Sposób wytwarzania preparatu enzymatycznego Przedmiotem wynalazku jest wytwarzanie pre¬ paratu enzymatycznego o trombino-podobnym dzia¬ laniu endopeptyidaizowym, majacego zastosowanie w medycynie i weterynarii w malych dawkach ja¬ ko srodek hemostatyczny, a w wiekszych dawkach jako srodek przeciw krzepliwosci krwi, z jadu we¬ zowego.W brytyjskim opisie patentowym nr 1 094 301 po¬ dano sposób wytwarzania enzymu o trombino-po¬ dobnym dzialaniu przeciw krzepliwosci krwi z jadu Ancistrodon rhodostoma. Enzym ten ma nastepu¬ jace wlasciwosci: w stanie czystym ma charakter proteinazowy i jest bezbarwny, adsorbuje na sla¬ bych zasadowych substancjach anionitowych, ta¬ kich jak dwuetyloaminometyloceluloza i trójetylo- aminoceluloza, rozpuszcza sie w roztworze soli fi¬ zjologicznej, wykazuje ruchliwosc elektroforetycz- na 3,9 X 10~5 volt/cm/sek. w 0,1 mola buforu fo¬ sforanowego o pH 7,0, posiada ciezar czasteczkowy (wyznaczony za pomoca ultrawirówki) nie przekra¬ czajacy 40000 w postaci monomerowej oraz wspól¬ czynnik sedymentacji S20W = 3,4 svedbergów przy stezeniu 4,86 mg/ml; czastkowa objetosc wlasciwa enzymu w stezeniu 4,86 ml/ml wynosi 0,7, jego dzialanie biologiczne jest podobne do dzialania troni- biny i antykrzepnieciowe in vivo i nie ulega zaha¬ mowaniu w ciagu 5 minut przez 1 X lO^8 molowy roztwór dwuizopropylofluorofosforanu.Stwierdzono, ze z jadu Bothrops atrox lub inne¬ go weza, którego jad jest immunologicznie wspól- 10 15 30 reaktywny z jadem Bothrops atrox, otrzymuje sie kompozycje enzymów, która z jednej strony, przy odpowiednio niskich dawkach dziala jako srodek hemostatyczny, a z drugiej, przy wiekszych daw¬ kach, dziala posrednio przeciw krzepnieciu krwi ludzi i innych ssaków, usuwajac z obiegu fibry- nogen, lecz nie powodujac hemostazy. Kompozycja ta, w porównaniu z enzymem wytworzonym spo¬ sobem opisanym w brytyjskim opisie patentowym nr ,1094 301, wykazuje kilka opisanych nizej zalet.Preparat enzymatyczny wedlug wynalazku, któ¬ ry w malych dawkach wykazuje dzialanie hemo- statyczne, a w wiekszych dawkach dziala jako sro¬ dek przeciw krzepnieciu krwi u ludzi i innych ssaków, ma nastepujace wlasciwosci: wykazuje trombdno-podobna aktywnosc endopeptydazowa; za¬ wiera skladnik peptydowy i skladnik weglowoda¬ nowy; z których ten pierwszy zawiera jeden lub wiecej polipeptydów o ciezarze czasteczkowym 18000—55000, wyznaczonym metoda ultrawirówki rzutowej; zawiera okolo 2—10fl/o wagowych weglo¬ wodanu (cukru obojetnego), co okresla sie na pod¬ stawie zawartosci protein; jest slabo rozpuszczal¬ na w wodzie destylowanej, lecz latwo rozpuszcza sie w roztworze soli fizjologicznej; tworzy kom¬ pleksy z fenolem i pochodnymi fenolu, slabo lub wcale nierozpuszczalne w wodzie; powoduje koa¬ gulacje fibrynogenu przez selektywne eliminowa¬ nie fibrynopeptydów A z fibrynogenu, nie uwal¬ niajac fibrynopeptydów B; wykazuje aktywnosc 82 80782807 4 trombino-podobna, odpowiadajaca okolo 30—450 jednostkom NIH-trombiny na 1 mg protein; roz¬ szczepia metylowy ester tosyloargininy i zelatyne, lecz nie rozszczepia metylowego estru lizyny, ety¬ lowego estru fenyloalaniny, N-acetylometioniny, N-acetylotyrozyny, leucyloglicyny i kazeiny; nie ulega zahamowaniu pod wplywem dzialania hepa¬ ryny, heparynoidów, hirudyny, antytrombin i wie- lowartosciowego inhibitora peptydazowego Kunitza [por. J. Gen. Physiol. 19, str. 991—1007, (1936)]; ule¬ ga zahamowaniu przy stezeniu enzymu okolo 5 ml/ /ml do okolo 95% pod wzgledem zdolnosci koagu- lacyjnej i aktywnosci esterazowej pod wplywem 2,5 X 10-3 molowego roztworu fluorofosforanu dwuizopropylu o pH 8, w ciagu 2 godzin; ulega za¬ hamowaniu pod wplywem metylowego estru tosylo¬ argininy i pod wplywem przeciwciala zawartego w surowicy antybothrops; nie jest wiazana, a wiec i dezaktywowana przez fibryne; jej pól-okres bio¬ logicznego rozpadu jest znacznie dluzszy od pól- -okresu rozpadu heparyny; wywoluje wytwarzanie sie pochodnej fibryny, która reaguje z nadmiarem fibrynogenu, tworzac dajacy sie polimeryzowac kompleks fibrynowo-fibrynogenowy; dziala na fi- brynogen tworzac fibryne o fizyko-chemicznych wlasciwosciach róznych od wlasciwosci fibryny wy¬ tworzonej z trombiny tym, ze ulega szybkiej hy¬ drolizie pod wplywem dzialania enzymów fibryno- litycznych, na przyklad plazminy, nawet w obec¬ nosci aktywowanego czynnika XIII i jonów wap¬ nia, a takze tym, ze rozpuszcza sie w 5-molowym wodnym roztworze mocznika; wywoluje in vivo defibrynogenacje i wtórna fibrynolize bez ubocz¬ nego dzialania krwotokowego i tromboembolicz- nego.