych, a antybiotyk A28695B w kolejnych frakcjach. Tozsamosc antybiotyku w poszczegól¬ nych frakcjach okresla sie metoda chromatogra¬ fii bibulowej i chromatografii cienkowarstwowej..Frakcje, zawierajace ten sam antybiotyk, miesza sie i odparowuje pod cisnieniem nizszym od at¬ mosferycznego, otrzymujac poszczególne antybio¬ tyki praktycznie biorac w czystej postaci.Przez rozpuszczenie bezpostaciowego antybioty¬ ku A26695A w cieplej woidaie krystalizuje sie go, otrzymujac 11,8 g mieszanej soli sodowo-potaso- wej o temperaturze topnienia 163—165°C.Antybiotyk A28695B krystalizuje sie z eteru* otrzymujac 5,3 g mieszanej soli sodowo-potaso- wej o temperaturze topnienia okolo 170—172°C.Przyklad V. Wytwarzanie antybiotyku A28695A w postaci kwasu. g mieszanej sodowo-poitasowej1 soli antybio¬ tyku A28695A rozpuszcza sie w 105 mil dioksanu, po czym dodaje 40 ml wody i doprowadza war¬ tosc pH [roztworu "do 4 przez dodanie kwasu sol¬ nego, a nastepnie odparowuje sie dioksan. Otrzy¬ many roztwór wodny ekstrahuje sie dwukrotnie taka sama iloscia octanu etylu, po czym oddzie¬ la sie faze wodna, ekstrakty octanowe miesza sie, odparowuje do sucha i rozpuszcza w cieplym ete¬ rze etylowym. Otrzymany roztwór chlodzi sie w ciagu nocy, otrzymujac krystaliczny antybiotyk A28695A, który odsacza sie i suszy. Ilosc produ¬ ktu o temperaturze topnienia okolo 97—99°C wy¬ nosi 4,5 g.Przyklad VI. Wytwarzanie antybiotyku A28695B w postaci kwasu. 100 mg antybiotyku A28695B w postaci mieszanej soli sodowo-portasowej rozpuszcza sie w 25 ml dio¬ ksanu, po czym dodaje 20 ml wody i doprowadza wartosc pH roztworu do 4,0 przez dodanie kwasu solnego. Nastepnie steza sie roztwór pod cisnie¬ niem nizszym od atmosferycznego w celu usunie¬ cia dioksanu, po czym ekstrahuje sie roztwór ta¬ ka saima objetoscia octanu etylu i odddzieHa fa¬ ze wodna. Ekstrakt octanowy odparowuje sie do sucha i rozpuszcza w minimalnej ilosci cieplego eteru etyllowego. Wytworzony roztwór przechowu¬ je sie w chlodzie, odsacza i suszy, otrzymujac 87 mg krystalicznego antybiotyku A28695B o tempe¬ raturze topnienia 122—1240C Przyklad VII. Wytwarzanie soli sodowe} A28695A. 200 mg kwasu A28695A, wytworzonego w sposób opisany w przykladzie V, rozpuszcza sie w 10 ml acetonu, po czym dodaje, mieszajac ml wody i doprowadza wartosc pH roztworu do 9,0 przez dodanie 1 n wodorotlenku sodowego.Po 30 minutowym sterylizowaniu roztworu w autoklawie pod cisnieniem 1,0(—d,4 kG/cm2 war¬ tosc ipH pozywki wynosi 7,2. Zaszczepiona pozy¬ wke napowieforza sie z predkoscia 0,3 objetosci powietaza/1 objetosc pozywki/l minute i miesza M w typowych mieszarkach, pracujacych z predko¬ scia 350 obrotów/minulte. Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 30°C w ciagu 5 dni.Przyklad III. Wyosabnianie mieszaniny an¬ tybiotyków. 92 litry roztworu fermentacyjnego z a hodowli A28695 filtruje sie przez pomocniczy ma¬ terial filtracyjny, po czym pilacek grzybniowy do¬ daje sie do 25 litrów metanolu i miesza energi¬ cznie w ciagu 30—60 minut. Nastepnie filtruje sie mieszanine i steza przesacz w celu usuniecia me- *° tanolu, po czym miesza sie wytworzona faze wo¬ dna z przesaczem z wyjsciowego roztworu fer¬ mentacyjnego. Ekstrahowany pilacek grzybniowy wprowadza siie do 25 litrów octanu etylu i mie¬ sza zawiesine w ciagu 30—60 minut, po czym 3'5 przesacza sie ja i usuwa placek grzybniowy. Prze¬ sacz ekstrahuje sie dwukrotnie po 50% objetosci octanu etylu, po czym usuwa sie zuzyty roztwór, a ekstrakty miesza z octanowym ekstraktem pla¬ ckagrzybniowego. *° Inna metoda ekstrahowania antybiotyku A26695 z nieprizefiltrowanego roztworu fermentacyjnego polega na tym, ze 92 litry roztworu miesza sie z taka sama iloscia octanu etylu, po czym filtruje mieszanine i rozdziela przesacz na faze octanowa i 45 faze wodna. Faze wodna odrzuca sie, a faze octa¬ nowa pozostawia do pózniejszego zmieszania z drugim ekstraktem.Nastepnie ponownie ekstrahuje sie mase grzy¬ bniowa octanem etylu, po