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania prepa¬ ratu enzymatycznego polega na tym, ze wytwarza sie izotoniczny roztwór wodny jadu Bothrops atrox lub innego weza, którego jad jest immunologicznie wspólreaktywny z jaden Bothrops atrox, o pH okolo 4,5—7, a nastepnie albo poddaje sie ten roz¬ twór frakcyjnemu wytracaniu soli w celu usunie¬ cia substancji balastowych, a nastepnie wytrace¬ nia frakcji zawierajacej enzym, po czym rozpusz¬ cza sie te frakcje w wodzie destylowanej ustala¬ jac wartosc pH roztworu na 3—4, ogrzewa roztwór w temperaturze 30—40°C w ciagu od kilku minut do okolo 2 godzin i doprowadza wartosc pH roz¬ tworu do okolo 4—6, albo ustala sie wartosc pH roztworu izotonicznego na 3—4 i ogrzewa sie go w temperaturze 30—50°C w ciagu od kilku minut do okolo 2 godzin, po czym wyosabnia sie wytra¬ cone proteiny, doprowadza wartosc pH roztworu do 4,5—7, poddaje go frakcyjnemu wytracaniu soli w celu usuniecia substancji balastowych, a na¬ stepnie wytracenia frakcji zawierajacej aktywny enzym, rozpuszcza sie te frakcje w wodzie desty¬ lowanej i doprowadza wartosc pH roztworu do okolo 4—6. Nastepnie do wytworzonego roztworu wprowadza sie fenol lub jego pochodne, w celu wytracenia nierozpuszczalnego kompleksu zawie¬ rajacego enzym i albo rozklada sie kompleks przez podzialanie nan rozcienczonym kwasem octowym w polarnym rozpuszczalniku organicznym i wyosab¬ nia sie uwolniony nierozpuszczalny enzym, albo poddaje sie kompleks w srodowisku wodnym reak¬ cji z zasada przy wartosci pH 7,5—8,5 i wyosab¬ nia uwolniony enzym przez ultrafiltracje, dialize lub filtracje przez zel, a nastepnie oczyszcza sie 5 wytworzony enzym.Jako substancje wyjsciowa do wytwarzania pre¬ paratu enzymatycznego sposobem wedlug wynalaz¬ ku stosuje sie korzystnie jad weza Bothrops atrox, znanego w literaturze równiez jako Coluber atrox 10 Linnaeus (Sys. Nat. Ed. 10, ,1 — 222, 1758) — Bothrops atrox Linnaeus (Dumeril, Bibron et Du- meril, Erpet, gen., 7 — ,1507, 1854), Lachesis lan- ceolatus Boulenger (Cat. Snak. Brit. Mus., 3 — 535, 1898), Lachesis atrox Linnaeus (Boulenger, Cat. 15 Sbak. Brit. Mus., 3 — 537 — 1896) — Bothrops atrox atrox Linnaeus (J. A. Peters, Buli, Mus, com.Zool., Cambridge. Mass., 122 — 509, 1960) i Bothrops moojeni Hoge (A. R. Hoge, Mem. Inst. Butantan, 32 — 126, (1965). Mozna równiez stosowac jad in- 20 nych wezów z gatunku Bothrops, na przyklad weza Bothrops jararaca. W zasadzie odpowiedni jest jad kazdego weza, który jest immunologicznie wspól¬ reaktywny z jadem Bothrops atrox. Definicje i wy¬ jasnienie terminu „immunologicznie wspólreaktyw- 23 ny" mozna znalezc np. w dziele B. A. Kabata, Einfiihrung in die Immunchemie und Immunolo¬ gie, Springer Verlag, 1971, str. 1 i nastepne.Ponizej podano szczególowy opis sposobu wy¬ twarzania preparatu enzymatycznego wedlug wy 30 nalazku.Liofilizowany jad wezowy, na przyklad jad weza Bothrops atrox, rozpuszcza sie w roztworze soli fizjologicznej o wartosci pH 4,5—7, a nierozpu- szczona substancje usuwa sie z roztworu przez od- 33 wirowanie lub odsaczenie. Nastepnie doprowadza sie wartosc pH roztworu do stanu slabo kwasnego, czyli okolo 3—4, przez dodanie kwasu nieorganicz¬ nego, np. kwasu solnego lub kwasu siarkowego, albo kwasu organicznego, takiego jak kwas octo- 40 wy, po czym ogrzewa sie roztwór, mieszajac, co powoduje wytracenie protein bez straty skladnika czynnego.Ilosc wytraconych substancji zalezy od czasu ogrzewania i temperatury, a takze od wartosci pH 45 roztworu. Przy wartosci pH 3 wystarcza 10-minu- towe ogrzewanie w temperaturze 30°C, podczas gdy przy pH 3,5 dogodnie jest ogrzewac roztwór w ciagu 1 godziny w temperaturze 30°C lub w cia¬ gu 30 minut w temperaturze 40°C. Przy wartosci 50 pH 4 przedluza sie czas ogrzewania do okolo 2 godzin i podnosi temperature do okolo 50°C.Wytracone proteiny wyosabnia sie przez odwi¬ rowanie, wartosc pH przesaczu doprowadza sie do okolo 4,5—7, korzystnie okolo 6,5, po czym przesacz 55 poddaje sie frakcyjnemu wytracaniu soli w celu usuniecia substancji balastowych, a nastepnie wy¬ tracenia frakcji czynnej. Wytracanie to prowadzi sie z zastosowaniem soli kwasów z amoniakiem, metalami alkalicznymi lub metalami ziem alkalicz- 60 nych, np. chlorku lub siarczanu sodowego, chlor¬ ku lub siarczanu magnezowego, badz chlorku lub siarczanu amonowego. W przypadku stosowania siarczanu amonowego przy wartosci pH 6,5, sub¬ stancje balastowe wytracaja sie przy 40% nasy- 05 ceniu, a frakcja czynna przy 55°/o nasycenia w tern-B28A7 $ peraturze 20°C. Stosowanie innych soli, wartosci pH i temperatur wymaga innych stopni nasycenia.Frakcje czynna wyosabnia sie z roztworu ma¬ cierzystego przez odwirowanie, po czym rozpusz¬ cza sie ja w wodzie destylowanej i doprowadza 5 wartosc pH roztworu do 4—6, korzystnie okolo 5.Przez dodanie okolo 7% wagowych fenolu lub od¬ powiedniej ilosci pochodnej tego zwiazku, wywo¬ luje sie wytracenie skladnika czynnego w postaci kompleksu. io- Odpowiednimi pochodnymi fenolu sa kwasy fe- nolokarboksylowe, na przyklad kwas salicylowy, alkilofenole, na przyklad o-, m- lub p^krezol, fe¬ nole chlorowcowane, na przyklad o-, m- lub p-chlo- rofenol, chlorowcowane lub alkilowane kwasy fe- 15 nololkarboksylowe, nip. (kwasy krezolowe i chloro- fenolowe, badz sole kwasów fenolokarboksylowych lub ich pochodne, np. salicylan sodowy i sodowe sole kwasów krezolokarboksylowych. Poza tym stosuje sie równiez zywice fenolowo-formaldehy- 20 dowe zawierajace wolne grupy fenolowe, takie jak Amberlite XE 97. Ilosc wytraconej substancji za¬ lezy od stopnia rozpuszczalnosci stosowanej po¬ chodnej fenolu lub, w przypadku kwasów, od stopnia rozpuszczalnosci stosowanej wolnego kwa- 25 su. Otrzymany nierozpuszczalny kompleks skladni¬ ka czynnego wyosabnia sie przez odwirowanie i rozklada jednym z nizej podanych sposobów.Wyosobniony kompleks plucze sie kilkakrotnie roztworem 0,1—0,5°/o kwasu octowego w rozpusz- 30 czalniku polarnym w celu rozlozenia kompleksu i rozpuszczenia fenolu lub jego pochodnej, przy czym skladnik czynny pozostaje w postaci nie¬ rozpuszczalnego osadu. Odpowiednimi rozpuszczal¬ nikami polarnymi sa np. alkanole o 1—4 atomach 35 wegla w lancuchu, ketony alkilowe o wzorze R1 —CO —R2, w którym R1 i R2 oznaczaja rodniki alkilowe o 1—4 atomach wegla, lub estry alkilowe o wzorze R1 — O — R2, w którym R1 i R2 oznaczaja rodniki alkilowe o 2—3 atomach wegla. 40 Inny sposób rozkladu jest nastepujacy: kompleks skladajacy sie ze skladnika czynnego i fenolu lub jego pochodnej, rozpuszcza sie w wodzie i dopro¬ wadza wartosc pH roztworu do okolo 7,5—8,5, ko¬ rzystnie 8, przez dodanie wodorotlenku metalu al- 45 kalicznego, octanu metalu alkalicznego, cytrynia¬ nu metalu alkalicznego, weglanu lub wodorowegla¬ nu metalu alkalicznego, fosforanu metalu dwu- lub trójalkalicznego badz aininej zasady buforowej, albo wodorotlenku amonowego lub amoniaku. Na- 50 stepnie przesacza sie roztwór pod cisnieniem azotu przez ultrafiltr o takiej wielkosci oczek, aby za¬ trzymal enzymowy skladnik czynny, a przepuscil roztwór fenolu lub jego pochodnej. Odpowiednimi filtraimi sa filtry „Diafilo" typu UM-05, UM-2, 55 UM^IO, lub PM-10 (sa to ultrafiltry np. z polime¬ rów syntetycznych, sprzedawane przez AMICON, Oosterhout (N. B.), Holandia). Zatrzymany na fil¬ trze skladnik czynny plucze sie kilkoma porcjami wody destylowanej lub roztworu odpowiedniego 60 srodka konserwujacego w celu usuniecia pozosta¬ lego fenolu lub jego pochodnej i równoczesnie steza.Aktywny preparat enzymatyczny, z którego usu¬ nieto fenol lub jego pochodna, wykazuje aktyw- 65 nósc okolo 10^-»15 jednostek NIH-trombiny na 1 mg substancji suchej (stopien czystosci I), daje on jednak trzy linie straceniowe na immunofero- gramie oraz cztery strefy proteinowe na ferogra- mie akryloamidowym i ma barwe zólta. Ponadto, preparat enzymatyczny o stopniu czystosci I wy¬ kazuje równiez aktywnosc tromboplastyczna.W celu dalszego oczyszczenia, preparat enzyma¬ tyczny o stopniu czystosci I rozpuszcza sie w bu¬ forze tris-(hydroksymetylo)-aminometanofosforano- wym o wartosci pH 6,0 (0,02 mola), otrzymujac 5% roztwór, który poddaje sie chromatografii na ko¬ lumnie DEAE — „Sephadex A-50?' (DEAE = dwu- etyloawiiLnoetyl, „Sephadex" jest anakaem handlo¬ wym produktów polidekstranowych, dostarczanych przez przedsiebiorstwo Pharmacia w Uppsali w Szwecji), uprzednio przeksztalconej w postac PO4 i zrównowazonej buforem TRIS-fosforanowym 0 wartosci pH 6,0 (0,02 mola).Chromatografie prowadzi sie przez wylewanie roztworu kompozycji enzymów na kolumne, usu¬ wanie substancji balastowych przez plukanie ko¬ lumny 4-krotnie wieksza od jej objetosci iloscia buforu TRISnfosforanowego o pH 6,0 (0,02 mola) [TRIS = tris-(hydroksymetylo)-aminometan] i roz¬ puszczenie kompozycji enzymów przez eluowanie jej dwukrotnie wieksza od objetosci kolumny ilo¬ scia buforu TRIS-fosforanowego o pH 6,0 (0,04 mola). Sole usuwa sie z aktywnego eluatu przez