czym oddziela sie te mase, a ekstrakt octanowy miesza z pierwszym ekstraktem. Polaczone ekstrakty steza sie do kon¬ systencji oleistej, po czym rozpuszcza koncentrat w 1 litrze chloroifionmu i przepuszcza roztwór przez kolumne wegla Pilttsburgh (12X40 mesh) w chlo¬ roformie, o wymiarach 5,5X100 cm. Nastepnie plucze sie kolmne 20 litrami chloroformu, po czym miesza popluczyny z odciekiem i odparo¬ wuje do sucha, otrzymujac 70,4 g antybiotyku A28d95.Przyklad IV. Rozdzielanie antybiotyków A28695A i A28695B. g mieszaniny antybiotyku A28695, wy¬ tworzonej w sposób opisany w przykladzie III, rozpuszcza sie w mieszaninie benzenu z M 1017 85 293 18 ~Pod struirnienieim azoitu powoli odparowuje sie aceton, po czym wyosabnia pozostalosc i rozpu¬ szcza ja w minimalnej ilosci eteru dwuetylowego.Nastepnie odiparowaijje sie roztwór do niewielkiej objetosci i chlodzi przez noc w temperaturze 5°C.Po odfiltrowaniu i wysuszeniu produktu otrzymu¬ je sie 33 img krysztalów sodowej soli A28695A o temperaturze topnienia okolo 150—160°C.Przyklad VIII. Wytwarzainie soli amonowej A28695A. 200 mg kwasu A28695A, wytworzonego w spo¬ sób opisany w przykladzie V, rozpuszcza sie w 10 ml acetonu, po czym dodaje sie 5 ml wody i doprowadza wartosc pH roztworu do 9,0 przez dodanie stezonego roztworu wodorotlenku sodowe¬ go. Aceton odpiarowuje sie powoli pod strumie¬ niem azotu, otrzymujac niekrysitaliczny osad. Na¬ stepnie ekstrahuje sie zawiesine taka sama obje¬ toscia eterai dwuetyilowego, steza wytworzony roz- wór eterowy do niewielkiej objetosci pod stru¬ mieniem azotu i pozostawia go na noc w tempe¬ raturze 5°C. Po odifdiltrowaniiu i wysuszeniu pro¬ duktu otrzymuje sie 120 mg krystalicznej soli o temperaturze topnienia okolo 124—125°C.Przyklad IX. Wytwarzanie sodowej soli A28695B. 200 mg kwasu A28695B, wytworzonego w sposób opisany w przykladzie VI, rozpuszcza sie w 10 ml acetonu, po czym dodaje powoli, mie¬ szajac, 5 ml wody. Wartosc pH roztworu dopro¬ wadza sie do 9,0 przez dodanie In wodorotlenku sodowego, po czym powoli odparowuje sie ace¬ ton pod strumieniieni azotu, przy czym zaczyna M sie wytracac krystaliczny osad. Zawiesine pozosta¬ wia sie na noc w temperaturze 5°C w celu za¬ konczenia krystalizacji, po czym odfiltrowuje sie produkt i suszy, otrzymujac 150 ml soli sodowej A28G95B o temperaturze topnienia 161—162°C.Przyklad X. Wytwarzanie soli amonowej A28695B. 200 mg wolnego kwasu A28695B, wytworzo¬ nego, jak opisano w przykladzie VI, rozpuszcza sie w 10 ml acetonu, po czym dodaje po¬ woli, mieszajac, 5 ml wody i doprowadza wartosc pH roztworu do 9,0 przez dodanie stezonego roz¬ tworu wodorotlenku amonowego. Aceton odparo¬ wuje sie z roztworu pod sitruniieniem azotu, przy czym po jego odparowaniu zaczyna sie wytracac krystaliczny osad. Nastejpmie pozostawia sie za¬ wiesine w temperaturze 5°C, po czym odfiltrowu¬ je sie produkt i suszy, otrzymujac 138 mg kry¬ stalicznej soli amonowej A28605B o temperaturze topnienia okolo 124—il25°C. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych antybiotyków A28695A i A28695B, znamienny tym, ze szczep Streptoniyoes albus NRKL 3883 hoduje sie w po¬ zywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla, azotu i soli nieorganicznych, w warunkach aero- bowych, wglebnie, do czasu wytworzenia sie od¬ powiedniej ilosci antybiotyków. 2. Sposób wedlug zastorz. 1, znamienny tym, ze mieszanine wytworzonych antybiotyków wyosaib- nia sie z pozywki, a nastepnie rozdziela sie ja na antybiotyki A28695A i A28695B. Sol A 28695 A 5000 4000 3000 2500 2000 Czestotliwosc (cm") 15001400 BOO 1200 1100 1000 950 900 850 600 750 700 Dluqo5C fal (mikrona) FIG. I85 293 SOL A 28695 B 5000 4000 3000 2500 KX ~eo V? .£ 60 c N «o40 O c 0) n20 L_ D- 0. ^ 3 ^ f 4 2000 5 ^ 6 Czestotliwosc (CMh) 1500 WOO1300 1200 1100 1000 950 900 850 800 750 f\ ^r r^~^ ..1 ' ! 1 ! ' ! 7 8 9 10 II 12 13 700 X 14 650 V-| 15 Dluqosc fal (mikrona) F/G.
2. 2 Cena 10 zl PZG Koszalin D-1088 Naklad: 10* egK PL