ultrafiltrowainie. Liofilizacja przesaczu daje pre¬ parat enzymatyczny o stopniu czystosci II o ak¬ tywnosci odpowiadajacej lOO—200 jednostkom NIH-trombiny na 1 mg zawartosci protein. Immu- nogerogram wykazuje pojedyncza linie stracenio- wa, a ferograim aJkryloainiiinowy — dwie strefy.Preparat enzymatyczny mozna wytworzyc w~po- staci krystalicznej przez pozostawienie wolnego od soli koncentratu, otrzymanego w wyniku ultrafil¬ tracj i, na okres 48 godzin w temperaturze 2°C, wyosobnienie krysztalów przez odwirowanie z rów¬ noczesnym chlodzeniem i wyplukanie tych kryszta¬ lów lodowata woda destylowana. W ten sposób, z niewielka wydajnoscia, otrzymuje sie prostokat¬ ne plytki tworzace bezpostaciowe czastki, przy czym nastepuje to szybko w przypadku suszenia pod zredukowanym cisnieniem, a stopniowo przy su¬ szeniu na powietrzu. Po wysuszeniu krysztalów otrzymuje sie preparat enzymatyczny o aktywno¬ sci wyzszej niz 200, jednostek NIH-trombiny na 1 mg zawartosci protein (stopien czystosci III).Preparat enzymatyczny o stopniu czystosci II okazuje sie substancja jednorodna na podstawie analizy elektroferogramu bibulowego, elektrofero- gramu membranowego, chromatogramu na zelu, chromatogramu jonitowegi i immunodyfuzogramu wedlug metody Ouchter-Lonny^go. Droga elektro¬ forezy w zelu poliakryloamidowym, z aktywnej frakcji enzymowej wyosabnia sie jednak farmako¬ logicznie nieaktywna frakcje poli-peptydowa.Skladnik nieaktywny wyosabnia sie z frakcji enzy¬ mowej przez poddanie preparatu enzymatycznego o stopniu czystosci II chromatografii na zelu z za¬ stosowaniem mieszaniny alifatycznego kwasu kar- bóksylowego z woda lub mieszaniny wodnego roz¬ tworu buforowego z mieszajacym sie z woda roz-82807 puszczalnikiem organicznym, przy czym stosuje sie zel hydrofobowy lub hydrofilowy.Przykladami zelów hydrofilowych sa zele poli- dekstranowe, takie jak „Sephadex" (Pharmacia, Uppsala — Szwecja), zele poliakryloamidowe, ta¬ kie jak „Bio-Gel" (wytworzony przez Bio-Rad La¬ boratories w Richmond w Kalifornii) oraz zele agarozowe i agarowe, takie jak „Sepharose" (Phar¬ macia, Szwecja). Chromatografie prowadzi sie do¬ godnie przy niezmiennym stezeniu jonów wodo¬ rowych na przyklad w zakresie wartosci pH 2—9, korzystnie w zakresie 2—6. Odpowiednimi kwasami karboksylowymi sa na przyklad mieszajace sie z woda alifatyczne kwasy monokarboksylowe o lancuchu prostym lub rozgalezionym i zawierajace 1—4 atomów wegla. Jako bufory stosuje sie typowe zwiazki rozpuszczalne w mieszaninach wody z roz¬ puszczalnikami, takie jak mrówczany, octany, fo¬ sforany, cytryniany i weglany zasad nieorganicz¬ nych, takich jak zasady metaloalkaliczne lub amo¬ nowe, badz zasad organicznych, takich jak piry¬ dyna lub tris-(hydroksymetylo)-aminometan. Ko¬ rzystnie stosuje sie bufory nie adsorbujace promie¬ ni nadfioletowych i wystepujace w stanie lotnym pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego, takie jak mrówczan amonowy lub octan amonowy; po przeprowadzeniu chromatografii dokonuje sie wte¬ dy analizy densytometrycznej eluatów w nadfio¬ lecie i steza sie te eluaty metoda liofilizacji.Alifatyczne kwasy karboksylowe stosuje sie w stezeniach 5—95% objetosciowo w wodzie. W przy¬ padku stosowania zelów hydrofilowych stosuje sie stezenie kwasu karboksylowego w wysokosci 5— —50% objetosciowo. Stosujac bufory wodne ciodaje sie mieszajacy sie z woda rozpuszczalnik organi¬ czny w stezeniu 5—95% objetosciowo. W przypad¬ ku stosowania zelów hydrofilowych stosuje sie ste¬ zenie rozpuszczalnika w wysokosci 10—50% obje¬ tosciowo. Przykladami odpowiednich mieszajacych sie z woda rozpuszczalników sa alkanole o lancu¬ chach prostych lub rozgalezionych, zawierajace 1—5 atomów wegla, ketony, takie jak aceton, dwu- etyloketon lub keton metylowo-etylowy, alkiloami- ny, takie jak jedno-, dwu- lub trójmetylo- etylo- lub propyloamina, lub uretany, np. etylouretany.Ze wzgledu na to, ze eluaty steza sie korzystnie metoda liofilizacji, zaleca sie stosowac rozpuszczal¬ niki wystepujace w stanie lotnym pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego i nie obnizajace tem¬ peratury zamarzania roztworu. Przykladami odpo¬ wiednich rozpuszczalników sa III-rzed. butanol i cykloheksanol.Wytworzone droga chromatografii na zelu pre¬ paraty enzymatyczne wykazuja aktywnosc biologi¬ czna 200—400 jednostek NIH-trombiny na 1 mg zawartosci protein (stopien czystosci III). Wiek¬ sza czesc frakcji nieaktywnej usuwa sie z prepa¬ ratu enzymatycznego metoda chromatografii na zelu.Stosowany w tym opisie termin „stopien czysto¬ sci II" oznacza 100—200 jednostek NIH-trombiny na 1 mg zawartosci protein, a termin „stopien czy¬ stosci III" — 200—400 jednostek NIH-trombiny na 1 mg zawartosci protein.Wyniki aminokwasowej analizy preparatu enzy¬ matycznego mieszcza sie w podanych nizej zakre¬ sach, w zaleznosci od stopnia czystosci. Analize te prowadzi sie w ciagu 22—72 godzin przez pod¬ danie preparatu hydrolizie z zastosowaniem stalo- wrzacego kwasu solnego w temperaturze 110°C, w atmosferze azotu. Wyniki podano w tablicy 1. 10 15 20 30 35 40 45 50 55 60 65 Tablica 1 Aminokwasy Kwas asparaginowy Treonina Seryna Kwas glutaminowy Prolina Glicyna Alanina Cystyna 1/2 Walina Metionina Izoleucyna Leucyna Tyrozyna . Fenyloalanina Histydyna Lizyna Arginina Liczba mikromoli w 1 mg skladnika peptydowego 1^1,3 0,35—0,55 0,4 —0,5 0,85—0,75 0,55—0,9 0,65—0,9 0,4 —0,65 0,35—0,e 0,45—0,6 0,1 —0,2 0,45—0,75 0,3 —0,5 0,3 ^0,5 0,3 —0,45 0,2 —0,25 0,45—0,65 0,3 —0,45 W tablicy 2 podano przykladowo wyniki analizy aminokwasowej dla: A — preparatu enzymatycznego o stopniu czysto¬ sci II, B — preparatu enzymatycznego o stopniu czysto¬ sci III (czyli preparat o znacznie zredukowa¬ nej zawartosci substancji nieaktywnej).Skladnik weglowodanowy preparatu enzymatycz¬ nego wydaje sie byc co najmniej czesciowo zwia¬ zany z polipeptydem, w postaci glikopeptydu. Okre¬ slenie zawartosci weglowodanów (cukru obojetne¬ go) prowadzi sie metoda orcynolowa [por. L. F.Hewitt, Biochem. J. 31 str. 360 (1937)].Preparat enzymatyczny o stopniu czystosci III (czyli preparat o zredukowanej zawartosci substan¬ cji nieaktywnej) zawiera skladnik peptydowy o prawdopodobnym ciezarze czasteczkowym 38000— —55000, natomiast skladnik peptydowy preparatu enzymatycznego o stopniu czystosci II ma ciezar czasteczkowy 28000^55000.Preparat enzymatyczny o stopniu czystosci II za¬ wiera skladnik aktywujacy czynnik XIII.Preparat enzymatyczny o stopniu czystosci III wykazuje nastepujacy uklad aminokwasów (wy¬ znaczony metoda rozkladowa Edmana, opisana przez S. B. Needlemana w Protein Seauence De- termination, Springer-Verlag, Berlin—Heidelberg, New York, 1970, str. 2ill i nast.) od azotowego kon¬ ca lancucha: walina -^ izoleucyna -+ glicyna -? glicyna r- kwas, asparaginowy -- kwas glutaminowy,9 8280T 10 T a bli b a 2 Aminokwasy Kwas aspara¬ ginowy Treonina Her^na Kwas glutami¬ nowy Prólina Glicyna" Alanina Cystyna 1/2 Walina Metionina Izoieueyfia Leucyria Tyrozyna Fenyloalanina Mistydyna Lizyna Argiilina Liczba mikromoli w 1 mg 1 skladnika peptydowego A 1,05-4,1 6,35^6,41 6,43—*,45 6,67—6,7 6,58—billi 6,67—0,76 6,41—0,5 6,47—6,^ 6,47—6,55 6,17—6,2 6,45—6,55 6,46—6,47 0,33—0,5 0,33—0,43 0,2 —0,22 0,6 —0,64 0,3 —0,4 B 1,17—1,25 0,42—6,54 0,41—0,5 0,6S—6,71 6,76—6,$ 0,63—6,64 0,35—0,41 6,55—0,6 6,65—0,72 0,6 —6,64 0,3 —0,36 0,33—0,38 0,21—0,23 0,48—0,53 0,32--0,36 Preparat enzymatyczny wytworzony sposobem wedlug wynalazku nie zawiera neurotoksyn dzia¬ lajacych szkodliwie na system nerwowy, proteaz tworzacych bradykinine, która obniza cisnienie krwi, lecytynaz dzialajacych hemolitycznie i uszka¬ dzajacych nerM, oksydaz arndinotowasowych i fosfa¬ taz* Preparat ten ma zastosowania jako reagent i sro¬ dek pomocniczy w fizjologicznych badaniach koa¬ gulacji in vitro, np. w badaniach konwersji fibry- nogenu w fibryne w obecnosci heparyny i anty- trombin oraz w badaniach fibrynopeptydów, pa¬ tologicznych struktur fibrynogenowych, produktów rozpadu fibryno&enu, czynnika VIII i czynnika XIII.Wytworzony sposobem wedlug, wynalazku prepa¬ rat enzymatyczny stosowany in vivo w umiarko¬ wanych dawkach, hamuje krwawienie i skraca czas koagulacji u zwierzat doswiadczalnych oraz u pa¬ cjentów o normalnej lub patologicznej hemostazie.Preparat ten, stosowany dozylnie w umiarkowa¬ nych dawkach u ludzi, powoduje wytwarzanie sie w obiegu krwionosnym rozpuszczalnych komplek¬ sów fibrynowo-fibrynogenowych, co stwierdzono na podstawie dodatniej próby plazmy na kriofi- bryne i próby parakoagulacyjnej oraz analiz azo¬ towego konca frakcji plazmy ludzkiej. Preparat enzymatyczny wytworzony sposobem wedlug wy¬ nalazku jest zatem pozytecznym srodkiem hemo- statycznym.W przypadku podawania tego preparatu psom w wiekszych dawkach, zachodzi szybka defibry- nogenacja i wtórna fibrynoliza, a we krwi daje sie.zauwazyc obecnosc produktów rozpadu fibryno- genu. Defibrynogenacja i fibrynoiiza zachodza bez zadnych objawów wstrzasowych, trombocytopenii i komplikacji tromboembolicznych lub krwotoko- wych; Doswiadczenia kliniczne na pacjentach z tromboza zyl nóg lub siatkówki wykazaly, ze preparat enzymatyczny ma szczególne zastosowa¬ nie w terapii defibrynogenujacej i fibrynolitycz- nej.; O ile wiadomo, nowy preparat enzymatyczny nie moze byc zastapiony jako reagent przez zaden in¬ ny porównywalny srodek. Chociaz wytwarzana z enzymu gronkowcowego koagulaza trombinowa jest równiez enzymem trombino-podobnym, które¬ go aktywnosc nie Ulega zahamowaniu pod wply¬ wem antytrombin, ódszCzepia ona z czasteczki fi¬ brynogenu zarówno peptyd A jak i peptyd B, pod¬ czas gdy preparat enzymatyczny wytworzony spo¬ sobem wedlug wynalazku uwalnia tylko peptyd A.Wsród srodków hemostatycznych o dzialaniu trombino^podobhym, preparat enzymatyczny wy¬ tworzony sposobem •¦ wedlug wynalazku wyróznia sie swoja wstrzykiwalnoscia. Trombina, koagulaza trombinowa i srodki trombinotwórcze, takie jak tromboplastyny i jad zmii Eussela, wywoluja przy stosowaniu pozajelitowym objawy tromboembolicz- ne oraz trombocytopenie; srodki te mozna wiec stosowac tylko miejscowo.W przypadku stosowania wiekszych dawek pre¬ paratu enzymatycznego wytworzonego sposobem wedlug wynalazku do defibrynogenowania w sta¬ nach tromboembolicznych, preparat ten dziala ja¬ ko koagulator i równoczesnie wywoluje fibryno- lize. Wskutek utraty i rozpadu wiekszej czesci fi¬ brynogenu, krew traci zdolnosc do koagulowania w wyniku defibrynogenacji. Ponadto, produkty roz¬ padu fibrynogenu wytworzone podczas wzbudzonej fibrynolizy dzialaja hamujaco na koagulacje. Po kilku dniach (np. 2—3 dniach), ilosc produktów rozpadu fibrynogenu spada na tyle, ze nie zwiek¬ szaja one tendencji do krwawienia. Podczas defi¬ brynogenacji nie wystepuje trombocytopenia, a pacjenci nie wykazuja zwiekszonej tendencji do krwawienia przy zawartosci 0,01—0,05 g fibryno¬ genu w 100 ml plazmy. Pacjentów tych mozna równiez poddawac zabiegom chirurgicznym bez ry¬ zyka niebezpiecznego krwawienia.Stosunkowo niewielkie zahamowanie hemostazy wywolane dzialaniem kompozycji enzymów we¬ dlug wynalazku stanowi wielka zalete w porów¬ naniu z antykoagulatorami grupy heparynowej oraz antykoagulatorami szeregu dwukumarynowe- go, które hamuja synteze róznych czynników koa- gulacyjnych w watrobie i dzialaja bardzo szkodli¬ wie na procesy hemostatyczne. Dzieki swemu sil¬ nemu dzialaniu antykoagulacyjnemu, nowy prepa¬ rat enzymatyczny ma szczególne zastosowanie do zapobiegania tworzeniu sie skrzeplin podczas za¬ biegów chirurgicznych. Dotychczas nie zaobserwo¬ wano odpornosci na ten prepart przy stosowania dozylnym. W przypadku stosowania tego prepa¬ ratu, leczenie i kontrola przebiegu terapii sa bardzo latwe.W porównaniu z antykoagulatorem wytwarza¬ nym sposobem podanym w brytyjskim opisie pa¬ tentowym nr 1004 301, preparat enzymatyczny wytwarzany sposobem wedlug wynalazku wykazu¬ je te zasadnicza zalete, ze jego aktywnosc fizjo¬ logiczna jest znacznie dluzsza. Porównywalna daw- 10 15 20 26 30 35 40 45 50 55 Kwas aspara¬ ginowy Treoftina Her^na Kwas glutami¬ nowy Prólina GlicyhS Alanina Cystyna 1/2 Walina Metionina Izoieueyfia Leucyria Tyrozyna Fenyloalanina Mistydyna Lizyna Arginina 1,65-4,1 6,35^6,41 6,43—*,45 6,67—6,7 6,58—6,73 6,67—0,76 6,41—0,5 6,47—6,^ 6,47—6,55 6,17—6,2 6,45—6,55 6,46—6,47 0,33—0,5 0,33—0,43 0,2 —0,22 0,6 —0,64 0,3 —0,4 1,17—1,25 0,42—6,54 0,41—0,5 0,6S—6,71 6,7&-Ó,8'? 6,76—0,$ 0,63—6,64 0,35—0,42 6,55—0,6 Ó,lS—6,17 6,65—0,72 0,6 —6,64 0,3 —0,36 0,33—0,38 0,2,1—0,23 0,48—0,53 0,32--0,3611 ka nowego preparatu wykazuje dluzsze dzialanie defibrynogenacyjne. Podczas gdy heparyne trzeba wstrzykiwac co 4—6 godzin, jedna dawka prepa¬ ratu enzymatycznego wytwarzanego sposobem we¬ dlug wynalazku zachowuje aktywnosc w ciagu co najmniej 24 godzin. Ponadto, przy stosowaniu do¬ zylnym, preparat ten nie wytwarza odpornosci organizmu. O ile antykoagulator z brytyjskiego opisu patentowego nr 1 094 301 nalezy stosowac w dawkach 4—6 razy po 60 jednostek na 60 kg wagi ciala pacjenta, w ciagu 24 godzin (.1 jednostka to taka ilosc enzymu, która zastosowana wobec fi- brynogenu ludzkiego daje taki sam okres koagulacji co 1 jednostka NIH-trombiny; NIH = National In- stitute of Health), to jedna dawka najwyzej 14 jednostek preparatu enzymatycznego wytworzo¬ nego sposobem wedlug wynalazku na 60 kg wagi ciala pacjenta wystarcza do utrzymania stanu de- fibrynogenacji u doroslego czlowieka w ciagu 24 godzin.Aktywnosc preparatu enzymatycznego wytwo¬ rzonego sposobem wedlug wynalazku wyznacza sie na podstawie jej trombino-podobnego dzialania na ludzki fibrynogen. Jedna jednostka tego preparatu odpowiada ilosci, która powoduje koagulacje roz¬ tworu fibrynogenu w tym samym czasie co jedna jednostka NIH standartowej trombiny.W stanie oczyszczonym preparat enzymatyczny wytworzony sposobem wedlug wynalazku jest la¬ two rozpuszczalny w rozcienczonych roztworach soli, lecz slabo rozpuszczalny w wodzie destylowa¬ nej. Daje sie on wytracac z roztworów wodnych solami lub mieszajacymi sie z woda rozpuszczal¬ nikami organicznymi oraz moze byc odwracalnie wiazana na jonitach zasadowych i tworzy nieroz¬ puszczalne w wodzie kompleksy z fenolem i jego pochodnymi. Ponadto, preparat ten cechuje wy¬ soki stopien odpornosci na cieplo i znaczna od¬ pornosc na dzialanie kwasów.Jako srodek hemostatyczny stosuje sie preparat enzymatyczny wytwarzany sposobem wedlug wy¬ nalazku w dziennych dawkach okolo 0,25—1,5 jed¬ nostek NIH na 60 kg wagi ciala pacjenta. Nato¬ miast jako antykoagulator krwi stosuje sie ten pre¬ parat w dziennych dawkach okolo 2—100, korzyst¬ nie okolo 7—14 jednostek NIH na 60 kg ciala pac¬ jenta.Zakres wynalazku obejmuje równiez srodek far¬ maceutyczny zawierajacy jako skladnik czynny preparat enzymatyczny wytworzony sposobem we¬ dlug wynalazku. Jezeli srodek taki ma byc sto¬ sowany jako antykoagulator krwi, wówczas wi¬ nien zawierac 10—500, 'korzystnie okolo 100 mifaro- gramów skladnika czynnego na dawke jednostko¬ wa. Najdogodniej rozpuszcza sie preparat enzyma¬ tyczny w srodowisku wodnym, odpowiednim do sto¬ sowania pozajelitowego. W praktyce najodpowied¬ niejszymi sa ampulki zawierajace 2 ml wodnego roztworu preparatu enzymatycznego, zawierajace¬ go korzystnie okolo 0,9% NaCl, okolo 0,3—0,5% fenolu i okolo 0,01—0,2% czesciowo zhydrolizowa- nej zelatyny (jako stabilizatora) oraz wykazujace¬ go wartosc pH okolo 5,0—8,0, korzystnie 6,5.Zakres wynalazku obejmuje takze reagent maja¬ cy zastosowanie w badaniach in vitro krwi ssa- 82807 12 ków, a szczególnie ludzi, na przyklad w badaniach procesu tworzenia sie fibryny lub anomalii w tym procesie, do szybkiego okreslania poziomu fibry¬ nogenu w obecnosci heparyny, do szybkiego wy- 5 krywania obecnosci fibryny i produktów jej roz¬ padu w plazmie oraz jako srodek zastepujacy trom- bine w próbach na koagulacje krwi.Dla celów praktycznych, reagent taki wytwarza sie z mieszaniny 10—50 mikrogramów liofilizowa¬ lo nego preparatu enzymatycznego, 1 mg czesciowo zhydrolizowanej zelatyny (jako stabilizatora), 2 mg p-ióksybenzoesainu metylu, 8,5 mg NaCl i glicyny w ilosci dopelniajacej do 34 mg. Mieszanine te rozpuszcza sie w 1 ml wody destylowanej, a otrzy- 15 many roztwór moze byc natychmiast uzyty jako opisany wyzej reagent.Przyklad I. W 1000 ml 0,9% roztworu NaCl rozpuszcza sie 20 g jadu Bothirops atrox, po czym odwirowuje sie roztwór w ciagu 10 minut z pred- 20 koscia 3O00 obrotów na minute. Po usunieciu wy¬ traconej substancji, doprowadza sie wartosc pH roztworu do 3,5 rozcienczonym kwasem octowym, ogrzewa sie ten roztwór w ciagu 1 godziny w tem¬ peraturze 30°C w kapieli wodnej i ponownie od- 25 wirowuje. Wytracona substancje usuwa sie, a na¬ stepnie doprowadza sie wartosc pH roztworu do 6,5 przez dodanie wodorotlenku sodowego i dopelnia sie roztwór do objetosci 1000 ml 0,9% roztworem NaCl, po czym dodaje sie, mieszajac 670 ml nasy- 30 conego roztworu siarczanu amonowego, pozostawia mieszanine do odstania w temperaturze pokojowej na okres 1 godziny i usuwa sie wytracony osad przez odwirowanie. Nastepnie dodaje sie dalsze 552 ml nasyconego roztworu siarczanu amonowe- 35 go, a po uplywie 1 godziny odwirowuje sie mie¬ szanine.Odwirowana ciecz usuwa sie, a wytracona sub¬ stancje rozpuszcza w 100 ml wody destylowanej, po czym doprowadza wartosc pH roztworu do 5,0 40 przez dodanie rozcienczonego kwasu octowego, a nastepnie, mieszajac roztwór, dodaje sie don 7,7 ml 90% fenolu i pozostawia mieszanine do odsta¬ nia w temperaturze pokojowej na okres 15 godzin.Po odwirowaniu usuwa sie ciecz, a wytracony 45 enzym plucze dwukrotnie 10 ml wody nasyconej fenolem, odwirowuje i rozpuszcza w 50 ml eta¬ nolu zawierajacego 1% kwas octowy. Mieszanine te miesza sie w ciagu 1 godziny, a nastepnie fil¬ truje przez szklany filtr prózniowy. Zatrzymana na 50 filtrze substancje plucze sie kilkoma porcjami po 20 ml etanolu i suszy pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego, otrzymujac 2—2,5 g kompozycji enzymów o stopniu czystosci I i aktywnosci trom- bino^podobnej okolo 10—12 jednostek NIH na 1 mg 55 substancji suchej. Produkt ten jest trwaly przy przechowywaniu.Surowy enzym rozpuszcza sie w 40 ml buforu tris-fosforanowego o wartosci pH 6,0 (0,02 mola) i miesza w ciagu 15 minut, po czym usuwa sie sub- 60 stancje nie rozpuszczona przez odwirowanie, czy¬ sta ciecz wylewa z predkoscia 0,8—1,0 ml/minute na kolumne 200 ml DEAE-Sephadexu wyrownowa¬ zona buforem tris-fosforanowym, a nastepnie elu¬ uje 800 ml tego samego roztworu buforowego. 65 Pierwsza frakcje eluatu usuwa sie, po czym eluujen sie enzym 400 ml buforu tris-fosforanowego (0,04 mola), a po wyosobnieniu aktywnego eluatu steza sie go pod cisnieniem na ultrafiltrze UM-10 (AMI- CON) i plucze az do calkowitego uwolnienia go od soli. Wolny od soli koncentrat suszy sie pod ci¬ snieniem nizszym od atmosferycznego nad P2O5 lub liofilizuje, otrzymujac 200—250 mg kompozycji enzymów o stopniu czystosci II i aktywnosci okolo 100^-il5O jednosteik NIH trombiny na 1 mg zawar¬ tosci protein.Nastepnie steza sie koncentrat na ultrafiltrze do objetosci 5 ml, a roztwór filtruje przez szklany filtr prózniowy o porowatosci G-4 w celu usunie¬ cia pylów, po czym pozostawia sie czysty roztwór do odstania w chlodziarce w temperaturze 2°C na okres co najmniej 24 godzin. Wytracone prostokat¬ ne krysztaly kompozycji enzymów wyosabnia sie przez odwirowanie w temperaturze 0—2°C, plucze kilkakrotnie 0,5 ml porcjami wódy destylowanej stosujac równoczesne chlodzenie lodem i wreszcie suszy nad P2O5, otrzymujac 45 mg bezbarwnego produktu o aktywnosci okolo 150—200 jednostek NIH trombiny na 1 mg zawartosci protein.Przyklad II. W 1000 ml 0,9% roztworu NaCl rozpuszcza sie 20 g jadu Bothrops atrox i dopro¬ wadza wartosc pH roztworu do 6,5. Po dodaniu 670 ml nasyconego roztworu siarczanu amonowego pozostawia sie mieszanine do odstania w tempera¬ turze 20°C na okres 1 godziny, a nastepnie odwi¬ rowuje sie ja. Po dodaniu dalszych 552 ml nasy¬ conego roztworu siarczanu amonowego i uplywie 1 godziny odwirowuje sie substancje stala, która nastepnie rozpuszcza sie w 100 ml wody destylo¬ wanej. Wartosc pH roztworu doprowadza sie do 3,5 przez dodanie rozcienczonego kwasu octowego, po czym ogrzewa roztwór w ciagu 1 godziny do temperatury 30°C. Po odwirowaniu ustala" sie war¬ tosc pH cieczy na 5,0 i po dodaniu 3 ml m-krezolu pozostawia sie ja w temperaturze pokojowej na okres 15 godzin.Wytracona substancje wyosabnia sie przez odwi¬ rowanie, plucze dwukrotnie 10 ml porcjami wody nasyconej krezolem, rozpuszcza w 50 ml wody de¬ stylowanej dodajac 1 n NaOH przy pH 8,0. Po usu¬ nieciu nie rozpuszczonej substancji przez odwiro¬ wanie, filtruje sie roztwór przez ultrafiltr AMI- CON UM-10, a nastepnie plucze pozostalosc na fil¬ trze woda destylowana dotad az krezol przestanie byc wykrywalny w popluczynach metoda reakcji z chlorkiem zelazowym, po czym rozpuszcza sie przesacz filtracyjny zawierajacy enzym w 20 ml buforu tris-fosforanowego o wartosci pH 6,0 (0,02 mola).Po usunieciu substancji nie rozpuszczonej przez odwirowanie, wylewa sie roztwór z predkoscia 0,8—1 ml/minute na kolumne 200 ml DEAE-Sep- hadex A-50 wyrównowazona tym samym roztwo¬ rem buforowym, a nastepnie plucze 800 ml buforu tris-fosforanowego o wartosci pH 6,0 (0,02 mola), po czym eiuuje sie trombino-podobny enzym 400 ml buforu tris-fosforanowego o pH 6,0 (0,04 mola), a aktywny eluat steza pod cisnieniem na ultrafil¬ trze i plucze do chwili calkowitego uwolnienia go od soli.Z otrzymanego koncentratu wytwarza sie bezpo- 82807 14 srednio sterylny roztwór do zastrzyków, badz su¬ szy sie go pod obnizonym cisnieniem. Po wysu¬ szeniu otrzymuje sie okolo 200' mg kompozycji enzymów o aktywnosci okolo 120«—-160 jednostek 5 NIH trombiny na 1 mg zawartosci protein.Przyklad III. Kolumne o dlugosci 92 cm i przekroju 1,8 cm2 wypelnia sie Sephadexem G-1O0 wyrównowazonym 10% wodnym roztworem kwasu octowego. 6,26 mg kompozycji enzymów wy- 10 tworzonej w przykladzie I (stopien czystosci II) rozpuszcza sie w 0,3 ml 10% wodnego roztworu kwasu octowego i wylewa ten roztwór na przy¬ gotowana kolumne. Od dolu kolumny przepuszcza sie przez nia ,10% wodny roztwór kwasu octowe- w go z predkoscia 5,6 ml/godzine. Analiza w nadfio¬ lecie wyfeazuje utworziende sde dwóch stref absorp¬ cyjnych w pasmie 280 milimikronów. Po zliofili- zowaniu eluatu z pierwszej strefy, otrzymuje sie 4,25 mg kompozycji enzymów o aktywnosci 200—250 20 jednostek NIH trombiny na 1 mg zawartosci pro¬ tein. 25 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL